專利名稱：利用抑制cd21的藥劑治療抗體介導(dǎo)的病變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體介導(dǎo)的病變(pathology)如自身免疫病領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及治療患有抗體介導(dǎo)的病變?nèi)缱陨砻庖卟〉姆椒ê屠酶蓴_CD21/C3d相互作用的藥劑延緩抗體介導(dǎo)的病變的發(fā)展的方法。
背景技術(shù)：
抗體介導(dǎo)的病變包括多種病癥，包括自身免疫病、異種移植排斥、同種移植排斥、移植物抗宿主疾病和對持續(xù)施用的治療性蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答?？贵w介導(dǎo)的病變的特征為可導(dǎo)致免疫復(fù)合體的自身抗體的過度產(chǎn)生。免疫復(fù)合體在特定器官或組織部位中的沉積可以引起例如組織損傷、腎衰竭、腎小球性腎炎、脈管炎和伴有心包炎的嚴(yán)重器官累及等病變。抗體介導(dǎo)的自身免疫病變包括原發(fā)性抗磷脂綜合癥(APS)、甲狀腺炎、重癥肌無力、格雷夫斯病(Graves′disease)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、系統(tǒng)性硬皮病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和多肌炎。
術(shù)語抗磷脂(aPL)抗體一般用于描述與血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)和血小板減少如原發(fā)性抗磷脂綜合癥(APS)以及自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)相關(guān)的自身抗體。Harris等人(1983)Lancet 21211-1214；和Lockshin等人(1985)N.Engl.J.Med.313152-156。APS可以原發(fā)的或者繼發(fā)的，這意味著其與其它病癥相關(guān)，所述病癥主要是SLE?！傲字Y(jié)合抗體”(Phospholipid-Binding Antibodies)(Harris等人主編，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，1991；McNeil等人“免疫學(xué)進(jìn)展”(Advances inImmunology)，第49卷，193-281頁(Austen等人主編，學(xué)院出版社，San Diego，CA，1991))。aPL抗體包括所謂的抗心磷脂(aCL)自身抗體，其將在下文中討論。aPL抗體(包括aCL抗體)在多種病癥中均可檢測出，但只有與自身免疫病相關(guān)的β2-糖蛋白I(β2GPI)依賴型抗磷脂抗體需要磷脂結(jié)合血清蛋白質(zhì)β2GPI的存在。Vaarala等人(1986)臨床免疫學(xué)免疫病理學(xué)(Clin.Immunol.Immunopathol.)418-15。APS的臨床表現(xiàn)包括動脈閉塞、肢體壞疽、中風(fēng)、心肌梗死、其它內(nèi)臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內(nèi)臟靜脈閉塞(如巴-希綜合癥、門靜脈閉塞)、習(xí)慣性流產(chǎn)、血小板減少癥、庫姆斯陽性溶血性貧血、網(wǎng)狀青斑、神經(jīng)系統(tǒng)異常(如舞蹈癥、短暫性局部缺血發(fā)作)、心瓣性心臟病以及突發(fā)性多系統(tǒng)動脈閉塞。Scientic American Medicine第15章，第IV節(jié)，5頁(2001)。
甲狀腺炎(或橋本甲狀腺炎)和格雷夫斯病是與甲狀腺有關(guān)的其它自身免疫病，并且被認(rèn)為由針對促甲狀腺激素(TSH)受體的自身抗體引起。甲狀腺中的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)包括慢性炎性細(xì)胞的過度浸潤、濾泡破裂、嗜曙紅細(xì)胞過多、不同程度的增生和纖維化。慢性甲狀腺炎的臨床表現(xiàn)多種多樣，但其主要的并發(fā)癥狀為無痛甲狀腺腫、甲狀腺機(jī)能減退以及上述兩種的聯(lián)合。Scientific American Medicine第6章，第VI節(jié)，6-8頁以及第3章，第I節(jié)，16頁(2001)。
重癥肌無力是一種自身免疫病，據(jù)認(rèn)為其由針對乙酰膽堿受體(AchR)的自身抗體引起。AchR的自身抗體可以在患有重癥肌無力的患者的血清中檢測和測量到。重癥肌無力的臨床表現(xiàn)包括骨骼肌無力和易疲勞。肌肉無力可以表現(xiàn)為不對稱上眼瞼下垂和復(fù)視，其因提升眼瞼和眼外肌移動的能力受損所致。其它身體癥狀包括頸伸肌無力、頭下垂、由于面部肌肉和球肌無力所致的當(dāng)患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構(gòu)音障礙的低音量發(fā)音困難、可導(dǎo)致氣阻或反胃的吞咽困難，以及可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力。該疾病可以利用患者的致病性IgG傳遞給實驗動物。Scientific American Medicine第6章，第VI節(jié)6-8頁以及第11章，第III節(jié)，12-13頁(2001)。
系統(tǒng)性硬皮病是一種罕見的、慢性進(jìn)行性風(fēng)濕疾病，據(jù)認(rèn)為其由針對核蛋白質(zhì)如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70和著絲粒的自身抗體引起。系統(tǒng)性硬皮病可以是擴(kuò)散性的或者限制性的。系統(tǒng)性硬皮病的限制形式或者CREST(鈣質(zhì)沉著、雷諾氏現(xiàn)象、食道累及、指端硬化以及毛細(xì)血管擴(kuò)張)可以是致命的，但比擴(kuò)散性硬皮病較少累及內(nèi)在器官。系統(tǒng)性硬皮病的臨床特征包括手指和手掌的腫脹和變厚并可能涉及面部，皮膚的變厚、累及軀干和臨近肘部的臂。隨著系統(tǒng)性硬皮病的進(jìn)展，臨床特征包括皮膚萎縮并可能脫發(fā)、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性喪失；皮包骨，其中皮膚緊繃并緊結(jié)合在下面的結(jié)構(gòu)上；以及有限的運動性，尤其是手指。ScientificAmerican Medicine第6章，第VI節(jié)6-8頁以及第15章，第V節(jié)，1-4頁(2001)。
特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是自身免疫病，其特征為血小板的快速破壞。據(jù)認(rèn)為是由于形成血小板上蛋白質(zhì)的自身抗體并結(jié)合至血小板，從而使血小板隨后被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)除去。這些自身抗體常常直接針對血小板糖蛋白(GP)IIb-IIIa受體復(fù)合物。ITP中自身抗體的另一個靶子為GPIb受體復(fù)合物。ITP的一些臨床特征包括下肢存在瘀斑，輕微臨床出血，包括紫癜、鼻衄、牙齦出血、月經(jīng)過多，脾不顯(unpalpable spleen)，以及在幾種血小板減少癥中，嘴中血泡。Scientific American Medicine第5章，第XIII節(jié)2頁(2001)。
多肌炎為風(fēng)濕性疾病，其涉及主要是骨骼肌無力。據(jù)認(rèn)為多肌炎由核蛋白如Jo-1、組氨酰-tRNA合成酶、蘇氨酰-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2的自身抗體引起。多肌炎的臨床特征為相鄰肌肉無力并且也可包括可能的肺部累及，如吸入性肺炎、間質(zhì)性肺??；軟組織鈣化(在兒童中最為常見)；以及與其它風(fēng)濕性疾病如雷諾氏現(xiàn)象相關(guān)。Scientific American Medicine第6章，第VI節(jié)6-8頁以及第15章第VI節(jié)1-4頁(2001)。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)為自身免疫病，其特征為產(chǎn)生多種核抗原(包括雙鏈DNA，dsDNA)的抗體。另外，抗-β2 GPI抗體也可以在患有SLE的個體中發(fā)現(xiàn)。據(jù)認(rèn)為，與DNA反應(yīng)的自身抗體在SLE的病理學(xué)中起作用，并且與狼瘡腎炎密切相關(guān)。參見例如Morimoto等人(1982)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1391960-1965；Foster等人(1993)Lab.Invest.69494-507；ter Borg等人(1 990)Arthritis Rheum.33634-643；以及Bootsma等人(1995)Lancet 3451595-1599。與SLE相關(guān)的其它臨床癥狀包括面頰疹、盤形疹、蝶形疹、光過敏、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、腎病(例如蛋白尿)、神經(jīng)系統(tǒng)病癥(例如癲癇發(fā)作或精神病)、血液病(例如溶血性貧血、白細(xì)胞減少癥、淋巴細(xì)胞減少癥、血小板減少癥)以及免疫學(xué)病癥(例如陽性紅斑狼瘡細(xì)胞制備、異常效價的針對天然DNA的抗-DNA抗體、抗-SM核抗原抗體)。Coutran等人，疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)(Pathologic Basis of Disease)第4版(1989)。
現(xiàn)已提出幾種可能治療SLE的方法。一種方法為與無免疫原性載體偶聯(lián)的dsON的使用，也稱為平臺療法。已經(jīng)證明，合成的dsON與抗-dsDNA抗體有交叉反應(yīng)(美國專利號5,276,013)。例如，由連接至聚乙二醇效價平臺的4個dsON構(gòu)成的四價偶聯(lián)物L(fēng)JP249被用于證實在免疫的小鼠模型系統(tǒng)中的耐受性(Jones等人(1994)，生物偶聯(lián)物化學(xué)(BioconiugateChem.)5390-399)。另一偶聯(lián)物，LJP394，為由連接至平臺的4個dsON構(gòu)成的四價偶聯(lián)物，在BXSB實驗小鼠狼瘡腎炎模型中被證明可以延緩腎病的進(jìn)展并延長生存(Plmkett等人(1995)狼瘡(Lupus)4S99；Coutts等人(1996)狼瘡(Lupus)5158-159)。LJP394在患有SLE的人中也被證明可降低抗-dsDNA抗體(Weisman等人(1997)風(fēng)濕病學(xué)雜志(J.rheumatol.)24314-318)。
其它可用于治療SLE的方法也已經(jīng)被描述，包括通過誘導(dǎo)B細(xì)胞耐受降低循環(huán)抗體水平的方法，包括但并不限于，美國專利號5,276,013、5,391,785、5,786,512、5,726,329、5,552,391、5,268,454、5,606,047、5,633,395、5,162,515、6,022,544；美國系列號08/118,055(美國專利號6,060,056)；美國系列號60/088,656和60/103,088(美國系列號09/328,199和PCT申請?zhí)朠CT/us99/13194)。
盡管SLE被普遍認(rèn)為是自身免疫病，其病因依然未知。據(jù)認(rèn)為，B細(xì)胞表達(dá)的人補(bǔ)體受體1和2(hCR1和hCR2)與SLE有一定關(guān)系。在患有SLE的患者中，利用hCR1和hCR2的單克隆抗體通過流式細(xì)胞術(shù)測量可常規(guī)觀察到hCR1和hCR2(CD21)的異常表達(dá)，水平為非SLE患者的約50％。參見例如Wilson，J.G.等人，Arthritis Rheum.(1986)29739；Levy，E.J.免疫學(xué)臨床實驗(Clin.Exp.Immunol.)(1992)90235；以及Marquart，H.V.等人，免疫學(xué)臨床實驗(Clin.Exp.Immunol.)(1995)10160。
人CD21或者補(bǔ)體受體2(CR2)為約145-150kDa的膜糖蛋白，其主要在成熟B淋巴細(xì)胞上表達(dá)。Tedder，T.F.等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)(1984)133678。人CD21是補(bǔ)體片斷C3d、C3dg和iC3b以及Epstein-Barr病毒(EBV)的受體。Weis，J.J.等人，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)81881和Fingeroth，J.D.等人，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)814150。CD21由約15到16個胞外短共有重復(fù)(SCR)(每一個有約60到70個氨基酸)、約24個氨基酸的跨膜區(qū)和約34個氨基酸的短胞質(zhì)部分。在小鼠中，CR2和CR1由同一基因經(jīng)可變剪切產(chǎn)生，而在人中CR2和CR1是不同基因的唯一產(chǎn)物。
CD21與CD81和CD19形成非共價受體復(fù)合體，這在B細(xì)胞活化中非常重要。在成熟B細(xì)胞上，CD21在通過多聚C3d發(fā)生交聯(lián)后傳導(dǎo)共刺激信號。Melchers，F(xiàn).等人，自然(Nature)(1985)317264。據(jù)認(rèn)為，短共有重復(fù)1和2(SCR1和/或SCR2)是CD21中特異性識別C3d的部分。據(jù)認(rèn)為，通過提供B細(xì)胞抗原受體和它的共受體之間的橋梁，補(bǔ)體片斷(例如C3d)結(jié)合至CD21在B細(xì)胞應(yīng)答中起著非常重要的作用，這可使B細(xì)胞對抗原的敏感性提高100到10,000倍。Janeway和Travers，免疫生物學(xué)(Immunobiology)第三版，(1997)843。
已經(jīng)描述了幾種CD21的結(jié)合劑的組合物，其涉及補(bǔ)體或者B細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。一種組合物涉及設(shè)計用于結(jié)合補(bǔ)體片斷的重組融合蛋白質(zhì)。參見例如WO91/16437。已經(jīng)描述的另一組合物涉及內(nèi)皮細(xì)胞上B細(xì)胞受體的結(jié)合劑。這些B細(xì)胞受體包括CD11b、CD11c、CD21、CD23、70到85kDa蛋白質(zhì)或者115kDa蛋白質(zhì)。參見例如WO96/12742、WO96/12741或者EP 0788513。另一組合物涉及人CD21的小鼠單克隆抗體。該小鼠單克隆抗體能夠抑制Epstein-Barr病毒感染表達(dá)CD21的細(xì)胞。此外，它也能夠干擾C3dg包被的抗原向濾泡樹突細(xì)胞和B細(xì)胞的遞送。參見例如Prodinger等人(1998)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1614604、美國專利號6,291,239(Prodinger等人)、EP1001021(Prodinger等人)、Guthridge等人(2001)1675758。也參見WO 01/92295(Isenman和Clemenza)、美國專利號5,552,381(Atkinson)和5,719,127(Atkinson等人)、WO00/67796(Curd等人)、WO96/12742(Bonnefoy和LeCoanet-Henchoz)、美國專利號6,238,670(Fearon和Dempsey)、WO 91/16437(Hebell和Fearson)、EP 528926(Hebell和Fearon)。
其它文獻(xiàn)描述了在抗體應(yīng)答中小鼠補(bǔ)體受體的參加。參見例如Wiersma，E.J.等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)(1991)212501-2506和Takahashi，K.等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)(1997)1591577-1569。其它文獻(xiàn)描述了在小鼠SLE模型中可能參予B細(xì)胞活化的淋巴細(xì)胞表面受體的研究。參見例如Early，G.S.等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)(1996)1573159-3164；和Mihara，M.等人(2000)(J.Clin.Invest.)10691-101。
盡管這些研究調(diào)查了B細(xì)胞活化受體CD40和CD152在SLE小鼠模型中的參予情況，但有關(guān)CD21在正在進(jìn)行的免疫應(yīng)答中的作用的研究依然有限。
目前需要能夠抑制不想要的抗體應(yīng)答的改進(jìn)方法。也需要治療自身免疫病(如SLE)患者的改進(jìn)方法和延緩個體中自身免疫病(如SLE)發(fā)展的改進(jìn)方法。于此提供的本發(fā)明滿足了這些需要。
于此引用的所有專利、專利申請和出版物特此全部引用作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療患有抗體介導(dǎo)的病變例如自身免疫病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、ITP或甲狀腺炎)的個體的方法，其包括向該個體施用有效量的干擾C3d結(jié)合CD21的藥劑，由此緩解抗體介導(dǎo)的病變的癥狀(即至少一種癥狀得以緩解和/或延緩)。
另一方面，本發(fā)明提供延緩個體中與抗體介導(dǎo)的病變(例如SLE、ITP或甲狀腺炎等自身免疫病)相關(guān)的癥狀發(fā)展的方法，其包括向該個體施用有效量的干擾C3d結(jié)合CD21的藥劑，由此延緩抗體介導(dǎo)的病變的癥狀。
所述癥狀可以是與抗體介導(dǎo)的病變相關(guān)的任何一種或多種癥狀。
附圖簡述

圖1描繪在致敏后14天和加強(qiáng)及利用PBS(對照動物)或可溶性CD21(sCD21，實驗動物)處理后7天小鼠中抗寡核苷酸(ON)IgG水平。
圖2描繪在加強(qiáng)免疫及利用PBS(對照動物)或抗-CD21單克隆抗體7G6(mAb；實驗動物)處理后14天小鼠中抗寡核苷酸(ON)IgG水平。
圖3描繪在對照(PBS)和抗-CD21(mAb 7G6)處理小鼠中抗Galα1-3Gal雙糖(即雙半乳糖)IgM和IgG的平均水平(±1個標(biāo)準(zhǔn)差或s.d.)。
圖4為Kaplan-Meier曲線，該曲線顯示出利用環(huán)磷酰胺、大鼠抗小鼠7G6或者兩者處理的NZB×NZW(F1)小鼠的存活結(jié)果。
發(fā)明詳述利用多種抗體介導(dǎo)的病變的本領(lǐng)域公認(rèn)模型，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抑制CD21與C3d相互作用可以阻抑抗體的產(chǎn)生?？贵w介導(dǎo)的病變包括但并不限于自身免疫病、異種移植和移植物抗宿主疾病?；趯嶒灲Y(jié)果，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用藥劑(包括但并不限于抗CD21單克隆抗體)抑制或干擾CD21與C3d的相互作用可以抑制抗體介導(dǎo)的病變中的抗體(例如在自身免疫病如SLE中的抗dsDNA抗體)水平。
因此，本發(fā)明提供利用抑制CD21與C3d相互作用的藥劑來治療抗體介導(dǎo)的病變?nèi)缱陨砻庖卟?如SLE)的方法，據(jù)推測，所述抑制可以在抗體介導(dǎo)的病變中阻止非期望的應(yīng)答。此外，本發(fā)明也提供延緩抗體介導(dǎo)的病變(如SLE)發(fā)展的方法，其通過向個體施用有效量的一種或多種可抑制CD21與C3d相互作用的藥劑而使抗體介導(dǎo)的病變的癥狀得以緩解，據(jù)推測所述抑制可以阻止B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。
一般技術(shù)除非另有指明，本發(fā)明的實施將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的闡釋，例如分子克隆實驗室指南(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主編，1984)；動物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)(R.I.Freshnev主編，1987)；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(學(xué)院出版公司)；實驗免疫學(xué)手冊(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell主編)；哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)(J.H.Miller和M.P.Calos主編，1987)；當(dāng)前分子生物學(xué)實驗方法(Current Protocols in Moleculor Biology)(F.M.Ausubel等人主編，1987)；PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRThe PolymeraseChain Reaction)(Mullis等人主編，1994)；當(dāng)前免疫學(xué)方法(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人主編，1991)以及精編分子生物學(xué)實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)。
定義“抗體”(可互換地使用復(fù)數(shù)形式)是能夠特異性結(jié)合靶(例如碳水化合物、多核苷酸或多肽)的免疫球蛋白分子，所述結(jié)合通過位于該免疫球蛋白分子可變區(qū)中的至少一個抗原識別位點完成。正如于此所使用的，該術(shù)語不僅包括完整抗體，還包括它的片斷(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)、突變體、含有抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化抗體，以及含有具有所需特異性的抗原識別位點的任何其它修飾構(gòu)型的免疫球蛋白分子。抗體包括任何種類的抗體，如IgG、IgA或者IgM，并且抗體不需要屬于任何特定種類。
“單克隆抗體”是指同質(zhì)抗體群，其中單克隆抗體由參與選擇性結(jié)合抗原的氨基酸(天然存在和非天然存在)組成。單克隆抗體具有針對單個的抗原性位點的高度特異性。術(shù)語“單克隆抗體”不僅僅包括完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，還包括它的片斷(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)、突變體、含有抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人單克隆抗體、嵌合(如人源化)單克隆抗體，以及含有具有所需特異性并能夠結(jié)合至抗原的抗原識別位點的任何其它修飾構(gòu)型的免疫球蛋白分子。上述無意限制抗體的來源和抗體產(chǎn)生的方式(例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動物等等)。
“人源化”抗體是指具有抗原結(jié)合位點(例如互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)的分子，其基本上來源于非人物種的免疫球蛋白，而該分子的剩余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列?？乖Y(jié)合位點可以包含融合至恒定區(qū)上的完整可變區(qū)或者僅是移植至可變結(jié)構(gòu)域中的適當(dāng)框架區(qū)上的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點可以是野生型的或者經(jīng)一個或多個氨基酸替代修飾的，例如修飾以使其與人免疫球蛋白更為相似。一些形式的人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有所有6個來自小鼠抗體的CDR的人源化小鼠抗體)。其它形式的人源化抗體具有一個或多個相對于原初抗體發(fā)生改變的CDR。
于此使用的“抗體介導(dǎo)的病變”或“抗體介導(dǎo)的疾病”是指免疫應(yīng)答病癥，其中一種或多種病理(包括癥狀)與不適當(dāng)?shù)暮?或非期望的抗體產(chǎn)生相關(guān)，更具體地由不適當(dāng)?shù)暮?或非期望的抗體產(chǎn)生(直接或間接)引起。因為免疫應(yīng)答病癥是背景依賴性的，對本發(fā)明而言，“抗體介導(dǎo)的病變”可以包括自身免疫病，并且也可以包括移植排斥(尤其是異種移植排斥和移植物抗宿主疾病)和妊娠期間的基于Rh的排斥，其中在移植排斥中，對試圖維持外源移植組織的努力而言，免疫應(yīng)答是不適當(dāng)?shù)摹？贵w介導(dǎo)的病變也包括在基因療法中與不恰當(dāng)?shù)目贵w產(chǎn)生相關(guān)的病理。抗體介導(dǎo)的病變也包括對治療劑(例如治療性蛋白質(zhì))的有害的或非期望的免疫應(yīng)答。這些蛋白質(zhì)的例子包括干擾素和肝素(其可以導(dǎo)致肝素誘導(dǎo)的血小板減少)。參見例如Perini(2001)Eur.Cytokine Netw.1256-61；Amiral等人(1998)血小板(Platelets)977-91。
于此可互換使用的“抗體介導(dǎo)的自身免疫病變”、“抗體介導(dǎo)的自身免疫病”或者“自身免疫病”是針對自身抗原產(chǎn)生了異常量抗體的免疫應(yīng)答。抗體介導(dǎo)的自身免疫病變包括但并不限于自身免疫病，例如系統(tǒng)性紅斑性狼瘡(SLE)、抗體介導(dǎo)的血栓形成、血小板減少癥(如ITP)、抗磷脂綜合癥(APS)、甲狀腺炎、系統(tǒng)性硬皮病、多肌炎和重癥肌無力。
于此使用的“自身免疫”是指針對自身抗原的免疫應(yīng)答。
于此使用的“自身抗體”是指針對自身抗原的抗體。自身抗原包括但并不限于核酸(如雙鏈DNA或RNA、單鏈DNA或RNA，或者它們的任何組合)、核蛋白質(zhì)(如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、著絲粒、Jo-1、組氨酰-tRNA合成酶、蘇氨酰-tRNA合成酶、PM-1、Mi-2、組蛋白和染色質(zhì))、細(xì)胞受體(例如乙酰膽堿受體、促甲狀腺激素受體)、細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如心磷脂或β2 GPI)、RNA蛋白質(zhì)復(fù)合體(例如RNP和Sm)、紅細(xì)胞和血小板糖蛋白(GP)受體復(fù)合體(例如IIb-IIIa和Ib)。
于此使用的術(shù)語“藥劑”是指生物學(xué)或化學(xué)化合物，例如簡單或復(fù)雜的有機(jī)或無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物或抗體片斷。多種化合物可由人工合成，例如寡聚體(例如寡肽和寡核苷酸)和基于多種核心結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物，這些也包括在術(shù)語“藥劑”之內(nèi)。在動物中產(chǎn)生的或者由重組合成的或通過噬菌體展示產(chǎn)生的抗體也包括在術(shù)語“藥劑”之內(nèi)。另外，多種天然來源可以提供供篩選的化合物，例如植物或動物提取物等等?；衔锟梢赃M(jìn)行測試和/或單獨或彼此聯(lián)合使用。
“抑制或阻抑CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化”的藥劑是指可以降低CD21/C3d介導(dǎo)的——由與C3d的相互作用介導(dǎo)的——B細(xì)胞活化程度的藥劑(即與C3d存在而藥劑不存在時CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化程度相比，在藥劑和C3d存在的條件下CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化程度減少)。B細(xì)胞活化的抑制可以是B細(xì)胞活性的部分減少，例如抗體產(chǎn)生的減少。對CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化的抑制或阻抑可以是部分或者完全的。指示CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化的方法為本領(lǐng)域所公知并于此描述。應(yīng)當(dāng)理解的是，“B細(xì)胞活化”包括靜息B細(xì)胞的活化、非抗體分泌B細(xì)胞的活化和已經(jīng)活化的B細(xì)胞(例如漿細(xì)胞)的活化狀態(tài)的維持和/或增強(qiáng)?？梢种艭D21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化的藥劑的例子包括但并不限于，抑制CD21與C3d相互作用的抗體(可以針對CD21中與C3d天然結(jié)合的區(qū)域)、競爭性抑制劑(可以結(jié)合至C3并競爭對CD21的結(jié)合)、可溶性蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)和小分子。對本發(fā)明方法而言，于此描述的藥劑可以抑制或阻抑CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化。
“干擾C3d結(jié)合至CD21”或“阻抑C3d結(jié)合至CD21”的藥劑是指與除了不加藥劑外的相同條件相比，可以使C3d配體與CD21的相互作用程度減小的藥劑。確定C3d與CD21結(jié)合的方法在本文中公開。當(dāng)恰當(dāng)?shù)厥┯脮r，“干擾C3d結(jié)合至CD21”的藥劑可以降低抗體(如抗dsDNA抗體)的水平。
正如于此所使用的，當(dāng)術(shù)語“抑制”、“阻抑”、“封閉”和“干擾”用于指CD21和C3d之間相互作用的情況時，這些術(shù)語意味著由于可以阻礙CD21與C3d之間發(fā)生相互作用的藥劑的施用，CD21與C3d之間的相互作用從被限制到被完全封閉?！耙种啤被颉白枰帧盋D21/C3d介導(dǎo)的抗體產(chǎn)生是指減少(可包括消除)這種抗體的產(chǎn)生。
“可溶性CD21”或“sCD21”于此可互換地使用，并且是指CD21的可溶(即非膜結(jié)合)形式。CD21可以利用重組技術(shù)產(chǎn)生或從細(xì)胞中分離(如CD21釋放)。可溶性CD21也可以以多種長度形式存在，只要能夠結(jié)合C3d即可，其可以是全長CD21的截短形式或片斷。
于此使用的“C3d”是指作為補(bǔ)體途徑的一部分生成的補(bǔ)體片斷。正如本領(lǐng)域所公知，血漿中存在大量的C3。作為經(jīng)典補(bǔ)體途徑的一部分，C3被C3轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化為C3a和C3b。iC3b是C3b的衍生物并且例如，當(dāng)作為調(diào)理作用的一部分結(jié)合至病原時，其可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镃3dg。作為補(bǔ)體旁路途徑的一部分，C3通過自發(fā)裂解(有時稱為“空轉(zhuǎn)tickover”)以相當(dāng)大的速率產(chǎn)生C3b。C3b可以與因子I相互作用，所述因子I為絲氨酸蛋白酶，其以活性形式存在于循環(huán)系統(tǒng)中并將C3b首先裂解成iC3b并且隨后將其進(jìn)一步裂解成C3dg。C3dg可以被進(jìn)一步降解產(chǎn)生C3d。C3d和C3dg都可以結(jié)合至CD21。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中C3d和C3dg可以互換地使用。提及C3d應(yīng)理解為也包括C3dg和iC3b。iC3b包括C3dg和C3d的氨基酸序列并且以相似的親合性結(jié)合CD21。iC3b經(jīng)蛋白酶裂解產(chǎn)生C3dg。C3dg在其羧基末端具有幾個額外的氨基酸，經(jīng)細(xì)胞蛋白酶裂解后生成C3d。C3d的結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域公知(參見例如，Nagar，B.等人，科學(xué)(Science)1998，280，1277-1281)。C3d可以利用重組技術(shù)產(chǎn)生(例如利用諸如Genbank等資源中已出版的序列)或者可以從商業(yè)來源得到純化形式(Calbiochem-Novabiochem；San Diego，CA，目錄號#204870)。
于此使用的“治療”是指為獲得有益或期望結(jié)果而采取的方法，所述結(jié)果包括并優(yōu)選臨床結(jié)果。對本發(fā)明而言，有益或期望的臨床結(jié)果包括但并不限于下列中的一種或多種降低抗體(如抗-雙鏈DNA抗體)產(chǎn)生水平(包括產(chǎn)生水平和/或循環(huán)水平)、緩和以下所列的與抗體介導(dǎo)的病變(例如自身免疫病如SLE、甲狀腺炎、異種移植排斥、重癥肌無力、APS、系統(tǒng)性硬皮病、ITP和多肌炎)相關(guān)的一種或多種癥狀、減小抗體介導(dǎo)的病變的程度、穩(wěn)定抗體介導(dǎo)的病理狀況(即未惡化)、阻止抗體介導(dǎo)的病變的發(fā)生或復(fù)發(fā)、延緩抗體介導(dǎo)的病變的發(fā)展、延緩或減慢抗體介導(dǎo)的病理、改善抗體介導(dǎo)的病變、產(chǎn)生緩解作用(部分或全部)、減少抗體介導(dǎo)的病變和/或與抗體介導(dǎo)的病變相關(guān)的癥狀的發(fā)生。
SLE的治療包括SLE的任何方面，包括但并不限于，免疫學(xué)病癥(例如陽性紅斑狼瘡細(xì)胞制備、異常效價的針對天然DNA的抗-DNA抗體、抗-SM核抗原抗體、抗-β2GPI抗體)、皮疹、光過敏、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、腎病(例如蛋白尿)、神經(jīng)系統(tǒng)病癥(例如癲癇發(fā)作或精神病)、血液病(例如溶血性貧血、白細(xì)胞減少癥、淋巴細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、繼發(fā)性血小板減少性紫癜)，或者狼瘡性腎炎一這是一種慢性炎性腎臟疾病。當(dāng)發(fā)生狼瘡性腎炎時，可能會出現(xiàn)“活動(flare)”。“活動”是指活性的增加，一般指炎性活性。如果活性出現(xiàn)在腎臟內(nèi)，那么活動稱作“腎活動”?！澳I活動”可以通過下列評價因素鑒定，其包括但并不限于蛋白尿水平、血尿水平和血清肌酸酐水平。狼瘡性腎炎的“治療”可在狼瘡性腎炎的癥狀未出現(xiàn)時進(jìn)行，并且這種治療(正如“治療”(定義)所指出的)將降低活動的發(fā)生率。“狼瘡的治療”或“SLE的治療”也包括狼瘡(例如狼瘡性腎炎)任一方面的病理學(xué)后果的減輕。
甲狀腺炎的治療包括甲狀腺炎的任一方面，其包括但并不限于，慢性炎性細(xì)胞的過度浸潤、濾泡破裂、嗜曙紅細(xì)胞過多、不同程度的增生、纖維化、無痛性甲狀腺腫和甲狀腺機(jī)能減退。與異種移植相關(guān)的抗體介導(dǎo)的病變的治療包括異種移植的任何方面，包括但并不限于，外源組織排斥的減少或消除、針對移植組織的抗體效價的降低和移植物抗宿主反應(yīng)的減少或消除。重癥肌無力的治療包括重癥肌無力的任何方面，包括但并不限于，骨骼肌無力、易疲勞、不對稱上眼瞼下垂、復(fù)視、頸伸肌無力、頭下垂、由于面部肌肉和球肌無力所致的當(dāng)患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構(gòu)音障礙的低音量發(fā)音困難、可導(dǎo)致氣阻或反胃的吞咽困難，以及可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力。系統(tǒng)性硬皮病的治療包括系統(tǒng)性硬皮病的任何方面，其包括但并不限于手指和手掌的腫脹和增厚并可能累及面部，皮膚的增厚，累及軀干和臨近肘部的臂，皮膚萎縮并可能脫發(fā)、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性丟失；皮包骨，其中皮膚緊繃并緊結(jié)合在下面的結(jié)構(gòu)上；以及有限的運動性，尤其是手指。ITP的治療包括ITP的任何方面，包括但并不限于下肢存在瘀斑、輕微臨床出血(包括紫癜、鼻衄、牙齦出血、月經(jīng)過多)、脾不顯以及在幾種血小板減少癥情況下嘴中血泡。多肌炎的治療包括多肌炎的任何方面，包括但并不限于，主要骨骼肌無力、相鄰肌肉無力、吸入性肺炎、間質(zhì)性肺病、軟組織鈣化和雷諾氏現(xiàn)象。APS(也可以包括抗體介導(dǎo)的血栓形成)的治療包括APS的任何方面，包括但并不限于動脈閉塞、四肢壞疽、中風(fēng)、心肌梗死、其它內(nèi)臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內(nèi)臟靜脈閉塞(如巴-希綜合癥、門靜脈閉塞)、習(xí)慣性流產(chǎn)、血小板減少癥、庫姆斯陽性溶血性貧血、網(wǎng)狀青斑、神經(jīng)系統(tǒng)異常(如舞蹈癥、短暫性局部缺血發(fā)作)、心瓣性心臟病以及突發(fā)性多系統(tǒng)動脈閉塞。
“減輕”抗體介導(dǎo)的病變或者一種或多種抗體介導(dǎo)的病變的癥狀是指根據(jù)本發(fā)明利用干擾CD21/C3d相互作用的藥劑治療的個體或個體群在抗體介導(dǎo)的病變的非期望臨床表現(xiàn)的程度和/或時程上出現(xiàn)減少。
抗體介導(dǎo)的病變的“癥狀嚴(yán)重性的降低”或者“癥狀的改善”是指與未施用干擾CD21/C3d相互作用的藥劑時相比，抗體介導(dǎo)的病變的一種或者多種癥狀得以減輕或者改善。“降低嚴(yán)重性”也包括癥狀持續(xù)時間的縮短或減少?？贵w介導(dǎo)的病變?nèi)缱陨砻庖卟?如SLE)、APS、ITP、甲狀腺炎、異種移植排斥、移植物抗宿主疾病、系統(tǒng)性硬皮病、重癥肌無力和多肌炎的癥狀描述如上并可以包括生存期(增加的總生存期作為改善的癥狀)。
于此使用的對抗體介導(dǎo)的病變發(fā)展的“延緩”是指對抗體介導(dǎo)的病變發(fā)展的推遲、阻礙、延緩、延遲、穩(wěn)定和/或延期。依賴于抗體介導(dǎo)的病變的病史和/或接受治療的個體，這種延緩可以有不同的時間長度。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，充分的或者顯著的延緩實際上包括預(yù)防，由此個體不發(fā)生抗體介導(dǎo)的病變。一種“延緩”抗體介導(dǎo)的病變發(fā)展的方法為當(dāng)與未利用該方法相比時，在給定的期限內(nèi)降低與抗體介導(dǎo)的病變相關(guān)的病理或癥狀的發(fā)展可能性和/或在給定期限內(nèi)降低疾病程度。這些比較通常(但不是必須)基于臨床研究，利用具統(tǒng)計意義的大量受試者進(jìn)行。例如，基于這種治療可以降低個體出現(xiàn)一種或多種抗體介導(dǎo)的病變癥狀的危險的觀點(無論有無臨床研究的基礎(chǔ))，臨床醫(yī)師可以決定對“危險”個體使用本發(fā)明方法。
抗體介導(dǎo)的病變的“發(fā)展”是指個體中抗體介導(dǎo)的病變(如自身免疫病)的發(fā)作和/或進(jìn)展?？贵w介導(dǎo)的病變(包括自身免疫病)的發(fā)展可以利用于此所述的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)檢測。然而，發(fā)展也指最初可能不能檢測的疾病進(jìn)展。對本發(fā)明而言，進(jìn)展是指疾病狀態(tài)的生物學(xué)過程，包括例如抗體(包括自身抗體)的形成?！鞍l(fā)展”包括發(fā)生、復(fù)發(fā)和發(fā)作。于此使用的抗體介導(dǎo)的病變的“發(fā)作”或“發(fā)生”包括最初的發(fā)作和/或復(fù)發(fā)。
于此使用的“危險”個體是指被認(rèn)為更可能發(fā)展抗體介導(dǎo)的病變的個體?！拔ｋU”個體可以具有或者不具有可檢測疾病，并且在利用于此描述的方法治療之前可以展示或者不展示可檢測的病癥。“危險”表示個體具有一種或者多種的所謂的危險因素。具有一種或者多種的這些危險因素的個體比無這些危險因素的個體有更高可能性發(fā)展出一種或者多種自身免疫病。這些危險因素可以包括但并不限于，發(fā)展一種或者多種抗體介導(dǎo)的病變的家族史、既往病史、年齡、性別、種族、飲食、前病癥的存在、基因(即遺傳)因素、所處環(huán)境、對SLE而言發(fā)生面頰疹和蝶形疹的病史，或者對APS而言習(xí)慣性流產(chǎn)的病史。另一個“危險”個體的例子是正在或者將要接受可以引起非希望抗體應(yīng)答的治療劑或療法的人體?！拔ｋU”個體是適宜接受本發(fā)明方法的個體的例子。
“表位”為本領(lǐng)域所熟知的術(shù)語，并且是指展示出可與抗體特異性結(jié)合的任何化學(xué)部分?！氨砦弧币部梢园乖?，即含有表位并且同樣也可特異性結(jié)合至抗體的部分或分子。
“雙鏈DNA表位”或者“dsDNA表位”是展示出可與抗-雙鏈DNA抗體特異結(jié)合的任何化學(xué)部分，并且同樣包括含有這些表位的分子。
“特異性結(jié)合”至抗體的表位是本領(lǐng)域所熟知的術(shù)語，并且確定這種特異性結(jié)合的方法為本領(lǐng)域所公知。如果與另外的細(xì)胞或者物質(zhì)相比，分子能夠更頻繁、更快速、更持久地和/或以更大的親和力與特定細(xì)胞或者物質(zhì)反應(yīng)或者結(jié)合，那么該分子被認(rèn)為展示出“特異性結(jié)合”。如果與抗體結(jié)合至其它物質(zhì)相比，抗體與靶的結(jié)合具有更大的親和力、親合性、更容易和/或更持久，那么抗體“特異性結(jié)合”至靶。正如本領(lǐng)域所公知，檢測特異性結(jié)合的一種方法是競爭測定，見于此所述。
于此可互換地使用的“抗-雙鏈DNA抗體”或“抗-dsDNA抗體”或“雙鏈DNA抗體”是指特異性結(jié)合至雙鏈DNA(dsDNA)的任何抗體。類似地，于此可互換地使用的“抗-乙酰膽堿受體抗體”或“抗-AchR抗體”是指特異性結(jié)合乙酰膽堿受體的任何抗體。于此可互換地使用的“抗-促甲狀腺激素受體抗體”或“抗-TSH受體抗體”是指特異性結(jié)合促甲狀腺激素受體的任何抗體?！翱?Gal α1-3 Gal抗體”為在異種移植排斥中與α-半乳糖部分結(jié)合的任何抗體。應(yīng)當(dāng)理解，核蛋白質(zhì)(如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、著絲粒、組蛋白、染色質(zhì)、Jo-1、組氨酰-tRNA合成酶、蘇氨酰-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2)或細(xì)胞受體(如乙酰膽堿受體、促甲狀腺激素受體)或者細(xì)胞蛋白質(zhì)(如心磷脂)可以成為抗體的“靶”并于此將此抗體稱為“抗‘靶’抗體”。另外，針對基因療法載體(如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等等)的抗體也包括在“抗‘靶’抗體”中。
正如在此處提供的“抗體”定義中所清楚地指明的，“抗-雙鏈DNA抗體”或于此所描述的任何抗體包括可以展示出該必要功能性質(zhì)(即特異性結(jié)合至dsDNA)的任何片斷，例如包含可變區(qū)的片斷，如Fab片斷，并且這一原則適用于此處描述的所有抗體。正如如下所討論的，應(yīng)當(dāng)理解，對任何抗雙鏈DNA抗體(或功能性片斷)的特異結(jié)合是充分的。
術(shù)語“循環(huán)抗體”是指未與生物學(xué)樣品之上和/或之中它的關(guān)聯(lián)表位相結(jié)合的抗體，即游離抗體。例如，術(shù)語“循環(huán)自身免疫抗體”是指未與生物學(xué)樣品上和/或中它的關(guān)聯(lián)表位相結(jié)合的自身免疫抗體，即游離抗體。在另一例子中，術(shù)語“循環(huán)抗-雙鏈(ds)DNA抗體”是指未與生物學(xué)樣品上和/或中的雙鏈DNA表位結(jié)合的抗雙鏈DNA抗體，即游離抗體。
于此使用的術(shù)語“免疫原”是指當(dāng)注射至動物體內(nèi)時引起體液免疫應(yīng)答的化學(xué)實體。免疫原具有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。
“T細(xì)胞表位”是指這樣的組分或其一部分，T細(xì)胞對其具有抗原特異性結(jié)合位點，其與該位點的結(jié)合將導(dǎo)致T細(xì)胞活化。當(dāng)本發(fā)明實施方案被描述為“缺少”T細(xì)胞表位時，這表示利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)測定方法不能檢測到T細(xì)胞表位。對本發(fā)明而言，“缺少”T細(xì)胞表位的表位是指該表位缺少在待治療個體(即接受呈遞表位的效價平臺分子的個體)中引起T細(xì)胞活化的T細(xì)胞表位。例如，一個表位可能對某一或者某群個體而言缺少T細(xì)胞表位，而對其它個體而言可能具有T細(xì)胞表位。檢測T細(xì)胞表位存在的方法為本領(lǐng)域所公知并包括檢測T細(xì)胞增殖(如胸苷摻入)的試驗。不能統(tǒng)計學(xué)顯著地誘導(dǎo)大于本底的胸苷摻入(即利用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計方法，一般p小于0.05)的免疫原一般被認(rèn)為缺少T細(xì)胞表位，但應(yīng)當(dāng)明了，所確定的胸苷摻入量可隨所測試的免疫原的不同而不同。通常，刺激參數(shù)小于約2-3，更優(yōu)選小于約1表示缺少T細(xì)胞表位。T細(xì)胞表位的存在也可以通過利用標(biāo)準(zhǔn)方法測量T細(xì)胞來源的淋巴因子的分泌來確定。T細(xì)胞表位的定位和含量(如果存在)可以通過經(jīng)驗確定。應(yīng)當(dāng)理解，隨著時間的推移會發(fā)展出更為敏感的測定試驗來檢測T細(xì)胞表位的存在，并且對T細(xì)胞表位缺少的限定取決于所用檢測系統(tǒng)的類型。
于此可互換地使用的術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”是指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸)的多聚體形式。這些術(shù)語包括單-、雙-或者三鏈DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體或者包含嘌呤和嘧啶堿基或者其它天然的、化學(xué)、生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的多聚體。應(yīng)當(dāng)理解，于此描述的雙鏈多核苷酸序列也包括于此描述的修飾物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基團(tuán)(正如一般在RNA或DNA中所發(fā)現(xiàn)的)，或者修飾或取代的糖或磷酸基團(tuán)。另外，多核苷酸的骨架可以包含合成亞單位如氨基磷酸酯的多聚體，并且因此可以形成寡聚脫氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混和的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚體。硫代磷酸酯連接可以代替磷酸二酯連接。另外，雙鏈多核苷酸還可以通過如下方式獲得自化學(xué)合成的單鏈多核苷酸產(chǎn)物，所述方式為合成互補(bǔ)鏈并在適當(dāng)條件下退火，或者利用適當(dāng)?shù)囊?、使用DNA聚合酶從頭合成互補(bǔ)鏈。以下所列為多核苷酸的非限制性例子基因或基因片斷、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、具任何序列的分離的DNA、具任何序列的分離的RNA、核酸探針以及引物。
正如于此所使用，“DNA”不僅僅包括A、T、C和G，也包括任何它們的類似物或這些堿基的修飾形式，例如甲基化核苷酸、核苷酸間修飾例如不帶電荷的連接和硫代酯(thioate)、糖類似物的使用以及修飾的和/或其它的骨架結(jié)構(gòu)，如聚酰胺。
“基本同源”是指序列同源，其中利用下述的一個序列比較算法或通過肉眼觀察，在比較和比對達(dá)到最大對應(yīng)性時，至少50％的序列相同，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少80％，并且更優(yōu)選至少90％的核苷酸或者氨基酸殘基相同?？梢员容^兩個序列(氨基酸或核苷酸)的全長(例如，如果它們實質(zhì)上長度不同，全長是指兩者之間較短者的長度)。對序列比較而言，一般一個序列作為參考序列，測試序列與其相比較。當(dāng)利用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機(jī)，指定子序列座標(biāo)(如果需要)，并設(shè)定序列算法的程度參數(shù)。隨后序列比較算法基于設(shè)定的程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。序列比較中的最佳比對可以通過例如Smith和Waterman，高級應(yīng)用數(shù)學(xué)(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源算法，通過Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443(1970)的同源比對算法，通過Pearson和Lipman，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444(1988)的相似性檢索方法，通過這些算則的計算機(jī)化執(zhí)行工具(威斯康星基因軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，基因計算機(jī)組，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通過肉眼觀察(一般參見Ausubel等人，當(dāng)前分子生物學(xué)實驗方法匯編(Current Protocols InMolecular Biology)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，紐約，同上)進(jìn)行。當(dāng)利用任何上述的算法時，針對視窗長度、空位罰分等等使用默認(rèn)參數(shù)。兩個核酸序列或者多肽基本相同的另一個指針是第一多肽(例如第一核酸編碼的多肽)與第二多肽(例如第二核酸編碼的多肽)具有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。因此，例如當(dāng)兩條多肽僅僅由于保守性替代而不同時，那么第一多肽一般基本上與第二多肽相同。
“天然存在”是指內(nèi)源的化學(xué)部分，諸如碳水化合物、多核苷酸或者多肽序列，即天然所發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。對天然存在的部分的加工可以在一步或者多步驟中進(jìn)行，并且這些術(shù)語包括加工的所有階段。相反地，“非天然存在”的部分是指所有其它部分，例如天然不存在的物質(zhì)，例如重組多核苷酸序列和非天然存在的碳水化合物。
當(dāng)多核苷酸，在其原初狀態(tài)或者在利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法操作后，可以轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)生多肽或其片斷，那么稱該多核苷酸“編碼”多肽。對本發(fā)明而言，并且為避免繁瑣地提及互補(bǔ)鏈，這些多核苷酸的反義(或互補(bǔ))鏈也被認(rèn)為編碼該序列；即，“編碼”多肽的多核苷酸序列包括常規(guī)的編碼鏈和互補(bǔ)序列(或鏈)。
“融合蛋白質(zhì)”是指包含處于非天然位置的多個區(qū)域的多肽。這些區(qū)域可能正常存在于分開的蛋白質(zhì)中而在融合多肽中被放置在一起，或者它們可能正常存在于同一蛋白質(zhì)中但在融合多肽中被置于新的排列位置上。融合多肽也可以來自多聚體形式，無論是線性或是分支結(jié)構(gòu)的，例如可以將抗-CD21單克隆抗體的可變區(qū)融合至用于篩選、純化或者觀測用途的標(biāo)記上。
“宿主細(xì)胞”包括可以或者已經(jīng)接受載體或者摻入多核苷酸和/或蛋白質(zhì)的個體細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個宿主細(xì)胞的后代，并且由于天然、隨機(jī)或者有意突變，該后代可以不必與原初親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)上或者在整套基因組DNA上)。宿主細(xì)胞包括體內(nèi)轉(zhuǎn)染了本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞。
“轉(zhuǎn)化”或者“轉(zhuǎn)染”是指外源多核苷酸插入宿主細(xì)胞中，這與插入所使用的方法無關(guān)，所述方法例如脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或者電穿孔。外源多核苷酸可以以非整合載體(例如質(zhì)粒)形式維持，或者可以整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。
“有效量”(對于抗體介導(dǎo)的病變，如自身免疫病的情況)是指足以實現(xiàn)有益或者期望結(jié)果(包括臨床結(jié)果或延緩疾病發(fā)作)的量。有效量可以以一次或者多次施用形式施用。對本發(fā)明而言，于此描述的藥劑(或者包含藥劑的組合物)的有效量通常但不是必需為足以降低具有非期望水平的抗體(例如抗-雙鏈DNA抗體，循環(huán)抗體或者作為免疫復(fù)合體沉積的抗體)的水平的量。對治療而言，于此描述的藥劑(或者包含藥劑的組合物)的“有效量”為足以減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或者延緩抗體介導(dǎo)的疾病的進(jìn)展或者預(yù)防該疾病的量，所述抗體介導(dǎo)的疾病為如自身免疫病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE))，包括由SLE導(dǎo)致的進(jìn)行性炎性腎變性(即狼瘡性腎炎)。對其它抗體介導(dǎo)的疾病例如ITP、甲狀腺炎、重癥肌無力、系統(tǒng)性硬皮病、多肌炎和APS的治療而言，于此所述的藥劑的“有效量”是指足以減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或者延緩這些抗體介導(dǎo)的疾病的一種或多種癥狀的進(jìn)展或者預(yù)防該疾病癥狀的量，所述癥狀包括但并不限于，血小板減少、血泡、慢性炎性細(xì)胞的過度浸潤、移植物抗宿主型外源組織排斥、異種移植排斥、濾泡破裂、嗜曙紅細(xì)胞過多、不同程度的增生、纖維化、無痛性甲狀腺腫、甲狀腺機(jī)能減退、骨骼肌無力、易疲勞、不對稱上眼瞼下垂、復(fù)視、頸伸肌無力、頭下垂、由于面部肌肉和球肌無力所致的當(dāng)患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構(gòu)音障礙的低音量發(fā)音困難、可導(dǎo)致氣阻或反胃的吞咽困難，以及可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力、手指和手掌的腫脹和增厚伴隨面部的可能累及，皮膚的增厚、累及軀干和臨近肘部的臂、皮膚萎縮及可能的脫發(fā)、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性喪失；皮包骨，其中皮膚緊繃并緊結(jié)合在下面的結(jié)構(gòu)上；有限的運動性，尤其是手指；主要骨骼肌無力、相鄰肌肉無力、吸入性肺炎、間質(zhì)性肺病、軟組織鈣化、雷諾氏現(xiàn)象的出現(xiàn)、動脈閉塞、四肢壞疽、中風(fēng)、心肌梗死、其它內(nèi)臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內(nèi)臟靜脈閉塞(如巴-希綜合癥、門靜脈閉塞)、習(xí)慣性流產(chǎn)、血小板減少癥、庫姆斯陽性溶血性貧血、網(wǎng)狀青斑、神經(jīng)系統(tǒng)異常(如舞蹈癥、短暫性局部缺血發(fā)作)、心瓣性心臟病以及突發(fā)性多系統(tǒng)動脈閉塞。癥狀也可以包括存活。
“分離的”或者“純化的”多肽或多核苷酸是指其基本上不含有與其天然相關(guān)的物質(zhì)。所謂基本上不合有是指至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％不含有與其天然相關(guān)的物質(zhì)。
“生物學(xué)樣品”包括多種獲得自個體的樣品，其可以用于診斷或監(jiān)測測定。該定義包括血液和其它生物學(xué)來源的流體樣品、實體組織樣品例如活檢樣本或者組織培養(yǎng)物或者來自上述來源的細(xì)胞，以及它們的后代。該定義也包括在獲得后經(jīng)過任何方式操作的樣品，所述操作如用藥劑處理、溶解或者富集某一組分(如蛋白質(zhì)或多核苷酸)。術(shù)語“生物學(xué)樣品”包括臨床樣品，并且也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物學(xué)流體和組織樣品。
“聯(lián)合”是指除施用一種治療模式外還施用另一種治療模式，例如向同一個體施用于此描述的藥劑及另一種藥劑(例如CD40、CTLA-4)。在另一例子中，一種抗-CD21單克隆抗體與另一具有不同序列但針對相同表位(例如SCR1和/或SCR2)的抗-CD21單克隆抗體一起施用。如上所述，“聯(lián)合”是指在一種治療模式施用于個體之前、之中或之后向該個體施用另一種治療模式。
“接受治療”包括初始治療和/或繼續(xù)治療。
“個體”為脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物包括但并不限于農(nóng)畜、運動動物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。
“包含”是指包括。
除非另外指明，于此使用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)意義。例如，抗體包括一種或多種抗體，而“癥狀”是指一種或多種癥狀。
發(fā)明方法對于此描述的所有方法而言，所涉及的組合物例如抑制CD21與C3d相互作用的藥劑也包括含有這些物質(zhì)中的一種或多種的組合物。這些組合物還可以含有適當(dāng)?shù)馁x形劑，例如藥學(xué)可接受的賦形劑(包括緩沖液)，這為本領(lǐng)域所公知。
通過抑制CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化治療抗體介導(dǎo)的病變的方法本發(fā)明提供以產(chǎn)生抗體為特征的抗體介導(dǎo)的病變(例如自身免疫病)的治療方法。該方法涉及抑制或者阻抑CD21/C3d的相互作用，這可以干擾CD21介導(dǎo)的B細(xì)胞活化，特別是，可以干擾能導(dǎo)致抗體產(chǎn)生的CD21/C3d介導(dǎo)的活化，所述抗體產(chǎn)生包括抗體產(chǎn)生和自身抗體產(chǎn)生。
本發(fā)明方法涉及施用抑制CD21/C3d相互作用的藥劑。將表達(dá)CD21的淋巴細(xì)胞(一般為B細(xì)胞)暴露于可抑制CD21/C3d相互作用的藥劑，由此可以抑制CD21介導(dǎo)的B細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生。在一些實施方案中，可以使用天然存在的CD21表達(dá)細(xì)胞(例如B細(xì)胞)。在一些實施方案中，將抑制CD21/C3d相互作用的藥劑以足夠的量施用至個體以抑制CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化以及隨后的抗體產(chǎn)生，通常由此可使一種或多種癥狀得以減輕和/或使疾病的發(fā)展被延緩。
可以通過干擾CD21/C3d相互作用抑制CD21的活化作用并由此抑制CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化和隨后的抗體產(chǎn)生的任何藥劑都是適宜的?？梢砸种艭D21/C3d相互作用并因此降低抗體產(chǎn)生水平(與未使用這些藥劑的抗體產(chǎn)生水平相比)的藥劑也是適宜的。在另一實施方案中，任何可以抑制CD21/C3d相互作用并由此延緩表達(dá)CD21的B細(xì)胞發(fā)育成分泌抗體的漿細(xì)胞的藥劑也是合適的。適用于抑制CD21/C3d相互作用的藥劑包括但并不限于抗-CD21抗體、它的衍生物或片斷，以及細(xì)胞CD21的競爭劑(例如可以結(jié)合C3d的可溶性CD21)。在一個實施方案中，該抗體針對CD21的SCR1和/或SCR2區(qū)域。適宜的藥劑及制備這些藥劑的方法的描述在文本中公開。在另一實施方案中，該藥劑為可溶性CD21分子，其可以結(jié)合至C3d并與細(xì)胞CD21競爭結(jié)合尚未結(jié)合的C3d。
應(yīng)當(dāng)理解，雖然推測地抗體介導(dǎo)的病變的癥狀發(fā)展的改善和/或延緩是由于抑制B細(xì)胞活化和/或抗體產(chǎn)生所致，而這種藥劑的施用可以導(dǎo)致抗體產(chǎn)生的減少，但精確的機(jī)制并不需要明了。任何藥劑只要可以干擾CD21/C3d相互作用并由此可以通過施用而有助于和/或?qū)е逻@種疾病發(fā)展的改善和/或延緩，則對本發(fā)明而言都是適宜的。
CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任何方法檢測。一種可以使用的方法是利用PCR和凝膠電泳檢測VDJ重組。另一種可以用于檢測B細(xì)胞活化的方法是利用流式細(xì)胞術(shù)和B細(xì)胞活化的指示性標(biāo)志，其包括但并不限于CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD39、CD69、CD72、CD75、CD76、CD86、CD97、CD125、CD126、CD130和CD153。
本發(fā)明使用可以抑制CD21/C3d相互作用的藥劑。對這種相互作用的抑制可以阻止B細(xì)胞活化和/或阻抑抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，抗體產(chǎn)生被抑制、阻抑或者降低。因此，在接受治療的個體中抗體的水平可以被降低。這種方法可以用于治療個體的抗體介導(dǎo)的病變，例如自身免疫病(例如SLE)，其通過向個體施用抑制CD21與C3d相互作用的藥劑來進(jìn)行。本方法也可用于延緩個體中抗體介導(dǎo)的病變例如自身免疫病(例如SLE、ITP或者甲狀腺炎)的發(fā)展。在沒有任何自身抗體出現(xiàn)的情況下皮疹(如蝶形疹)、易疲勞、習(xí)慣性流產(chǎn)、言語或微笑困難的發(fā)生可能是隨后而來的自身抗體發(fā)生的征兆。可以在自身抗體出現(xiàn)之前將于此描述的藥劑施用給具有皮疹或其它與SLE相關(guān)的初期癥狀的個體。于此提供的方法也可以用于阻止SLE的復(fù)發(fā)或者長期延緩與SLE相關(guān)的癥狀。
可以使用幾種方法來評價對CD21/C3d相互作用的抑制。這些方法適用于多種可抑制CD21/C3d相互作用的藥劑(例如抗-CD21抗體或可溶性CD21)。一種評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是確定抗-CD21單克隆抗體與B細(xì)胞或其它表達(dá)CD21的細(xì)胞(例如來自接受該抗體治療的個體)的結(jié)合?？贵w與細(xì)胞上CD21的結(jié)合可以利用結(jié)合至抗-CD21的第二抗體直接確定。第二抗體可以偶聯(lián)酶(如辣根過氧化物酶)或熒光染料例如熒光素。應(yīng)當(dāng)理解，第二抗體應(yīng)該針對抗-CD21抗體的動物種類。例如，如果藥劑為小鼠抗-CD21單克隆抗體，那么與觀察標(biāo)志物偶聯(lián)的第二抗小鼠IgG可以用于評價這種結(jié)合?；蛘撸梢酝ㄟ^利用偶聯(lián)了酶或熒光染料的無關(guān)抗-CD21抗體測量CD21的表達(dá)來確定來自接受治療的個體的B細(xì)胞或其它表達(dá)CD21的細(xì)胞上CD21的水平。
另一種可用于評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是使用包被了C3d的ELISA培養(yǎng)板，將ELISA培養(yǎng)板接觸生物學(xué)樣品(例如B細(xì)胞或者其它表達(dá)CD21的細(xì)胞)并計數(shù)結(jié)合至ELISA培養(yǎng)板上的細(xì)胞的數(shù)目。在另一備選方法中，在ELISA培養(yǎng)板上通過比色測定(例如MTT染色)來評價活細(xì)胞表達(dá)的酶。
另一種可以使用的方法為利用抗紅細(xì)胞抗體和補(bǔ)體通過經(jīng)典補(bǔ)體活化途徑利用補(bǔ)體片斷包被紅細(xì)胞(例如綿羊紅細(xì)胞，SRBC)。補(bǔ)體裝飾的SRBC可以從National Jewish Hospital的補(bǔ)體實驗室(Denver，CO)獲得。在不存在抗-CD21抗體的條件下混和補(bǔ)體包被的SRBC和表達(dá)CD21的細(xì)胞，形成“玫瑰花結(jié)”。相反，在存在抗-CD21抗體的條件下混和補(bǔ)體包被的SRBC和表達(dá)CD21的細(xì)胞不形成“玫瑰花結(jié)”，因為抗-CD21抗體與CD21的結(jié)合抑制了CD21結(jié)合至SRBC。這種玫瑰花結(jié)技術(shù)也可以用于評價可溶性CD21抑制CD21/C3d相互作用的能力。另一種可以使用的方法是通過補(bǔ)體旁路途徑的活化，使用在血清中孵育的酵母顆粒來固定補(bǔ)體。隨后酵母顆?？梢耘c表達(dá)CD21的細(xì)胞接觸并監(jiān)測玫瑰花結(jié)的形成。另一種可以使用的方法是通過旁路途徑的活化或者通過與純化的補(bǔ)體片斷直接偶聯(lián)，用補(bǔ)體片段包被熒光乳膠小珠(Molecular Probes，Eagene，Oregon)。小珠與表達(dá)CD21的細(xì)胞的結(jié)合可以通過顯微鏡或者通過流式細(xì)胞術(shù)確定。
另一種可用于評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是從每一個體(在不同增加劑量)獲得生物學(xué)樣品(例如血液)，并且如果需要，通過將全血倒入綿羊紅細(xì)胞(SRBC)中從B細(xì)胞中分離出T細(xì)胞。T細(xì)胞會優(yōu)先結(jié)合至SRBC上，并且T細(xì)胞-SRBC群體具有比B細(xì)胞更大的密度。利用密度離心可以從B細(xì)胞中分離T細(xì)胞-SRBC群體。隨后可以在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中將B細(xì)胞與C3d包被的培養(yǎng)板接觸，如果抗-CD21抗體(或者備選地，可溶性CD21)的水平足夠封閉B細(xì)胞上的所有C3d結(jié)合區(qū)域，那么將幾乎沒有或者完全沒有B細(xì)胞會結(jié)合至C3d包被的培養(yǎng)板上。
另一種可以用于評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是利用偶聯(lián)有可檢測標(biāo)志(例如FITC)的抗-CD21抗體?？梢詮慕邮芰伺悸?lián)有可檢測標(biāo)志的抗CD21抗體的個體中獲得生物學(xué)樣品。利用流式細(xì)胞術(shù)通過在適當(dāng)通道(例如對FITC而言FL1)中監(jiān)測所述可檢測標(biāo)志物，并聯(lián)合第二抗體以確認(rèn)抗-CD21抗體已經(jīng)結(jié)合至B細(xì)胞上來觀察與B細(xì)胞的結(jié)合。一旦確認(rèn)B細(xì)胞具有結(jié)合至其上的抗-CD21抗體，它們就可以與補(bǔ)體包被的SRBC混和并監(jiān)測如上所述的“玫瑰花結(jié)”的出現(xiàn)。
另一種用于評價可以抑制CD21/C3d相互作用的藥劑(例如可溶性CD21或者抗-CD21抗體)對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是競爭測定(例如Farr測定)。其它用于評價可以抑制CD21/C3d相互作用的藥劑(例如可溶性CD21或者抗-CD21抗體)對CD21/C3d相互作用的抑制的方法也可以使用并且它們?yōu)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。
抗體介導(dǎo)的病變例如自身免疫病(例如SLE)的幾種小鼠模型可以用于測試可以抑制CD21/C3d相互作用從而在抗體介導(dǎo)的病變中阻抑抗體應(yīng)答的藥劑(例如抗-CD21抗體或sCD21)。一種模型為自發(fā)狼瘡模型，其利用雌性新西蘭黑×新西蘭白(NZB×NZW)F1小鼠。另一可以使用的模型為MRL lpr/lpr自發(fā)狼瘡模型。MRL lpr/Ipr小鼠發(fā)展出與SLE人類患者相似的癥狀。這些癥狀包括但并不限于高效價的抗-dsDNA抗體、低補(bǔ)體血癥、淋巴結(jié)病和致命的免疫復(fù)合體介導(dǎo)的腎小球腎炎。
另一個可以用于評價治療效果的動物模型是抗-DNA抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)模型。在這一模型中，將寡核苷酸-匙孔血藍(lán)蛋白(ON-KLH)以有效量施用至小鼠以誘導(dǎo)抗-dsDNA抗體的形成。實施例1公開了在小鼠模型中如何使用ON-KLH誘導(dǎo)抗-ON抗體。ON-KLH通過將KLH偶聯(lián)至由(CA)10-(TG)10組成的20-mer雙鏈寡核苷酸上而制成，并可以通過上述任何方法施用。施用方法包括但并不限于注射(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等等)。隨后可以允許小鼠產(chǎn)生抗-ds ON抗體，然后將一種或多種抑制CD21與C3d相互作用的藥劑(例如抗-CD21抗體或可溶性CD21蛋白質(zhì))施用給小鼠?？?ds DNA抗體的水平可以在實驗進(jìn)程的任何時間監(jiān)測，其包括但并不限于在施用一種或多種抑制CD21與C3d相互作用的藥劑之前的一個或多個時間點，以及在施用一種或多種抑制CD21與C3d相互作用的藥劑之后的一個或多個時間點。
評價治療效果的其它方法也在此進(jìn)行了描述。對于各種抗體介導(dǎo)的病變，其它本領(lǐng)域公認(rèn)的適宜小鼠模型在實施例中描述。
抑制CD21與C3d相互作用的藥劑本發(fā)明方法涉及與CD21相互作用的藥劑的使用，所述相互作用可以抑制CD21與補(bǔ)體片斷iC3b、C3d和C3dg的相互作用。應(yīng)當(dāng)理解，在本文本中C3d和C3dg可以互換地使用。提及C3d應(yīng)理解為也包括C3dg和iC3b。iC3b包括C3dg和C3d的氨基酸序列并以相似的親和力結(jié)合至CD21。iC3b被蛋白酶裂解后產(chǎn)生C3dg。C3dg在羧基末端具有幾個額外的氨基酸，這些氨基酸被細(xì)胞蛋白酶切除后產(chǎn)生C3d。
因此，本發(fā)明所期望的藥劑包括但并不限于抗-CD21抗體、融合蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)(如可溶性CD21)和重組蛋白質(zhì)。
因此，一個可以利用的干擾CD21/C3d相互作用的藥劑的例子為可溶性CD21(sCD21)蛋白質(zhì)，其結(jié)合至C3d配體并與細(xì)胞CD21競爭結(jié)合尚未發(fā)生結(jié)合的C3d。優(yōu)選大多數(shù)C3d被sCD21結(jié)合，由此使細(xì)胞CD21(即結(jié)合在例如B細(xì)胞和T細(xì)胞等細(xì)胞的表面的CD21)與未結(jié)合的C3d間的相互作用被抑制或者阻抑，并且使抗體產(chǎn)生減少或者受到抑制。sCD21可以通過公開在Hebell等人(1991)科學(xué)(Science)254102或者WO91/16437上的方法獲取，這些方法在下文描述。
在一些實施方案中，藥劑可以是抗-CD21抗體，例如人或者人源化抗體。一個可以使用的抗-CD21抗體的例子是結(jié)合至CD21中與C3d天然結(jié)合的區(qū)域的抗體。短共有區(qū)域1和2為這種區(qū)域的例子。在一個實施方案中，藥劑為結(jié)合至人CD21的短共有區(qū)域1(SCR1)和SCR2的小鼠抗-人抗體。在另一實施方案中，藥劑為結(jié)合至人CD21的短共有區(qū)域1(SCR1)和短共有區(qū)域2(SCR2)的人源化抗體。在另一實施方案中，藥劑為結(jié)合至人CD21的短共有區(qū)域1(SCR1)和SCR2的人抗體。在再一實施方案中，藥劑為結(jié)合至SCR1或其部分的抗體。在另一實施方案中，藥劑為結(jié)合至SCR2或其部分的抗體。
抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片斷(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、它們的突變體、含有抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化抗體，以及任何其它修飾構(gòu)型的含有具所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子?？贵w可以是小鼠、大鼠、人或者任何其它來源的。對本發(fā)明而言，抗體以抑制人CD21與C3d相互作用并且可以阻抑CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化和隨后的抗體產(chǎn)生的方式與人CD21反應(yīng)。在一個實施方案中，抗體為識別人CD21上可與C3d結(jié)合的一個或多個表位的小鼠或者大鼠抗體。表位可以是連續(xù)或者不連續(xù)的?？贵w可以針對的表位的例子包括但并不限于短共有區(qū)域1和2(SCR1和/或SCR2)。如果需要，結(jié)合至SCR1和/或SCR2的抗體(例如大鼠單克隆抗體7G6，其針對小鼠CD21)可以按照Kinoshita等人(1988)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1403066方法獲取，并且可以在適當(dāng)?shù)?、本領(lǐng)域公認(rèn)的小鼠疾病模型中使用。在另一方面，抑制CD21與C3d相互作用(例如對CD21的SCR1和/或SCR2表位具特異性)的抗體(例如人、人源化、小鼠、嵌合的)可以通過利用表達(dá)CD21的免疫原制備。一個免疫原的例子為具有高的CD21表達(dá)的細(xì)胞，例如Raji細(xì)胞，其可以從ATCC獲取(登錄號#CCL-86)。另一個可以使用的免疫原的例子為含有CD21的SCR1和/或SCR2部分的可溶性CD21融合蛋白質(zhì)。CD21的SCR1和/或SCR2部分可以與重鏈IgG相融合，例如象公開在WO 91/16437中的那樣。Raji細(xì)胞或者CD21融合蛋白質(zhì)可以單獨使用或者彼此聯(lián)合使用作為免疫原。
在另一方面，可以使用的結(jié)合至人CD21(具體地，結(jié)合至SCR1和/或SCR2)的抗體為小鼠抗-人單克隆抗體(mAb)2B12。mAb 2B12按照實施例6-11的描述生成并鑒定。已經(jīng)證明mAb 2B12可以破壞CD21和C3d之間的相互作用(實施例7)。按照布達(dá)佩斯條約，產(chǎn)生mAb 2B12的雜交瘤已經(jīng)在2002年5月15日被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas VA 20110-2209)，保藏號為——。本發(fā)明提供這一雜交瘤或者它的任何子代(其可能與保藏的雜交瘤相同或者不相同)。
因此，本發(fā)明提供下述的任何一項(或者含有下述任何一項的組合物，包括藥物組合物)(a)抗體2B12；(b)由上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體；(c)抗體2B12的人源化形式；(d)由上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體的人源化形式；(e)包含抗體2B12輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的抗體；(f)包含由上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的抗體；(g)包含2B12的輕鏈和/或重鏈CDR的抗體；(h)包含由上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體的輕鏈和/或重鏈CDR的抗體。抗體的人源化形式可以具有或不具有與2B12或者與上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體相同的CDR。CDR區(qū)域的確定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個CDR的抗體，所述CDR與2B12或者由上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體的至少一個CDR、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個CDR基本同源(或者，在一些實施方案中與2B12的所有6個CDR基本同源)。其它實施方案包括具有至少2個、3個、4個、5個或者6個CDR的抗體，所述CDR與2B12或者由上述雜交瘤產(chǎn)生的抗體的至少2個、3個、4個、5個或6個CDR基本同源。應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明而言，結(jié)合特異性和/或總體活性(可以就抗體產(chǎn)生的阻抑和/或一種或多種癥狀的改善而言)通常會得以保持，但與2B12相比活性程度可能不同(可能更大或者更小)。本發(fā)明也提供制備這些抗體的方法。制備抗體的方法為本領(lǐng)域公知并將在本文中描述。
免疫宿主動物的途徑和時間表一般與已建立的用于抗體刺激和產(chǎn)生的常規(guī)技術(shù)相一致。
根據(jù)預(yù)期，任何哺乳動物對象(包括人)或者由其來源的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞都可以通過操作而作為哺乳動物(包括人)雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的基礎(chǔ)。一般地，給宿主動物腹膜內(nèi)接種足以引起免疫原應(yīng)答的量的免疫原，例如Raji細(xì)胞或者SCR1/SCR2融合蛋白質(zhì)，并且隨后利用相似量的免疫原加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)后收集宿主的淋巴樣細(xì)胞(優(yōu)選脾淋巴樣細(xì)胞)并且利用其制備細(xì)胞懸液用于融合。
雜交瘤可以利用通常的體細(xì)胞雜交技術(shù)從淋巴細(xì)胞和永生化骨髓瘤細(xì)胞制備，所述體細(xì)胞雜交技術(shù)為Kohler，B.和Milstein，C.(1975)自然(Nature)256495-497公開或者如Buck，D.W等人(1982)體外(InVitro)18377-381所改良?？梢栽陔s交中使用現(xiàn)有的骨髓瘤細(xì)胞系，包括但并不限于X63-Ag8.653以及那些來自Salk Institute，Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.，USA的細(xì)胞系。通常，該技術(shù)涉及利用融合劑例如聚乙二醇，或者利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與電有關(guān)的方法融合骨髓瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。經(jīng)融合后，將細(xì)胞從融合培養(yǎng)基上分離，并在選擇生長培養(yǎng)基(例如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基)上生長以淘汰未雜交的親本細(xì)胞。于此描述的培養(yǎng)基(無論其補(bǔ)充血清與否)都可以用于培養(yǎng)分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一替代方法，EBV永生化B細(xì)胞可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗-CD21單克隆抗體。將雜交瘤擴(kuò)大并，如果需要，亞克隆，之后利用常規(guī)的免疫測定方法測定上清中的抗-免疫原活性，所述方法例如放射免疫測定、酶免疫測定或者熒光免疫測定。
可以作為抗體源使用的雜交瘤包括親本雜交瘤的所有衍生物、子代細(xì)胞，它們將產(chǎn)生抗原特異性單克隆抗體，這些抗體具有用于免疫的細(xì)胞類型的特征。
產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤可以利用已知的方法在體外或者體內(nèi)生長。如果需要，單克隆抗體可以從培養(yǎng)基或者體液中分離，分離手段可以為常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，例如硫酸銨沉淀、凝膠電泳、透析、層析和超濾。如果存在非期望的活性，那么可以通過例如將制備物過由連接至固相上的免疫原制成的吸附劑并從免疫原上洗脫或者釋放所需抗體而除去這些活性。利用Raji細(xì)胞或者SCR1/SCR2融合蛋白質(zhì)免疫宿主動物可以產(chǎn)生抗體(例如單克隆抗體)群。
如果需要，可以測序目的抗-CD21抗體(單克隆或多克隆)，并且可以隨后將該多核苷酸序列克隆入載體用于表達(dá)或者擴(kuò)增。編碼目的抗體的序列可以在宿主細(xì)胞的載體中保持，并且隨后宿主細(xì)胞可以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存以備將來使用。在備選方案中，多核苷酸序列可以用于基因操作以使抗體“人源化”或者改善抗體的親和力或者其它特性。例如，如果抗體用于臨床試驗和人的治療，則可以改造恒定區(qū)域使其與人恒定區(qū)域更相似以避免免疫應(yīng)答?？赡芷谕ㄟ^基因操作抗體序列獲得對SCR1和/或SCR2的更大親和力。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對抗-CD21抗體進(jìn)行-個以上的多核苷酸改變，而仍使其保維持對SCR1/或SCR2區(qū)域或者CD21的表位的結(jié)合能力。
單克隆抗體的人源化有4個一般步驟。它們是(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸和推測的氨基酸序列；(2)設(shè)計人源化抗體，即決定在人源化過程中使用哪一抗體框架區(qū)域；(3)實際的人源化方法學(xué)/技術(shù)，以及(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。參見例如美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
現(xiàn)已描述了多種含有來自非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的“人源化”抗體分子，包括具有與人恒定區(qū)融合的嚙齒類或修飾的嚙齒類V區(qū)和它們的相關(guān)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的嵌合抗體。參見例如Winter等人，自然(Nature)349293-299(1991)，Lobuglio等人，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)864220-4224(1989)，Shaw等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1384534-4538(1987)以及Brown等人，癌癥研究(Cancer Res.)473577-3583(1987)。其它參考文獻(xiàn)描述了在與適當(dāng)?shù)娜丝贵w恒定區(qū)融合之前嫁接至人支持構(gòu)架區(qū)(FR)上的嚙齒類CDR。參見例如Riechmann等人，自然(Nature)332323-327(1988)，Verhoeyen等人，科學(xué)(Science)2391534-1536(1998)，以及Jones等人，自然(Nature)321522-525(1986)。另一參考文獻(xiàn)描述了被重組鑲飾的嚙齒類構(gòu)架區(qū)所支持的嚙齒類CDR。參見例如歐洲專利出版號519,596。
這些“人源化”分子設(shè)計以最小化針對嚙齒類抗-人抗體分子的非期望免疫學(xué)應(yīng)答，所述應(yīng)答將限制這些部分在人類受者中的治療應(yīng)用持續(xù)時間和效力。其它也可以使用的人源化抗體的方法公開在Daugherty等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，192471-2476(1991)和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
另一方面，完全人抗體可以通過利用已被改造表達(dá)特異人免疫球蛋白的商業(yè)化小鼠獲得。設(shè)計以產(chǎn)生更合乎期望的(例如完全人抗體)或者更強(qiáng)的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物也可用于產(chǎn)生人源化或者人抗體。這種技術(shù)的例子有Abgenix公司(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex公司(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TC MouserM。
或者，抗體可以利用本領(lǐng)域任何已知的方法通過重組技術(shù)制備和表達(dá)?？贵w的重組制備方法為首先分離宿主動物產(chǎn)生的抗體，獲得它的基因序列，并利用此基因序列在宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中重組表達(dá)抗體?？晒┦褂玫牧硪环椒樵谥参?例如煙草)或者轉(zhuǎn)基因奶中表達(dá)抗體序列。在植物或者轉(zhuǎn)基因奶中表達(dá)抗體序列的方法已經(jīng)公開。參見例如Peeters等人(2001)疫苗(Vaccine)192756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)國際免疫學(xué)評論(Int.Rev.Immunol.)1365；和Pollock等人(1999)免疫學(xué)方法雜志(J Immunol Methods)231147。制備抗體衍生物(例如人源化、單鏈等等)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。另外，抗體可以通過噬菌體展示技術(shù)重組制備。參見例如美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter等人免疫學(xué)年評(Annu.Rev.Immunol.)(1994)12433-455。
通過免疫宿主動物或者重組技術(shù)制備的抗體應(yīng)展現(xiàn)下列的所有特征(a)結(jié)合CD21；(b)結(jié)合CD21中可與C3d結(jié)合的一個或多個表位；(c)結(jié)合CD21以抑制CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化；(d)結(jié)合CD21以抑制CD21/C3d介導(dǎo)的B細(xì)胞活化并降低抗體產(chǎn)生的水平。
也可以使用免疫測定和流式細(xì)胞分選技術(shù)例如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)來分離對CD21特異且更優(yōu)選對CD21的SCR1和/或SCR2表位特異的抗體。例如，可以使用C3d包被的和可溶性CD21包被的培養(yǎng)板進(jìn)行ELISA來確定對CD21的C3d結(jié)合部分(即SCR1和/或SCR2)具特異性的抗體。流式細(xì)胞術(shù)可以用于評價抗體與CD21表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞系的結(jié)合程度，上述CD21表達(dá)細(xì)胞包括但并不限于B細(xì)胞，所述細(xì)胞系例如Raji?；蛘?，抗體可以通過與B細(xì)胞群相混和并隨后將B細(xì)胞暴露于分離形式(例如C3d包被的培養(yǎng)板)或者天然形式(例如，存在血清中)的C3d源而篩選。流式細(xì)胞術(shù)和B細(xì)胞活化指示性標(biāo)志可以用于檢測抗-CD21抗體抑制B細(xì)胞活化的情況，所述B細(xì)胞活化指示性標(biāo)志包括但并不限于CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD39、CD69、CD72、CD75、CD76、CD86、CD97、CD125、CD126、CD130和CD153。
抗體可以結(jié)合至許多不同的載體上。載體可以為活性的和/或者惰性的。為人所熟知的載體的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、玻璃、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。對本發(fā)明而言，載體的性質(zhì)可以為可溶或不溶的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或能利用常規(guī)試驗確定用于結(jié)合抗體的其它適宜載體。
抗體也可以偶聯(lián)至可檢測試劑上。復(fù)合體可以用于檢測樣品中與抗體特異結(jié)合的抗原，這可以利用如Harlow和Lane(1988)(上述引文)所描述的標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)技術(shù)，例如流式細(xì)胞術(shù)或者免疫組化進(jìn)行?？蓹z測標(biāo)志也可以用于確定對細(xì)胞類型(例如B細(xì)胞)的結(jié)合特異性，方法是利用可檢測標(biāo)志與另一明確的B細(xì)胞標(biāo)志(例如CD19、CD20、CD22等)并通過FACS分析染色模式。多種不同的標(biāo)記物和標(biāo)記方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知?？梢栽诒景l(fā)明中使用的標(biāo)記物類型的例子包括放射性同位素、酶、膠體金屬、熒光化合物(例如FITC、PE、PECy5、APC等)、生物發(fā)光化合物和化學(xué)發(fā)光化合物等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道或者能夠利用常規(guī)試驗確定用于結(jié)合抗體的其它適宜標(biāo)記物。此外，這些標(biāo)記物與本發(fā)明抗體的結(jié)合可以利用對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言一般的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。
藥劑的施用可以使用藥劑(例如抗體或其片斷)的各種制劑形式來給藥。在一些實施方案中，藥劑(例如抗-CD21抗體或其片斷)可以單獨施用。在一些實施方案中，藥劑含有抗-CD21抗體或其片斷和藥學(xué)可接受的賦形劑，并且可以為各種制劑形式。藥學(xué)可接受賦形劑為本領(lǐng)域所公知，并為有利于藥理有效物質(zhì)施用的相對惰性物質(zhì)。例如，賦形劑可以賦予形狀或者稠度，或者作為稀釋劑使用。合適的賦形劑包括但并不限于穩(wěn)定劑、濕潤和乳化劑、針對不同摩爾滲透壓濃度的鹽、包囊劑、緩沖液和皮膚穿透增強(qiáng)劑。賦形劑以及用于腸胃外和非腸胃外藥物遞送的制劑在<<Remington，Science and Practice of pharmacy，第20版，Mack出版公司(2000)中列出。
通常，這些藥劑配制用于注射施用(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等等)。因此，這些藥劑優(yōu)選與藥學(xué)可接受載體如鹽、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等等混和使用。具體給藥方案(即劑量、時機(jī)和重復(fù))將依賴于特定個體和該個體的病史。經(jīng)驗考慮因素(例如半衰期)通常將有助于劑量的確定。施用頻度可隨治療進(jìn)程確定和調(diào)整，并且一般(但不是必須)基于對抗體產(chǎn)生減少的維持和/或?qū)σ环N或者多種癥狀的阻抑/改善/延緩。其它適當(dāng)?shù)慕o藥時間表可以為每天連續(xù)輸注或者每周3次給藥，或者每周一次給藥，或者每2到4周一次給藥，或者每月一次給藥或者更小的頻度，這取決于接受治療的個體或者抗體介導(dǎo)的疾病的狀況?？赡苄枰貜?fù)施用來獲得和/或維持對CD21/C3d相互作用的阻抑狀態(tài)從而治療抗體介導(dǎo)的病變例如自身免疫病(例如SLE)，其中重復(fù)給藥的時間安排通?；贐細(xì)胞周轉(zhuǎn)速率來確定?；蛘?，藥劑的持繼緩釋制劑可能是適宜的。用于獲得緩釋的多種制劑和裝置為本領(lǐng)域公知。
備選地，可以對具有抗體介導(dǎo)的病變?nèi)缱陨砻庖卟?例如SLE)家族史的個體，相應(yīng)地調(diào)整給藥方案以延緩抗體介導(dǎo)的病變的發(fā)展。在這種情況下，應(yīng)當(dāng)考慮平衡有效劑量和由可能毒性所致的副作用。
在一個實施方案中，對已經(jīng)接受過一次或者多次抑制CD21/C3d相互作用的藥劑施用以治療抗體介導(dǎo)的病變?nèi)缱陨砻庖卟?例如SLE)的個體而言，藥劑的劑量可以由經(jīng)驗確定。可以給予個體增加的藥劑劑量，所述藥劑抑制CD21/C3d相互作用，例如抗-CD21抗體。從施以不同增加劑量的每一個體中獲得生物學(xué)樣品(例如血液)并且(如果需要)通過將全血加入到綿羊紅細(xì)胞(SRBC)中將T細(xì)胞從B細(xì)胞中分離。T細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合SRBC并且T細(xì)胞-SRBC群比B細(xì)胞具有更大的密度。利用密度離心可以從B細(xì)胞中分離T細(xì)胞-SRBC群。隨后可以在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中將B細(xì)胞與C3d包被的培養(yǎng)板接觸，如果抗-CD21抗體的水平足夠封閉B細(xì)胞上的所有C3d區(qū)域，那么將幾乎沒有或者完全沒有B細(xì)胞結(jié)合至C3d包被的培養(yǎng)板上?；蛘?，可以將補(bǔ)體包被的SRBC用在如上所公開的玫瑰花結(jié)測定中。在另一替代方案中，也可以通過例如FACS監(jiān)測接受治療的個體的細(xì)胞表面上CD21的喪失。CD21的喪失可因施用一種或者多種本文公開藥劑進(jìn)行治療后細(xì)胞表面上CD21的下調(diào)引起或者因CD21的脫落而發(fā)生。參見例如Fremeaux-Bacchi等人(1999)免疫藥理學(xué)(Immunopharmacology)4231。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，劑量可以隨個體、抗體介導(dǎo)的病變的階段和個體內(nèi)B細(xì)胞組成的不同而不同。此外，按占整體淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)計具有較多B細(xì)胞組成的個體比具有低比例B細(xì)胞的個體可能需要更高的劑量。出現(xiàn)SLE癥狀(例如抗-dsDNA抗體或者抗β2GPI抗體(它們也在具有APS或者抗體介導(dǎo)的血栓形成的個體中出現(xiàn)))的個體與具有低或者無抗-dsDNA抗體水平的個體相比可能需要更高劑量的抑制CD21/C3d相互作用的藥劑。
其它制劑包括本領(lǐng)域公知的適當(dāng)?shù)倪f送形式，其包括但并不限于載體，例如脂質(zhì)體。Mahato等人(1997)藥理學(xué)研究(Pharm.Res.)14853-859。脂質(zhì)體制劑包括但并不限于細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
在一些實施方案中，存在一種以上的藥劑，例如抗體。這些藥劑可以彼此相同或者不相同。這些藥劑可以含有至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同的抗體?？?CD21抗體可以與一種或者多種針對B細(xì)胞表面蛋白質(zhì)具反應(yīng)性的抗體混和，所述表面蛋白質(zhì)包括但并不限于CD19、CD20、CD23、CD28、CD38、CD40、CD45、CD45R或CD81。在一個實施方案中，B細(xì)胞表面蛋白質(zhì)為B細(xì)胞活化或者B細(xì)胞成熟中涉及的蛋白質(zhì)。B細(xì)胞的成熟可以指B細(xì)胞發(fā)育的任何階段。在一個實施方案中，抗體為針對活化途徑(例如CD19和CD81)的抗體的混合物。在另外的實施方案中，抗體為針對發(fā)育過程中的特異B細(xì)胞群(例如未成熟B細(xì)胞、成熟的幼稚B細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或者漿細(xì)胞)的抗體的混合物。在另一實施方案中，抗-CD21抗體與可以和T淋巴細(xì)胞表面蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體混和，所述表面蛋白質(zhì)參與輔助B細(xì)胞活化和/或成熟。這些蛋白質(zhì)的例子包括但并不限于CD40配體，CD152(CTLA4)和CD28。正如在本領(lǐng)域中常常指出的，抗體的混合物可能對于治療更廣范圍的個體群是尤其有用的。應(yīng)當(dāng)理解，個體中任何B細(xì)胞群體都含有處于不同發(fā)育時期的未成熟、部分成熟和成熟B細(xì)胞的混合物。與使用僅僅一種(或者比“雞尾酒”中含有的種類少)抗體相比，抗-CD21抗體與其它抗淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)的聯(lián)合也可能更為有效。
在一些實施方案中，該方法涉及施用藥劑(其可以是抗體)并與另一治療方法或者治療模式相聯(lián)合。在一些實施方案中，所述其它療法不同于基于CD21的療法(即此額外的療法不影響CD21/C3d相互作用)。因此，本發(fā)明提供了這樣的方法，該方法還包括施用另一或額外治療(或治療劑)，該額外治療(式治療劑)可以包括一種或多種額外治療(治療劑)。額外治療(或治療劑)可以是任何可用于治療抗體介導(dǎo)的病變的形式(包括藥劑或者其它治療，例如放療)。例如，可以向同一個體施用一種或者多種免疫抑制劑以及適用于狼瘡的藥劑，所述免疫抑制劑為例如皮質(zhì)類固醇環(huán)磷酰胺免疫抑制劑。例如對免疫抑制療法而言，可以施用一種或者多種額外的治療劑，并且這些聯(lián)合療法為本領(lǐng)域公知。環(huán)磷酰胺(以及其它免疫抑制劑)的施用(包括制劑、給藥等等)為本領(lǐng)域公知。這種聯(lián)合可以降低對往往具有不良副作用的其它治療劑的需要(例如更少的施用和/或給藥頻率)。相反，由于基于CD21的療法的保護(hù)作用，這些聯(lián)合療法也可以允許更高的劑量。
評價療效的方法療效的評價可以在幾種不同的水平進(jìn)行。評價可以通過監(jiān)測臨床病征(例如與抗體介導(dǎo)的病變(如SLE、ITP或甲狀腺炎)相關(guān)的癥狀)、細(xì)胞應(yīng)答(例如抗體分泌)或者一種或多種細(xì)胞內(nèi)的分子變化(例如B細(xì)胞活化標(biāo)志)進(jìn)行。對抗體介導(dǎo)的病變的治療的各種測量的例子已經(jīng)在上文中進(jìn)行了討論。
對抗體介導(dǎo)的病變例如自身免疫病的治療療效的檢測與測量通?；趯ψ陨砜乖鸬淖陨砻庖邞?yīng)答水平和/或其它與自身免疫疾病相關(guān)的癥狀的檢測與測量。自身免疫應(yīng)答水平可以由針對自身抗原的抗體效價來反映。優(yōu)選地，與利用本發(fā)明一種或多種藥劑治療前相比，利用本發(fā)明一種或多種藥劑治療后針對自身抗原的抗體效價降低。在SLE的情況中，對抗-雙鏈DNA(抗-dsDNA)抗體、抗-SM核抗原抗體、抗-β2GPI抗體(其也出現(xiàn)在具有APS或者抗體介導(dǎo)的血栓癥的個體中)和/或SLE相關(guān)臨床癥狀的測量(上述為本領(lǐng)域所公知)可以用作療效的測量?？?dsDNA抗體水平的測量可以通過在臨床情況下常規(guī)使用的測試(例如Farr測試或ELISA)來完成。其它SLE相關(guān)癥狀的例子包括但并不限于面頰疹、盤狀疹、蝶形疹、光敏感口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、腎病(例如蛋白尿)、神經(jīng)系統(tǒng)病癥(例如癲癇發(fā)作或精神病)、血液病(例如溶血性貧血、白細(xì)胞減少癥、淋巴細(xì)胞減少癥、血小板減少癥)和狼瘡性腎炎。狼瘡性腎炎(腎小球性腎炎或者腎發(fā)炎)以腎功能的進(jìn)行性喪失并最后導(dǎo)致腎衰竭為特征。狼瘡性腎炎的特征為血尿、尿量減少、血尿氮水平升高、血清肌酸酐水平升高、高血壓和蛋白尿。因此，這些參數(shù)可以作為監(jiān)測腎變性的手段。
對甲狀腺炎而言，療效的確定可以包括但并不限于測量針對促甲狀腺激素受體的抗體效價水平和甲狀腺炎相關(guān)癥狀的改善或者減輕，上述癥狀包括但并不限于慢性炎性細(xì)胞的過度浸潤、濾泡破裂、嗜曙紅細(xì)胞過多、不同程度的增生、纖維化、無痛性甲狀腺腫和甲狀腺機(jī)能減退。
對ITP而言，療效的確定可以包括但并不限于測量血小板水平、臨床出血(例如紫癜、鼻血丑、齒齦出血或者月經(jīng)過多)的改善、血泡和下肢瘀斑的消散。
對異種移植而言，療效的確定可以包括但并不限于測量針對移植(即異種)組織的抗體效價水平、移植物抗宿主應(yīng)答的減少或消失，和移植組織排斥的排斥減輕(例如壞死組織的減少或者消失)，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
對APS(也可以包括抗體介導(dǎo)的血栓癥)而言，療效的確定可以包括但并不限于測量針對抗磷脂、心磷脂或者β2-GPI抗體效價的水平。另外，與APS相關(guān)的非限制性癥狀包括動脈閉塞、四肢壞疽、中風(fēng)、心肌梗死、其它內(nèi)臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內(nèi)臟靜脈閉塞(如巴-希綜合癥、門靜脈閉塞)、習(xí)慣性流產(chǎn)、血小板減少癥、庫姆斯陽性溶血性貧血、網(wǎng)狀青斑、神經(jīng)系統(tǒng)異常(如舞蹈癥、短暫性局部缺血發(fā)作)、心瓣性心臟病以及突發(fā)性多系統(tǒng)動脈閉塞。
對重癥肌無力而言，療效的確定可以包括但并不限于測量針對乙酰膽堿受體的抗體效價水平和與重癥肌無力相關(guān)的癥狀的改善或減輕，所述癥狀包括但并不限于可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力、易疲勞、不對稱上眼瞼下垂、復(fù)視、頸伸肌無力、頭下垂、由于面部肌肉和球肌無力所致的當(dāng)患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構(gòu)音障礙的低音量發(fā)音困難、可導(dǎo)致氣阻或反胃的吞咽困難。
對系統(tǒng)性硬皮病而言，療效的確定可以包括但并不限于測量針對核蛋白質(zhì)如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70和著絲粒的抗體效價水平。另外，與系統(tǒng)性硬皮病相關(guān)的癥狀包括但并不限于手指和手掌的腫脹和增厚并可能累及面部，皮膚的增厚、累及軀干和臨近肘部的臂。皮膚萎縮并可能脫發(fā)、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性喪失；皮包骨，其中皮膚緊繃并緊結(jié)合在下面的結(jié)構(gòu)上；以及有限的運動性，尤其是手指。
對多肌炎而言，療效的確定可以包括但并不限于測量針對核蛋白質(zhì)如Jo-1、組氨酰RNA合成酶、蘇氨酰-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2的抗體的效價水平。另外，與多肌炎相關(guān)的癥狀包括但并不限于主要骨骼肌無力、相鄰肌肉無力、吸入性肺炎、間質(zhì)性肺病、軟組織鈣化和雷諾氏現(xiàn)象。
一般地，測量適當(dāng)?shù)目贵w效價(依賴于疾病種類)對監(jiān)測疾病狀況以及合適的劑量是合適的。對本發(fā)明而言，一種或者多種癥狀得以改善(如果適當(dāng)，包括疾病事件的發(fā)生和頻度)和/或延緩。
藥劑盒本發(fā)明提供實現(xiàn)本發(fā)明方法的藥劑盒。因此，本發(fā)明提供適當(dāng)包裝的多種藥劑盒。藥劑盒可以用于于此描述的任何一種或者多種用途，并且相應(yīng)地可以含有用于任何一種或多種下列用途的說明書，所述用途為治療抗體介導(dǎo)的病變；延緩抗體介導(dǎo)的病變的發(fā)展。
本發(fā)明藥劑盒包含一個或多個容器，容器中含有于此描述的任何一種藥劑，例如抗體。每一組分(如果存在一種以上組分的話)可以分別包裝在不同容器中，或者在交叉反應(yīng)性和保存期所允許的情況下，一些組分可在一個容器中混和。
本發(fā)明藥劑盒可以任選地包括一套與本發(fā)明方法中各組分的使用相關(guān)的說明書，盡管含有說明書的電子存貯介質(zhì)(例如磁盤或光盤)是可以接受的，但一般包括書寫的說明書。包含在藥劑盒中的說明書一般包括有關(guān)組分以及將它們施用給個體的信息。
提供下述實施例用于闡釋而并不是限制本發(fā)明。
實施例實施例1 使用sCD21降低抗-dsDNA抗體的水平利用模式T細(xì)胞依賴型抗原致敏C57/B6小鼠，上述模式T細(xì)胞依賴型抗原為以3.8摩爾寡核苷酸/摩爾KLH的比例偶聯(lián)至由(CA)10-(TG)10組成的20-mer雙鏈寡核苷酸上的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)(ON-KLH)。
將小鼠取血并隨后腹膜內(nèi)施用50μg明礬沉淀的ON-KLH連同作為另外佐劑的2×109個處死的百日咳博德特氏桿菌(B.Pertussis)生物體進(jìn)行免疫。14天后，腹膜內(nèi)施用10μg ON-KLH對小鼠加強(qiáng)免疫。在加強(qiáng)免疫時，小鼠靜脈內(nèi)接受300μg可溶性CD21(sCD21；Hebell等人(1991)科學(xué)(Science)254102)并腹膜內(nèi)接受300μg的sCD21。對照小鼠接受PBS。隨后的3天，小鼠每天靜脈內(nèi)接受300μg的sCD21或PBS。
在加強(qiáng)免疫后7天將小鼠取血并利用偶聯(lián)至牛血清白蛋白的ON通過ELISA測量血清中對ON特異的IgG水平。通過與標(biāo)準(zhǔn)的免疫小鼠血清庫比較以適宜單位確定針對ON的抗體濃度。如表1和圖1所示，利用sCD21處理顯著減少抗ON的IgG水平(p＝0.02，Mann-Whitney U檢驗)。
表1致敏后(u/ml，前)和加強(qiáng)免疫加利用PBS或sCD21處理后7天(u/ml，后)小鼠中抗-ON的IgG水平。

與PBS處理組相比，sCD21處理組中抗體平均水平下降64％。
實施例2 使用抗-CD21抗體降低抗-dsDNA抗體的水平利用模式T細(xì)胞依賴型抗原致敏BALB/c小鼠，上述模式T細(xì)胞依賴型抗原為以3.8摩爾寡核苷酸/摩爾KLH的比例偶聯(lián)至由(CA)10-(TG)10組成的20-mer雙鏈寡核苷酸上的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)(ON-KLH)。
將小鼠取血并隨后腹膜內(nèi)施用50μg 明礬沉淀的ON-KLH連同作為另外佐劑的2×109個處死的B.Pertussis生物體進(jìn)行免疫。10周后，將小鼠取血并利用PBS或者200μg大鼠單克隆抗體7G6靜脈內(nèi)處理。大鼠單克隆抗體7G6(IgG2b抗-小鼠CD21抗體)描述在Kinoshita等人(1988)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1403066中。24小時后，腹膜內(nèi)施用10μgON-KLH對小鼠加強(qiáng)免疫。ON特異性IgG抗體的測量在加強(qiáng)免疫后14天利用針對ON的ELISA進(jìn)行。在這一實驗中，在加強(qiáng)免疫前小鼠具有顯著的IgG抗-ON抗體水平，因此處理效果通過比較加強(qiáng)前后IgG抗-ON抗體比例確定。利用單克隆抗體處理顯著減少IgG抗-ON抗體水平(p＝0.03，Mann-Whitney U檢驗)。數(shù)據(jù)顯示在表2并在圖2中繪出。

與PBS處理組相比，抗體處理組中后/前抗體水平比率下降45％。實施例3A使用抗-CD21抗體降低狼瘡自發(fā)模型中抗-dsDNA抗體的水平NZB/WF1(H-2d/z)小鼠株系提供了研究控制狼瘡自身免疫發(fā)作的復(fù)雜機(jī)制的自身免疫模型。該動物為NZB/B1NJ雌性和NZW/LacJ雄性小鼠的F1雜交后代，并且它們獲得自Jackson實驗室(Bar Harbor，Maine)。該小鼠發(fā)展出一種未知來源的慢性炎性疾病，其可以被遺傳因子強(qiáng)烈的影響。自身免疫反映在高水平的循環(huán)抗-核抗體(包括抗雙鏈DNA抗體)；針對RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體(例如RNP和Sm)、ssDNA、組蛋白、染色質(zhì)、紅細(xì)胞和心磷脂的自身抗體；免疫復(fù)合體形成并在腎中沉積導(dǎo)致蛋白尿；以及進(jìn)行性腎小球性腎炎。
由于雌性小鼠比雄性小鼠具有高得多的疾病發(fā)生率和嚴(yán)重性，因此本研究利用雌性動物進(jìn)行(對雌性而言平均生命期為約35周，而雄性為約1年，根據(jù)Jackson實驗室)。
每一研究由處于疾病不同階段的動物組組成(詳見下述)，并包括(1)未接受處理(鹽水)的對照組，(2)接受同種型對照抗體的對照組，和(3)接受測試藥劑(單獨或彼此聯(lián)合)的測試組。
在4至6月齡之間時，根據(jù)蛋白尿監(jiān)測確定的疾病階段將小鼠分為4個研究組。這些疾病階段如下所述·疾病發(fā)作前＝無·1+＜30mg/dl(輕微)·2+＜100mg/dl(嚴(yán)重)·3+＞100mg/dl(后期)利用大鼠IgG2b抗-小鼠CD21抗體(7G6)或者大鼠IgG2b同種型對照(Kinoshita等人(1990)Int.Immunol.2651-659)處理動物?；蛘?，使用可溶性CD21-Ig融合蛋白質(zhì)或者小鼠IgG1對照(Hebell，T.等人(1991)科學(xué)(Science)254102-105)。環(huán)磷酰胺也用于一般的免疫抑制并測試與這些抗體的協(xié)同作用。
每一組(每組最少10只小鼠)中，小鼠利用下述方案之一處理1.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用抗-CD21 500μg。
2.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用CD21-Ig 500μg。
3.每周(第7天)腹膜內(nèi)施用環(huán)磷酰胺1mg。
4.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用大鼠IgG2b 500μg。
5.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用小鼠IgG1 500ug。
6.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用鹽水。
7.聯(lián)合1和3。
8.聯(lián)合2和3。
經(jīng)處理后，每周對小鼠取血用于確定抗-dsDNA和抗-β2 GPI抗體效價以及針對RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體(例如RNP和Sm)、ssDNA、組蛋白、染色質(zhì)、紅細(xì)胞和心磷脂的自身抗體的效價。此外每周評估蛋白尿的水平以監(jiān)測自身免疫病的進(jìn)展。
可以使用幾種測定方法確定自身免疫病的發(fā)作或進(jìn)展。以下為所使用的測定法1)抗-dsDNA ELISA。動物血清中抗-雙鏈DNA抗體的效價利用固相ELISA確定。
2)抗-RNP、抗-Sm、抗-ssDNA、抗-組蛋白、抗-染色質(zhì)、抗-紅細(xì)胞和抗-心磷質(zhì)抗體的效價利用ELISA確定。
3)腎病。蛋白尿通過利用商業(yè)化的量桿(Ames Uristix；BayerDiagnostics，目錄號2184，Tarrytown，NY)測量。
4)抗-β2糖蛋白I(β2GPI)ELISA。針對β2GPI的抗體的效價利用固相ELISA確定。
5)存活。監(jiān)測實驗動物的存活率。
實施例3B 利用抗-CD21抗體的動物研究在18周齡時對60只雌性(NZB)×(NZW)F1小鼠取血，并且利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定法測量針對雙鏈(ds)DNA的血清抗體效價，所述測定使用鮭魚精子DNA(Calbiochem，San Diego，CA)作為底物。將小鼠隨機(jī)分成4組，每組13到15只，由此每一組包含具有類似血清抗-DNA抗體水平的小鼠。隨后使動物開始接受下述4種處理方案之一A)無處理B)每周以40mg/kg的劑量單次腹膜內(nèi)注射施用溶于無菌磷酸緩沖鹽水中的環(huán)磷酰胺(第3天)。
C)每周單次腹膜內(nèi)注射施用溶于無菌磷酸緩沖鹽水中的250μg大鼠IgG2b κ抗-小鼠CD21 mAb 7G6(第7天)。
D)腹膜內(nèi)注射上述劑量的環(huán)磷酰胺(第3天)和7G6(第7天)。
處理僅僅在18到36周齡之間進(jìn)行。在這期間，對小鼠每2周分析一次來確定體重、蛋白尿水平、血細(xì)胞比容和血清抗-dsDNA抗體濃度。另外，每天監(jiān)測動物的痛苦跡象并對垂死的動物實施安樂死。
每一處理對存活的影響顯示在Kaplan-Meier曲線中(圖4)。與未處理相比，單獨注射抗-CD21 mAb并不延長存活，而單獨注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺卻能延長。在同時接受環(huán)磷酰胺和mAb 7G6的動物組中觀察到對延長存活最顯著的影響。
與對照小鼠(未處理)或者單獨利用環(huán)磷酰胺處理的小鼠相比，抗-CD21(7G6)處理對總抗-dsDNA抗體濃度無影響(無論是單獨施用還是與環(huán)磷酰胺聯(lián)合施用)。
實施例4 利用單克隆抗-CD21抗體7G6對α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除小鼠中g(shù)al α1-3gal的抗體的抑制α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除小鼠(Thall等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)(1995)27021437-21440)(GalT KO)不能合成Gal α1-3 Gal雙糖(雙半乳糖)，并且這與人、猿、舊大陸猴相似，因為它們自發(fā)形成識別末端Gal α1-3 Gal表位的抗體。人中的天然抗Gal α1-3 Gal抗體是異種移植的明顯的障礙，其引起超急性異種移植排斥。因此，GalT KO小鼠模型是測試用于減少天然抗Gal α1-3 Gal抗體的潛在方法的一個非常有用的系統(tǒng)(Yang等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)(1998)1871335-1342)。
本實驗的目的是確定利用CD21特異性單克隆抗體7G6處理GalT KO小鼠能否阻止響應(yīng)兔紅細(xì)胞(Gal α1-3 Gal二糖的來源)免疫引起的抗Gal α1-3 Gal抗體誘導(dǎo)。
GalT KO小鼠獲得自John Lowe(密歇根大學(xué))。利用600μg溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)的7G6或者單純PBS腹膜內(nèi)施用處理小鼠(11周齡，每組10只)。一天后利用1×109兔紅細(xì)胞腹膜內(nèi)施用免疫這些小鼠。8天后對這些動物取血并利用ELISA測定血清樣品中的抗-雙半乳糖抗體。利用溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)的5μg/ml共100μl/孔雙半乳糖牛血清白蛋白(BSA-雙半乳糖)4℃過夜包被免疫測定滴定板(Costar#3590)。利用PBS洗滌滴定板并利用250μl/孔溶于PBS的5％脫脂奶粉4℃過夜封閉剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。將血清樣品在含有0.5％BSA的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(HBSA)中稀釋。封閉的滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗滌并加入50μl的血清樣品稀釋物。將滴定板在室溫下孵育1小時。滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗滌。加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG或IgM(Jackson#115-055-146或者115-055-075，利用HBSA稀釋1000倍)(100μl/孔)并將滴定板在室溫下孵育1小時。滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗滌。加入酚酞單磷酸(在蒸餾水中1∶26稀釋，100μl每孔)并將滴定板在室溫下孵育。10和30分鐘孵育后在PowerWave340微量滴定板分光光度計上讀出550nm的光密度。
通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較以適宜單位/ml確定抗-雙半乳糖抗體的血清水平，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線利用取自兔紅細(xì)胞免疫的GalT KO小鼠的血清庫生成。
血清抗雙半乳糖抗體水平利用Statview通過Students t檢驗來分析。與安慰劑處理的動物相比較，7G6處理的動物中IgM和IgG抗-雙半乳糖抗體顯著減少(IgM，p＝0.0085，IgG，p＝0.0146，Mann-Whitney U檢驗)。利用7G6的處理阻斷了由RRBC免疫刺激的抗-雙半乳糖抗體增加。這些實驗的結(jié)果總結(jié)在表3和圖3中。
表3對照和抗-CD21處理小鼠中抗-雙半乳糖IgM和IgG水平

與PBS處理組相比，抗體處理組中IgM抗雙半乳糖抗體水平降低65％。與PBS處理組相比，抗體處理組中IgG抗半乳糖抗體水平降低69％。
實施例5 在自身免疫性甲狀腺炎自發(fā)模型中抗-CD21抗體的使用NOD.H-2h4株系小鼠從飲用水中接受碘化鈉后發(fā)展出自發(fā)自身免疫性甲狀腺炎。自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)展伴隨著針對小鼠甲狀腺球蛋白的抗體水平的增加(Braley-Mullen，H.和Yu，S.(2000)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1657265-7269)。
通過在飲用水中引入碘化鈉誘發(fā)動物出現(xiàn)甲狀腺炎并隨后利用7G6大鼠IgG2b抗-小鼠CD21抗體或者大鼠IgG2b同種型對照(Kinoshita等人，1990，Int.Immunol.，2651-659)處理。
處理方案每一研究由如下的動物組組成(a)未接受處理(鹽水)的對照組。
(b)接受同種型對照抗體的對照組。
(c)接受7G6抗-CD21的測試組。
在8周齡時，小鼠在它們的飲用水中接受0.05％碘化鈉以誘發(fā)甲狀腺炎。在最初的實驗中，小鼠的處理從8周齡開始(即在疾病發(fā)作之前)。處理方案如下所詳述。在16周齡時收集血液樣品并對甲狀腺球蛋白抗體進(jìn)行測定。在向飲用水中引入碘化鈉后8周，將小鼠處死并收集甲狀腺組織用于組織學(xué)評價。NOD.H-2h4小鼠的甲狀腺損傷在飲用水中引入碘化鈉后7-9周最為嚴(yán)重。
在隨后的實驗中，對小鼠的處理在16周齡以后進(jìn)行，即在疾病發(fā)作之后。利用下述的方案對小鼠處理4周。隨后收集血液樣品以確定抗甲狀腺球蛋白抗體的水平。將小鼠處死并收集甲狀腺組織用于組織學(xué)評價。
對每一組而言，利用下述方案之一處理小鼠1.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用抗-CD21抗體500μg。
2.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用大鼠IgG2b抗體500μg。
3.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用鹽水。
每組評價最少10只小鼠。下述測定用于跟蹤甲狀腺炎的發(fā)展1.抗甲狀腺球蛋白ELISA。動物血清中抗甲狀腺球蛋白抗體的效價利用固相ELISA確定。
2.甲狀腺病理由組織學(xué)確定。對甲狀腺濾泡的損傷通過測量單核細(xì)胞滲浸潤程度來定量。
實施例6 單克隆抗體2B12的生成利用10μg溶于Immuneasy佐劑(Qiagen，Valencia，CA)的可溶性人CD21(結(jié)構(gòu)域1-2)-Ig融合蛋白質(zhì)(Hebell，T等人(1991)科學(xué)(Science)254102-105)肌內(nèi)(i.m.)致敏Balb/cJ雌性小鼠。兩周之后，利用同一抗原和佐劑的混合物加強(qiáng)免疫該小鼠。6周后，利用溶于無菌PBS的50μgsCD21(1-2)-Ig靜脈內(nèi)(i.v.)加強(qiáng)免疫該小鼠。3天后將小鼠處死并通過標(biāo)準(zhǔn)方法將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0融合。經(jīng)2周的選擇后，首先利用sCD21(1-2)-Ig通過直接ELISA篩選雜交瘤的上清，并且隨后利用實施例7-11描述的方法篩選。
實施例7mAb 2B12對CD21/C3d相互作用的破壞BSA-或C3d-微球體的包被將1μm羧酸酯修飾的熒光微球體(#F8823，Molecular Probes，Eugene，OR)的懸液(體積相當(dāng)于約1.5×1010個微球體)利用5000×g離心沉淀5分鐘，并在1ml 50mM MES，pH7.0(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)中洗滌一次，并在0.5ml 50mM MES中重懸。向此懸液中加入各2mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺HCl，Pierce#22980)和磺基-NHS(N-羥基磺基琥珀酰亞胺，Pierce#24510)，并隨后將樣品在室溫下暗處旋轉(zhuǎn)20分鐘。將活化的微球體懸液在5000×g離心5分鐘并在1ml 50mM MES，pH7.0中洗滌3次。隨后將1體積的活化微球體懸液加至2倍體積的溶于PBS的1mg/ml C3d或者BSA蛋白中，并在室溫下暗處旋轉(zhuǎn)2小時。再將微球體離心并在50mM MES，pH7.0中洗滌3次。C3d-或者BSA包被的微球體最終以4×109/ml重懸于含有1％BSA和0.01％NaN3的50mM HEPES，pH7.4中，并貯存于4℃。
Raji細(xì)胞-C3d微球體結(jié)合測定將CD21+人Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞系Raji(ATCC#CCL86)細(xì)胞從培養(yǎng)中收獲并在PFN(含有1％(V/V)胎牛血清(FBSGibco BRL，Gaithersburg，MD)和0.01％(V/V)的疊氮化鈉的PBS，以防止CD21的表面調(diào)節(jié))中洗滌。將細(xì)胞在PFN中以106/ml重懸并以200μl/樣品小份加入至FACS管中。在50μL PFN中加入小鼠抗人CD21 mAb 2B12(在預(yù)實驗中確定為30-50ng)。對照管不合抗體或者含有30-50ng的小鼠抗-人CD21 mAb HB5(BD Pharmingen，La Jolla，CA)，該mAb識別CD21的3-4結(jié)構(gòu)域上的表位，并對C3d結(jié)合具有極小的影響。將小管在4℃下孵育15分鐘。隨后將BSA-或者C3d-包被的1μm熒光微球體加至細(xì)胞中，終比例為每個Raji細(xì)胞25、50或者100個微球體。加入的微球體的總體積為20μL。將小管短暫渦旋并在室溫下孵育20分鐘。加入PFN至終體積500μL，并隨后將樣品渦旋并在室溫下在FACSC Calibur流式細(xì)胞儀上分析。Raji-微球體偶聯(lián)物在FL3中鑒定為一系列峰，這些峰代表與不同數(shù)目的微球體結(jié)合的細(xì)胞。為定量分析結(jié)果，在直方圖中設(shè)定標(biāo)志由此將第一個峰從分析中排除。
下表顯示的典型數(shù)據(jù)為在mAb 2B12存在或者不存在時，以不同微球體細(xì)胞比率，與C3d-或者BSA-包被的小珠結(jié)合的Raji細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
可以看出mAb 2B12的加入完全抑制了對Raji細(xì)胞的C3d特異性結(jié)合。利用mAb HB5觀察到很小程度的抑制作用，尤其在較低的微球體細(xì)胞比率時。

*結(jié)合細(xì)胞％為標(biāo)志M1內(nèi)的細(xì)胞％。
**抑制作用％＝100×[(無Ab時M1內(nèi)的細(xì)胞％)-(Ab存在時M1內(nèi)的細(xì)胞％)/無Ab時M1內(nèi)的細(xì)胞％]實施例8 利用直接ELISA檢測2812對可溶性重組人CD21蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合用5μg/ml的重組可溶性CD21(1-2)-Ig融合蛋白質(zhì)(Hebell，同上引文)或重組可溶性CD21(1-4)-his 4℃過夜包被微量滴定板孔。
重組可溶性CD21(1-4)-his按照下述制備利用標(biāo)準(zhǔn)方法，從人脾總RNA(Clontech，Palo Alto，CA)中通過PCR擴(kuò)增含有cDNA的片斷，所述cDNA編碼人CD21的信號肽和氨基末端前四個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。擴(kuò)增引物為5’CGCGAGCTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAATTTCTTCACA-3’(反向)(SEQ ID NO1)和5’-GATCTTATAAATATGGGCGCCGCGGGCCTG-3’(正向)(SEQ ID NO2)。反向引物編碼(His)6純化標(biāo)簽并跟著終止密碼子和Sac I限制性位點。正向引物編碼Bgl II限制性位點。將擴(kuò)增片斷按照生產(chǎn)廠家說明書(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆至pCR2.1-TOPO質(zhì)粒中。克隆片斷(SEQ ID NO3)的核酸序列通過利用Retrogen引物延伸測序服務(wù)(San Diego，CA)確證。CD21編碼序列以小寫字母表示；擴(kuò)增引物序列以大寫字母表示；Bgl II和Sac I限制性位點以下劃線標(biāo)出。
5’-AGATCTTATAAATatgggcg ccgcgggcct gctcgqggtt ttcttggctc tcgtcgcacc gggggtcctcgggatttctt gtggctctcc tccgcctatc ctaaatggcc ggattagtta ttattctacc cccattgctg ttggtaccgtgataaggtac agttgttcag gtaccttccg cctcattgga gaaaaaagtc tattatgcat aactaaagac aaagtggatggaacctggga taaacctgct cctaaatgtg aatatttcaa taaatattct tcttgccctg agcccatagt accaggaggatacaaaatta gaggctctac accctacaga catggtgatt ctgtgacatt tgcctgtaaa accaacttct ccatgaacggaaacaagtct gtttggtgtc aagcaaataa tatgtggggg ccgacacgac taccaacctg tgtaagtgtt ttccctctcgagtgtccagc acttcctatg atccacaatg gacatcacac aagtgagaat gttggctcca ttgctccagg attgtctgtgacttacagct gtgaatctgg ttacttgctt gttggagaaa agatcattaa ctgtttgtct tcgggaaaat ggagtgctgtcccccccaca tgtgaagagg cacgctgtaa atctctagga cgatttccca atgggaaggt aaaggagcct ccaattctccgggttggtgt aactgcaaac tttttctgtg atgaagggta tcgactgcaa ggcccacctt ctagtcggtg tgtaattgctggacagggag ttgcttggaccaaaatgcca gtatgtgaag aaattCACCA CCACCACCAC CACTAAGAGC TC-3’(SEQ IDNO3)克隆的核酸序列(SEQ ID NO4)含有編碼CD21序列的開放閱讀框，見下述。推定的信號肽和(His)6純化標(biāo)簽以下劃線標(biāo)出。
MGAAGLLGVFLALVAPGVLGISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGEKSLLCITKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKTNFSMNGNXSVWCQANNMWGPTRLPTCVSVFPLECPALPMIHNGHHTSENVGSLAPGLSVTYSCESYLVGEKIINCLSSGKWSAVPPTCEEARCKSLGRFPNGKVKEPPILRVGVTANFFCDEGYRLQGPPSSRCVLAGQGVAWTKMPVCEEIHHHHHH(SEQ ID NO4)利用Bgl II和Sac I限制性內(nèi)切酶將SEQ ID NO3中的限制性片斷從pC R2.1-TOPO上釋放，并利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其亞克隆至表達(dá)載體pBacPAK8(Clontech，Palo Alto，CA)中，pBacPAK8已經(jīng)利用相同的限制性內(nèi)切酶線性化。產(chǎn)生的表達(dá)載體上的CD21片斷的核酸序列(CD21SCR1-4)通過利用Retrogen引物延伸測序服務(wù)(San Diego，CA)確認(rèn)。
按照生產(chǎn)廠家的說明書，利用BaculoPlatinumTM共轉(zhuǎn)染載體(Orbigen，San Diego，CA)將CD21SCR1-4轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞中。收集病毒顆粒并按照標(biāo)準(zhǔn)方法利用Sf9細(xì)胞的再感染產(chǎn)生高滴度的原種。重組蛋白質(zhì)SCD21(1-4)-組氨酸通過用高滴度病毒感染TN5昆蟲細(xì)胞，并孵育約50小時而產(chǎn)生。重組sCD21(1-4)-his蛋白質(zhì)按照生產(chǎn)廠家的說明書利用在Ni-NTA瓊脂糖(QIAGEN，Valencia，CA)上的鎳螯合層析收集。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見于Prodinger WM等人，Immunopharmacology(1997)39141-8。
相應(yīng)的對照為用小鼠IgGλ(Ig融合部分的同種型)或者用其它含組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)包被的孔。在將孔用1％BSA/PBS溶液封閉1小時后，將孔洗滌，隨后加入測試抗體(兩個重復(fù))并將滴定板在室溫下孵育1小時。將滴定板洗滌并向孔中加入第二山羊抗-小鼠Igκ-堿性磷酸酶抗體，室溫下30分鐘。將滴定板洗滌并加入酚酞單磷酸底物(PPMP)顯色。
典型的OD結(jié)果為
sCD21包被孔 MoIg包被孔正常小鼠血清1∶2500 0.055 0.061OKB7(小鼠抗-人CD21)1∶2500 0.44 0.0962B12培養(yǎng)物上清 0.65 0.045對照培養(yǎng)基 0.041 0.041實施例9 通過細(xì)胞ELISA檢測2B12對Raji細(xì)胞的結(jié)合將Raji細(xì)胞在HFN(含有1％v/v FBS和0.05％ w/v NaN3的Hanks平衡鹽溶液(HBSS))中洗滌一次并等分加入微量滴定板的孔中。所有步驟均在4℃下進(jìn)行。將微量滴定板離心并移去上清。向孔中加入測試抗體，將微量滴定板振蕩并孵育30分鐘。隨后通過4個循環(huán)的加入HFN然后離心并移去上清洗滌來洗滌細(xì)胞。加入HFN中的第二堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，將微量滴定板振蕩并孵育30分鐘。將細(xì)胞如上所述再次洗滌。加入PPMP底物溶液并孵育30分鐘，之后將微量滴定板在550nm讀數(shù)確定OD。
典型的OD結(jié)果為加入OD 550nm對照培養(yǎng)物上清0.0922B12上清 2.451小鼠IgG 0.072抗-人CD21 mAb BE-50.546抗-人CD21 mAb Bly-4 1.171實施例10 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測2B12對Raji細(xì)胞的結(jié)合將Raji細(xì)胞在冷的PFN(含有1％FBS和O.1％NaN3的PBS)中洗滌并以2×105/樣品分成小份加入FACS小管。將測試樣品加至細(xì)胞(例如雜交瘤上清，純化的mAb)，混和并在4℃下孵育20分鐘。將細(xì)胞在PFN中洗滌并加入第二熒光素偶聯(lián)Ab(例如山羊抗小鼠IgG(H+L)-FITC，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。將細(xì)胞再次在4℃下孵育20分鐘并隨后洗滌。通過加入碘化丙錠至終濃度為PFN中的2μg/ml從流式細(xì)胞分析中排除死細(xì)胞。隨后在FACSCCalibur上分析細(xì)胞，并利用MFI測量染色的強(qiáng)度。典型的結(jié)果顯示如下條件 平均熒光指數(shù)(MFI)單獨的Raji 5+對照培養(yǎng)基4+2B12培養(yǎng)物上清165+OKB7*123+BE-5**85+HB5***117*OKB7來自O(shè)rtho Diagnostics(Raritan，NJ)**BE-5來自BioSource International(Camarillo，CA)***HB5來自BD Pharmingen(La Jolla，CA)實施例11 2B12對Raji細(xì)胞CD21的免疫沉淀將人B類淋巴母細(xì)胞系Raji細(xì)胞進(jìn)行表面生物素化并溶于含有去污劑的緩沖液中。將細(xì)胞裂解物與來自骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0(陰性對照)，或來自雜交瘤HB5(小鼠抗人CD21結(jié)構(gòu)域3-4)，或來自測試雜交瘤2B12的培養(yǎng)上清一起孵育。隨后，將裂解物與兔抗小鼠多克隆抗體孵育，接著與含有殺死的金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)生物體的蛋白質(zhì)-A(PansorbinTM)孵育，由此收集免疫復(fù)合體。從這些初級免疫沉淀得到的沉淀物通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜，利用過氧化物酶偶聯(lián)的鏈親合素顯象并隨后通過化學(xué)發(fā)光法顯示。
為證明已知的抗-CD21 mAb和測試2B12抗體識別相同的分子，將每一來自初級免疫沉淀的上清分成3部分，并利用相同的抗體進(jìn)行第二輪的免疫沉淀。
本實驗的結(jié)果毫無疑義地證明，mAb 2B12與mAb HB5識別同一分子。首先，它們都直接免疫沉淀相同大小約140kD的分子。其次，利用mAb HB5去除了CD21的上清也去除了被mAb 2B12識別的分子。相反地，去除了被2B12識別的分子的上清也去除了被HB5免疫沉淀的CD21。因此，mAb HB5和2B12都免疫沉淀來自Raji細(xì)胞的CD21。
盡管為清楚和易于理解起見，前述發(fā)明已經(jīng)通過說明和實例被詳細(xì)地描述，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以進(jìn)行某些改變和修飾。因此，本描述和實例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍，所述本發(fā)明范圍通過附加的權(quán)利要求描繪。
權(quán)利要求
1.治療患有抗體介導(dǎo)的病變的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量的干擾C3d結(jié)合至CD21的藥劑，由此改善此抗體介導(dǎo)的病變的癥狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抗體介導(dǎo)的病變?yōu)樽陨砻庖卟　?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中自身免疫病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抗體介導(dǎo)的病變?yōu)楫惙N移植排斥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抗體介導(dǎo)的病變?yōu)榧谞钕傺住?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中藥劑為特異性結(jié)合至CD21的與C3d結(jié)合的區(qū)域的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述區(qū)域包含短共有區(qū)域1和短共有區(qū)域2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述區(qū)域包含短共有區(qū)域1或者它的一部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述區(qū)域包含短共有區(qū)域2或者它的一部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥劑為抗體。
11.延緩個體中與抗體介導(dǎo)的病變相關(guān)的癥狀發(fā)展的方法，其包括向所述個體施用有效量的干擾C3d結(jié)合至CD21的藥劑，由此延緩抗體介導(dǎo)的病變的癥狀發(fā)展。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中抗體介導(dǎo)的病變?yōu)樽陨砻庖卟　?br> 13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中自身免疫病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中抗體介導(dǎo)的病變?yōu)楫惙N移植排斥。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中抗體介導(dǎo)的病變?yōu)榧谞钕傺住?br> 16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中藥劑為特異性結(jié)合至CD21的與C3d結(jié)合的區(qū)域的抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述區(qū)域包含短共有區(qū)域1和短共有區(qū)域2。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述區(qū)域包含短共有區(qū)域1或者它的一部分。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述區(qū)域包含短共有區(qū)域2或者它的一部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述藥劑為抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供利用抑制CD21/C3d相互作用的藥劑改善抗體介導(dǎo)的病變的一種或多種癥狀而治療抗體介導(dǎo)的病變，諸如自身免疫病(例如SLE、ITP和甲狀腺炎)的方法。本發(fā)明也提供利用抑制CD21/C3d相互作用的藥劑延緩抗體介導(dǎo)的病變發(fā)展的方法。
文檔編號A61P37/06GK1511041SQ02810098
公開日2004年7月7日 申請日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月17日
發(fā)明者M·D·林尼克, M－A·坎貝爾, M D 林尼克, 脖炊 申請人:拉喬拉制藥公司