專利名稱：由蛋黃抗體制成的免疫共軛物及其成型方法和在診斷和治療中的應(yīng)用的制作方法
根據(jù)權(quán)利要求1、13、14和16，本發(fā)明涉及由蛋黃抗體制成的免疫共軛物及其成型方法和在診斷和治療中的應(yīng)用。
為了更好地理解本發(fā)明，當(dāng)本領(lǐng)域中的術(shù)語(yǔ)出現(xiàn)在申請(qǐng)中時(shí)，將會(huì)被詳細(xì)的定義，在本申請(qǐng)中，這些術(shù)語(yǔ)不會(huì)有別的意思。
“無(wú)特定病原體雞”(簡(jiǎn)稱“SPF雞”)根據(jù)歐洲藥典和DAB10的指南，這些“SPF雞”是從SPF母雞遺傳下來(lái)的動(dòng)物，從它們生下來(lái)的第一天，就保持在SPF狀態(tài)。這些動(dòng)物不含人和禽病原體及它們的抗體。
“IgY”(免疫球蛋白蛋黃)這是從禽蛋蛋黃中提取出來(lái)的免疫球蛋白，和雞血清中的IgG相對(duì)應(yīng)。這些禽免疫球蛋白在結(jié)構(gòu)上和哺乳動(dòng)物IgG有區(qū)別，主要表現(xiàn)在分子量高于后者，這是因?yàn)镮gY的Fc片段中恒定區(qū)數(shù)比后者多。
“特異的IgY”它在這里指的是整個(gè)IgY中能識(shí)別用于免疫的抗原的部分，而非特異的IgY指的是整個(gè)IgY中和免疫無(wú)關(guān)的部分，它是動(dòng)物和抗原作用物質(zhì)或非病原體和病原體的接觸中形成的。
“完整抗體”它們可以理解為未片段化的免疫球蛋白，即它們含有一個(gè)Fc片段和2個(gè)Fab片段，F(xiàn)c片段包括重鏈的恒定區(qū)，而Fab片段則包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)。
“IgY片段”在本發(fā)明中，它的含義是禽免疫球蛋白中不含或含一小部分殘余Fc片段的Fab片段。出于簡(jiǎn)單，后文中的的術(shù)語(yǔ)“Fab”也可指諸如F(ab)2這樣的片段。
“Fab結(jié)構(gòu)”術(shù)語(yǔ)“Fab結(jié)構(gòu)”定義的是把2或多個(gè)不同的Fab片段合成在一起形成的結(jié)構(gòu)(2價(jià)或3價(jià)結(jié)構(gòu)等)，它能識(shí)別1或多個(gè)不同的抗原決定位點(diǎn)(單，雙或三特異性結(jié)構(gòu)等)，因此能滿足1或多種功能，換句話說，它們具單、雙和三功能。
“抗原決定位點(diǎn)”這是一個(gè)位于抗原上的分子結(jié)構(gòu)，能被抗體特異性地識(shí)別(也叫“表位”)。
“IgY制備物”它們可被理解成蛋黃抗體(IgY)，IgY片段，F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)或如果需要，也可理解成從蛋黃中提取和純化的嵌合蛋黃抗體。
“信號(hào)物質(zhì)”它們指的是能對(duì)病理或生理結(jié)果以可視或成像的方式進(jìn)行分析評(píng)價(jià)的一類物質(zhì)。
“活性劑”它指的是治療上可用的物質(zhì)，例如酶，抗生素，病毒抑制劑，細(xì)胞毒素如毒素或放射性核素，不排除也具有信號(hào)物質(zhì)性質(zhì)的活性劑。
“前體藥物”它的定義是在體內(nèi)從無(wú)活性的前期物質(zhì)原位轉(zhuǎn)化成活性劑的一類物質(zhì)。
“加強(qiáng)免疫”和“維持免疫(replenishment immunization)”這個(gè)術(shù)語(yǔ)將會(huì)和SPF雞的免疫一起提及。加強(qiáng)免疫是用來(lái)獲得最大的IgY效價(jià)。維持免疫的含義指的是通過接觸更新抗原，從而使IgY的效價(jià)直到產(chǎn)卵期末均能保持最大。
基于小鼠(鼠源MAK)或人(人MAK)的單克隆抗體的免疫共軛物是眾所周知的。把信號(hào)物質(zhì)(染料，氟化鉻，診斷用放射性核素)或活性劑(如毒素，治療用放射性核素，光敏劑，前體藥物)結(jié)合抗體的許多方法已得以建立。這使得用ELISA，RIA，熒光顯微術(shù)，脈沖細(xì)胞計(jì)量術(shù)，閃爍照相術(shù)，SPECT(單光子發(fā)射計(jì)算的斷層顯像)，PET(正電子發(fā)射斷層顯像)和光子免疫診斷等方法進(jìn)行檢測(cè)或用放射免疫療法，免疫毒素療法或光動(dòng)力學(xué)療法等方法進(jìn)行治療成為可能。
單克隆抗體的不利之處主要是抗體的單特異性及其相對(duì)復(fù)雜和昂貴的研究和成型(confectioning)。一般而言，單克隆抗體的成型必須在發(fā)酵罐中進(jìn)行，因?yàn)槔眯∈蟾顾畞?lái)生產(chǎn)單克隆抗體在許多國(guó)家是被禁止的。
哺乳動(dòng)物(如綿羊，馬，豬等)的多克隆免疫血清和免疫過的/受感染的供體(如來(lái)自HIV感染的p24抗體效價(jià)高的人的血)在不同的診斷過程及被動(dòng)免疫療法中均是重要的。從改善復(fù)雜抗原的靶向來(lái)看，這些免疫血清的單克隆性是有用的。然而，哺乳動(dòng)物或常規(guī)雞中的免疫血清含有相對(duì)少的確定的多特異性抗體混合物，其中所需的特異性抗體占一小部分，而非特異、因此也是不需要的抗體則占主要部分。從動(dòng)物保護(hù)角度來(lái)說，從哺乳動(dòng)物中獲得免疫血清幾乎不可接受，原因是這種做法在若干國(guó)家很大程度上被禁止。從人血捐贈(zèng)者中獲取免疫血清是昂貴的，也不是絕對(duì)沒危險(xiǎn)的(傳播病毒，如HIV，HCV，甚至可能是朊病毒)，同時(shí)也涉及到倫理問題，因此，從寬的應(yīng)用范圍來(lái)說，這種做法不可行。
在這些蛋黃抗體(IgY)中，禽源多克隆抗體也是眾所周知的。當(dāng)前，由不同制造者提供的IgY在用于體外診斷時(shí)，可以作為哺乳動(dòng)物免疫血清或單克隆抗體的一種替代抗體。專業(yè)文獻(xiàn)也提及到了如何將蛋黃抗體和生物素，F(xiàn)ITC或辣根過氧化物酶(POD)偶聯(lián)，從而使其在體外診斷中有用的例子(Schade等，2001[1])。
口服常規(guī)雞的禽源抗體也是眾所周知的。人用藥的腸胃外施用方式迄今大都是避免的，一方面是由于種系間隔，哺乳動(dòng)物IgY既不能和補(bǔ)體因子C1，也不能和Fc受體偶聯(lián)，這樣它就不能有效地和哺乳動(dòng)物防衛(wèi)系統(tǒng)相互作用，另一方面是因?yàn)镮gY可能會(huì)引起過敏反應(yīng)。此外，從常規(guī)雞的蛋黃中獲得IgY也無(wú)效率，而從純度和親和力來(lái)說，這種IgY質(zhì)量次。原因是常規(guī)雞會(huì)形成許多針對(duì)別的微生物作用的非特異性抗體，而對(duì)靶免疫源的應(yīng)答也就相對(duì)弱，持續(xù)時(shí)間短。由于這個(gè)原因，在常規(guī)雞的免疫中，相對(duì)全部IgY，特異性IgY的比例遠(yuǎn)小于10％(美國(guó)專利4,550,019，Hansen等，1998[2]；Bouhours等，1998[3]，Gassmann等，1990[4])。
本領(lǐng)域最接近的現(xiàn)有技術(shù)在一個(gè)德國(guó)專利說明書195 04 755中所描述，它涉及用IgY對(duì)HIV感染進(jìn)行被動(dòng)免疫治療。來(lái)自特異性(SPF)雞的IgY被靶向到HIV核心抗原p24和p17上。用人免疫血清進(jìn)行被動(dòng)免疫療法也是眾所周知的。和免疫血清與單克隆抗體相比，IgY的獲得更容易和更便宜。用實(shí)施例2所述的免疫方案進(jìn)行基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫的SPF雞每個(gè)星期將會(huì)產(chǎn)5-7個(gè)蛋，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)16個(gè)月。因?yàn)閼{經(jīng)驗(yàn)，一個(gè)蛋黃包含至少50mg具所需特異性的IgY，就此而論，從250-350個(gè)SPF雞蛋中，能獲得大約15000mg的特異性IgY。此外，由于對(duì)這些動(dòng)物規(guī)定了一些特異性處理，SPF雞所受的污染顯著低于農(nóng)場(chǎng)用來(lái)產(chǎn)肉和產(chǎn)蛋的普通雞。因此，抗多達(dá)19種在常規(guī)雞養(yǎng)殖中常見的具商業(yè)意義的傳染病的通常主動(dòng)免疫，包括兩次規(guī)定的接種也被消除了。這些免疫說明常規(guī)雞IgY制備物的低質(zhì)量及分離特異性IgY的復(fù)雜性和費(fèi)用。SPF雞的飼養(yǎng)場(chǎng)所沒有人和禽病原體病菌。為了排除食物中的病原菌，水和免疫狀態(tài)都是調(diào)節(jié)控制的。為了防止動(dòng)物SPF的隱匿狀態(tài)，食物沒加抗生素。
從醫(yī)學(xué)角度來(lái)說，IgY的優(yōu)點(diǎn)一般在于特異性抗體對(duì)若干抗原決定簇的識(shí)別，這樣就能保證改善目標(biāo)抗原的靶向，因?yàn)榭贵w是來(lái)自禽類，以及在于禽類的免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物和人的免疫系統(tǒng)在抗原識(shí)別方面是有差異的事實(shí)。由于禽類免疫系統(tǒng)能識(shí)別(系統(tǒng)發(fā)生上調(diào)節(jié)的)與人免疫系統(tǒng)不同的抗原決定簇，這樣就增強(qiáng)了目標(biāo)抗原的靶向作用。因此，病人身上天然存在的抗體和禽類體內(nèi)抗體之間對(duì)表位的競(jìng)爭(zhēng)就會(huì)下降。而且，禽類抗原既不能和人補(bǔ)體系統(tǒng)也不能和Fc受體，蛋白A或蛋白G作用，這種假定的缺點(diǎn)在許多情況下并不顯著，甚至于變成了優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的目的就是開發(fā)和利用傳統(tǒng)的免疫共軛物的替代物，它們適用于診斷和治療，并且從純度和抗原靶向來(lái)說，要優(yōu)于單克隆抗體和哺乳動(dòng)物的免疫血清以及常規(guī)雞的IgY制備物。此外，基本上不會(huì)形成人抗IgY的抗體，而且大量制備免疫共軛物是有成本效益的，也符合動(dòng)物保護(hù)。
在本發(fā)明描述之前，還有一些術(shù)語(yǔ)將會(huì)被定義，以便于在后面的本發(fā)明描述和專利的權(quán)利要求書中便于理解。在本申請(qǐng)中，它們沒有別的意思。
“放射性免疫共軛物”在這個(gè)申請(qǐng)中，它指的是SPF雞或轉(zhuǎn)基因SPF雞的IgY制備物與診斷和/或治療用放射性核素和/或加強(qiáng)分子結(jié)合并用于核醫(yī)學(xué)診斷和/或放射性免疫療法方面的制備物。
“免疫毒素”它是和毒素(植物毒素，細(xì)胞抑制劑，化療藥物，抗生素等)結(jié)合的Ig制備物制劑，并用于免疫毒素療法中。
“特異性靶向”它指通過免疫球蛋白，把信號(hào)物質(zhì)或活性劑結(jié)合到所需的目標(biāo)抗原上的過程。
“預(yù)靶向”在這方面，它的應(yīng)用包括在抗原連接和信號(hào)物質(zhì)/或活性劑之間的任何階段，通過進(jìn)一步插入另一物種的抗體或別的合適分子(本文還有一個(gè)通名“加強(qiáng)分子”)，能引起IgY制備物信號(hào)或效果增強(qiáng)。
“嵌合的蛋黃抗體”它的意思是指1)把雞Fab片段和人IgG的Fc片段通過生化手段連接在一起的人源化免疫球蛋白，或2)轉(zhuǎn)基因SPF雞的人源化免疫球蛋白，其中編碼IgY恒定區(qū)的基因部分或多或少地被人IgG恒定區(qū)所取代。
“IgY共軛物”在本申請(qǐng)中，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括多克隆IgY制備物(免疫組分)和信號(hào)物質(zhì)和/或活性劑(診斷或治療用組分)和/或加強(qiáng)分子結(jié)合的制備物。
根據(jù)本發(fā)明，通過完整的蛋黃抗體(IgY)，IgY片段，F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)或來(lái)自SPF雞，優(yōu)選來(lái)自轉(zhuǎn)基因SPF雞的人源化蛋黃抗體結(jié)合的多克隆IgY共軛物可以完成目標(biāo)。作為一種免疫活性成分，抗體或抗體片段至少可以結(jié)合一種別的成分，它可以是信號(hào)物質(zhì)、活性劑或加強(qiáng)分子。
本發(fā)明涉及IgY共軛物在醫(yī)學(xué)診斷和治療中的應(yīng)用，以及涉及在動(dòng)物(如小鼠，綿羊或非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物)中的實(shí)驗(yàn)用途。它的使用并不局限于腸胃外應(yīng)用，而是取決于應(yīng)用的目標(biāo)，它包括外用(如對(duì)黑色素瘤)和內(nèi)用(如對(duì)食管癌)。
此外，本發(fā)明也涉及到IgY共軛物的成型，作為備用的診斷劑或藥物，既可作為單獨(dú)的成分，作標(biāo)記試劑盒，也可作為備用的制備物?？紤]的目標(biāo)抗原均是蛋白，多肽，糖蛋白，核酸，多糖和脂蛋白。首先，本發(fā)明涉及抗腫瘤抗原，激素，受體蛋白，RNS和DNS部分，傳染性病原體，朊病毒或這些目標(biāo)抗原的部分抗原決定簇的IgY共軛物。IgY共軛物包括多特異性IgY的多少取決于用于免疫的抗原的復(fù)雜性。
本發(fā)明的其他方面涉及預(yù)靶向方法，在這種方法中，或1)生物素化的IgY和目標(biāo)抗原相連，用作標(biāo)記的親和素或鏈親和素的媒介，或2)未結(jié)合的IgY和目標(biāo)抗原相連，用作人或人源化抗IgY結(jié)合物的媒介。在第一種情況下，生物素和親和素或鏈親和素酸之間強(qiáng)鍵結(jié)合，因此IgY共軛物中的生物素成分也可稱作加強(qiáng)分子。
最后，本發(fā)明涉及IgY共軛物的制備物及其應(yīng)用，通過這些制備物和應(yīng)用，IgY共軛物的診斷和/或治療特性可以被改善，如手術(shù)過程，化療，免疫調(diào)節(jié)劑和旁免疫誘導(dǎo)劑(paraimmunity inducer)。
本發(fā)明的IgY共軛物中和本發(fā)明直接相關(guān)的成分，它們的功能，效果及應(yīng)用將在后面詳細(xì)表征，它們的溶液也會(huì)詳細(xì)列舉出來(lái)。
a)免疫成分根據(jù)本發(fā)明，免疫活性成分由下列任一組成1)完整的蛋黃抗體(IgY)，IgY片段，F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)或2)嵌合的蛋黃抗體，即通過生化手段人源化的IgY或，優(yōu)選的是通過遺傳技術(shù)從轉(zhuǎn)基因SPF雞的蛋中獲得的人源化IgY。
在這點(diǎn)上，F(xiàn)ab片段可以是一價(jià)、二價(jià)或三價(jià)，可以單特異性、雙特異性或三特異性方式發(fā)揮效應(yīng)(即它們可以識(shí)別一個(gè)、二個(gè)或不同的抗原決定簇)。Fab片段可以通過酶消化產(chǎn)生。嵌合抗體可以通過把禽源片段和另一生物的Fc片段連接而成(在這點(diǎn)上，優(yōu)選的是人Fc片段)。可以從轉(zhuǎn)基因雞中獲得人源化的IgY，其中只有高可變區(qū)是來(lái)自雞IgY，而所有的恒定區(qū)均來(lái)自人IgG。利用嵌合抗體，不僅可能減少或防止抗IgY的不需要抗體的形成，而且使得利用人IgG恒定區(qū)的效應(yīng)機(jī)制成為可能。
b)信號(hào)物質(zhì)包含在本發(fā)明的IgY共軛物中的診斷用成分是信號(hào)物質(zhì)，如放射性核素(γ發(fā)射體，如锝99m，銦111，碘123，碘125，碘131，鉈201，硒75，鎵67，氙133)，酶(如過氧化物酶，堿性磷酸酶和半乳糖苷酶)，光敏劑(卟啉衍生物等)或染料(氟化鉻，膠體金)。10-1850MBq(27-50mCi)的活性對(duì)閃爍照相診斷是必需的，這取決于應(yīng)用的目的方式，抗體親和力及核素。具體而言，例如，對(duì)于碘131，37-370MBq(1-10mCi)(優(yōu)選的是37-74MBq)可以考慮，對(duì)于碘123，185-370MBq(5-10mCi)可以考慮，對(duì)于锝99m，74-1480MBq(2-40mCi)(優(yōu)選的是74-740MBq(2-20mCi))可以考慮，對(duì)碘111和鎵67，74-185MBq(2-5mCi)可以考慮，或者對(duì)于硒75，大約10MBq(27mCi)則可以考慮。
c)活性劑作為一種治療成分，本發(fā)明的IgY共軛物可選擇性地或附帶地包含放射性核素(β發(fā)射體，α發(fā)射體或螺旋電子發(fā)射體)，例如，磷32，鍶89，釔90，碘125，碘131，釤153，鉺169，錸186，錸188，氪85，鈥166，砹21，鉍212，鉍213，鐳224，錒225。像診斷中一樣，發(fā)射性免疫療法中所需的活性取決于幾個(gè)因素疾病的種類，病變細(xì)胞對(duì)放射的敏感度，將要治療的細(xì)胞的質(zhì)量，擴(kuò)散的程度及模式，抗原表達(dá)，應(yīng)用方式，抗體親和力及放射性核素的能譜。例如，對(duì)于碘131，活性范圍在370MBq-11.1 GBq(10-30mCi)均可考慮。一般而言，這些活性只能用一次，但可以每隔幾周或幾個(gè)月(優(yōu)選3-6周)分級(jí)發(fā)生，或者在恢復(fù)原狀時(shí)，它們可被重復(fù)直至總劑量為40-80GBq(1-2Ci)。腫瘤特異性IgY和細(xì)胞抑制劑的結(jié)合可以減少傳統(tǒng)化療的不利。腫瘤學(xué)中的一個(gè)最大的問題是在階段檢查中有限診斷的不確定性(尤其缺乏技術(shù)來(lái)證明或排除微轉(zhuǎn)移的存在)以及由于高毒性及同時(shí)產(chǎn)生的低特異性而導(dǎo)致細(xì)胞抑制劑窄的治療范圍。相對(duì)治療過程而言，這些因子會(huì)不停地導(dǎo)致顯著的不確定性。由于抗體而產(chǎn)生的具低副作用的特異細(xì)胞抑制劑將有利于對(duì)化療做出決定，也因此將會(huì)有助于減少?gòu)?fù)雜的昂貴的和/或費(fèi)力的階段檢查。從本發(fā)明來(lái)說，蛋黃抗體也可和不同的細(xì)胞抑制劑結(jié)合(如alkylants，長(zhǎng)春花生物堿，居間抗生素，抗代謝物，紫杉醇)。本發(fā)明的IgY共軛物也可包含作為治療活性成分的毒素(蓖麻毒蛋白A，相思豆毒蛋白，假單孢菌外毒素，白喉毒素，gelonin及其它)。化療藥物(細(xì)胞抑制劑，抗生素，抗病毒物質(zhì))，纖溶劑(如鏈激酶，尿激酶，rt-PA)，用來(lái)激活前體藥物的酶(如細(xì)菌羧肽酶ECPG2，它能催化還原或非還原葉酸的水解)或前體藥物本身也適合作為本發(fā)明的IgY共軛物中的治療成分。最后，本發(fā)明的IgY共軛物可以包含作為有效成分的光敏物質(zhì)，用于通過光動(dòng)力學(xué)療法來(lái)選擇性地破壞病變細(xì)胞。例如，光敏劑可以是photofrin，5-氨基乙酰丙酸或Foscan。
d)加強(qiáng)分子對(duì)于診斷和治療應(yīng)用，本發(fā)明的IgY共軛物可以包含生物素，用來(lái)增強(qiáng)以親和素-生物素或鏈親和素-生物素結(jié)合為基礎(chǔ)的信號(hào)和效果(所謂的預(yù)靶向)。此外，IgY共軛物的信號(hào)和效果可以通過與IgY分子進(jìn)一步結(jié)合成分(如補(bǔ)體)而得到增強(qiáng)。
e)佐劑，補(bǔ)充措施為了優(yōu)化治療的目標(biāo)，本發(fā)明的IgY共軛物可以和別的活性劑結(jié)合。禽源抗體可以起始人抗IgY抗體的形成。這樣，IgY共軛物的重復(fù)使用會(huì)中和用于診斷和治療的抗體或甚至于產(chǎn)生過敏反應(yīng)。例如可以利用環(huán)孢菌素來(lái)抑制免疫系統(tǒng)，從而防止這種現(xiàn)象發(fā)生。另一方面，使用放射性碘可以導(dǎo)致甲狀腺不需要地暴露在放射線中。為此，在這種情況下，用IgY-碘131進(jìn)行放射性治療之前，通過施用碘化鉀或高氯酸鈉來(lái)阻斷甲狀腺的功能是可取的。在病毒感染的免疫療法中，自由的病毒粒子將會(huì)誘捕IgY共軛物，這樣IgY共軛物對(duì)特異性地靶復(fù)制病毒的細(xì)胞將不再是有效的。因此，用一種或多種具抗病毒或抗反轉(zhuǎn)錄病毒活性的化療藥物進(jìn)行預(yù)處理，從而減少病毒復(fù)制的方法是可取的。如果有必要，可以暫時(shí)不施用這種藥物療法，以引發(fā)或誘導(dǎo)更新的抗原表達(dá)。此外，病毒粒子的釋放可通過穩(wěn)定細(xì)胞膜的手段(如α-干擾素)來(lái)降低。另一方面，在休眠病毒感染(如HIV或EBV感染)中，刺激感染細(xì)胞的抗原表達(dá)(如利用白細(xì)胞介素-2)或利用別的抗病毒劑(如α-干擾素和/或治療丙型肝炎過程中的三氮唑核苷)來(lái)增加IgY共軛物的有效性都是必要的。在細(xì)菌感染的治療中，進(jìn)一步補(bǔ)充施用活性劑(抗生素)是可取的。以此類推，在腫瘤病中，補(bǔ)充放射性免疫療法是必需的，這種療法通過施用細(xì)胞抑制劑或通過局部外部輻射的免疫毒素治療來(lái)進(jìn)行。一般而言，免疫成型劑或旁免疫誘導(dǎo)劑將有利地影響放射性免疫療法，免疫毒素療法或光動(dòng)力學(xué)療法的效果。
f)標(biāo)記過程許多已經(jīng)建立數(shù)年的方法均可用來(lái)放射性地標(biāo)記鼠或人單克隆抗體(Peters J.H.，Baumgarten H.(編)單克隆抗體(Monoclonal antibodies)，Springer-Verlag，Berlin，1992)。金屬的放射性核素如锝99m，銦111或砹211通常利用錯(cuò)合劑(Complexing agent)如二乙撐三胺五乙酸(DPTA)或去鐵敏(DFO)，或通過將抗體的二硫橋部分還原(如通過2-巰基乙醇)連接到抗體上。許多放射性的碘同位素也可通過直接的親電取代結(jié)合到抗體上被激活的芳族基(如酪氨酸的酚環(huán))。碘酸鉀(KIO3)，溶解的氯胺T或吸附到載體(如聚苯乙烯珠)上的氯胺T(碘代珠)或iodogen(1，2，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基-glycouril)通常被用作氧化劑，形成碘離子。每一個(gè)單獨(dú)的抗體至少可以被一種放射性的原子所標(biāo)記。為了獲得更高的親和力，而不至于對(duì)抗體特定的結(jié)合能力有不利的影響，結(jié)合必須在目標(biāo)抗原存在的情況下進(jìn)行。它隨后又被分開，因此，高可變區(qū)中放射性核素的結(jié)合得以阻止。在抗體氨基反應(yīng)的基礎(chǔ)上，氟化鉻，光敏劑，細(xì)胞抑制劑，毒素可以通過許多過程結(jié)合到抗體上，在某種程度上，也可利用商業(yè)上獲得的間隔物，在抗體中插入SH基因。其他過程是基于裂解抗體，釋放SH基，而信號(hào)物質(zhì)和活性劑可結(jié)合在SH基上。此外，抗體的碳水化合物殘基可被過碘酸所氧化，過碘酸會(huì)產(chǎn)生信號(hào)物質(zhì)和活性劑可結(jié)合的醛基。最后，雙功能或三功能Fab結(jié)構(gòu)可以通過活性劑結(jié)合到分子的一或2個(gè)Fab片段上，并利用自由的Fab片段?？康侥繕?biāo)抗原上。
g)成型方法在本發(fā)明中，帶有IgY制備物的標(biāo)記試劑盒(制劑試劑盒)可用來(lái)提供放射性免疫共軛物，以便用戶利用通常半壽期短的放射性核素將它們?cè)粯?biāo)記。假設(shè)半壽期足夠長(zhǎng)，和核素結(jié)合的IgY制備物(即完全的放射性免疫共軛物)也可直接提供給用戶。在標(biāo)記試劑盒或全部制備物中，IgY制備物或現(xiàn)成的放射性免疫共軛物以一種無(wú)菌等滲的注射液獲得，如果有必要，也可帶有合適添加劑(如穩(wěn)定劑)的緩沖液(優(yōu)選PBS，pH7.4)，并且包裝在一個(gè)合適的容器中(塑料/玻璃安瓿瓶/刺吸小瓶，假設(shè)有必要，也用鉛制容器，深層冷卻到4～-20EC)。在標(biāo)記試劑盒中，IgY制備物在第一個(gè)安瓿瓶/刺吸小瓶中，而還原劑(例如用锝99m標(biāo)記)或氧化劑(如用碘131標(biāo)記)則放在第二個(gè)安瓿瓶/刺吸瓶中。為了純化放射性免疫共軛物，每個(gè)標(biāo)記試劑盒可包含一個(gè)層析柱以及用于控制質(zhì)量的一套薄層層析裝置。根據(jù)給定的需求，標(biāo)記試劑盒可以包含用于一個(gè)或若干個(gè)應(yīng)用的IgY制備物或現(xiàn)成的IgY共軛物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了下列使用和應(yīng)用領(lǐng)域a)總的使用領(lǐng)域根據(jù)本發(fā)明，IgY制備物能和下列許多抗原反應(yīng)生理分子，腫瘤特異性抗原，傳染性的病原體及它們的抗原，朊病毒及RNS-或DNS部分或者與其相關(guān)的分子。根據(jù)信號(hào)物質(zhì)或活性劑的不同(放射性核素、酶、纖溶劑、染色劑、光敏劑、毒素)，本發(fā)明的IgY共軛物可以用于腫瘤，傳染病，凝血缺損病和自身免疫病的體外和體內(nèi)診斷和治療。
b)生理性目標(biāo)抗原根據(jù)CD分類(NK細(xì)胞抗原，B細(xì)胞抗原，myeloic抗原，祖抗原，激活抗原，附著抗原，細(xì)胞因子受體)，可視為本發(fā)明IgY共軛物的分子中有白細(xì)胞抗原，以及胞內(nèi)分子(例如細(xì)胞角蛋白)，受體(雄激素受體，雌激素受體，多巴胺D2受體或促生長(zhǎng)素抑制素受體等)或如凝血因子(如血纖蛋白或纖溶酶原)。
c)病理目標(biāo)抗原可考慮用于IgY共軛物的腫瘤特異性抗原有預(yù)定的高表達(dá)白細(xì)胞抗原(如CD20，CD22)，高表達(dá)的雄激素或雌激素受體，降鈣素，甲狀腺球蛋白以及范圍更小一點(diǎn)的腫瘤標(biāo)記物，如Egp34，Ca 15-3，唾液酸-Lea-抗原，BCA225，黑色素瘤相關(guān)抗原(MMA)，CEA，17-1A，PAP，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，溴脫氧尿苷(BrdU)，Ki67，PCNA，髓過氧化物酶(MPO)和突變的p53。可以被本發(fā)明IgY共軛物靶向的傳染性病原體有細(xì)菌(炭疽桿菌，疏螺旋體，布魯氏菌，分枝桿菌，綠膿桿菌(Pseudomonas aeroginosa)，沙門氏菌，葡萄球菌，弓形蟲，密螺旋體屬，錐蟲)，病毒(HIV-1，HIV-2，HTLV-1，HTLV-2，HCV和其它黃病毒，HBV，EBV，HSV，HHV-8，柯薩奇病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，cymegalo病毒，流感病毒，風(fēng)疹病毒，乳頭瘤病毒，登革病毒，漢坦病毒，沙粒病毒(arenavirus)，布尼亞病毒(bunyna virus)，絲狀病毒)，原生動(dòng)物(瘧原蟲，弓形蟲，棘阿米巴)，霉?jié){菌(mykoplasma)，真菌(念珠菌屬，曲霉屬)，寄生蟲(蛔蟲，棘球包蟲(echinococci)，利氏曼原蟲，羅阿絲蟲，旋盤尾絲蟲，masonella，布氏絲狀蟲，囊尾蚴，血吸蟲，班氏絲蟲)和傳染性粒子(朊病毒)。傳染性病原體的抗原決定簇在以本發(fā)明IgY共軛物作為靶的腫瘤診斷和/或治療中也很重要，如伯基特淋巴瘤，鼻咽癌，何杰金病，T細(xì)胞淋巴瘤和免疫母細(xì)胞性淋巴瘤，它們的特點(diǎn)是表達(dá)EBV相關(guān)抗原(EBNA 1-3，LMP 1-2)，在Sarkosi-Sarkom和AIDS相關(guān)淋巴瘤中，這兩種腫瘤均和HHV-8相關(guān)，或者和HTLV-1感染相關(guān)的成人T細(xì)胞白血病(ATL)或和HPV相關(guān)的生殖癌中。
d)應(yīng)用的形式根據(jù)需要，本發(fā)明的IgY共軛物可以體外或體內(nèi)應(yīng)用。體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，可以外用或內(nèi)用(如在光動(dòng)力學(xué)治療以及腸胃外應(yīng)用的情況下(如采用閃爍照相術(shù)，SPECT，放射性免疫療法或放射性毒素治療))。如在這里使用一樣，術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，鞘內(nèi)，間質(zhì)，海綿竇內(nèi)和病斑內(nèi)或腫瘤內(nèi)的應(yīng)用。
本發(fā)明將在后面的實(shí)施例中被詳細(xì)地解釋和描述。從附圖和說明書中概括出來(lái)的特征將在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中以單一形式或與相互間任何所需的組合形式應(yīng)用。下列應(yīng)用和實(shí)施方案僅僅代表一些實(shí)施例，這些實(shí)施例并沒完全提出基于SPF雞的本發(fā)明IgY共軛物的可能性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將因此會(huì)進(jìn)一步推斷出其他的實(shí)施方案和應(yīng)用，這些方案和應(yīng)用都落入了本發(fā)明權(quán)利要求中的范圍。
在附圖中

圖1描繪的是雞免疫球蛋白及用作比較的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白。
圖1a表示雞IgY。
圖1b表示哺乳動(dòng)物包括人的IgG。
圖2表示在完整IgY基礎(chǔ)上的放射性免疫共軛物。
圖3表示在單價(jià)IgY Fab片段基礎(chǔ)上的放射性免疫共軛物。
圖4描繪的是在二價(jià)IgYF(ab)2基礎(chǔ)上的放射性免疫共軛物。
圖5描繪的是三個(gè)融合的IgY Fab片段(三價(jià)Fab結(jié)構(gòu))基礎(chǔ)上的放射性免疫共軛物。
圖6描繪的是人源化IgY(IgYFab+人Fc)基礎(chǔ)上的放射性免疫共軛物。
圖7描繪的是完整IgY基礎(chǔ)上的免疫毒素。
實(shí)施例1為了獲得本發(fā)明的IgY共軛物，用50-1,000μg(優(yōu)選的是50-200μg)目標(biāo)抗原或其片段和弗氏完全佐劑，優(yōu)選在第14周對(duì)SPF雞或轉(zhuǎn)基因的SPF雞進(jìn)行皮下(s.c.)免疫，優(yōu)選的是肌內(nèi)(i.m.)免疫。緊接著3次加強(qiáng)免疫，直到IgY的效價(jià)達(dá)到最大值，然后在幾乎整個(gè)產(chǎn)蛋期分別用50-1,000μg(優(yōu)選的是50-200μg)同樣的抗原和弗氏不完全佐劑進(jìn)行三次維持免疫，以使IgY效價(jià)保持在最大。例如每次注射液包含1mL抗原懸浮液和0.5mL佐劑，因此用于SPF狀態(tài)雞的優(yōu)選的免疫方案按下列時(shí)間順序進(jìn)行。
第0天*第一次免疫(基礎(chǔ)免疫)肌內(nèi)注射；第28天第二次免疫(第一次加強(qiáng)免疫)肌內(nèi)注射；第56天第三次免疫(第二次加強(qiáng)免疫)肌內(nèi)注射，產(chǎn)生IgY；第84天第四次免疫(第三次加強(qiáng)免疫)肌內(nèi)注射，產(chǎn)生IgY；第168天第五次免疫(第一次維持免疫)肌內(nèi)注射，產(chǎn)生IgY；第252天第六次免疫(第二次維持免疫)肌內(nèi)注射，產(chǎn)生IgY；第336天第七次免疫(第三次維持免疫)肌內(nèi)注射，產(chǎn)生IgY；第490天終止產(chǎn)生IgY。
*生命的第14周。
在12-14個(gè)月時(shí)，保持在SPF狀態(tài)的雞下的蛋可以收集和加工。根據(jù)Schade等的標(biāo)準(zhǔn)方法，蛋黃最初從蛋清中分離出來(lái)，并被加工(雞蛋黃抗體的生產(chǎn)及應(yīng)用(Chicken Egg Yolk Antibodies，Production andApplication)Springer-Verlag，Berlin，2001[1])。SPF雞的明顯優(yōu)勢(shì)在于它們是SPF雞的后代并保持在SPF條件下，因此在免疫學(xué)上不會(huì)由于免疫或特異性傳染病帶來(lái)的不利影響。因此，這些動(dòng)物會(huì)和它們用來(lái)免疫的抗原產(chǎn)生特別劇烈的免疫應(yīng)答，這樣產(chǎn)生的特異抗體在量級(jí)上(50-90％的特異性IgY)要高于對(duì)常規(guī)雞的免疫。此外，在加強(qiáng)免疫后，通過重復(fù)的維持免疫長(zhǎng)達(dá)生命的16周，可使特異性抗體的高效價(jià)保持穩(wěn)定。按照本發(fā)明，這對(duì)于IgY共軛物是很有意義的，因?yàn)橐呀?jīng)很好地證明，通過對(duì)免疫記憶不停的刺激，使淋巴細(xì)胞群發(fā)生改變，從而形成特別高親和力的抗體。出于這個(gè)原因，來(lái)自SPF雞蛋中的IgY制備物和來(lái)自常規(guī)雞的IgY制備物在對(duì)特異性抗原的親和力上也存在差異。在一個(gè)分子平面上，更高親和力被這些抗體的高可變區(qū)的結(jié)構(gòu)所制約，相對(duì)于低親和力抗體的高可變區(qū)的結(jié)構(gòu)，它們和抗體更匹配。按照本發(fā)明，來(lái)自SPF雞的IgY共軛物在最終的分析中，和來(lái)自常規(guī)雞的IgY共軛物在分子平面(即它們高可變區(qū)的特定結(jié)構(gòu))上存在可復(fù)制的差異。
實(shí)施例2本實(shí)施例描述的是來(lái)自轉(zhuǎn)基因雞的人源化的IgY的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)染以如美國(guó)專利5,162,215,6,020,465和WO 00/75300所描述的本身已知的方式進(jìn)行。它也可以通過對(duì)公雞的精子進(jìn)行微注射來(lái)完成。這個(gè)特征然后通過人工授精插入卵細(xì)胞并傳給后代。此外，也可通過對(duì)精子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒感染來(lái)完成轉(zhuǎn)染。一個(gè)復(fù)制缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶有人Fc片段基因，人IgG恒定區(qū)的基因片段可以通過同源重組整合進(jìn)SPF雞的免疫球蛋白基因位點(diǎn)。其中在人的“敲進(jìn)(knock in)”基因靶向載體攜帶有和人IgG恒定區(qū)的外顯子同源的序列和啟動(dòng)子。新霉素，胸苷激酶表達(dá)盒及禽源IgY恒定區(qū)的缺失均可利用短暫的Cre-重組酶表達(dá)來(lái)完成。用這種方式，轉(zhuǎn)基因雞通過微生物途徑把人源化IgY的基因傳遞給它們的后代。轉(zhuǎn)基因雞的選擇可利用血液或雞蛋白的人恒定區(qū)來(lái)證明IgY。ELISA，Western印跡或PCR適合用來(lái)檢測(cè)人源化抗體。
實(shí)施例3
由于完整抗體從血液中消失得慢(HWZ1-3)，因此在免疫閃爍照相中，其通常有足夠長(zhǎng)的檢查時(shí)間，直到獲得將要呈遞的病斑和背景之間的最佳對(duì)照。在治療應(yīng)用中，問題更可能存在于難以把完整的抗體放入實(shí)體瘤或血腦屏障之外的事實(shí)。出于這個(gè)原因，在某些情況下，基于Fab片段的共軛物會(huì)提供一些明顯的優(yōu)勢(shì)。為了制造Fab共軛物，用實(shí)施例1所描述的方法，用50-1,000μg(優(yōu)選的是50-200μg)目標(biāo)抗原或其片段對(duì)SPF雞或轉(zhuǎn)基因雞進(jìn)行免疫。這些雞蛋用上述的方式進(jìn)行加工，而IgY通過親和層析從特定抗原(目標(biāo)抗原)中分離出來(lái)，然后完整的抗體通過酶裂解如利用胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)進(jìn)行酶解，從而獲得Fab和Fc片段。根據(jù)特異性的抗原，特異性的Fab片段從Fc片段和非特異性Fab片段中通過親和層析被分開和分離出來(lái)。用這種方式得到的Fab片段在無(wú)菌環(huán)境下過濾。它們可以標(biāo)記試劑盒的形式用于臨床，和一種半壽期短的放射性核素(如锝99m)結(jié)合，這種試劑盒的第二個(gè)刺吸小瓶中裝的是用于標(biāo)記的還原劑。放射性的免疫共軛物也可以由制造者用半壽期長(zhǎng)的放射性核素(如碘131)集中標(biāo)記，然后被分發(fā)。在這種情況下，按照當(dāng)前管理放射性保護(hù)的規(guī)則，運(yùn)輸?shù)接脩羰种斜仨毷窃跇?biāo)記的同一天，這樣就能使由于放射性核素衰變及抗體解離而導(dǎo)致的產(chǎn)物質(zhì)量損失降到最低。如果IgY制備物是和化療藥物，毒素，氟化鉻，酶或前體藥物結(jié)合，集中標(biāo)記也有可能。
實(shí)施例4如今，不明確的貴重放射性源通過粒細(xì)胞閃爍照相術(shù)可通過一種有差異的診斷方式加以闡明。目前用的鼠源單克隆抗體均能識(shí)別在早幼粒細(xì)胞，中幼粒細(xì)胞和粒細(xì)胞中表達(dá)的非特異交叉反應(yīng)的抗原，不管是NCA-95(＝CD66b)還是NCA-90(＝CD66c)。它們標(biāo)記有診斷用放射性核素(γ發(fā)射體)，然后通過靜脈內(nèi)注射。在血液和傳染源中，它們和粒細(xì)胞結(jié)合。通過這種方式，感染過程，如骨髓炎，能通過閃爍照相術(shù)顯示出來(lái)。為了制造本發(fā)明的放射性免疫共軛物，采用如實(shí)施例1所述的方式，SPF雞用NCA-90或NCA-95或其片段免疫和加強(qiáng)免疫。NCA-90或NCA-95特異性IgY分別根據(jù)NCA-90和NCA-95，通過親和層析分離出來(lái)。然后，無(wú)菌的IgY作為一種標(biāo)記試劑盒在商業(yè)上銷售，例如，帶有1mg的等滲NaCl，第二個(gè)刺吸瓶中有還原劑。為了標(biāo)記锝99m，用戶原位制備的抗NCA-IgY-Tc-99m在利用試劑盒附帶的柱子分離出未結(jié)合的放射性核素，并且用高效液相層析(HPLC)，或者優(yōu)選采用薄層層析對(duì)終產(chǎn)物的放射性化學(xué)純度進(jìn)行最終質(zhì)量控制后可以通過靜脈注射。和只能識(shí)別和結(jié)合一個(gè)抗原決定簇的常規(guī)單克隆抗體相比，NCA90或NCA95上不同的抗原決定簇可以同時(shí)被多克隆的蛋黃抗體識(shí)別，從而導(dǎo)致相對(duì)背景而言帶有高特異吸收的改進(jìn)的圖像再現(xiàn)。
實(shí)施例5IgY共軛物也可用來(lái)檢測(cè)淋巴結(jié)。當(dāng)淋巴腺和惡性黑色素瘤，乳房或前列腺癌一起出現(xiàn)時(shí)，擴(kuò)大的淋巴腺切除通常和高的發(fā)病率聯(lián)系在一起。從這個(gè)原因考慮，對(duì)位于腫瘤旁流區(qū)域的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測(cè)可以為治療過程提供很重要的信息。迄今為止，用標(biāo)記有Tc99m或Tc99m毫微膠體(nanocolloid)的膠體白蛋白(colloidal albumen)進(jìn)行了這方面的工作。這個(gè)粒子的直徑是100-1,000nm。在瘤周圍注射放射性膠體后，用γ相機(jī)上，以15分鐘到大約6小時(shí)的間隔，按規(guī)定程序制作三個(gè)連續(xù)的平面圖。這個(gè)方法的缺點(diǎn)在于粒子的大小和缺乏腫瘤特異性。一方面，大量的放射性活性劑仍留在注射位點(diǎn)，使通過多余輻射進(jìn)行的淋巴結(jié)呈遞變得復(fù)雜。另一方面，不用感染而能進(jìn)行淋巴結(jié)的呈遞也就被證明了。相反，如果應(yīng)用淋巴細(xì)胞特異或腫瘤特異的放射性免疫共軛物，這些缺點(diǎn)在一定程度上或全部被避免。溶解的IgY或Fab共軛物通過淋巴通道比膠體白蛋白引流得更快，這樣就使得注射位點(diǎn)的殘余活性更少，因此淋巴結(jié)就更高密可見。同時(shí)，由于抗體能結(jié)合到與淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的淋巴結(jié)上，所以產(chǎn)生了一種特異性的檢測(cè)方法。這些淋巴結(jié)也可能在手術(shù)期內(nèi)檢查，然后用合適的γ探針切除。此外，或者說除了檢查淋巴結(jié)外，如果在診斷中使用了含治療用核素(如碘131)或毒素(紫杉醇)的IgY共軛物或第二IgY共軛物，那些淋巴結(jié)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移容易遭受大量的選擇性放療或化療。可以用抗p210的放射性免疫共軛物來(lái)檢查黑色素瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，p210是一種黑色素瘤相關(guān)抗原(MAA)。為了獲得本發(fā)明的放射性免疫共軛物，根據(jù)實(shí)施例1，用50-1,000μg(優(yōu)選的是50-200μg)p210對(duì)SPF雞進(jìn)行免疫。IgY從蛋黃中被分離出來(lái)。然后用無(wú)菌方式過濾純化的IgY，并把它凍干或懸浮在滅菌的等滲PBS(pH7.4)中。例如，從商業(yè)上獲得的制備物試劑盒包含，在第一個(gè)刺吸小瓶中有100mg特異性IgY，而第二個(gè)刺吸小瓶中則是用Tc99m標(biāo)記的還原劑。在計(jì)劃?rùn)z查之前，IgY制備物和10-1,000MBq(優(yōu)選的是20-100MBq)Tc99m立即結(jié)合。在瘤周圍組織注射放射性免疫共軛物后，用γ相機(jī)根據(jù)程序從三個(gè)平面攝平面圖，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)(優(yōu)選3-6小時(shí))。如果有必要，也可以對(duì)質(zhì)疑的區(qū)域補(bǔ)充用SPECT檢測(cè)。此外，受影響的淋巴結(jié)可在以后的手術(shù)期內(nèi)用合適的人工檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)，然后選擇性地去除。
實(shí)施例6用放射性免疫共軛物通過閃爍照相術(shù)來(lái)診斷內(nèi)分泌腫瘤。嗜鉻細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，類癌和副神經(jīng)節(jié)瘤均是從神經(jīng)內(nèi)分泌(APUD)系統(tǒng)的細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，而神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的細(xì)胞遍布機(jī)體全身。這樣，它們一般都具有促生長(zhǎng)素抑制素受體，利用這些受體，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤在標(biāo)記有銦111的奧曲肽(octrotide)(促生長(zhǎng)素抑制素類似物)的幫助下，在閃爍照相中是可見的。然而，促生長(zhǎng)素抑制素類似物以1∶1的比率結(jié)合到受體上。而多克隆的IgY則能識(shí)別受體上的幾個(gè)抗原決定簇。這樣就會(huì)導(dǎo)致更好地靶向和診斷改進(jìn)的圖像再現(xiàn)。為了獲得抗促生長(zhǎng)素抑制素受體的IgY制備物，用實(shí)施例1所述的方法對(duì)SPF雞再次進(jìn)行免疫。這種特異性的IgY在商業(yè)上以實(shí)施例3，4或5所述的標(biāo)記試劑盒形式提供。它可以被用戶用γ發(fā)射體(如锝99m)原位標(biāo)記。在靜脈注射100mg特異性的IgY-Tc99m(10-1,000MBq，優(yōu)選的是50-200MBq)后1-24小時(shí)，在兩個(gè)平面上攝取平面圖，如果有必要，也可采用SPECT。在手術(shù)期內(nèi)，通常很難檢測(cè)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤在下列操作程序中，則很容易被發(fā)現(xiàn)和切除。
實(shí)施例7放射性免疫共軛物的進(jìn)一步應(yīng)用是治療非何杰金氏淋巴癌。低惡性的非何杰金氏淋巴癌對(duì)化療應(yīng)答很弱。而放射性免疫療法在這種情況下表現(xiàn)得特別有效。在大多數(shù)研究中，碘131標(biāo)記的鼠源單克隆抗體被用來(lái)抗CD20，CD20是一種抗原，它在95％的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面表達(dá)。然而，單克隆抗體只能識(shí)別這種抗原的一個(gè)抗原決定簇。結(jié)合比率也因此只有1∶1。相反，用能同時(shí)識(shí)別這種抗原若干表位的CD20特異的IgY可以改善尋靶。在這種方式中，減少骨髓接觸放射線，而在沒必要移植骨髓的情況下，可提高放射劑量的應(yīng)用。用親和素或鏈親和素標(biāo)記的單克隆抗體和放射活性劑標(biāo)記的生物素進(jìn)行預(yù)靶向，從而減少放射劑量。通過一個(gè)尋找蛋白的預(yù)靶向過程，放射性免疫療法中IgY的治療效果也可以得到改進(jìn)。為此，如實(shí)施例1的方法，用50-1000μg(優(yōu)選的是50-200μg)CD20對(duì)SPF雞進(jìn)行免疫。在12-14個(gè)月的產(chǎn)蛋期，收集雞蛋，根據(jù)IgY和CD20的結(jié)合，用親和層析分離和純化完整的IgY。為了預(yù)靶向，特異的IgY以一種無(wú)菌的方式進(jìn)行過濾，和親和素(或鏈親和素)結(jié)合，然后另與助劑一起凍干或溶解在等滲NaCl溶液(或PBS，pH7.4)中。在這種情況下，標(biāo)記試劑盒中優(yōu)選含有，第一個(gè)刺吸小瓶中是IgY-親和素共軛物(100μg-5mg，優(yōu)選的是1mg)，第二個(gè)刺吸小瓶中是以凍干狀態(tài)或溶解狀態(tài)存在的生物素(11-1,000μg)，而第三個(gè)刺吸小瓶中是用于標(biāo)記碘131(1-4MBq)的氧化劑(例如iodogen) 此外，進(jìn)一步含有諸如層析柱和DC試劑盒的助劑?；蛘?，生物素也可以由制造商集中標(biāo)記，然后和IgY-親和素共軛物一起被分送。通過靜脈注射IgY-親和素共軛物以標(biāo)記淋巴細(xì)胞，從而起始治療。在此后的1至幾天，再通過靜脈注射碘131標(biāo)記的生物素。或者，放射性免疫療法也可用α發(fā)射體如銦211來(lái)進(jìn)行。
實(shí)施例8大約半數(shù)的乳腺癌含有雌激素受體，并取決于激素。抗雌激素受體的蛋黃抗體不僅僅能競(jìng)爭(zhēng)性抑制受體上的雌激素結(jié)合，作為一種放射性免疫共軛物，它們還適合用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)移和用于內(nèi)部放療。為了免疫SPF雞，帶有雌激素受體的胞外抗原決定簇的多肽被應(yīng)用。SPF雞的免疫以及雞蛋的制備和IgY的純化都按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行，以及根據(jù)上述其它實(shí)施例之一進(jìn)行生產(chǎn)。
實(shí)施例9商業(yè)上獲得的抗體如URO7能識(shí)別腎細(xì)胞癌，但不能和健康腎組織結(jié)合。因此腎細(xì)胞癌及它們的轉(zhuǎn)移可以通過放射性免疫共軛物被特異性地檢測(cè)和/或治療。為了鑒定一個(gè)合適的抗原，勻漿腎癌細(xì)胞得到的蛋白可通過電泳被分開和分離。SPF雞用這些抗原來(lái)免疫，并用腎癌細(xì)胞或具特異性和交叉反應(yīng)性的生理組織來(lái)檢查產(chǎn)生的蛋黃抗體。只能識(shí)別惡性細(xì)胞的選擇性抗體和治療用放射性核素如碘131或和細(xì)胞毒素如蓖麻毒蛋白A結(jié)合并被用于治療。
實(shí)施例10放射性免疫共軛物的進(jìn)一步應(yīng)用見于HIV感染的治療中。在HIV感染中，反轉(zhuǎn)錄病毒基因組被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體。HIV感染不可能用傳統(tǒng)的復(fù)制抑制劑來(lái)治療。HIV復(fù)制宿主細(xì)胞在其細(xì)胞表面表達(dá)HIV結(jié)構(gòu)蛋白(p24，gp120和gp41)?？惯@些結(jié)構(gòu)蛋白的抗體能識(shí)別這些細(xì)胞并和其結(jié)合。假設(shè)它們和放射性核素或另一種細(xì)胞毒素結(jié)合，它們會(huì)破壞這些細(xì)胞，因此，也就破壞了HIV產(chǎn)生的場(chǎng)所。有效靶向細(xì)胞的前提是血液中的自由細(xì)胞數(shù)目減少，例如利用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物補(bǔ)充復(fù)制抑制。這開辟了有效治療HIV感染的新的可能性。從序言中提及的那些原因考慮，使用來(lái)自SPF雞特異性IgY的多克隆抗體比DE198 09 785中所述的那種單克隆抗體更具優(yōu)點(diǎn)。為了生產(chǎn)抗體，如實(shí)施例1所述，用HIV p24，HIV-1 gp120或HIV-1 gp41對(duì)SPF雞進(jìn)行免疫。保持在確定條件下的雞蛋在12-14個(gè)月產(chǎn)蛋期收集。蛋黃從蛋清中分離出來(lái)，而IgY通過一種標(biāo)準(zhǔn)方法分離。HIV特異的抗體通過親和層析與特異性抗原結(jié)合而被純化，而非特異的IgY則被去除。無(wú)菌的IgY制備物和一種治療用放射性核素結(jié)合(如碘131或砹211)。一般來(lái)說，對(duì)每一次治療應(yīng)用，100μg的特異IgY都用1-4GBq的碘131來(lái)標(biāo)記。在HIV感染的情況下，由于感染細(xì)胞數(shù)相對(duì)低(和淋巴瘤惡性退化細(xì)胞數(shù)比較)，基本上較低的活性可被證明是有效的。標(biāo)記可以通過不同的確定程序來(lái)進(jìn)行。IgY-碘131可優(yōu)選由iodogen方法來(lái)生產(chǎn)。放射性免疫共軛物結(jié)合以后的產(chǎn)量以及和未結(jié)合的放射性核素分離以后的純度可以通過HPLC或DC來(lái)控制。在無(wú)菌設(shè)備中制備和/或無(wú)菌過濾的放射性免疫共軛物可以等滲溶液的形式輸注。
實(shí)施例11此外，IgY共軛物可以用來(lái)治療自身免疫疾病。CD-4陽(yáng)性細(xì)胞在自身免疫疾病的病理上和機(jī)體移植的排斥反應(yīng)中扮演了重要的角色。對(duì)于M.Crohn，抗CD4受體的單克隆抗體表現(xiàn)在紅斑狼瘡，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但在小鼠皮膚移植后效果并不顯著。為了產(chǎn)生有效的CD4陽(yáng)性細(xì)胞損耗，抗體能和治療用的放射性核素、細(xì)胞抑制劑或毒素結(jié)合在一起。根據(jù)實(shí)施例1，SPF雞被免疫抗CD4或CD4片段。完整的IgY從蛋黃中分離出來(lái)，而CD4特異的IgY可以通過CD4的親和層析純化出來(lái)。如果有必要，抗體可以被酶切，禽源Fc片段可以被人Fc片段所取代。然后，根據(jù)本發(fā)明，IgY制備物可以以非結(jié)合狀態(tài)或標(biāo)記有放射性核素的IgY共軛物的形式被銷售用于臨床應(yīng)用(優(yōu)選的是靜脈注射)。
實(shí)施例12IgY制備物用于治療血栓，是它的一種進(jìn)一步應(yīng)用。血栓一般通過全身性應(yīng)用纖溶劑(鏈激酶，尿激酶，rt-PA)來(lái)治療。鏈激酶被體內(nèi)蛋白酶快速地降解，而尿激酶和rt-PA可以被肝快速代謝掉。它在把纖溶劑固定到血栓上有用處(Bode等，J.Biol.Chem，1989，264(2)944-8；Lijinen等，Thromb Res，1990，57(3)333-42)。SPF雞或轉(zhuǎn)基因雞可以用實(shí)施例1所述的方法免疫抗人血纖蛋白。特異性的IgY被分離和純化。如果有必要，可以將抗體進(jìn)行酶切，從而將Fc片段分離出來(lái)。然后完整的Fab片段抗體(5-50mg)和rt-PA(5-50mg)結(jié)合，優(yōu)選的比率是1∶1。這些IgY制備物可以凍干狀態(tài)或以無(wú)菌溶液形式被提供用于注射目的。通過合適大小的包裝用來(lái)治療深層腿部血栓、肺部栓塞、腦血管損傷或心肌梗塞。此外，第二組SPF雞被免疫來(lái)抗rt-PA(優(yōu)選的是活性中心外的區(qū)域)。第一組Fab片段可以和第二組Fab片段進(jìn)行雜交。用這種方式，通過一個(gè)分支途徑，血纖蛋白特異的雙功能Fab片段可以被生產(chǎn)用來(lái)和rt-PA結(jié)合。
實(shí)施例13IgY制備物和光敏劑結(jié)合在一起用于光動(dòng)力學(xué)診斷或治療。光動(dòng)力學(xué)治療代表一種創(chuàng)傷性極小的治療手段，主要用于治療皮膚或粘膜表面癌，卡波氏肉瘤和黑色素細(xì)胞瘤。它是建立在腫瘤選擇性富集光敏物質(zhì)基礎(chǔ)上的一種療法，通過吸收光波，光敏物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生光動(dòng)力作用(熒光或細(xì)胞受傷自由基的形成及腫瘤血管形成的破壞)。光動(dòng)力學(xué)療法的成功在很大意義上依賴于光敏劑在壞死和健康組織中的相對(duì)分布。光敏劑在腫瘤細(xì)胞中的固定可被腫瘤特異抗體顯著地增強(qiáng)，如食管癌或惡性的黑色素瘤。診斷和治療可以通過合適的光源進(jìn)行。在診斷應(yīng)用中，紫光會(huì)引發(fā)惡性退化細(xì)胞發(fā)出熒光。在光動(dòng)力學(xué)療法中，惡性退化組織在紅光沖擊下變成壞死。
權(quán)利要求
1.蛋黃抗體(IgY)的免疫共軛物，其組成為來(lái)自轉(zhuǎn)基因SPF雞或根據(jù)歐洲藥典和DAB10的無(wú)特定病原體(SPF)雞的蛋中的多克隆IgY制備物，形成具有人IgG恒定區(qū)的多克隆IgY，以及至少一種信號(hào)物質(zhì)和/或活性劑和/或加強(qiáng)分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋黃抗體(IgY)的免疫共軛物，其中多克隆IgY制備物被純化成蛋黃抗體(IgY)、IgY片段、Fab結(jié)構(gòu)或嵌合的蛋黃抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫共軛物，其特征在于用于制劑的IgY制備物包含人源化的蛋黃抗體，它是通過將禽源抗體和人IgG恒定區(qū)化學(xué)連接而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的免疫共軛物，其特征在于IgY制備物包含單價(jià)或雙價(jià)抗體片段，優(yōu)選的是Fab或F(ab)2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的免疫共軛物，其特征在于IgY制備物包含二、三或更多特異性的Fab結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫共軛物，其特征在于信號(hào)物質(zhì)是診斷用放射性核素、酶、染料和/或光敏劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫共軛物，其特征在于活性劑是治療用放射性核素、細(xì)胞抑制劑、毒素、化療藥物、前體藥物、酶、光敏劑和/或纖溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫共軛物，其特征在于IgY制備物和加強(qiáng)分子結(jié)合，優(yōu)選的是和生物素或和補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白結(jié)合。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的免疫共軛物，其特征在于信號(hào)物質(zhì)或活性劑通過共價(jià)鍵或助劑如螯合劑，加強(qiáng)分子和/或加強(qiáng)分子的高親和分子或二、三或更多特異性的IgY結(jié)構(gòu)的一或多個(gè)分支的可變區(qū)結(jié)合到IgY制備物上。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的免疫共軛物，其特征在于IgY制備物對(duì)腫瘤抗原、激素、RNA和/或DNA片段、傳染性病原體或他們的表面抗原、白細(xì)胞抗原、胞內(nèi)分子、受體分子或凝血因子是特異的。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的免疫共軛物，其中就預(yù)靶向而言，只有在通過次級(jí)人抗IgY抗體結(jié)合到特異抗原上之后，免疫共軛物才在體內(nèi)連接到信號(hào)物質(zhì)或活性劑或加強(qiáng)分子上。
12.根據(jù)前述一和多個(gè)權(quán)利要求所述的免疫共軛物，其中就預(yù)靶向而言，只有在通過次級(jí)人抗IgY抗體途徑鍵合到特異抗原上之后，免疫共軛物才在體內(nèi)連接到信號(hào)物質(zhì)或活性劑或加強(qiáng)分子抗原上。
13.蛋黃抗體(IgY)的包裝，用于制造如權(quán)利要求1-10所述的免疫共軛物，包含IgY制備物和信號(hào)物質(zhì)或活性劑和/或加強(qiáng)分子以及附加成分中的至少一個(gè)，所述其他成分如通過薄層層析、分離柱、儀器架、沖洗和洗脫緩沖液進(jìn)行質(zhì)量控制的一套材料。
14.如權(quán)利要求1-10所述的IgY共軛物的包裝，包含至少一套通過薄層層析進(jìn)行質(zhì)量控制的材料和應(yīng)用裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求11和12所述的包裝，其中IgY制備物以凍干形式或和添加劑如穩(wěn)定劑共同使用的懸浮液形式出現(xiàn)，調(diào)節(jié)到最適的pH值。
16.如權(quán)利要求1-10所述的免疫共軛物，用來(lái)生產(chǎn)診斷用或治療用試劑，優(yōu)選針對(duì)非傳染性炎癥、傳染病、凝血紊亂、自身免疫病和腫瘤病。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自蛋黃抗體(IgY)中的免疫共軛物及其成型方法和在診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的就是推出一種傳統(tǒng)免疫共軛物的替代產(chǎn)品，用于診斷和治療。就純度和抗原靶向而言，根據(jù)本發(fā)明制備的免疫共軛物優(yōu)于單克隆抗體和來(lái)自哺乳動(dòng)物中的免疫血清以及優(yōu)于來(lái)自常規(guī)雞的IgY制備物。如果有可能，人抗IgY抗體的產(chǎn)生將會(huì)被避免，免疫共軛物以公正地對(duì)待動(dòng)物保護(hù)的方式大量經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，通過來(lái)自SPF雞，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因SPF雞的完整蛋黃抗體(IgY)的多克隆IgY共軛物，IgY片段，F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)或人源化的蛋黃抗體可以完成此目的?？乖蚩乖螌⒆鳛槊庖哂行С煞趾椭辽倭硗庖环N的成分結(jié)合在一起，另外一種成分可以是信號(hào)物質(zhì)，和活性劑或加強(qiáng)分子。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1509188SQ02809886
公開日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月15日
發(fā)明者沃爾夫?qū)へ惛裉? 哈特穆特·科比爾克, 沃爾夫?qū)?貝格特, 特 科比爾克 申請(qǐng)人:沃爾夫?qū)へ惛裉? 哈特穆特·科比爾克, 約阿基姆·斯羅卡, 沃爾夫?qū)?貝格特