專利名稱：制備血紅蛋白氧載體的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是2001年2月28日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/795,821的繼續(xù)申請(qǐng)。上述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。
背景技術(shù)：
血紅蛋白氧載體的開發(fā)聚焦于藥物治療中應(yīng)用的氧傳遞，諸如輸血和生產(chǎn)血液制品。血紅蛋白氧載體可用于預(yù)防或治療失血導(dǎo)致的缺氧癥(例如，急性出血或外科手術(shù))、由貧血導(dǎo)致的缺氧癥(例如，惡性貧血、或鐮狀細(xì)胞貧血癥)、或由休克導(dǎo)致的缺氧癥(例如，缺血性休克、過敏性休克、膿毒性休克、變應(yīng)性休克)。
現(xiàn)有的血紅蛋白氧載體包括全氟化合物、合成的血紅蛋白類似物、脂質(zhì)體包裹的血紅蛋白、化學(xué)改性的血紅蛋白、血紅蛋白分子相互交聯(lián)的血紅蛋白氧載體。血紅蛋白氧載體的制備包括一些提純步驟。必須從采集血液去除的成分是纖維蛋白原，纖維蛋白原是一種在凝結(jié)過程中與凝血因子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的可溶性蛋白。處理血液的現(xiàn)有技術(shù)通常包括添加化學(xué)試劑阻止凝固，諸如檸檬酸鈉。然而，人們正在尋找，例如，降低處理成本而不損害其質(zhì)量(諸如最終產(chǎn)品純度)的其它技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及，使用去纖維蛋白的血液提純血紅細(xì)胞，制備血紅蛋白溶液，再制備血紅蛋白氧載體?；瘜W(xué)凝結(jié)劑(諸如、膠原蛋白)和機(jī)械攪拌(諸如攪拌)是去除血液纖維蛋白的方法。后續(xù)的細(xì)胞清洗去除了導(dǎo)致供體與受體血液間不相容的血漿蛋白。
在一實(shí)施方案中，提純血紅細(xì)胞的方法包括，去除含有血紅細(xì)胞與血漿成分全血中的纖維蛋白。隨后，過濾全血，提純血紅細(xì)胞，從而生成血紅細(xì)胞懸液。
在制備血紅蛋白溶液方法的實(shí)施方案中，去除全血的纖維蛋白。分離出全血的血紅細(xì)胞，再?gòu)难t細(xì)胞離析出血紅蛋白分子，從而生成血紅蛋白溶液。
在制備血紅蛋白氧載體方法的實(shí)施方案中，去除全血的纖維蛋白。分離全血的血紅細(xì)胞。再離析并穩(wěn)定血紅蛋白分子，生成血紅蛋白氧載體。
本發(fā)明有許多優(yōu)點(diǎn)。其中之一是，本發(fā)明消除了全血(人、牛、哺乳動(dòng)物)必須混合抗凝血?jiǎng)┑囊?。添加抗凝血?jiǎng)┥婕暗街苽涓呒兓旌纤芤?、制備檸檬酸化的收集容器、收集、混合、提純等過程，這些都消耗人力與財(cái)力。此外，當(dāng)運(yùn)輸血液時(shí)，與在運(yùn)輸起點(diǎn)建造裝置添加抗凝血?jiǎng)┫啾?，去除血液的纖維蛋白通常更容易實(shí)現(xiàn)。
附圖
簡(jiǎn)述本圖是適合實(shí)施本發(fā)明方法的裝置實(shí)施方案的簡(jiǎn)圖。
發(fā)明詳述如附圖所示，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的更具體描述使本發(fā)明上述和其它目的、特點(diǎn)、和優(yōu)點(diǎn)更加顯而易見。本圖無需定量說明，而是將重點(diǎn)放在說明本發(fā)明原理上。
通常，本發(fā)明是一種提純血液的方法，用于生成血紅細(xì)胞(RBC)懸液，以離析出血紅蛋白溶液，再生成血紅蛋白氧載體。本方法包括去除全血的纖維蛋白。為了描述本發(fā)明，全血被認(rèn)為是由血紅細(xì)胞與血漿成分構(gòu)成。
參照附圖，圖中顯示出適合實(shí)施本發(fā)明方法裝置10的實(shí)施方案。在容器12中收集全血。適合本發(fā)明使用的全血可以是新鮮采集的，也可以來自過期的資源，諸如血庫中過期的人類血液。此外，盡管全血可在冷凍和/或液態(tài)下保存，但是優(yōu)選的是，按本方法使用以前，全血未經(jīng)冷凍。全血來源的適當(dāng)實(shí)例有人、牛、羊、豬、其它脊椎動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因生成的血紅蛋白，諸如BIO/TECHNOLOGY，1255-59(1994)所述的轉(zhuǎn)基因血紅蛋白，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。血液采集也可以來自活動(dòng)物供體或剛被屠宰的動(dòng)物供體。在Rausch等人公開的美國(guó)專利5,084,558和5,296,465中描述了采集牛全血的方法，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。
在容器12中，按照適當(dāng)方法去除全血的纖維蛋白。去除血液的纖維蛋白的過程要引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)(the cloting cascade)，從而人為地去除凝結(jié)成塊的纖維蛋白分子。去除纖維蛋白是通過化學(xué)或機(jī)械方法引發(fā)的。本文中，化學(xué)凝結(jié)劑定義為導(dǎo)致血液凝固的物質(zhì)。例如，膠原蛋白產(chǎn)生凝結(jié)，以致當(dāng)受到外傷時(shí)，纖維蛋白凝塊阻止血液的流失。人為地將血液與膠原蛋白接觸，會(huì)生成纖維蛋白凝塊，將其去除可生成去纖維蛋白的血液。
在一實(shí)施方案中，通過將血液與凝結(jié)劑相接觸，去除血液的纖維蛋白。凝結(jié)劑的實(shí)例包括膠原蛋白、組織提取物、組織因子、組織凝血因子、陰離子的磷脂、鈣、帶負(fù)電荷的材料(例如，玻璃、高嶺土、合成塑料、織物)。優(yōu)選的凝固劑是膠原蛋白。
將全血與凝固劑接觸，經(jīng)過充足的時(shí)間，使血液中的所有纖維蛋白基本轉(zhuǎn)化為纖維蛋白凝塊。以纖維蛋白分子聚合明顯停止的時(shí)刻，確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間。本文中，化學(xué)去纖維蛋白定義為與化學(xué)凝結(jié)劑接觸而引發(fā)的去纖維蛋白過程，其在適當(dāng)溫度下進(jìn)行，優(yōu)選的溫度大約在4℃-40℃。
在另一實(shí)施方案中，機(jī)械攪拌，諸如攪拌，也具有引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)的效應(yīng)。攪拌直到纖維蛋白聚合明顯停止后，通過去除積累的纖維蛋白，完成纖維蛋白的去除也是可行的。本文中，機(jī)械去纖維蛋白定義為由攪拌血溶液引發(fā)的去纖維蛋白過程，其在適當(dāng)溫度下進(jìn)行，優(yōu)選溫度大約在4℃-40℃。
以適當(dāng)方法去除全血的纖維蛋白。適當(dāng)方法的實(shí)例有，引導(dǎo)含有纖維蛋白的全血，從容器12通過管路14和濾網(wǎng)16。適合的濾網(wǎng)實(shí)例是60目濾網(wǎng)。在濾網(wǎng)16收集纖維蛋白，并將全血的剩余物引導(dǎo)到容器18。除了使用濾網(wǎng)外，還可以任意使用干酪包布、或聚丙烯過濾器，去除包括纖維蛋白的大碎片。
如圖所示，使用泵22，引導(dǎo)全血從容器18通過管路20，穿過第一過濾器24和第二過濾器26到達(dá)容器28。在一實(shí)施方案中，第一過濾器24和第二過濾器26是聚丙烯過濾器。在特別可取實(shí)施方案中，第一過濾器24具有大約800微米的滲透性，第二過濾器26具有大約50微米的滲透性。使用第一過濾器24和第二過濾器26基本上去除了全部的纖維蛋白，完成了去纖維蛋白的步驟。
在容器28中以適當(dāng)溫度保存全血。優(yōu)選的是，保存全血的溫度大約在4℃-15℃。保持容器28中全血的溫度是通過再循環(huán)適當(dāng)介質(zhì)(諸如乙二醇)穿過容器28的夾套30。維持穿過夾套30的介質(zhì)再循環(huán)線路包括管路32、儲(chǔ)罐34、泵36、38、冷卻器或致冷單元40。
此后，過濾全血，從血紅細(xì)胞至少分離出一部分血漿成分，生成血紅細(xì)胞懸液，從而提純了血紅細(xì)胞。優(yōu)選的是，以透濾方式過濾全血。
在一實(shí)施方案中，將全血從容器28通過管路42和泵44轉(zhuǎn)移到透濾組件46，進(jìn)行透濾處理。透濾組件46包括進(jìn)口48、滯留出口50、和透過出口52。膜54劃分出透濾組件46的透過分區(qū)58和滯留分區(qū)56。優(yōu)選的是，膜54具有大約0.01-5微米的滲透性。
滲濾組件46中全血的部分血漿成分，從滯留分區(qū)56穿過膜54，到達(dá)透過分區(qū)58，從而在滯留分區(qū)56提純血紅細(xì)胞。引導(dǎo)提純過的血紅細(xì)胞，穿過滯留出口50和管路60回到容器28。在容器28收集提純過的血液，經(jīng)過閥門62，進(jìn)入管路64，用于進(jìn)一步加工?？梢砸龑?dǎo)穿過膜54的血漿，從滲濾組件46的透過分區(qū)58，通過管路66，在容器68中收集。在管路42或管路60的取樣口(圖中未標(biāo)明)，提取通過容器28和透濾組件46再循環(huán)血液的樣品。
優(yōu)選的是，在過濾全血去除至少一部分血漿成分以前，來自容器70和管路72的液體加入到容器28中的全血內(nèi)，稀釋其濃度。在一實(shí)施方案中，通過改變體積，將全血濃度稀釋到大約初始濃度(稀釋以前)的25％-75％。接著，再減少血液體積，使其濃度恢復(fù)至初始濃度或更高。通常，將液體加入全血再去除至少一部分液體的過程，被稱為“細(xì)胞清洗”。
在一實(shí)施方案中，細(xì)胞清洗包括連續(xù)過濾操作中稀釋和透濾的過程；向過濾滯留物加入鹽溶液或檸檬酸鹽溶液，維持再循環(huán)儲(chǔ)罐中溶液體積不變。該結(jié)果降低了可透過微過濾膜物質(zhì)的濃度(包括透膜的血漿蛋白)。接著，將稀釋的血溶液再濃縮回初始體積，產(chǎn)生提純過的血溶液。
在可取實(shí)施方案中，為了從細(xì)胞外血漿蛋白(諸如，血清白蛋白或抗體，例如免疫球蛋白IgG)分離血紅細(xì)胞，使用至少一種溶液(諸如，等滲溶液)，采用滲濾、或稀釋與濃縮步驟的組合，清洗血溶液。優(yōu)選的是，等滲溶液含有離子溶質(zhì)，或其是水溶液?？梢岳斫?，血紅細(xì)胞能夠以分批或連續(xù)進(jìn)料方式清洗。
可用的等滲溶液為業(yè)內(nèi)所公知，包括具有一定pH值和摩爾滲透壓濃度的溶液(諸如檸檬酸溶液/鹽溶液)，該溶液不能造成血紅細(xì)胞膜破裂，并能夠替換全血的血漿部分。血液可以稀釋到大約原有濃度的25％-75％。優(yōu)選的等滲溶液pH呈中性，摩爾滲透壓濃度大約在285-315mOsm。在優(yōu)選實(shí)施方案中，等滲溶液是由檸檬酸鈉二水合物水溶液(6.0克/升)和氯化鈉水溶液(8.0克/升)構(gòu)成。
在一方法中，穿過大約0.2-2微米滲透性的膜，滲濾全血。其它適合的滲濾材料包括微孔膜，其孔徑能夠從更小的血溶液成分充分分離出血紅細(xì)胞，諸如0.1-0.5微米過濾器(例如，0.2微米中空纖維過濾器，Microgen Krosflo II microfiltration cartridge)。在細(xì)胞清洗過程中，血溶液的液體成分(諸如血漿)，或直徑遠(yuǎn)小于血紅細(xì)胞的組分透過過濾器的滲濾材料壁。紅細(xì)胞、血小板和血溶液的更大物質(zhì)，(諸如白細(xì)胞)被截留下來，并與連續(xù)或分批添加的等滲溶液混合，生成滲析血溶液。
同時(shí)，連續(xù)加入(或分批加入)濾過的等滲溶液作為補(bǔ)充，以維持濾液體積，補(bǔ)充穿過滲濾材料損失的溶液部分。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，向滲濾儲(chǔ)罐中加入一定體積濾過的等滲溶液，稀釋滲濾儲(chǔ)罐中最初體積的血溶液。優(yōu)選的是，加入等滲溶液的體積大約與最初血溶液的體積相等。
在另一實(shí)施方案中，通過一系列連續(xù)的(或反向連續(xù)的)稀釋和濃縮步驟，清洗血液，其中加入至少一種等滲溶液稀釋血溶液，并且使其流經(jīng)過濾器濃縮血溶液，因此生成滲析血溶液。
當(dāng)充分減少污染血紅細(xì)胞的血漿蛋白含量時(shí)(至少減少大約90％)，通常認(rèn)為完成細(xì)胞清洗。附加清洗會(huì)進(jìn)一步從血紅細(xì)胞分離細(xì)胞外血漿蛋白。例如，滲濾采用6倍體積的等滲溶液，充分從血溶液中去除至少大約99％的免疫球蛋白G。
潛在的膜污染物會(huì)造成清洗問題，諸如制備過程緩慢，對(duì)于每次清洗過程，使用新過濾膜，可以使制備時(shí)間最短。然而，盡管存在潛在的膜污染物，制備有效的血紅蛋白氧載體依舊是可行的。如果小纖維蛋白分子在0.1-5微米滲透性的膜表面積累并堵塞過濾孔，它們就會(huì)產(chǎn)生問題，也許會(huì)污染過濾器。產(chǎn)生問題的污染物狹小的粒徑范圍是0.2-0.4微米。去除纖維蛋白(機(jī)械，化學(xué)、任一形式)能夠造成血紅細(xì)胞的溶解。破裂的血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、或血小板會(huì)粘住過濾器。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，與處理未檸檬酸化血液的方法相似，先用二價(jià)陽離子飽和檸檬酸化的血液，再去除溶液的纖維蛋白，此種去除檸檬酸化血液中纖維蛋白的方法也是可行的。優(yōu)選的二價(jià)陽離子是鈣離子。
為了制備血紅蛋白血溶液，提純過的血液樣品可以進(jìn)一步加工，離析血紅蛋白分子。所得滲析血溶液經(jīng)過適當(dāng)方法的處理、諸如離心法，從白細(xì)胞和血小板分離出滲析血溶液的血紅細(xì)胞?？梢岳斫猓材軌蚴褂脧钠渌撼煞址蛛x出血紅細(xì)胞的其它業(yè)內(nèi)公知方法。例如，本發(fā)明一實(shí)施方案中，通過沉淀分離血紅細(xì)胞，其中從其它血液成分分離出血紅細(xì)胞以前，該分離方法沒有使大量血紅細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，諸如大約少于30％的血紅細(xì)胞。
提純血紅細(xì)胞后，將血紅細(xì)胞溶解，產(chǎn)生血紅蛋白(Hb)溶液。溶解的方法包括機(jī)械溶解、化學(xué)溶解、低滲溶解、或釋放血紅蛋白且不顯著損害其運(yùn)輸和釋放氧氣能力的其它公知溶解方法。
溶解后，接著將溶解的血紅蛋白相超濾處理，去除較大的細(xì)胞碎片，諸如分子量大于大約100,000道爾頓的蛋白質(zhì)。再?gòu)臑V液中的非血紅蛋白成分分離血紅蛋白。
1995年6月7日提交的美國(guó)專利5,691,452公開了超濾法和以pH梯度和層析法從非血紅蛋白成分分離出血紅蛋白的方法，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。
接著，優(yōu)選的是，在聚合前去除血紅蛋白洗出液中的氧，生成去氧血紅蛋白溶液(下文稱為去氧血紅蛋白)，以進(jìn)一步加工成血紅蛋白氧載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，去氧作用充分地去除了血紅蛋白中的氧，并未明顯降低血紅蛋白洗出液中血紅蛋白運(yùn)送和釋放氧的能力，諸如生成氧化的血紅蛋白(metHb)。另外，可以使用還原劑化學(xué)去除血紅蛋白溶液中的氧，還原劑選自N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)、半胱氨酸、連二亞硫酸鈉、或抗壞血酸。
1995年6月7日提交的美國(guó)專利5,895,810公開了去除氧氣的方法，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。
去氧血紅蛋白溶液可以進(jìn)一步加工成血紅蛋白氧載體。如文中定義，“血紅蛋白氧載體”指的是適用于人類、哺乳動(dòng)物、其它脊椎動(dòng)物的血紅蛋白合成物，其具有向重要器官和組織運(yùn)輸和傳遞氧的能力，至少也能夠維持血管內(nèi)充足的滲透壓，其中血紅蛋白已經(jīng)從血紅細(xì)胞中析出。按照傳統(tǒng)定義，脊椎動(dòng)物包括人類、或在循環(huán)系統(tǒng)中用血液傳輸氧到組織的任何其它脊椎動(dòng)物。此外，按照傳統(tǒng)定義限定循環(huán)系統(tǒng)，其由心臟、動(dòng)脈、靜脈、含有更小血管結(jié)構(gòu)(諸如，毛細(xì)血管)的微循環(huán)組成。
本文中，“穩(wěn)定的聚合血紅蛋白”定義為血紅蛋白氧載體合成物的一種成分，在適當(dāng)儲(chǔ)存溫度下，兩年或更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期中，其分子量分布和/或高鐵血紅蛋白的含量不顯著地升高或降低。對(duì)于1年或更長(zhǎng)存儲(chǔ)期，適當(dāng)存儲(chǔ)溫度大約在0℃-40℃。更可取的存儲(chǔ)溫度大約在0℃-25℃。
在一定環(huán)境下，至少大約2個(gè)月，優(yōu)選至少大約1年，或更優(yōu)選至少大約2年的儲(chǔ)存周期中，與血紅蛋白氧載體接觸氧的積累量，在血紅蛋白氧載體中產(chǎn)生了按照重量計(jì)算濃度小于15％的高鐵血紅蛋白，此環(huán)境被定義為適當(dāng)?shù)牡脱醐h(huán)境、或近乎無氧環(huán)境。氧的積累量包括血紅蛋白氧載體和包裝中的初始氧含量、以及滲入血紅蛋白氧載體包裝的氧含量。
本方法自始至終，從血紅細(xì)胞的收集直到血紅蛋白的聚合，血溶液、血紅細(xì)胞和血紅蛋白保存在使其微生物生長(zhǎng)或生物負(fù)載最低的條件下，諸如保存溫度在0℃-20℃。優(yōu)選的是，溫度保持在大約15℃或更低。更優(yōu)選的是，溫度保持在10±2℃。
在本方法制備穩(wěn)定的聚合血紅蛋白氧載體的過程中，其部分成分被充分消毒，制備無菌產(chǎn)品?！盁o菌”按照業(yè)內(nèi)定義，特別要滿足美國(guó)藥典的要求，見美國(guó)藥典XXII，第71節(jié)、1483-1488頁。此外，通常用不與加工液流反應(yīng)或污染加工液流的材料，制造或覆蓋暴露于加工液流的部分組件。此類材料包括不銹鋼和其它鋼合金，諸如Hasteloy。
在一實(shí)施方案中，聚合是由血紅蛋白分子內(nèi)相互交聯(lián)產(chǎn)生的。對(duì)于與去氧血紅蛋白混合的硫氫化合物，由于高離子強(qiáng)度，其含量要足夠高以增加聚合過程中血紅蛋白分子內(nèi)的相互交聯(lián)，同時(shí)其含量也要足夠低且不能顯著降低血紅蛋白分子間的相互交聯(lián)。通常，氧化-穩(wěn)定大約0.25-5摩爾的去氧血紅蛋白，需要大約1摩爾的硫氫官能團(tuán)(-SH)。
聚合氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白之前，可在聚合反應(yīng)器中加入適量的水。在一實(shí)施方案中，適量的水指的是，當(dāng)向聚合反應(yīng)器中加入氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白時(shí)，產(chǎn)生血紅蛋白濃度大約為10-100克/升溶液的水量。優(yōu)選的是，所用的水經(jīng)過去氧處理。
將聚合反應(yīng)器中氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白溶液升高到特定溫度，該溫度下與交聯(lián)劑接觸時(shí)，氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白的聚合效果最佳。通常，在聚合的全過程中，氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白的溫度大約在25-45℃，優(yōu)選大約在41-43℃。加熱聚合反應(yīng)器的可接受熱傳遞方法的實(shí)例是夾套加熱系統(tǒng)，其加熱是通過引導(dǎo)熱乙二醇穿過夾套實(shí)現(xiàn)的。
在足以聚合氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白的溫度下，將氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白與適合的交聯(lián)劑接觸，經(jīng)過大約2-6個(gè)小時(shí)，生成聚合的血紅蛋白(poly(Hb))溶液。交聯(lián)劑的適合用量指的是，其用量既允許血紅蛋白分子內(nèi)相互交聯(lián)使其穩(wěn)定，也允許其分子間相互交聯(lián)，生成血紅蛋白聚合物，從而增加血管內(nèi)血紅蛋白的保留量。通常，交聯(lián)劑的適合用量指的是交聯(lián)劑與血紅蛋白摩爾比超過2∶1的用量。優(yōu)選的是，交聯(lián)劑與血紅蛋白的摩爾比是20∶1到40∶1。
適合交聯(lián)劑的實(shí)例包括能夠交聯(lián)血紅蛋白的多官能團(tuán)試劑，諸如戊二醛，丁二醛，活化態(tài)的聚氧乙烯和葡聚糖，α-羥基醛、諸如羥乙醛，N-馬來酰亞胺-6-氨己?；?(2’-硝基，4’-磺酸)-苯基酯，m-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基丁二酰胺酯，4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸丁二酰亞胺酯，4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基丁二酰亞胺酯，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基丁二酰亞胺酯，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基磺基丁二酰亞胺酯，(4-碘代乙酰)氨基苯甲酸N-丁二酰亞胺酯，(4-碘代乙酰)氨基苯甲酸磺基丁二酰亞胺酯，4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸丁二酰亞胺酯，4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸磺基丁二酰亞胺酯，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸化物，N，N’-亞苯基二馬來酰亞胺，和屬于bis-imidate類、?；B氮類或芳基二鹵化物類的化合物以及其它。
如果大部分(例如，至少大約50％)血紅蛋白分子化學(xué)結(jié)合在聚合的血紅蛋白中，僅有小部分血紅蛋白分子(諸如小于大約15％)包含于高分子量的聚合血紅蛋白鏈中，聚合的血紅蛋白被定義為具有實(shí)際意義的分子內(nèi)相互交聯(lián)。高分子量的聚合血紅蛋白分子具有例如大于500,000道爾頓的分子量。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，戊二醛作為交聯(lián)劑。通常，每千克氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白使用大約10-70克戊二醛。更優(yōu)選的是，在超過5小時(shí)的周期中加入戊二醛，直到加入了大約29-31克戊二醛/千克氧化-穩(wěn)定的去氧血紅蛋白。
當(dāng)不以醛作為交聯(lián)劑時(shí)，生成的聚合血紅蛋白通常是穩(wěn)定的。當(dāng)以醛作為交聯(lián)劑時(shí)，生成的聚合血紅蛋白通常不穩(wěn)定，直到與適當(dāng)?shù)倪€原劑混合，在聚合血紅蛋白中還原不穩(wěn)定鍵，生成更穩(wěn)定的鍵。適合的還原劑實(shí)例包括硼氫化鈉、氰硼氫化鈉、連二亞硫酸鈉、三甲胺、t-丁胺、嗎啉硼烷和嘧啶硼烷。采用超濾法，任意濃縮聚合血紅蛋白溶液，直到將其濃度增加到75-85克/升。例如，適合的超濾過濾器是30,000道爾頓過濾器(例如，Millipore Helicon Cat#CDUFO50LT；Amicon Cat#540430)。
接著，將聚合血紅蛋白的pH值調(diào)節(jié)到堿性pH范圍，保護(hù)還原劑，同時(shí)防止氫氣生成，該氫氣能夠在后續(xù)的還原反應(yīng)過程中改性血紅蛋白。通常，聚合血紅蛋白經(jīng)提純，去除非聚合的血紅蛋白。采用透濾法或羥磷灰石層析法，去除非聚合血紅蛋白(參見，例如于1995年6月7日提交的美國(guó)專利5,691,453，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文)。調(diào)節(jié)pH后，通常在去氧循環(huán)的聚合步驟中，加入至少一種還原劑，優(yōu)選的是硼氫化鈉溶液。然后，使用具有適當(dāng)pH值和生理電解質(zhì)含量的透濾溶液，透濾穩(wěn)定的聚合血紅蛋白，使其pH值和電解質(zhì)恢復(fù)到生理水平，生成穩(wěn)定的聚合血紅蛋白氧載體。
在1997年11月25日公開的美國(guó)專利5,691,452中，詳細(xì)討論了交聯(lián)血紅蛋白和保護(hù)血紅蛋白氧載體的適當(dāng)方法，該專利全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。
能夠接受本發(fā)明方法生成的血紅蛋白氧載體的脊椎動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，諸如人類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、狗、貓、鼠、馬、或羊。能夠接受所述血紅蛋白氧載體的脊椎動(dòng)物，包括胎兒(產(chǎn)前哺乳動(dòng)物)、產(chǎn)后哺乳動(dòng)物、或生產(chǎn)時(shí)的哺乳動(dòng)物。
按照一種或多種注射方法，通過直接和/或間接地向脊椎動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)注射血紅蛋白氧載體，可以將本發(fā)明的血紅蛋白氧載體用藥于循環(huán)系統(tǒng)中。直接注射方法的實(shí)例有血管內(nèi)注射，諸如靜脈內(nèi)注射和動(dòng)脈內(nèi)注射、心臟內(nèi)注射。間接注射方法的實(shí)例有腹膜內(nèi)注射、皮下注射，諸如血紅蛋白氧載體會(huì)通過淋巴系統(tǒng)運(yùn)送到循環(huán)系統(tǒng)中，或以套針或?qū)Ч芊绞阶⑸淙牍撬?。?yōu)選的是，血紅蛋白氧載體在靜脈內(nèi)給藥。
在注入血紅蛋白氧載體之前、過程中、和/或之后，接受治療的脊椎動(dòng)物可以是正常血容量、高血容量、或低血容量。按照方法，諸如頂加載法和交換法，將血紅蛋白氧載體導(dǎo)入循環(huán)系統(tǒng)。
血紅蛋白氧載體可以作為治療用藥，治療脊椎動(dòng)物中因多種原因造成的低氧組織，其中包括貧血、休克、部分或全部的循環(huán)系統(tǒng)中血紅細(xì)胞流量降低。此外，血紅蛋白氧載體可以作為預(yù)防性用藥，以防止脊椎動(dòng)物中組織缺氧，造成組織缺氧的原因是脊椎動(dòng)物整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)或流向組織的血紅細(xì)胞流量可能或預(yù)期降低。此外，1995年3月23日提交的美國(guó)專利5,854,209公開了，將血紅蛋白給藥治療或預(yù)防缺氧癥(特別是部分動(dòng)脈梗阻或微循環(huán)部分封阻造成的缺氧癥)的詳細(xì)討論及其藥量，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本文。
通常，如果需要補(bǔ)償大體積血液損失，適合的劑量、或血紅蛋白氧載體的劑量組合指的是，當(dāng)溶于血漿時(shí)，在脊椎動(dòng)物血液中產(chǎn)生大約0.1-10克血紅蛋白/分升、或更高總血紅蛋白濃度的用量。
以下實(shí)例將深入具體地描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)例1-實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)在附圖所示的裝置中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)中所用的去纖維蛋白血液樣品是通過與膠原蛋白接觸去除纖維蛋白。最初，按照大約1∶1比例，加入檸檬酸鹽等滲緩沖液，稀釋全血。接著，濃縮稀釋的血液，使血紅蛋白含量在10.5克/分升(大約2倍濃度)。用于滲濾的處理體積是200毫升，因此將大約200毫升緩沖液加入大約200毫升全血，再濃縮回初始體積。此過程產(chǎn)生大約200毫升膜透過物。再使用檸檬酸緩沖液或鹽溶液，透濾血紅蛋白濃度為10.5克/分升的200毫升全血。收集400毫升透過體積(2倍滯留物體積)的時(shí)間作為比較檸檬酸化血液與去纖維蛋白血液的時(shí)間點(diǎn)。該時(shí)間包括將稀釋血液濃縮至初始體積(200毫升)的時(shí)間，以及進(jìn)行第一次滲濾體積(200毫升)的時(shí)間。所用的時(shí)間越長(zhǎng)，處理的越慢。表1概括了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表1
如表1所示，收集400毫升滲透物所需時(shí)間大約在15分鐘到1小時(shí)。
實(shí)施例2-中試實(shí)驗(yàn)在圖中所示的裝置中，進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)。中試實(shí)驗(yàn)所用的去纖維蛋白血液樣品是通過機(jī)械攪拌去除纖維蛋白。再一次，用檸檬酸鹽等滲液稀釋全血，再濃縮，但是因?yàn)橹性囅到y(tǒng)中處理需要大體積稀釋溶液，按照大于1∶1比例，用檸檬酸緩沖液或緩沖鹽溶液，稀釋初始的全血。在滲濾過程中，血液的血紅蛋白濃度小于10.5克/分升(大約2倍濃度)。當(dāng)血紅蛋白濃度恢復(fù)到系統(tǒng)最小處理體積對(duì)應(yīng)的濃度時(shí)，滲濾血液，產(chǎn)生了5倍體積的滲濾液。與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)相同，處理時(shí)間越長(zhǎng)說明處理的越慢。表2概括了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表2
等效方案業(yè)內(nèi)技術(shù)人員可以理解、或能夠確定，不超出常規(guī)實(shí)驗(yàn)范圍，存在本發(fā)明特殊實(shí)施方案的等效方案。下述權(quán)利要求包含了上述方案和其它等效方案。
權(quán)利要求
1.一種提純血紅細(xì)胞的方法，其中包含如下步驟a)去除含有血紅細(xì)胞和血漿成分全血的纖維蛋白；b)過濾該全血，由此從血紅細(xì)胞分離出至少一部分血漿，生成血紅細(xì)胞懸液，從而提純血紅細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將全血與凝結(jié)劑接觸，去除全血的纖維蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中凝結(jié)劑選自膠原蛋白、組織提取液、組織因子、組織凝血因子、陰離子磷脂、鈣、或帶負(fù)電荷的材料(例如，玻璃、高嶺土、合成塑料、織物)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過攪拌所述血液去除全血的纖維蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中以透濾方式過濾全血。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中穿過大約0.01-5微米滲透性的薄膜，滲濾全血。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，還包括稀釋全血的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，還包括用等滲溶液、或高滲溶液稀釋全血的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中在去除纖維蛋白之后并在透濾之前稀釋全血。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中將去纖維蛋白的全血稀釋到大約初始濃度的25％-75％。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中等滲溶液含有離子溶質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中等滲溶液是水溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中等滲溶液含有選自檸檬酸鈉、氯化鈉、檸檬酸、葡萄糖、腺嘌呤、或磷酸鈉的溶質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，還包括透濾前再濃縮全血的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中通過稀釋全血、再穿過中空纖維膜，進(jìn)行透濾。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中中空纖維膜具有大約0.1-2微米的滲透性。
17.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，還包括在透濾全血以前過濾全血的步驟，由此去除全血溶液中的碎片。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中使用干酪包布過濾血液。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中將血液通過小于大約800微米平均滲透性的過濾器，過濾血液。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中將血液穿過小于大約50微米平均滲透性的過濾器，過濾血液。
21.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中全血含有抗凝劑，該方法還包括用二價(jià)陽離子飽和全血的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中二價(jià)陽離子是鈣離子。
23.一種制備血紅蛋白溶液的方法，其中包括下列步驟a)去除全血的纖維蛋白；b)從全血分離血紅細(xì)胞；c)從血紅細(xì)胞離析血紅蛋白分子，由此生成血紅蛋白溶液。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中從全血分離血紅細(xì)胞的步驟包括離心全血。
25.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中離心全血至少造成了一部分血紅細(xì)胞溶解，從而釋放出血紅蛋白分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中以離心方式離析釋放的血紅蛋白。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中以過濾方式離析釋放的血紅蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，還包括溶解分離過的血紅細(xì)胞的步驟。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中離心血紅細(xì)胞將其溶解。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中低滲溶解血紅細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，還包括去除血紅蛋白溶液中氧的步驟。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中將血紅蛋白溶液中的氧合血紅蛋白成分減少到低于大約20％。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中將血紅蛋白溶液中的氧合血紅蛋白成分減少到低于大約10％。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中使用還原劑化學(xué)去除血紅蛋白溶液中的氧。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中還原劑選自N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)、半胱氨酸、連二亞硫酸鈉或抗壞血酸。
36.一種制備血紅蛋白氧載體的方法，其中包括下列步驟a)去除全血的纖維蛋白；b)從全血分離出血紅細(xì)胞；c)離析所述細(xì)胞的血紅蛋白分子，生成了血紅蛋白溶液；d)穩(wěn)定血紅蛋白，從而制備血紅蛋白氧載體。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，還包括去除血紅蛋白溶液中氧的步驟。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中將血紅蛋白溶液中的氧合血紅蛋白成分減少到低于大約20％。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中將血紅蛋白溶液中的氧合血紅蛋白成分減少到低于大約10％。
40.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中通過聚合血紅蛋白分子使其穩(wěn)定。
41.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中在聚合血紅蛋白之前，去除血紅蛋白溶液中的氧。
42.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中通過pyridoxylation穩(wěn)定血紅蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中通過使其分子交聯(lián)穩(wěn)定血紅蛋白。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中通過使其分子間相互交聯(lián)，穩(wěn)定血紅蛋白。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中通過使其分子內(nèi)相互交聯(lián)，穩(wěn)定血紅蛋白。
46.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，還包括保護(hù)血紅蛋白氧載體的步驟。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中將其盛裝在屏蔽氧薄膜的包裝中，保護(hù)血紅蛋白氧載體。
48.使用去纖維蛋白的血液制備血紅蛋白氧載體的方法，包括下列步驟a)使用膠原蛋白，去除血液的纖維蛋白，從而生成去纖維蛋白的血液；b)透過800微米和50微米的聚丙烯過濾器，過濾去纖維蛋白的血液；c)使用檸檬酸鈉溶液(為了注射使用含有6.0克/升檸檬酸鈉二水合物和8.0克/升氯化鈉的水溶液)，稀釋血液；d)透過0.2微米中空纖維透濾器，將稀釋的血溶液再濃縮至原體積；e)透濾再濃縮的血溶液，從而清洗細(xì)胞；f)以離心方式從白細(xì)胞與血小板分離出血紅細(xì)胞，從而生成血紅細(xì)胞懸液；g)以離心方式溶解血紅細(xì)胞，釋放血紅蛋白；h)為了注射與離心，將血紅細(xì)胞相與水混合，從而生成血紅蛋白溶液；i)去除血紅蛋白溶液中的氧；j)在聚合裝置中聚合去氧的血紅蛋白；k)以交聯(lián)聚合戊二醛的去氧血紅蛋白，制備血紅蛋白氧載體；l)在屏蔽氧的包裝中，保護(hù)血紅蛋白氧載體。
全文摘要
先去除全血的纖維蛋白，再過濾去纖維蛋白的全血，提純血紅細(xì)胞，由此從血紅細(xì)胞分離出至少一部份血漿成分，生成血紅細(xì)胞懸液，從而提純了血紅細(xì)胞。例如，使用化學(xué)凝結(jié)劑或機(jī)械攪拌，去除全血的纖維蛋白。例如，通過透析，完成從血紅細(xì)胞分離出血漿成分。接著，可以使用血紅細(xì)胞懸液，生產(chǎn)血紅蛋白氧載體。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1499978SQ02807358
公開日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者瑪麗亞·S·蓋瑞爾, 瑪麗亞 S 蓋瑞爾, A 胡特陳斯, 羅伯特·A·胡特陳斯, R 賴特, 威廉·R·賴特 申請(qǐng)人:柏爾純公司