專利名稱：用于減弱炎癥過程和非特異性免疫參數(shù)的異常激活的含有益生素的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能通過改善非特異性免疫防御參數(shù)和淋巴細(xì)胞亞群體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)減弱炎癥過程的含有益生素(益生佐劑)的組合物。本發(fā)明還涉及將益生制劑用于生產(chǎn)用來減弱炎癥過程和/或諸如吞噬細(xì)胞的非特異性免疫參數(shù)的異常激活的藥物或食品或?qū)櫸锸称方M合物的用途。
背景技術(shù)：
眾所周知，益生素包括糖類，更具體地講，包括寡糖。另外，已知所述糖類業(yè)已被廣泛用作功能性食品成分。它們能抗人類消化道中的酶的水解作用，能夠不被降解地到達(dá)結(jié)腸，并且提供特別適合雙歧桿菌屬生長的糖類物質(zhì)。寡糖可以由葡萄糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、木聚糖、半纖維素、菊糖、樹膠或其混合物產(chǎn)生。純化的市售產(chǎn)品，如寡聚果糖含有超過大約95％的寡糖形式的固體。
主要針對(duì)與礦物質(zhì)的生物可利用性、脂類代謝和胃腸習(xí)性的調(diào)控的功能作用，業(yè)已在人類中研究了寡聚果糖(Roberfroid，M.B.Delzenne，N.M.Annu Rev Nutr 1998；18117-143。對(duì)于它們對(duì)免疫學(xué)功能的影響的關(guān)注較少，同時(shí)，通過動(dòng)物研究了解了它們對(duì)與腸道相關(guān)的淋巴組織的致癌作用和刺激的修飾作用(Pierre，F(xiàn).，等.Cancer Res 1997；57225-228)。
實(shí)際上，寡聚果糖、長鏈(菊糖)和短鏈(寡聚果糖)是能夠逃脫在上胃腸道中被消化的糖類。然后它們?cè)诮Y(jié)腸中發(fā)酵，并且選擇地刺激雙歧桿菌屬生長。
人類腸道菌群及其重要的代謝活性可能與多種和健康相關(guān)的功能相關(guān)，如維持腸道穩(wěn)態(tài)，生物異源物質(zhì)的代謝和腸道免疫的刺激。它們受疾病、飲食、緊張的影響，并且有可能受衰老的影響。大腸中的每克糞便含有高達(dá)1012個(gè)細(xì)菌，具有來自細(xì)菌的大約40-50個(gè)屬的大約103個(gè)不同的種。其中的大部分是專性厭氧菌，不過具有一個(gè)龐大的兼性厭氧菌群。主要的厭氧菌物種是擬桿菌、雙歧桿菌、真桿菌，它們占整個(gè)糞便菌群的99％，其后是梭菌、乳桿菌和格蘭氏陽性球菌、腸球菌、大腸菌類、產(chǎn)甲烷菌，以及含量低得多的硫酸還原細(xì)菌(Hill，M.J.Normal gut bacterial flora.1995；3-17)。
成年人的微菌群特征是在大約兩歲的時(shí)候出現(xiàn)的。成年人腸道微菌群似乎相當(dāng)穩(wěn)定；不過，業(yè)已報(bào)導(dǎo)過隨著衰老會(huì)發(fā)生某些改變，主要是低水平的雙歧桿菌屬和擬桿菌屬(Hopkins，M.J.，等.Gut2001；48198-205)。腸道菌群可以劃分成具有有益作用的菌種，如雙歧桿菌，或具有有害作用的菌種，如銅綠甲單胞菌、變形菌、葡萄球菌、某些梭菌和韋榮氏球菌，和具有中間作用的菌種，如腸球菌、大腸桿菌、腸球菌和擬桿菌。業(yè)已報(bào)導(dǎo)過雙歧桿菌屬和乳桿菌屬對(duì)特異的免疫功能有有益作用(Schiffrin，E.J.，等.，J Dairy Sci1995；78491-497)。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，隨著衰老，雙歧桿菌屬通常會(huì)減少，同時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸球菌和腸桿菌科增加(Mitsuoka，T.Hayakawa，K.ZentralblBakteriol[Orig A]1973；223333-342)。由于較高的萎縮性胃炎和胃酸過少的傾向，在老年人群中細(xì)菌過度生長更為常見。在健康的老年人群中，細(xì)菌的過度生長似乎沒有臨床癥狀，它可能在75歲以上的虛弱的老年人群中具有某些重要作用，并且在與抗生素治療相關(guān)的急性護(hù)理或長期護(hù)理的老年人群中，與艱難梭菌相關(guān)的腹瀉更為常見，并且有可能減弱免疫反應(yīng)。業(yè)已認(rèn)識(shí)到衰老與免疫功能的喪失相關(guān)，并且在營養(yǎng)和免疫功能之間存在相關(guān)性(Meydani，S.N.營養(yǎng)免疫學(xué)研究現(xiàn)狀J Nutr Immunol 1994；293-97)。
免疫反應(yīng)的改變(細(xì)胞因子生產(chǎn)的重建和免疫功能失調(diào))與感染和與感染相關(guān)的死亡的發(fā)病率增加相關(guān)。營養(yǎng)干預(yù)，主要是維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充，可以改善虛弱老年人的免疫反應(yīng)[Lesourd，B.M.Am JClin Nutr 1997；66478S-484S 41]。
本發(fā)明的目的是提供能夠限制免疫功能失調(diào)，尤其是諸如吞噬細(xì)胞和單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的非特異性免疫反應(yīng)的異常激活，以及將淋巴細(xì)胞亞群保持在正常的激活水平上的另一種組合物。
發(fā)明概述因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種含有至少一種益生素的，用于減弱炎癥過程和/或非特異性免疫參數(shù)的異常激活的組合物。
例如，該組合物特別適用于減弱吞噬細(xì)胞的異常激活。
業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，益生添加劑可以誘導(dǎo)炎癥過程的減弱，特別是能誘導(dǎo)非特異性免疫的改變，如減弱了的吞噬細(xì)胞活性，以及白介素-6mRNA在外周血單核細(xì)胞中的減弱了的表達(dá)。
在第二方面，本發(fā)明提供了至少一種益生素用于生產(chǎn)用來減弱哺乳動(dòng)物的炎癥過程的藥物或食品或?qū)櫸锸称方M合物的用途。
在第三方面，本發(fā)明提供了至少一種益生素用于生產(chǎn)用來減弱哺乳動(dòng)物的非特異性免疫參數(shù)的異常激活的藥物或食品或?qū)櫸锸称方M合物的用途。
在第四方面，本發(fā)明提供了一種減弱哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎癥過程的方法，該方法包括給予有效量的益生素或含有至少一種益生素的組合物。
在第五方面，本發(fā)明提供了一種減弱哺乳動(dòng)物體內(nèi)非特異性免疫參數(shù)的異常激活的方法，該方法包括給予有效量的益生素或含有至少一種益生素的組合物。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它能夠減弱炎癥過程，特別是減弱白介素-6mRNA在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它能減弱粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬細(xì)胞活性，特別是在患有慢性炎癥狀況的虛弱患者體內(nèi)的活性。
本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過簡單地消耗本發(fā)明的食品組合物，它可用于改善哺乳動(dòng)物的炎癥狀況，并且因此降低發(fā)生有害感染的危險(xiǎn)。可以理解的是，靜脈內(nèi)或皮下注射藥物需要專業(yè)知識(shí)，并且與口服相比，注射不夠安全、方便或者不容易被患者接受?？紤]到這些因素，本發(fā)明提供了具有可以口服的營養(yǎng)性和/或治療性產(chǎn)品的明確優(yōu)點(diǎn)。
詳細(xì)說明根據(jù)第一方面，所述組合物優(yōu)選含有至少一種益生素或益生混合物。
所述益生素優(yōu)選包括由葡萄糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、木聚糖、半纖維素、菊糖、樹膠(例如阿拉伯樹膠)或其混合物產(chǎn)生的寡糖。所述寡糖更優(yōu)選包括寡聚果糖(FOS)，所述益生素最優(yōu)選是寡聚果糖和菊糖的混合物。該混合物優(yōu)選包括PREBI01或市售RAFTILOSE和RAFTILINE的混合物。
所述益生素優(yōu)選包括大約50％-95％FOS。更優(yōu)選包括大約60％-80％FOS。最優(yōu)選包括大約70％FOS。
所述益生素優(yōu)選包括大約10％-50％菊糖。更優(yōu)選包括大約20％-40％菊糖。最優(yōu)選包括大約30％菊糖。
所述益生素可以包括寡聚果糖和菊糖的混合物，其重量百分比為寡聚果糖70％，菊糖30％。
所述組合物除了所述益生素之外，優(yōu)選含有一種益生菌。例如，所述益生菌可以是雙歧雙歧桿菌或嗜熱鏈球菌。所述雙歧桿菌優(yōu)選是乳酸雙歧桿菌。
在一種實(shí)施方案中，所述組合物可以是完全的和營養(yǎng)平衡的食品或?qū)櫸锸称?。例如，它還可以是食品添加劑。所述組合物優(yōu)選是針對(duì)老年人或老年寵物或患有慢性炎癥的危重疾病患者。
因此，可以制備一種營養(yǎng)全面的寵物食品。所述營養(yǎng)全面的寵物食品可以是任何合適形式的；例如干燥形式、半潮濕形式或潮濕形式；它可以是冷藏或貨架儲(chǔ)存穩(wěn)定的寵物食品。所述寵物食品可以按常規(guī)方法生產(chǎn)。所述益生素優(yōu)選是以含有所述益生素的植物材料形式提供的。合適的植物材料包括蘆筍、洋薊、洋蔥、小麥、yacon或菊苣，或所述植物材料的殘余物。另外，所述益生素能夠以菊糖提取物或其水解產(chǎn)物形式提供，通常被稱為寡聚果糖、寡聚半乳糖、寡聚木糖或淀粉的寡聚衍生物。來自菊苣的提取物是特別適合的。益生素在寵物食品中的最大含量優(yōu)選占重量的大約20％；特別是占重量的大約10％。例如，所述益生素可以占寵物食品重量的大約0.1％-大約5％。對(duì)于用菊苣作為益生素的寵物食品來說，所添加的菊苣可以占該食品混合物重量的大約0.5％-大約10％；更優(yōu)選占重量的大約1％-大約5％。
除了本發(fā)明的益生素之外，所述寵物食品還可以包括任何一種或多種糖類來源、蛋白來源或脂類來源。
可以使用任何合適的糖類來源。所述糖類來源優(yōu)選是以谷物、面粉和淀粉形式提供的。例如，所述糖類來源可以是大米、大麥、高粱、小米、燕麥、玉米粉或小麥面。還可以使用諸如蔗糖、葡萄糖和玉米漿的簡單糖類?？梢愿鶕?jù)需要選擇由所述糖類來源所提供的糖類數(shù)量。例如，寵物食品可以含有高達(dá)占重量的大約60％的糖類。
合適的蛋白來源可以從任何合適的動(dòng)物和植物蛋白來源中選擇；例如肌肉或骨骼肉，肉和骨粉、禽肉粉、魚肉粉、乳蛋白、玉米面筋、小麥面筋、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、卵蛋白、乳清、酪蛋白、和面筋等。對(duì)于老年動(dòng)物來說，所述蛋白來源優(yōu)選含有優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白?？梢愿鶕?jù)需要選擇由所述蛋白來源所提供的蛋白數(shù)量。例如，以干重量為基礎(chǔ)計(jì)算，寵物食品可以含有大約12％-70％的蛋白。
所述寵物食品可以含有脂肪來源。任何合適的脂肪來源都可以使用，包括動(dòng)物脂肪和植物脂肪。優(yōu)選的脂肪來源是動(dòng)物脂肪來源，如牛脂。還可以使用植物油類，如玉米油、向日葵油、紅花油、油菜籽油、大豆油、橄欖油和富含單不飽和和多不飽和脂肪酸的其他油類。除了必須脂肪酸(亞油酸和α亞油酸)之外，所述脂肪來源還可以包括長鏈脂肪酸。合適的長鏈脂肪酸包括γ亞油酸、硬脂烯酸、花生四烯酸、十二碳五烯酸、和二十二碳六烯酸。魚油是十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的合適來源。玻璃苣油、黑醋栗籽油和月見草油是γ亞油酸的合適來源。油菜籽油、大豆油、亞麻油和胡桃油是α亞油酸的合適來源。紅花油、向日葵油、玉米油和大豆油是亞油酸的合適來源。橄欖油、油菜籽油(canola)、高油向日葵和紅花、花生油、稻米糠油是單不飽和脂肪酸的合適來源。可以根據(jù)需要選擇由所述脂肪來源所提供的脂肪的數(shù)量。例如，以干重量計(jì)，所述寵物食品可以含有重量百分比為大約5％-大約40％的脂肪。所述寵物食品優(yōu)選具有較少數(shù)量的脂肪。
所述寵物食品可以含有其他活性劑，如長鏈脂肪酸。合適的長鏈脂肪酸包括α亞油酸、γ亞油酸、亞油酸、十二碳五烯酸、和二十二碳六烯酸。魚油是十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的合適來源。玻璃苣油、黑醋栗籽油和月見草油是γ亞油酸的合適來源。紅花油、向日葵油、玉米油和大豆油是亞油酸的合適來源。
糖類、蛋白和脂類來源的選擇并不是關(guān)鍵的，并且可以根據(jù)動(dòng)物的營養(yǎng)需要、適口性因素、以及所生產(chǎn)的產(chǎn)品類型選擇。另外，根據(jù)需要，還可以將各種其他成分摻入所述寵物食品，例如糖、鹽、香料、調(diào)料、維生素、礦物質(zhì)、芳香劑、樹膠、和益生性微生物。
還可以添加益生性微生物。所述益生性微生物可以選自適合動(dòng)物消耗并且能夠改善腸道中微生物平衡的一種或多種微生物。合適的益生性微生物的例子包括酵母，如啤酒糖酵母屬、德巴利酵母屬、念珠菌屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬；霉菌，如曲霉屬、根霉屬、毛霉屬、和青霉屬以及球擬酵母屬；以及細(xì)菌，如雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、梭桿菌屬、蜜蜂球菌屬、原粘桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬、消化鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬、微球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、氣球菌屬、酒球菌屬和乳桿菌屬。所述益生性微生物可以是粉狀的干燥形式的；特別是對(duì)于能產(chǎn)生孢子的微生物來說是孢子形式的。另外，如果需要的話，可以將所述益生性微生物膠囊化，以便進(jìn)一步提高存活的可能性；例如，膠囊化于糖基質(zhì)、脂肪基質(zhì)或多糖基質(zhì)中。如果使用益生性微生物的話，所述寵物食品優(yōu)選在每克寵物食品中含有大約104-1010細(xì)胞的所述益生性微生物；更優(yōu)選每克食品含有大約106-大約108細(xì)胞的所述益生性微生物。所述寵物食品含有重量百分比為大約0.5％-大約20％的所述益生性微生物的混合物；優(yōu)選大約1％-大約6％的重量百分比；例如，大約3％-大約6％的重量百分比。
對(duì)于老年寵物來說，所述寵物食品優(yōu)選含有與用于年輕寵物的食品相比成比例地減少的脂肪。另外，所述淀粉來源可以包括燕麥、大米、大麥、小麥和玉米中的一種或多種。
對(duì)于干燥的寵物食品來說合適的工藝是擠壓蒸煮，不過，也可以使用烘烤和其他合適的工藝。在進(jìn)行擠壓蒸煮時(shí)，所述干燥的寵物食品通常是以粗粒形式提供的。如果使用益生素的話，可以在加工之前將所述益生素與所述干燥寵物食品的其他成分混合。在歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?850569中披露了一種合適的工藝。如果使用益生性微生物的話，最好將所述微生物包衣在干燥的寵物食品上或填充到寵物食品內(nèi)。在歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?862863中披露了一種合適的工藝。
對(duì)于潮濕的寵物食品來說，可以用披露于美國專利4,781,939和5,132,137中的方法生產(chǎn)模擬的肉類食品。還可以使用用于生產(chǎn)大塊型產(chǎn)品的其他方法；例如，在蒸汽烤爐中蒸煮。另外，可以生產(chǎn)長方形食品，包括乳化合適的肉類材料以便生產(chǎn)肉類乳液，添加合適的膠凝劑，并且在填充到包裝罐或其他容器中之前，對(duì)所述肉類乳液進(jìn)行加熱。
在另一種實(shí)施方案中，制備了一種供人類消耗的食品組合物。該組合物可以是營養(yǎng)全面的配方、乳制品、冷藏的或貨架儲(chǔ)存穩(wěn)定的飲料、湯、食品添加劑、谷粉替代品、和營養(yǎng)棒或糖果。
除了本發(fā)明的益生素之外，所述營養(yǎng)配方還可以包括蛋白來源。優(yōu)選將飲食蛋白用作蛋白來源。飲食蛋白可以是任何合適的飲食蛋白；例如動(dòng)物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物蛋白(如大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游離氨基酸的混合物；或其組合。諸如酪蛋白的乳蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白是特別優(yōu)選的。所述組合物還可以含有糖類來源和脂肪來源。
如果所述營養(yǎng)配方包括脂肪來源的話，所述脂肪來源優(yōu)選能提供所述營養(yǎng)配方的大約5％-大約55％的能量；例如大約20％-大約50％的能量。組成所述脂肪來源的脂類可以是任何合適的脂肪或脂肪混合物。植物脂肪是特別適合的；例如大豆油、棕櫚油、椰子果油、紅花油、向日葵油、玉米油、canola油、和卵磷脂等。如果需要的話，還可以添加動(dòng)物脂肪，如乳類脂肪。
可以在所述營養(yǎng)配方中添加糖類來源。糖類來源優(yōu)選提供所述營養(yǎng)組合物的大約40％-大約80％的能量。可以使用任何合適的糖類，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體和麥芽糖糊精及其混合物。如果需要的話，還可以添加食用纖維。如果使用的話，它優(yōu)選占所述營養(yǎng)配方能量的大約5％。所述食用纖維可以來自任何合適的來源，例如，包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜耳膠、阿拉伯樹膠、和寡聚果糖。在所述營養(yǎng)配方中還可以添加滿足適應(yīng)的指導(dǎo)數(shù)量的合適的維生素和礦物質(zhì)。
如果需要的話，可以將一種或多種食品級(jí)乳化劑添加到所述營養(yǎng)配方中；例如二乙酰酒石酸單-和雙-甘油酯，卵磷脂和單-和雙-甘油酯。類似地，可以添加合適的鹽和穩(wěn)定劑。
所述營養(yǎng)配方優(yōu)選是可以腸道給藥的；例如以粉末、片劑、膠囊、液體濃縮物、固體產(chǎn)品或便于飲用的飲料形式提供。如果需要生產(chǎn)粉末狀的營養(yǎng)配方的話，可以將均化的混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)諸如噴霧干燥器或冷凍干燥器的合適的干燥裝置中，并且轉(zhuǎn)化成粉末。
在另一種實(shí)施方案中，一種營養(yǎng)組合物包括與益生制劑混合在一起的乳基谷物。所述乳基谷物優(yōu)選是嬰兒谷物，它起著所述益生制劑的載體的作用。
在另一種實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的至少一種益生素強(qiáng)化常規(guī)的食品。例如，發(fā)酵乳、酸奶、鮮奶酪、凝乳、糖果食品，例如甜味或增甜飲料、糖果棒、早餐谷片或條、飲料、奶粉、大豆基產(chǎn)品，非乳發(fā)酵產(chǎn)品或用于臨床營養(yǎng)的營養(yǎng)添加劑。所述組合物的添加量優(yōu)選至少占重量的大約0.01％。
下面所提供的實(shí)施例僅僅是說明性的，并且不能以任何形式理解成是對(duì)本發(fā)明主題的限定。百分比和份數(shù)是以重量為基礎(chǔ)的，除非另有說明。在實(shí)施例之前是對(duì)附圖的扼要說明。


圖1食用8克短鏈寡聚果糖(FOS)對(duì)療養(yǎng)院的老人的新鮮糞便樣品中雙歧桿菌的活菌數(shù)量的影響。所述時(shí)間點(diǎn)是在為期3周FOS攝取之前(2)、期間(3)、和之后(4)。(A)各個(gè)值。(B)方框圖。方框表示25th和75th百分位數(shù)，在方框內(nèi)的實(shí)線條表示中間值，和t型5th和95th百分位數(shù)；實(shí)心點(diǎn)表示外側(cè)值。
圖2寡聚果糖(FOS)對(duì)成年人和老年人體內(nèi)雙歧桿菌的影響。編號(hào)24(Bouhnik Y等，J Nutr 1999；129113)在18-47歲的成年人中來自2.5-20克FOS/天的劑量反應(yīng)；編號(hào)25(Menne E等，J Nutr2000；1301197)在20-50歲的成年人體內(nèi)對(duì)8克FOS/天的反應(yīng)；編號(hào)26(Gibson GR J Nutr 1999；1291438S)在年輕成年人體內(nèi)對(duì)15克FOS/天的反應(yīng)；編號(hào)27(Kruse HP等，Brit J Nutr 1999；82375)在26-53歲成年人體內(nèi)對(duì)高達(dá)34克/天的菊糖的反應(yīng)；編號(hào)28(Kleessen B等，Am J Clin Nutr 1997；651397)在年齡為68-89歲的老年便秘受試者中對(duì)20克FOS/天的反應(yīng)。本研究在年齡為77-91歲的療養(yǎng)院的受試者對(duì)8克FOS/天的反應(yīng)。
圖3在補(bǔ)充了FOS的老年人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中IL-6mRNA表達(dá)的差異。通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定IL-6mRNA在PBMC中的表達(dá)。通過用NIH-圖象程序掃描帶強(qiáng)度，估算定量改變，并且以IL-6mRNA與β-肌動(dòng)蛋白mRNA的百分比的密度比例形式計(jì)算。時(shí)間點(diǎn)為在為期3周的FOS攝取之前(2)、期間(3)、和之后(4)。(A)來自溴化乙錠染色凝膠的各個(gè)改變的典型圖象。(B)IL-6mRNA表達(dá)的定量評(píng)估在FOS攝取期間，IL-6mRNA的改變明顯不同于在攝取FOS之前的改變(p＝0.018)。
實(shí)施例1寡糖對(duì)老年人糞便菌群和非特異性免疫系統(tǒng)的影響材料和方法研究設(shè)計(jì)本研究是對(duì)19位療養(yǎng)院的老年患者的試驗(yàn)前/試驗(yàn)后研究(參見研究方案)。
在時(shí)間點(diǎn)1(試驗(yàn)前或在洗脫期開始的時(shí)候)，2(在攝取益生素之前)，3(在攝取益生素期間)，和4(隨訪期后)測定體重并且采集大便、血液和尿液樣品。
在整個(gè)研究期間，限制發(fā)酵乳制品的攝取，并且限制含有寡聚果糖的食品(洋蔥、韭菜、菊苣根)。
受試者征集19位療養(yǎng)院的老年受試者用于研究。在本研究中排除滿足下列標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的受試者在上個(gè)月做過抗生素治療慢性腸道疾病特殊飲食方案(即素食者)診斷出胃腸癌出現(xiàn)腸胃氣脹獲得了研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。獲得了來自所有受試者的知情同意書。本研究是在一家當(dāng)?shù)丿燄B(yǎng)院進(jìn)行的，Le Mont-P lerin，Switzerland。
營養(yǎng)狀態(tài)在開始研究時(shí)，通過最低營養(yǎng)評(píng)估(MNA)測試評(píng)估營養(yǎng)狀態(tài)，該測試包括以下項(xiàng)目人體測量(小腿圍和臂圍、身高、體重、和體重減少)，一般性評(píng)估(生活方式、醫(yī)療、運(yùn)動(dòng)能力)，飲食詢問(用餐次數(shù)、攝取的液體和食物、進(jìn)食的自主性)，和主觀評(píng)估(對(duì)健康和營養(yǎng)的自我感覺)[Guigoz，Y.，等.Nutr Rev 1996；54S59-S65]。MNA使用30分的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)老年人營養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行分類MNA≥24＝營養(yǎng)良好，MNA 17-23.5＝有營養(yǎng)不良的危險(xiǎn)，而MNA＜17＝營養(yǎng)不良。
益生素補(bǔ)充按以下方式每天給予8克短鏈寡聚果糖(FOS)每天2次，4克FOS粉末(Actilight 950P，Béghin-Meiji industries，Neuilly-sur-Seine，F(xiàn)rance)，由護(hù)理人員在用餐時(shí)摻入飯菜中。為了評(píng)估并發(fā)癥，由護(hù)士在每天的記錄表上記錄每天對(duì)添加劑的消耗量。
微生物學(xué)研究統(tǒng)計(jì)了乳桿菌屬、擬桿菌屬、腸桿菌科、腸球菌屬、雙歧桿菌屬和產(chǎn)氣莢膜梭菌的內(nèi)源群體。
在第0、21、42和63天收集每一位受試者的大便樣品。將所述大便樣品立即(在30分鐘之內(nèi))放入一個(gè)厭氧罐中，并且在4℃下保存直到分析(最長6小時(shí))。用含有0.5％半胱氨酸的預(yù)先還原的Ringer溶液進(jìn)行100倍的系列稀釋，從-2到-8。接種各種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，并且使用Anaerocult A(Merck，Darmstadt，Germany)在37℃下，在厭氧環(huán)境中溫育48小時(shí)，所不同的是，腸球菌和腸桿菌是在37℃下，在需氧環(huán)境下溫育24小時(shí)。按以下方法在選擇性或半選擇性培養(yǎng)基上檢測細(xì)菌在Drigalski培養(yǎng)基上檢測腸桿菌科(SanofiDiagnostics Pasteur，F(xiàn)rance)，在Eugon Tomato培養(yǎng)基上檢測雙歧桿菌屬(Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual，V.Suter，D.Citron and S.Finegold Third edition)，在含有抗生素(Phosphomycine(79.5mg/l)+磺甲惡唑(0.93mg/l)+甲氧芐啶(5mg/l))的MRS(Difco，MI.USA)中檢測乳桿菌屬，在NN瓊脂(Lowbury and Lilly，1995)檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌，在Neo-Vanco培養(yǎng)基(BioMrieux，Marcy-l′Etoile，F(xiàn)rance)上培養(yǎng)擬桿菌屬，并且在Azide瓊脂上檢測腸球菌(Difco)。
在溫育之后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，并且在必要時(shí)進(jìn)一步鑒定。通過顯微技術(shù)鑒定乳桿菌和雙歧桿菌菌株，并且使用API觀察系統(tǒng)(BioMrieux)進(jìn)行生物化學(xué)鑒定，分別將API 50CHL觀察系統(tǒng)用于乳桿菌，將API ID 32A觀察系統(tǒng)用于雙歧桿菌屬。細(xì)菌數(shù)量是以每克新鮮糞便樣品中的log10菌落形成單位(CFus)形式表示的，檢測限為3.30cfu/g。
糞便pH在排便后不久由護(hù)士用微電極(Orion)在粗糞便上的三個(gè)不同點(diǎn)上測定糞便pH。計(jì)算每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的平均pH。
血液取樣在研究開始之前(4ml)以及在第0、21、42和63天(23ml)從每一位禁食的受試者體內(nèi)抽取血液樣品。血液是在禁食一夜之后在上午(在上午10點(diǎn)之前)采集的。將樣品收集在真空容器管中。將13ml樣品收集在肝素化試管中，并且讓10ml樣品在室溫下凝固30-60分鐘。血清樣品在-70℃下冷凍保存直到分析。將肝素化的血液用于功能性免疫參數(shù)(吞噬作用，參見下文)和血液學(xué)。
免疫學(xué)分析通過Simulset和Pagotest(Becton Dickinson，Basel，Switzerland)在新鮮肝素化血液樣品中分析外周血單核細(xì)胞群及其吞噬活性。
通過PCR分析白介素-6mRNA表達(dá)在外周血單核細(xì)胞中mRNA表達(dá)的分析是按照Delneste，Y.，等(Nutr Rev 1998；56S93-S98)所披露的方法通過PCR評(píng)估的。引物序列為5′-CTGCAGGAACTGGATCAGGACTTTTGTACT-3′ 和5′-GCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG-3′用于白介素-6(IL-6) 和5′CGTTTCCCGCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC-3′ 和5′-GGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCATC-3′用于β-肌動(dòng)蛋白。
生物學(xué)測定使用Behring濁度計(jì)，通過免疫-濁度法分析血清白蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白(前白蛋白)、C-反應(yīng)蛋白、和α1-酸性糖蛋白濃度(方法和試劑由Behring，Marburg，Germany提供)。通過放射免疫測定分析葉酸和維生素B12(鈷胺素)濃度(Dual Count，Diagnostic ProductCorporation，Los Angeles，California，USA)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析根據(jù)平均差計(jì)算單樣品t-檢驗(yàn)或Wilcoxon signed-rank檢驗(yàn)，以便評(píng)估主要假設(shè)的在0.05％水平上的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性益生素對(duì)所測定的不同參數(shù)是否有作用？根據(jù)所述平均差計(jì)算另一個(gè)單樣品t-檢驗(yàn)，以便評(píng)估與本研究的設(shè)計(jì)相關(guān)的兩個(gè)問題(包括試驗(yàn)前和試驗(yàn)后期)在0.025％水平上的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(對(duì)自由度損失進(jìn)行校正終止發(fā)酵乳(＝洗脫期)是否對(duì)測定的不同參數(shù)有影響？終止益生素(＝隨訪期)是否對(duì)測定的不同參數(shù)有影響？所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都是用NCSS 6.0.22統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成的。
結(jié)果受試者所述19位受試者(4個(gè)男性和15個(gè)女性)的平均年齡為85±6.0(77-97歲)。女性體重明顯比男性輕。在表1中提供了在研究開始時(shí)受試者的特征。
表1受試者特征
只有一位受試者患有營養(yǎng)不良，7位具有患營養(yǎng)不良危險(xiǎn)的女性處在21.5-23的較高得分范圍內(nèi)，而營養(yǎng)良好的平均MNA得分范圍為24.6±3.0分。
血清白蛋白(正常范圍35-55g/L)和運(yùn)甲狀腺素蛋白(前白蛋白；正常范圍0.16-0.40)在較低的正常范圍內(nèi)，而急性期蛋白、α1-酸性糖蛋白(正常范圍0.5-1.3)和C-反應(yīng)蛋白(正常值＜10mg/L，而老年人的異常值＞20mg/L)表明不存在炎癥過程，只有2位男性(具有較高的C-反應(yīng)蛋白水平)和2位女性(低白蛋白水平，具有正常的運(yùn)甲狀腺素蛋白和臨界C-反應(yīng)蛋白)。以上結(jié)果表明，有一類老年人仍然營養(yǎng)良好，但是相當(dāng)虛弱。
細(xì)菌學(xué)分析和糞便pH在補(bǔ)充FOS的3周時(shí)間內(nèi)，雙歧桿菌屬的細(xì)菌數(shù)量的log10CFU平均值提高了2.8±0.57(p＜0.001)，但是擬桿菌屬數(shù)量也增加了(p＜0.032)(參見表2a和2b以及圖1)。
表2a給予FOS對(duì)糞便菌群和pH的影響
95％CI＝±95％置信區(qū)間腸桿菌科、腸球菌屬和乳桿菌屬的細(xì)菌數(shù)量沒有受到抑制乳制品發(fā)酵和/或攝取寡聚果糖(FOS)的顯著影響。不過，對(duì)于雙歧桿菌屬來說，所述影響似乎是對(duì)攝取FOS的一種特異性反應(yīng)，它主要導(dǎo)致了在開始使用FOS之前表現(xiàn)出log10CFU低于7的受試者的雙歧桿菌屬數(shù)量的增加。抑制FOS補(bǔ)充，顯著降低了雙歧桿菌屬的數(shù)量，log10CFU降低了1.1±0.39，不過，沒有達(dá)到起始水平(表2a和2b以及圖1)。在圖2中，比較了在本研究中獲得的雙歧桿菌屬的變化和以前研究中的變化，表明老年人對(duì)FOS作用的敏感程度至少與年輕的成年人一樣。抑制發(fā)酵的乳制品或攝取FOS，都沒有改變糞便pH(表2a)。
非特異性免疫攝取FOS導(dǎo)致了外周T淋巴細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞亞型CD4+，CD8+T細(xì)胞百分比顯著增加(表3a和3b)。白細(xì)胞、激活的T淋巴細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞的總數(shù)量沒有受到攝取FOS的影響(表3a和3b)。
表3a外周免疫學(xué)參數(shù)淋巴細(xì)胞亞群
95％CI＝+/-95％置信區(qū)間表3b-c-d外周免疫學(xué)參數(shù)的改變所提供的數(shù)據(jù)是在每個(gè)3周時(shí)間之后的平均差±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)
1FOS＝4g/每日兩次，2終止發(fā)酵乳制品的作用＝在試驗(yàn)前取樣和開始補(bǔ)充益生素之間的平均變化(3周洗脫期)，3補(bǔ)充FOS的作用(4克/每日兩次)＝在開始補(bǔ)充益生素和補(bǔ)充結(jié)束時(shí)之間的平均變化(3周益生素?cái)z取期)，4終止補(bǔ)充F0S的作用＝補(bǔ)充益生素結(jié)束和本研究結(jié)束之間的平均變化(3周隨訪期)，5對(duì)平均差的單樣品t-檢驗(yàn)。
通過攝取FOS顯著降低了粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬活性吞噬活性以平均熒光強(qiáng)度改變形式表示，對(duì)于粒細(xì)胞來說從130±10降低到52±2(p＜0.001)，而對(duì)于單核細(xì)胞來說從75±5降低到26±2(p＜0.001)。
在攝取FOS之后外周血單核細(xì)胞中白介素-6mRNA的含量的顯著降低，同樣表明了炎癥過程的可能的減輕(圖3)。
維生素B12和葉酸狀態(tài)補(bǔ)充FOS沒有影響維生素B12或葉酸血清含量在補(bǔ)充之前血清維生素B12含量為271±143ng/L，而在補(bǔ)充期間為289±160ng/L。不過有3位受試者缺乏維生素B12有2位受試者在研究期間恢復(fù)到正常狀態(tài)，而其他的受試者在整個(gè)研究期間保持缺乏。在補(bǔ)充之前血清葉酸含量為5.9±2.0ug/L，而在補(bǔ)充期間為5.7±1.9ug/L。
我們的結(jié)果有力支持了寡聚果糖在老年受試者中的產(chǎn)雙歧桿菌作用，雙歧桿菌屬數(shù)量增加了2個(gè)對(duì)數(shù)值，因?yàn)槲覀兊奶撊醯睦夏晔茉囌咴谘芯块_始時(shí)表現(xiàn)出低的雙歧桿菌屬數(shù)量。外周血單核細(xì)胞中IL-6mRNA表達(dá)的減弱表明了炎癥過程的減弱。
實(shí)際上，本研究證明了補(bǔ)充FOS對(duì)在成年人和老年人中所觀察到的雙歧桿菌屬的正影響(圖2)，表明與年輕的成年人一樣，老年人對(duì)益生素(FOS)的反應(yīng)是雙歧桿菌屬的增加，或者如果雙歧桿菌屬的數(shù)量很低的話結(jié)果會(huì)更好。另外，8克或更少的FOS似乎就足以獲得對(duì)雙歧桿菌屬數(shù)量的最大影響。盡管不同的研究似乎存在一種劑量反應(yīng)，單一的研究表明，超過4-5克/天的閾值獲得了最大反應(yīng)，并且雙歧桿菌屬的增加似乎在更大程度上取決于起始數(shù)量(圖1和2)。通常添加到飲食中的FOS可以增加雙歧桿菌屬的含量，其代價(jià)是減少了潛在的有害細(xì)菌，主要是梭菌屬和擬桿菌屬。不過，在本研究中我們觀察到了擬桿菌屬的顯著增加(表2a和2b)。
我們發(fā)現(xiàn)了吞噬活性的顯著減弱。這種吞噬活性的減弱病可能是與致病細(xì)菌的可能減少相關(guān)的巨噬細(xì)胞激活減弱的一種反映，并因此暗示了由于具有較低的內(nèi)毒素負(fù)擔(dān)而減輕了炎癥。不過，令人吃驚的是，炎癥過程的這種可能的減輕，是通過外周血單核細(xì)胞中白介素-6mRNA含量的降低表明的(圖3)。
例2食品添加劑通過以大約70％的寡聚果糖與大約30％的菊糖的重量比例混合或摻合寡聚果糖和菊糖制備了一種食品添加劑。所得到的益生混合物可以添加或摻合任何合適的載體，例如，發(fā)酵乳、酸乳、鮮奶酪、凝乳、糖果條、早餐谷物片或條、飲料、奶粉、大豆基食品、非乳發(fā)酵制品或用于臨床營養(yǎng)的營養(yǎng)添加劑。
例3干燥的寵物食品一種飼料混合物是由重量百分比為大約58％的玉米、重量百分比為大約5.5％的玉米面筋、重量百分比為大約22％的雞肉粉、2.5％的干燥菊苣、1％的肉堿、組成其余部分的鹽、維生素和礦物質(zhì)組成。
將所述飼料混合物添加到一個(gè)預(yù)調(diào)節(jié)器中，并且濕化。然后將所述濕化的飼料添加到一個(gè)擠出器-蒸煮器中，并且明膠化。離開所述擠出器的明膠化基質(zhì)強(qiáng)制通過一個(gè)模具并且擠出。將擠出物切割成適合飼養(yǎng)狗的小塊，在大約110℃下干燥大約20分鐘，并且冷卻以便形成團(tuán)。
這種干燥的狗食特別適用于減輕炎癥過程和/或諸如吞噬細(xì)胞的非特異性免疫參數(shù)的異常結(jié)果。
例4濕的罐裝寵物食品用56％的禽骨架，豬肺和豬肝(研磨物)，3％的魚，16％的小麥粉，8％的血漿，10.8％的水，2.2％的染料、1％的半精煉κ角叉菜膠，無機(jī)鹽和9％的富含單不飽和脂肪酸的油(橄欖油)和3％的菊苣制備一種混合物。在12℃下乳化該混合物，并且以布丁形式擠出，然后在90℃下蒸煮。將其冷卻到30℃，并且切割成厚塊。
將30％的這種厚塊(含水量為58％)摻入由23％的禽骨架，1％的瓜耳樹膠，1％的染料和香料以及75％的水制備的基料中。然后填充到鍍錫鐵皮罐中，并且在127℃下消毒60分鐘。
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)減輕炎癥過程和/或非特異性免疫參數(shù)的異常激活的組合物，該組合物含有至少一種益生素。
2.如權(quán)利要求1的組合物，用于減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)的吞噬細(xì)胞的異常激活。
3.如權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述益生素包括由葡萄糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、木聚糖、半纖維素、菊糖、樹膠或其混合物產(chǎn)生的寡糖。
4.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中，所述益生素包括寡聚果糖。
5.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中，所述益生素包括寡聚果糖和菊糖的混合物。
6.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中，所述益生素包括重量百分比為大約60％-大約80％的寡聚果糖，和大約20％-大約40％的菊糖。
7.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，除了所述益生素之外，它還含有益生菌。
8.如權(quán)利要求7的組合物，其中，所述益生菌選自雙歧雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌。
9.如權(quán)利要求1-7的組合物，它是針對(duì)老年人或老年寵物，或患有慢性炎癥的重病患者。
10.至少一種益生素用于生產(chǎn)用來減輕哺乳動(dòng)物的炎癥過程的藥物或食品或?qū)櫸锸称方M合物的用途。
11.至少一種益生素用于生產(chǎn)用來減輕哺乳動(dòng)物的非特異性免疫參數(shù)的異常激活的藥物或營養(yǎng)組合物的用途。
12.如權(quán)利要求10或11的用途，其中，所述益生素包括由葡萄糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、木聚糖、半纖維素、菊糖、樹膠或其混合物產(chǎn)生的寡糖。
13.如權(quán)利要求10-12中任意一項(xiàng)的用途，其中，所述益生素包括寡聚果糖或寡聚果糖和菊糖的混合物。
14.如權(quán)利要求10-13中任意一項(xiàng)的用途，其中，所述益生素包括重量百分比為大約60％-大約80％的寡聚果糖，和大約20％-大約40％的菊糖。
15.如權(quán)利要求10-14中任意一項(xiàng)的用途，其中，所述益生素是以與益生菌，特別是雙歧雙歧桿菌或嗜熱鏈球菌的混合物形式提供的。
16.如權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)的用途，它是針對(duì)老年人或老年寵物，或患有慢性炎癥的重病患者。
17.一種減輕哺乳動(dòng)物的炎癥過程的方法，該方法包括給予有效量的益生素或含有至少一種益生素的組合物。
18.一種用于減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)諸如吞噬細(xì)胞的非特異性免疫參數(shù)的異常激活的方法，該方法包括給予有效量的益生素或含有至少一種益生素的組合物。
19.如權(quán)利要求17或18中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述益生素包括由葡萄糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、木聚糖、半纖維素、菊糖、樹膠或其混合物產(chǎn)生的寡糖。
20.如權(quán)利要求17-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述益生素包括寡聚果糖。
21.如權(quán)利要求17-20中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述益生素包括寡聚果糖和菊糖的混合物。
22.如權(quán)利要求16-20中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述益生素包括重量百分比為大約60％-大約80％的寡聚果糖和大約20％-大約40％的菊糖。
23.如權(quán)利要求17-22中任意一項(xiàng)的方法，除了給予所述益生素之外，它包括給予有效量的益生菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及能通過改善非特異性免疫參數(shù)和淋巴細(xì)胞亞群的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)減弱炎癥過程的含有益生素(益生佐劑)的組合物。本發(fā)明還涉及將益生制劑用于生產(chǎn)用來減弱炎癥過程和/或諸如吞噬細(xì)胞的非特異性免疫參數(shù)的異常激活的藥物或食品或?qū)櫸锸称方M合物的用途。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1738595SQ02807078
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月22日
發(fā)明者F·羅查特, E·施夫林, Y·吉戈茲 申請(qǐng)人:雀巢制品公司