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一種治療冠心病的中藥的制作方法

文檔序號(hào):811176閱讀:552來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種治療冠心病的中藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于一種治療冠心病的中藥。
背景技術(shù)
冠心病在發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家是常見(jiàn)病、多發(fā)病。近年在我國(guó)也呈明顯上升的趨勢(shì),城市人口死亡中冠心病約占10%左右,因此,冠心病已引起人們的重視,對(duì)該疾病的治療,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采取擴(kuò)張血管療法,、改善血液療法及內(nèi)皮細(xì)胞重建法三大方法,但有許多弊端和不良反應(yīng)。中醫(yī)藥治療冠心病以其療效確切、副作用小、作用持久的優(yōu)勢(shì)已逐漸被人們所認(rèn)知。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為冠心病是以臟腑虛損,氣血陰陽(yáng)不足為本,以氣滯、血瘀、痰濁和寒凝等有形之邪為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。目前已有一些治療冠心病的中藥,如地奧心血康等,對(duì)治療冠心病有一定的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種一以益氣活血為原則、療效好、無(wú)任何毒副作用、作用持久、價(jià)格低廉的一種治療冠心病的中藥。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明是由黃芪、黨參、桂枝、甘草、丹參、元胡、降香、三七組成,它們的重量份數(shù)比是黃芪10-20份、黨參4-6份、桂枝1-2份、甘草1-2份、丹參4-6份、元胡4-10份、降香1-2份、三七1-2份。制備工藝可按中藥制取的常規(guī)工藝根據(jù)需要制成不同劑型。
由于冠心病多以氣虛血瘀為主要發(fā)病機(jī)制,因此治療應(yīng)采取以補(bǔ)為通、補(bǔ)中寓通、通補(bǔ)兼施,著眼于整體功能的調(diào)節(jié),達(dá)到氣盈血行,血脈通利,胸痛自解的目的。本發(fā)明綜合冠心病中醫(yī)補(bǔ)中寓通的治法,提出了以益氣活血為組方原則的新配方。本發(fā)明選用黃芪、黨參為主藥,黃芪味甘,性微溫,歸脾肺二經(jīng),具有補(bǔ)益宗氣,益氣固表,利水消腫作用。
《本草求真》黃芪,入肺補(bǔ)氣,入表實(shí)衛(wèi),為補(bǔ)氣諸藥之最?,F(xiàn)代藥理研究則揭示黃芪具有擴(kuò)張血管,尤其是擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用,減輕心肌缺血和心肌代謝及縮小梗塞面積的作用,而且還具有升降雪壓,降低血液粘稠度及改善異常的血液流變學(xué)指標(biāo)等功能。黃芪還具有明顯贈(zèng)加心排量及心臟指數(shù)、保護(hù)心肌細(xì)胞、加強(qiáng)心肌的的收縮力等功效。黨參味甘,性平,歸脾肺二經(jīng),具有益氣、生津、養(yǎng)血之作用?!侗静輳男隆贰爸餮a(bǔ)中益氣,和脾胃,涂煩渴。中氣微弱,用以調(diào)補(bǔ),甚為平妥?!爆F(xiàn)代藥理則揭示黨參能增強(qiáng)心肌收縮力,增強(qiáng)心輸出量,還能擴(kuò)張外周血管,調(diào)節(jié)血壓。丹參為輔藥,具有活血化瘀的作用。丹參能通過(guò)清除自由基而保護(hù)心肌、抗血栓形成及擴(kuò)張血管作用、降低血壓作用,研究還發(fā)現(xiàn),丹參對(duì)心肌鈣反常損傷具有明顯的保護(hù)作用。丹參素具有改善微循環(huán)障礙,從而改善細(xì)胞缺血缺氧所致的代謝障礙的作用。元胡、三七為佐藥,以助丹參活血化瘀之效?!侗静萸笳妗费浴叭邭馕犊鄿?,能于血分化其血瘀。”三七中有效成分三七總皂甙可顯著保護(hù)SOD活力的降低,減少M(fèi)DA生成,有明顯的抗氧化作用。三七還有改善冠脈循環(huán)和抗血小板聚集力的作用。同時(shí)三七還能明顯的降低心肌耗氧量,具有改善心肌氧代謝的作用。元胡在《本草綱目》中記載“玄胡索味苦微辛,氣溫;入手足太陰,厥陰四經(jīng),能行血中氣滯,氣中血滯,故專(zhuān)治一身上下諸痛?!痹继嵛镉忻黠@的擴(kuò)張離體兔心和在體豬心的冠狀血管,降低冠脈阻力與增加血流量的作用,對(duì)麻醉犬冠狀動(dòng)脈的擴(kuò)張作用最明顯,頸內(nèi)動(dòng)脈次之。元胡醇提物還可明顯提高動(dòng)物對(duì)常壓或減壓缺氧的耐受能力、增加麻醉犬的心輸出量、降低血壓和外周阻力。降香、桂枝、甘草為使藥,一方面助臣藥丹參和佐藥活血化瘀,另一方面具有行氣作用?,F(xiàn)代藥理研究表明,降香主要含黃檀素,異黃檀素等,對(duì)血流變學(xué)的纖溶蛋白原有降低作用,并增加冠脈流量,減慢心率,增加心肌供氧,降低心肌氧耗量的作用。桂枝味辛甘,性溫、歸心、肺、膀胱經(jīng),現(xiàn)代藥理研究表明桂枝其成分含有揮發(fā)油,桂皮油能使血管擴(kuò)張,調(diào)整血液循環(huán),促使血液流向體表。甘草味甘,歸平,歸心肺、脾胃涇,具有益氣補(bǔ)中、調(diào)和藥性、抗心率失常之功效。
研究和實(shí)驗(yàn)表明,本發(fā)明不僅具有顯著的抗心肌缺血損傷作用,而且還具有多重的作用機(jī)制,它可改善心肌細(xì)胞能量代謝,改善內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能障礙,加速和增強(qiáng)側(cè)支肢循環(huán)的的建立和血管的新生,抑制和阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因而對(duì)冠心病的治療療效顯著,作用持久,并且無(wú)任何毒副作用。
下面是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果(一)材料與方法1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar雄性大白鼠100只,體重200±25g。昆明種小鼠240只,體重18-21克,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2、實(shí)驗(yàn)藥物(1)實(shí)驗(yàn)藥物采用本發(fā)明的沖劑劑型,即復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑取黃芪100g,黨參30g,丹參30g,元胡50g,三七10g,降香10g,桂枝10g,甘草10g,加水煎煮3次,三次均加水8倍量,每次煎煮90min,保持80-90℃熱浸1小時(shí),合并三次煎液,濾過(guò),濾液減壓濃縮至稠膏(約占原體積的二分之一)冷卻后慢慢加入2倍量的乙醇,快速充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅o置12-14小時(shí),濾取上清液,減壓回收乙醇至相對(duì)密度1.30-1.35(50℃熱測(cè))的清膏,取清膏1份,糊精1份及乙醇適量,混勻,過(guò)10目篩制成顆粒,于60-70℃干燥,然后分裝。實(shí)驗(yàn)前制成復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑懸液,用蒸餾水配制成25%(100ml含生藥25g)的濃度備用。
(2)地奧心血康膠囊成都地奧制藥公司批號(hào)990415,實(shí)驗(yàn)前以生理鹽水調(diào)成0.3/2ml濃度懸液備用。
(3)鹽酸異丙腎上腺素注射液上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)991002。
3、實(shí)驗(yàn)儀器研究用萬(wàn)能顯微鏡(BX60),日本OLYMPUS公司產(chǎn)品攝影顯微鏡(CH型),日本OLYMPUS產(chǎn)品透射電子顯微鏡(1220型),日本電子公司產(chǎn)品萊卡輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(2145型),德國(guó)萊卡公司醫(yī)用微波爐,南韓SAMSUNG液體閃爍記錄儀(FJ-210P型),國(guó)營(yíng)二六二廠電熱恒溫水箱(HHWZ1600),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠氣浴恒溫振蕩器(THZ-82A),江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠分光光度計(jì)(UV-754),上海第三分析儀器廠干燥箱(101A-Z)型,上海市實(shí)驗(yàn)集器總廠II導(dǎo)生理記錄儀LMS-2A型,成都儀器廠4、實(shí)驗(yàn)用主要試劑一氧化氮試劑盒,北京解放軍總院科技開(kāi)發(fā)中心內(nèi)皮素試劑盒,北京解放軍總院科技開(kāi)發(fā)中心ATPase(組織)試劑盒,南京建成生物工程研究所原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒,德國(guó)B·M公司Bcl-2試劑盒,武漢博士德公司Fas試劑盒,武漢博士德公司血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(FaVIII)試劑盒,武漢博士德公司血脂試劑盒,黑龍江省省醫(yī)院放免中心5、實(shí)驗(yàn)方法(1)動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為五組,每組12只大鼠,即正常組、模型組、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑高劑量組、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑低劑量組、地奧心血康對(duì)照組(2)實(shí)驗(yàn)用藥、造模及取材實(shí)驗(yàn)用藥前各組動(dòng)物分別以II導(dǎo)生理記錄儀測(cè)心電圖,繼則開(kāi)始每天分別灌胃,生理鹽水(10ml/kg體重)、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑5g/kg體重(含生藥量)、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑2.5g/kg體重(含生藥量)地奧心血康0.12g/kg體重,連續(xù)7天,于第5天、第6天和第7天灌藥后30分鐘,各組動(dòng)物分別以烏拉坦(10%的烏拉坦,1ml/100g體重)麻醉,皮下多點(diǎn)注射鹽酸異丙腎上腺素(ISO8mg/kg體重,參照文獻(xiàn)復(fù)制ISO心肌缺血損傷模型),正常對(duì)照組給予等容量的生理鹽水。于第3次注射異丙腎上腺素后24小時(shí)眼眶采血2ml分離血清待測(cè)生化指標(biāo),采血之后將大鼠處死,摘取心臟,立即用予冷的生理鹽水沖洗,沖洗后分別切取心肌組織行各項(xiàng)觀察指標(biāo)的檢測(cè)。
(3)各組心肌組織勻漿的制備①切取心肌組織塊,用冰冷的生理鹽水沖洗,除去血液,濾紙拭干,稱(chēng)重(300mg),放入5-10ml的小燒杯內(nèi)。
②用量筒量取予冷的生理鹽水2.7ml(組織重量的9倍),用滴管移取少量于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織(小燒杯放入冰水中進(jìn)行)。
③將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的生理鹽水用來(lái)沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰塊的器皿中,右手將搗桿垂直插入管中,上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次,充分磨碎使組織勻漿化,15分鐘左右,即制成10%的心肌組織勻漿。2%的心肌組織勻漿再以生理鹽水稀釋。
④取少量勻漿組織作涂片,顯微鏡下觀察細(xì)胞是否磨破。
⑤將勻漿以3000-4000轉(zhuǎn)/分離心10-15分鐘。
⑥取適量上清液進(jìn)行各種生化指標(biāo)測(cè)定ATP酶活性,(4)血清NO、心肌組織ATP酶活性分別按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,以分光光度計(jì)測(cè)吸光度值,并結(jié)合公式計(jì)算結(jié)果。具體過(guò)程略。
(5)放射免疫法測(cè)定血漿內(nèi)皮素含量處死動(dòng)物后,立即眼球取血2ml,置于含10%EDTA二鈉60μl和2000IU(100μl)抑肽酶的試管中,混勻,4℃,3000rpm離心10min,取血漿2ml,按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。
(6)心肌組織常規(guī)石蠟包埋①動(dòng)物處死后,分別切取部分心尖組織置于4%多聚甲醛液中固定24小時(shí);②經(jīng)遞度酒精脫水(70%、80%、95%、100%);③二甲苯透明;④熔點(diǎn)為54℃及60℃石蠟浸透4小時(shí);⑤石蠟包埋供光學(xué)顯微鏡檢查、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及免疫組化檢測(cè)。
(7)光學(xué)顯微鏡檢測(cè)心肌組織石蠟切片厚度5um,分別裱于用多聚賴(lài)氨酸(Poly-Lysine)處理的載玻片上,50℃恒溫箱烤片24小時(shí),備用。
蘇木素-伊紅染色(HE)切片入二甲苯脫蠟二次,每次15分鐘,逐級(jí)酒精入水(100%-95%-80%-70%-蒸餾水)。蘇木素浸染5-10min后10%鹽酸酒精分化,自來(lái)水沖水15min-蒸餾水后伊紅浸染1min-各級(jí)酒精脫水,二甲苯透明后樹(shù)脂膠封片,于普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。
(8)電子顯微鏡檢測(cè)切取1mm各組大鼠心尖部心肌組織塊,于0-4℃條件下,置于3%的戊二醛液中固定。0.1M磷酸緩沖液(PBS)沖洗,0.1%鋨酸固定,雙蒸水連續(xù)沖洗,用50%、70%、90%、100%丙酮逐級(jí)脫水,室溫下包埋劑浸透過(guò)夜,包埋修塊,半薄切片Humphne染色、精確定位、超薄切片、電子染色,于透射電鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。
(9)細(xì)胞凋亡檢測(cè)①切片常規(guī)脫蠟至水;原位末端標(biāo)記法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡②磷酸緩沖液(PBS)沖洗切片2次,5分鐘/次;③滴加蛋白酶K(20ug/ml)消化5分鐘,PBS洗2次,5分鐘/次;④吸干切片周?chē)?,滴?.3%H2O2,滅活內(nèi)源性酶,室溫孵育15分鐘,PBS洗2次,5分鐘/次;⑤吸干切片周?chē)?,滴加末端?biāo)記酶置濕盒內(nèi)37℃(水浴1小時(shí),PBS洗5分鐘/次,3次);⑥滴加抗熒光抗體,置濕盒內(nèi)37℃(水浴30分鐘,PBS洗5分鐘/次,3次);⑦DBA顯色10分鐘,蒸餾水洗;⑧正丁醇脫水3次;⑨二甲苯透明2次;⑩樹(shù)脂封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察。
陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞核被染成棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。
電鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)變化特征是細(xì)胞核染色質(zhì)密度高并凝聚于核膜周邊,核體積縮小、畸變、核仁裂解,進(jìn)行性細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割為外有膜包裹、內(nèi)有完整細(xì)胞器的細(xì)胞凋亡小體。
(10)免疫組織化學(xué)染色方法以免疫組化(S-P)法檢測(cè)VEGF、Bcl-2及Fas等細(xì)胞因子及基因的蛋白表達(dá)。
①心肌組織石蠟切片脫蠟至水(切片厚度為5um);②蒸餾水新鮮配置3%H2O2,室溫5-10分鐘,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,蒸餾水洗3次;③微波修復(fù)抗原將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0),微波爐中(98℃)修復(fù)抗原10分鐘。冷卻后PBS洗3次,5分鐘/次(0.01mol,PH7.4);④滴加正常血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體,不洗;⑤滴加適當(dāng)稀釋的一抗置濕盒內(nèi)4℃冰箱過(guò)夜;0.01MPBS洗2分鐘×3次。
⑥滴加生物素化山羊抗小鼠LgG,置濕盒內(nèi)-37℃20分鐘。0.01MPBS洗2分鐘×3次。
⑦滴加試劑SABC,置濕盒內(nèi)37℃20分鐘。0.01MPBS洗5分鐘×4次PBS洗3次,5分鐘/次。
⑧DAB顯色使用DAB顯色試劑盒(ED1022)。取1ml蒸餾水,加試劑盒A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片。室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌。
⑨蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。
陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)Fa-VIII因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿染成棕褐色。
Bcl-2、Fas大部分胞漿彌漫性染成棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+++);部分胞漿染為淡棕黃色,部分胞漿不著色為弱陽(yáng)性表達(dá)(+)。介于兩者之間的為陽(yáng)性表達(dá)(++)。
6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以X±SD表示,兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn);等級(jí)資料的兩樣本比較用秩和檢驗(yàn)。
(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠心電圖的影響,表1復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)急性心肌缺血大鼠T波增高的影響(X±SD)(1mv=1cm)組別n 給藥前 給藥后空白對(duì)照組 125.96±0.87 5.85±1.59模型組 1212.33±0.3212.54±0.45**地奧心血康組1211.71±0.619.14±0.98*低劑量組1211.78±0.426.10±0.78高劑量組1212.10±0.666.00±0.97與本組正常時(shí)比較*P<0.05,**P<0.01表1結(jié)果顯示各組動(dòng)物在靜脈注射異丙腎上腺素24小時(shí)后各組T波均增高,模型組與空白對(duì)照組比較有差異,地奧心血康組與正常時(shí)比較有差異,其它兩組均無(wú)差異。
2、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)急性心肌缺血大鼠ST段抬高的影響各組動(dòng)物均于給藥前及第3次注射ISO后24小時(shí)記錄心電圖(標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)II),測(cè)量∑ST段,計(jì)算ST的mv數(shù)均值作為心肌缺血損傷程度的指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表4。
表2復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)急性心肌缺血大鼠ST段抬高的影響(X±SD)
組別 n ∑ST/mv空白對(duì)照組 12模型組 12 0.464±0.058*地奧心血康組 12 0.158±0.035△低劑量組 12 0.153±0.022△▲高劑量組 12 0.132±0.038△▲與正常組比較*P<0.001,與模型組比較△P<0.01,與對(duì)照組比較▲P>0.05表2結(jié)果顯示,正常組∑ST段均值接近零值,模型組與正常組比差異顯著(P<0.01);對(duì)照組及高低劑量組與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01),高劑量組效果尤佳,可顯著對(duì)抗∑ST段的升高,但與對(duì)照組相比未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血有明顯改善作用,可顯著減輕心肌缺血程度(∑ST)。且具有一定的劑量差別,高劑量作用尤佳。
3、耐缺氧實(shí)驗(yàn)3.1對(duì)常壓耐缺氧的影響取體重18-21克健康小白鼠100只,雌雄各半,隨機(jī)分為4組,每組25只,分別為空白對(duì)照組、地奧心血康組、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑高、低劑量組,劑量詳見(jiàn)表5。按劑量每日給藥1次,連續(xù)給藥4天,于第末次給藥后50min,分別將小鼠放入容器相同(125ml)裝有5g鈉石灰的密閉廣口瓶?jī)?nèi),每瓶?jī)?nèi)放入2只,瓶口涂以凡士林,將瓶密閉,記錄小鼠存活時(shí)間,以小鼠呼吸停止為記錄終結(jié)時(shí)間。
結(jié)果見(jiàn)表6表3復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)小鼠常壓缺氧的影響組別例數(shù)劑量(g/kg) 平均存活時(shí)間 P值(X±Smin)對(duì)照組 25 8.36±1.508地奧心血康 25 0.129.34±1.709 <0.05低劑量組25 2.5 9.78±2.406 <0.05高劑量組25 5.0 9.48±1.925 <0.05表3可見(jiàn),復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑,高低劑量組及地奧心血康組同對(duì)照組相比,可使小鼠在常壓缺氧條件下存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。
3.2對(duì)低壓耐缺氧的影響取小鼠100只,雌雄各半,隨機(jī)分為4組,每組25只,分組、給藥劑量及時(shí)間均同實(shí)驗(yàn)1。于末次給藥1小時(shí)后,取事先做好標(biāo)記的每組小鼠各4只,一同放入減壓裝置內(nèi),密閉玻璃容器,開(kāi)動(dòng)抽氣泵,逐漸減壓,待真空表針至負(fù)70.49Pa時(shí)(530mmHg),停止抽氣。觀察各組小鼠死亡數(shù)量,最后將各組總存活率進(jìn)行X2檢驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4。
表4復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)小鼠低壓缺氧的影響組別 例數(shù)劑量存活數(shù)存活率P值(g/kg) (只) (%)對(duì)照組 25 20ml 735地奧心血康組 25 0.12 735 >0.05低劑量組 25 2.5 12 60 >0.05高劑量組 25 5.00 88 44 >0.05表4可見(jiàn),復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑各組與對(duì)照組相比,可提高高小鼠在減壓缺氧條件下的存活率,但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著差異,地奧心血康無(wú)提高存活率的作用。
4、抗疲勞實(shí)驗(yàn)選小鼠40只,體重18-22g之間,雌雄各半,隨機(jī)分為4組,分組及劑量見(jiàn)表6,每日給藥1次,連續(xù)7天,末次給藥后1h,在鼠尾部系鼠重10%重量砝碼,將鼠放入溫度為20±0.5℃水中,記錄每只鼠的游泳時(shí)間,最后比較各組之間的差異性,結(jié)果見(jiàn)表8。
表5復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)小鼠疲勞作用的影響組別 例數(shù)劑量 游泳時(shí)間P值(n) (g/kg) (X±Smin)對(duì)照組 10 20ml 2.52±0.559地奧心血康組 10 0.12 2.67±0.712>0.05
低劑量組102.5 3.32±0.704<0.05高劑量組105.003.15±0.494<0.05表5結(jié)果表明,復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑高、低劑量組具有明顯的抗疲勞作用(P<0.05),而地奧心血康組有延長(zhǎng)的作用,但無(wú)差異性.說(shuō)明復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑具有抗疲勞作用,其效果比地奧心血康為佳.
5、抗氧化作用測(cè)SOD和LPO。此實(shí)驗(yàn)采用放免法,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)大鼠LPO和SOD的影響(X±SD)組別 例數(shù)LPO(mmol/100mg)SOD(ng/ml)正常組12 105.23±32.78 5.59±1.45模型組12 156.46±33.25 3.45±1.23地奧心血康組 12 116.80±31.56**4.94±1.32低劑量組 12 122.63±38.79**5.63±1.02*△高劑量組 12 118.54±30.60**5.12±1.35*與模型組比較*P<0.05**P<0.01;與地奧心血康組比較△P<0.05。
表6結(jié)果表明復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑抗氧化作用優(yōu)于地奧心血康組。
6、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠血清NO含量的影響利用硝酸還原酶法,以分光光度計(jì),波長(zhǎng)550nm,光徑0.5cm下測(cè)定各吸光度OD值并計(jì)算NO含量,結(jié)果見(jiàn)表7。
表7復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠血清NO含量的影響(X±SD)組別n NO含量(μmol/L)正常組 12 143.98±41.55模型組 12 36.21±4.44△對(duì)照組 12 66.93±4.26*低劑量組12 85.44±6.79*#高劑量組12 110.24±8.37*#注△與正常組相比P<0.01;*與模型組相比P<0.01;與對(duì)照組相比#P<0.05##P<0.01表7結(jié)果顯示與正常組相比,模型組血清NO含量顯著降低(P<0.01);對(duì)照組及高、低劑量治療組均能顯著提高心肌缺血大鼠血清NO含量,治療組作用尤佳,與對(duì)照組相比,分別為P<0.05和P<0.01。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)性心肌缺血損傷能夠顯著降低血清NO含量,復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑能夠顯著提高實(shí)驗(yàn)心肌缺血損傷大鼠血清NO含量,且有一定的劑量差別。
7、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血內(nèi)皮素的影響表8復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血內(nèi)皮素的影響組別 例數(shù) ET含量(pg/ml)正常組1260.23±19.36模型組1299.47±16.59對(duì)照組1264.82±13.90**低劑量1269.94±8.12**高劑量1259.28±7.35**△與模型組比較**P<0.01,與對(duì)照組比較△P<0.05表8結(jié)果顯示大鼠心肌缺血時(shí)與正常組相比,模型血漿ET含量明顯升高,與模型組比較,對(duì)照組及治療組均能降低血漿ET含量(P<0.01),與對(duì)照組比較,治療高劑量組降低ET有差異(P<0.05)。提示復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑可明顯降低大鼠心肌缺血時(shí)血漿ET水平,抑制ET的釋放,從而減輕ET對(duì)血管和心肌組織的損傷作用。
8、復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞ATP酶活性的影響表9復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞ATP酶活性的影響(X±SD,n=10)組別 Na+-K+ATPase Ca2+ATPase Mg2+ATPaseμmolpi/mgprot/h正常組 3.57±0.53 3.87±0.144 3.78±0.056模型組 1.25±0.044△1.12±0.059△1.26±0.052△對(duì)照組 2.34±0.46* 2.32±0.05* 2.36±0.036*低劑量組 2.85±0.49**#3.18±0.087**##2.85±0.48#**高劑量 3.09±0.69**#3.46±0.074**##3.46±0.064**##注與正常組相比△P<0.01;與模型組相比*P<0.05**P<0.01;與對(duì)照組相比#P<0.05##P<0.01表9結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組Na+-K+ATP酶、Ca2+ATP酶及Mg2+ATP酶活力均顯著下降(P<0.01);與模型組相比,對(duì)照組及治療組均能顯著提高ATP酶的活力,治療組作用尤為顯著(P<0.05,P<0.01);與對(duì)照組相比,高劑量組及低劑量組均有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。提示,實(shí)驗(yàn)性心肌缺血損傷能夠顯著降低心肌細(xì)胞Na+-K+ATP酶及Ca2+-Mg-ATP酶活性,復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑具有顯著提高的作用,且具有一定的量效關(guān)系。
9、光鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞病理變化光鏡下觀察顯示正常組心肌纖維互相連接排列緊密,心肌細(xì)胞橢圓形或短梭形,位于細(xì)胞中央,肌纖維可見(jiàn)橫紋。模型組心肌纖維萎縮呈波浪狀,纖維間毛細(xì)血管有灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。心肌纖維變性、斷裂,細(xì)胞核消失。地奧組心肌纖維腫脹,部分肌纖維變性。治療高劑量組心肌纖維排列整齊,纖維間毛細(xì)血管不同程度增多。
10、電鏡下對(duì)各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示正常組大鼠電鏡下見(jiàn)心肌細(xì)胞排列規(guī)則,肌節(jié)排列規(guī)整,肌絲清晰;心肌間為橋粒連接,閏盤(pán)發(fā)育較好;細(xì)胞核發(fā)育良好,核周?chē)写罅烤€粒體;線粒體結(jié)構(gòu)清晰,無(wú)腫脹及空泡變、髓樣變等;血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育正常,飲泡豐富。線粒體及肌絲間豐富的糖原顆粒。
模型組大鼠電鏡下可見(jiàn)心肌肌原纖維排列紊亂,肌節(jié)縮短,排列不規(guī)整,肌絲斷裂、溶解、消失,Z線模糊消失,肌漿網(wǎng)擴(kuò)張;可見(jiàn)細(xì)胞核體積便小,異染色質(zhì)邊集核膜下,核膜呈泡狀芽生,亦可見(jiàn)核內(nèi)空泡樣變及核膜模糊,核周細(xì)胞器呈點(diǎn)狀、碎片狀等變化;多數(shù)線粒體腫大、嵴斷裂溶解呈現(xiàn)絮狀、水鞘圖樣及空泡樣變,線粒體膜下及基質(zhì)內(nèi)含有大量片狀、斑狀、顆粒狀電子致密物質(zhì)(鈣鹽沉積);肌細(xì)胞線粒體間糖元散在,閏盤(pán)排列紊亂,有斷裂現(xiàn)象;心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體;血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可見(jiàn)核內(nèi)染色質(zhì)邊集,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒等現(xiàn)象。
對(duì)照組大鼠電鏡下見(jiàn)心肌肌原纖維排列較規(guī)整,肌節(jié)排列亦較為整齊,肌絲溶解較模型組明顯減少,細(xì)胞核完整,未見(jiàn)異形變,大都可見(jiàn)明顯的核仁,但仍可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變及大量肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,大多數(shù)線粒體發(fā)育尚可,但部分區(qū)域亦可見(jiàn)線粒體嵴的灶性絮狀變及少量的水鞘圖樣及空泡樣變;未見(jiàn)鈣鹽沉積;與模型組比較,肌細(xì)胞間血管增多。
治療組大鼠電鏡下可見(jiàn)心肌肌原纖維大都排列整齊,肌節(jié)發(fā)育良好,明暗帶分明,未見(jiàn)肌絲溶解,肌漿網(wǎng)擴(kuò)張明顯減少;細(xì)胞核發(fā)育良好,未見(jiàn)異形樣變,核仁明顯,核周大量豐富的發(fā)育良好的線粒體,僅可見(jiàn)少量灶性絮狀樣變,未見(jiàn)鈣鹽沉積;肌絲及線粒體間豐富的糖元顆粒;閏盤(pán)排列緊密;肌細(xì)胞間可見(jiàn)明顯增多豐富的毛細(xì)血管,部分血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器核常染色質(zhì)較多。
11、心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)通過(guò)電鏡形態(tài)學(xué)及原位末端標(biāo)記法檢測(cè)了心肌細(xì)胞凋亡情況及復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑的干預(yù)作用。
11.1電鏡形態(tài)學(xué)觀察造模24h模型組均可見(jiàn)心肌細(xì)胞的凋亡改變現(xiàn)象。其多表現(xiàn)為細(xì)胞核畸變,核體積縮小,核異染色質(zhì)成塊邊集,核膜內(nèi)陷,同時(shí)核周?chē)?xì)胞器完整,部分細(xì)胞可見(jiàn)核小體正在脫落;且部分血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可見(jiàn)類(lèi)似變化11.2原位末端標(biāo)記法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況正常組心肌纖維排列緊密,心肌細(xì)胞未見(jiàn)凋亡發(fā)生;模型組梗死區(qū)見(jiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡(細(xì)胞核呈棕色)地奧組部分心肌細(xì)胞凋亡。治療組低劑量組少部分心肌細(xì)胞凋亡。高劑量組心肌細(xì)胞未見(jiàn)凋亡。
各組大鼠造模24小時(shí),心肌細(xì)胞凋亡情況,光鏡下觀察提示連續(xù)注射異丙腎上腺素造成大鼠心肌缺血損傷,可明顯引起心肌細(xì)胞凋亡,尤其以早期顯著;此現(xiàn)象同電鏡觀察一致。復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑治療組及對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯減少,其中尤以復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑組更為顯著。
12、Fas與Bcl-2基因的蛋白表達(dá)檢測(cè)按S-P法行免疫組化檢測(cè)Fas與Bcl-2基因的蛋白陽(yáng)性表達(dá)及復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑的影響情況。判斷標(biāo)準(zhǔn)大部分胞膜及胞漿著棕褐色者為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+++);胞膜及胞漿著色強(qiáng)度減弱,呈淡棕黃色者為弱陽(yáng)性表達(dá)(+);著色強(qiáng)度介于兩者之間為陽(yáng)性表達(dá)(++);極少著色為陰性表達(dá)。
異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血損傷,可顯著引發(fā)Fas基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)。對(duì)照組及復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑治療組均可顯著下調(diào)Fas蛋白表達(dá),尤以治療高劑量組明顯。
異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血損傷,在顯著引發(fā)Fas基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí),亦引發(fā)Bcl-2基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)。Bcl-2基因蛋白表達(dá)即免疫反應(yīng)增強(qiáng)的程度輕于Fas基因。復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑治療組能夠上調(diào)Bcl-2基因的蛋白表達(dá)。
13、細(xì)胞因子(Fa-VIII)的蛋白表達(dá)檢測(cè)按S-P進(jìn)行免疫組化檢測(cè),用免疫組織化學(xué)方法對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Fa-VIII)進(jìn)行免疫組化染色,以檢測(cè)其陽(yáng)性表達(dá)情況及復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)其的影響,F(xiàn)a-VIII免疫組化染色為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿著色,陽(yáng)性表達(dá)程度判定標(biāo)準(zhǔn)同F(xiàn)as、Bcl-2。結(jié)果正常組陽(yáng)性表達(dá)不明顯(±),模型組未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(-),對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)(+),治療組陽(yáng)性表達(dá)(++)。
以下是臨床觀察結(jié)果
一、資料和方法1、病例選擇及分組病例來(lái)源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研門(mén)診,根據(jù)WHO《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》(66)及衛(wèi)生部1993年制訂發(fā)布的《中藥新藥治療胸痹(冠心病心絞痛)的臨床研究指導(dǎo)原則》(67)確定冠心病分型及中醫(yī)氣虛血瘀型。選擇經(jīng)動(dòng)態(tài)心電圖(Holter)檢查發(fā)現(xiàn)有心肌缺血、ST-T改變明顯者60例,隨機(jī)分為復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑組30例,地奧心血康對(duì)照組30例。復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑男性18例,女性12例,年齡47-70歲,平均56.4歲;病程1-10年,平均2.7年。地奧心血康組男性16例,女性14例,年齡45-69歲,平均58.5歲,病程10月-11年,平均2.9年。兩組患者在年齡、性別、病程等多方面基本平衡,具有可比性。
2、治療方法 治療組服用復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑(配方及制備同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)),每袋含生藥6g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供,每次1袋,每日3次口服。對(duì)照組服用地奧心血康,990412每次200mg,每日3次口服。
3、觀察項(xiàng)目 觀察其臨床療效及心電圖改變,于療程前后做動(dòng)態(tài)心動(dòng)圖檢測(cè)心肌缺血總負(fù)荷(TIB)、用藥前后空腹取靜脈血測(cè)定血漿內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)和血液流變學(xué)及血脂、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)濃度變化;4、檢測(cè)方法動(dòng)態(tài)心動(dòng)圖用美國(guó)MARS8000型Holter System,MV1、MV5導(dǎo)聯(lián)24h記錄,ST段實(shí)時(shí)連續(xù)計(jì)算機(jī)回放分析;心肌缺血標(biāo)準(zhǔn)采用“1×1×1規(guī)則”(即ST段水平或下斜型壓低幅度≥1mm,持續(xù)時(shí)間≥1min,并與上一次缺血性發(fā)作間隔至少1min,以ST段壓低的最大幅度及連續(xù)壓低持續(xù)時(shí)間的乘積總和作為心肌缺血總負(fù)荷mm/min);血漿ET、NO濃度測(cè)定ET用放射免疫法,試劑藥盒由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所提供;NO用比色法,試劑盒由南京建成生物研究所提供。血脂測(cè)定應(yīng)用比色法,藥盒由黑龍江省省醫(yī)院臨床放免中心提供,血流變檢測(cè)應(yīng)用血清SOD、MDA均用比色法測(cè)定,藥盒由南京建成生物研究所提供。
5、療效標(biāo)準(zhǔn)心絞痛療效顯效癥狀消失或基本消失,輕重度心絞痛癥狀減輕到輕度、重度心絞痛癥狀減輕到中度、好轉(zhuǎn),疼痛發(fā)作次數(shù),程度及持續(xù)時(shí)間有明顯減輕,中度的癥狀減輕到輕度,較重度減輕到中度,重度減輕到較重度。無(wú)效癥狀與治療前相同或有所加重。
心電圖療效顯效心電圖恢復(fù)至大致正常或正常,好轉(zhuǎn),ST段降低到治療后回升0.05mv以上,但未達(dá)到正常水平,在重度導(dǎo)聯(lián)倒置的T波變淺(達(dá)25%以上)或T波由平坦變?yōu)橹绷?,房室或室?nèi)傳導(dǎo)阻滯改善;無(wú)效心電圖基本與治療前相同或有所加重。
6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。
7、觀察結(jié)果(1)兩組治療前后心絞痛癥狀比較,結(jié)果見(jiàn)表10。
表10兩細(xì)治療前后心絞痛癥狀比較組別 例數(shù) 顯效 有效 無(wú)效 總有效率治療組30 6(0.2)19(0.633) 5(0.167) 83.33%對(duì)照組30 4(0.133) 14(0.467) 12(0.4) 59.99%(2)兩組治療前后心電圖的變化比較,結(jié)果見(jiàn)表11表11兩組治療前后心電圖的變化比較組別 例數(shù)顯效 有效 無(wú)效 總有效率治療組30 12(0.4) 11(0.367) 7(0.233) 76.66%對(duì)照組30 4(0.133) 11(0.367) 15(0.5)49.99%(3)兩組治療前后血脂的變化,結(jié)果見(jiàn)表12表12兩組治療前后血脂的變化(X±SD)組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)療前 療后 療前 療后療前 療后治療組6.04±0.68 5.67±0.66**△2.01±0.36 1.81±0.34**△0.96±0.161.04±0.17*△△對(duì)照組6.06±0.7 6.03±0.74 1.99±0.34 1.99±0.33 0.97±0.150.94±0.16與治療前后自身比較*P<0.05**P<0.01;與對(duì)照組比較△P<0.05△△P<0.01(4)兩組治療前后血液流變學(xué)變化,結(jié)果見(jiàn)表13表13兩組治療前后血液流變學(xué)變化X±SD組別 全血比黏度(mpa.s)血漿比黏度 纖維蛋白原紅 細(xì)胞電泳時(shí)間高切 低切 (mpa.s) (g/L) (s)治療組療前 5.81±0.16 8.56±1.21 1.92±0.38 4.03±1.02 18.96±3.24療后 4.77±1.18**△△7.64±1.18**△△1.67±0.36**△△3.35±0.96**△△17.01±3.16**△△對(duì)照組療前 5.19±1.14 8.53±1.20 1.91±0.37 4.01±1.10 18.93±3.30療后 5.17±1.16 8.47±1.24 1.89±0.39 3.98±1.14 18.79±3.26
與治療前后自身比較*P<0.05**P<0.01對(duì)照組比較△P<0.05△△P<0.01(5)復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)TIB、癥狀積分的影響結(jié)果見(jiàn)表14表14復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)TIB、癥狀積分變化比較(X±S)組別 例數(shù) TIB(mm/min) 癥狀積分(分)治療組 30療前74.88±17.60 13.45±1.22療后15.56±3.64**△3.24±1.43**△對(duì)照組 30療前77.89±16.43 13.46±1.21療后24.76±5.66** 4.86±1.34**與本組療前比較,*P<0.05,**P<0.01;與對(duì)照組療后比較,△P<0.01表14結(jié)果顯示兩組治療后TIB、癥狀積分下降,與治療前比較均有顯著性差異(P<0.01)。治療后兩組比較,治療組TIB減少及癥狀積分下降幅度顯著大于對(duì)照組(P<0.01),表明復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑具有較好抗心肌缺血作用。
(6)復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)血漿ET、NO的影響,結(jié)果見(jiàn)表15。表15兩組治療前后血漿ET、NO濃度含量變化比較(X±S)組別 例數(shù) ET(ng/L) NO(μmol/L)治療組 30療前106.86±32.41 37.67±13.46療后48.37±11.40**△85.17±14.40**△對(duì)照組 30療前101.71±35.52 42.79±11.26療后94.89±24.52 67.17±11.68**注與治療前比較**P<0.01;與對(duì)照組比較△P<0.01表15結(jié)果顯示兩組治療后血漿NO濃度上升,與治療前比較均有顯著差異(P<0.01);治療后復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑組血漿ET水平下降,與治療前比較有顯著差異(P<0.01),對(duì)照組ET有所下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后兩組比較,復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑組血漿ET含量明顯低于對(duì)照組,NO濃度明顯高于對(duì)照組(P<0.01),表明復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)分泌功能,在缺血缺氧狀態(tài)下可調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)代謝。
顆粒沖劑對(duì)血清SOD、LPO的影響,結(jié)果見(jiàn)表16。
表16復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)血清SOD、LPO的影響(X±S)組別 例數(shù) SOD(u/ml) MDA(nmol/L)治療組30療前240.76±22.44 5.61±0.85療后277.70±16.85** 4.79±0.55**△對(duì)照組30療前245.90±21.10 5.73±0.58
療后 249.37±20.61 5.46±0.60*注與治療前比較**P<0.01;與對(duì)照組比較△P<0.01表16結(jié)果顯示復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑治療后血清SOD含量升高,與治療前比較顯著差異(P<0.01)。兩組治療后MDA水平降低,與治療前比較有顯著差異(P<0.05),而復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑組降低幅度大于對(duì)照組(P<0.01),表明復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑可調(diào)節(jié)自由基代謝,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再給氧所致?lián)p傷。
(8)復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)血漿tPA和PAI的影響,結(jié)果見(jiàn)表17表17復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)血漿tPA和PAI的影響(X±S)組別 例數(shù)t-PA(Iu/ml) PA-I(Iu/ml)治療組 30 療前1.15±0.31 8.21±2.69療后1.32±0.25* 6.37±2.25*△對(duì)照組 30 療前1.15±0.30 8.37±2.28療后1.13±0.23 8.94±2.94與治療前比較*P<0.05;與對(duì)照組比較△P<0.05表17結(jié)果顯示兩組冠心病心絞痛患者用藥前血漿tPA水平較低,PAI水平較高,治療后復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑組tPA水平提高,PAI水平下降,而地奧心血康組tPA和PAI治療前后無(wú)明顯變化。
以下是毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、急性毒理實(shí)驗(yàn)為了評(píng)價(jià)其臨床用藥的安全性,故對(duì)其進(jìn)行了急性毒理實(shí)驗(yàn)。
1、受試品復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑,為處方固定、工藝條件和質(zhì)量控制穩(wěn)定情況下的制劑,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供。規(guī)格10g/袋,用法用量10g/次,3/日。
2、試驗(yàn)動(dòng)物純昆明種小白鼠,體重18-22g,雌雄兼用,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1、試驗(yàn)藥品的處理將復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑用熱水溶解,制成0.5g/ml的溶液。
2、半數(shù)致死量測(cè)定預(yù)試驗(yàn)用小鼠9只,分三組,但未找出100%動(dòng)物死亡的劑量。
正式試驗(yàn)取小鼠50只,隨機(jī)分成5組,每組10只,雌雄各半,一次灌胃給藥,劑量按1∶0.8等比級(jí)數(shù)給藥,最大劑量為1ml/20g濃縮液,給藥后觀察7天,未見(jiàn)有不良反應(yīng)和死亡情況,未能測(cè)出LD50。
3、最大耐受量試驗(yàn)因無(wú)法測(cè)出一次給藥的LD50,故將該藥做了最大耐受量試驗(yàn)。試驗(yàn)選擇健康小鼠20只,雌雄各半,正常飼養(yǎng)2日后,按1ml/20g灌胃給予復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑濃縮液,24小時(shí)內(nèi)給藥3次,每次間隔5小時(shí),總給藥體積3ml/20g。給藥后連續(xù)觀察7天,未件有不良反應(yīng)和死亡,小鼠反應(yīng)靈敏,活動(dòng)自如,皮毛光澤,無(wú)脫毛、腹瀉、厭食、驚厥等生活狀態(tài)改變,解剖后肉眼尸檢未見(jiàn)異常。
最大耐受量計(jì)算如下小鼠服用藥物量 成人平均體重(g)(g) ×X=小鼠平均體重 成人每日給藥量(g)(g)1×3×0.5 5000= × =20.920 6×3如果按成人每日服用18g計(jì)算,結(jié)果為正常臨床劑量的20.9倍,可以認(rèn)為臨床用藥是安全的。
二、本發(fā)明長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究為觀察動(dòng)物連續(xù)用藥而產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度,以及停藥后的發(fā)展及恢復(fù)情況,因而采用大鼠進(jìn)行了長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究。現(xiàn)報(bào)告如下1、試驗(yàn)周期本藥療程為1個(gè)月,故實(shí)驗(yàn)周期為2個(gè)月。
2、受試品復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供,規(guī)格6g/次,3次/日。
3、動(dòng)物處理選擇健康Wistar大鼠,體重80±10g,60只,雌雄各半,隨機(jī)分成三組,每組20只,雌雄各10只,即正常組、高劑量組、低劑量組。
4、劑量及給藥途徑高劑量組按20g/kg劑量給大鼠灌服復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑水溶液,1次/日。
低劑量組按2g/kg劑量給大鼠灌服復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑水溶液,1次/日。
空白對(duì)照組灌服同體積水。
按上述劑量每天給要,連續(xù)2個(gè)月,因試驗(yàn)周期在30天以上,所以每周給藥6天,并根據(jù)動(dòng)物體重變化隨時(shí)改變給藥量。
5、指標(biāo)及方法(1)一般狀況的觀察一般體征、外觀、行為、進(jìn)食量、排泄物變化等。
(2)體重變化每半個(gè)月稱(chēng)體重一次。
(3)血常規(guī)測(cè)定RBC、WBC采用普遍染色法。HB采用高鐵血紅蛋白測(cè)定法。
(4)肝功能測(cè)定,采用底物顯色法。
(5)其它均采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法。
(6)重要器官的肉眼觀察和病理檢驗(yàn)。
6、實(shí)驗(yàn)過(guò)程各組動(dòng)物均喂飼統(tǒng)一制備的基礎(chǔ)飼料,分組后各組動(dòng)物觀察素、飼養(yǎng)一天。試驗(yàn)組中高劑量組20g/kg/日,低劑量組2g/kg/日,灌胃給藥,對(duì)照組給同體積水,給藥2個(gè)月后經(jīng)眼眶靜脈采血分別測(cè)定各組大鼠血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù),肝腎功能及一般常規(guī)檢查,然后處死動(dòng)物,對(duì)各組動(dòng)物器官進(jìn)行較全面的肉眼尸檢,其次按常規(guī)方法處理,取動(dòng)物肝、心、脾、肺、腎等主要器官用10%福爾馬林固定,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。
7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)一般狀況在整個(gè)給藥過(guò)程中,各組大鼠外觀正常,皮毛光滑,運(yùn)動(dòng)自如,飲食及排泄物均正常,其它未見(jiàn)異常。
(2)體重變化各組動(dòng)物不同時(shí)期體重均有所增加,結(jié)果見(jiàn)表18表18大鼠體重增長(zhǎng)變化表(X±SD)組別 0天 15天 30天 45天空白對(duì)照組 78.2±8.194.5±9.2 124.6±13.3 145.7±14.5高劑量組 79.3±9.396.1±10.8 125.1±14.2 146.8±16.1低劑量組 78.9±7.695.3±11.2 125.8±15.1 146.2±15.960天 75天 90天 105天 120天166.2±18.7 181.4±21.7 194.6±28.9212.3±31.5 224.4±32.6168.7±19.2 183.0±25.6 197.2±29.9214.1±29.9 227.5±42.1166.9±16.6 182.7±23.5 195.3±29.4212.0±26.5 225.6±29.8將表中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組之間無(wú)顯著差異(P0.05),表明藥物對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)無(wú)影響。
(3)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表19、20、21表19復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)血常規(guī)的影響(X±SD)
組別 動(dòng)物數(shù)(只) Hb(g/L) RBC(×1012/L) WBC(×109/L)空白對(duì)照組20 124.5±8.96.60±0.89 7.8±1.1高劑量組 20 125.6±7.86.65±0.91 7.7±1.4低劑量組 20 124.7±7.96.62±0.88 7.7±1.2以上統(tǒng)計(jì)數(shù)字經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組之間血常規(guī)無(wú)顯著差異,說(shuō)明藥物對(duì)大鼠血常規(guī)無(wú)影響。
表20復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)WBC分類(lèi)記數(shù)的影響(X±SD)組別 動(dòng)物數(shù) 嗜中性 嗜酸性嗜堿性淋巴單核(只)空白對(duì)照組 20 21.7±2.4 2.7±0.4 1.1±0.4 73±12 1.0±0.5高劑量組 20 21.5±3.1 2.8±0.9 1.1±0.2 73±13 1.1±0.7低劑量組 20 20.8±4.0 2.8±0.5 1.1±0.7 74±12 1.1±0.5以上結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩用藥組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),因此該藥對(duì)血中WBC分類(lèi)計(jì)數(shù)無(wú)影響。
表21復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑對(duì)血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間的影響(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)(只) 血小板計(jì)數(shù)(×109/L) 凝血時(shí)間(秒)空白對(duì)照組 20 86±1.026.8±12.5高劑量組20 87±1.225.8±12.9低劑量組20 87±1.526.7±15.3以上結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,高低兩給藥組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05),證實(shí)該藥對(duì)血小板計(jì)數(shù)及凝血時(shí)間無(wú)影響。
(4)血液生化指標(biāo)測(cè)定①對(duì)大鼠血中AST及ALT活性的影響測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表22。
表22對(duì)大鼠血中AST及ALT活性的影響(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)(只) AST(IU/L) ALT(IU/L)空白對(duì)照組 20 14.9±2.3 3.2±0.8高劑量組20 15.0±1.8 3.2±0.7低劑量組20 15.0±1.9 3.1±0.6
以上結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,高低兩給藥組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05),證實(shí)該藥對(duì)大鼠血中AST和ALT活性無(wú)影響。
②對(duì)大鼠血清中尿素氮、肌酐、血糖含量的影響。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表23。
表23對(duì)大鼠血中尿素氮、肌酐、血糖含量的影響(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)BUN CreaGlu(只) (mg/100ml) (mg/100ml) (mg/100ml)空白對(duì)照組20 27.1±4.31.0±0.188.5±15.5高劑量組 20 27.5±4.41.0±0.487.7±11.5低劑量組 20 27.9±3.81.0±0.888.2±15.0以上結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,高低兩給藥組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05),證實(shí)該藥對(duì)大鼠血中尿素氮、肌酐、血糖含量的變化無(wú)影響③對(duì)大鼠血清中總蛋白、白蛋白、總膽固醇、總膽紅素含量的影響,表24對(duì)大鼠血清中總蛋白、白蛋白、總膽固醇、總膽紅素的影響(X±SD)組別 動(dòng)物數(shù) TP ALB T-CHOT-BIL(只)(mg/100ml) (mg/100ml) (mg/100ml) (mg/100ml)空白對(duì)照組 20 7.4±1.02.5±0.898.4±11.0 0.15±0.05高劑量組 20 7.4±0.82.5±0.298.1±12.6 0.16±0.04低劑量組 20 7.4±0.52.5±0.598.7±9.8 0.15±0.02以上結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,高低兩給藥組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05),證實(shí)該藥對(duì)大鼠血清中總蛋白、白蛋白、總膽固醇、總膽紅素含量變化無(wú)影響。
(5)尿液的檢查表25對(duì)尿中隱血、蛋白、糖、尿膽原、尿膽紅素的影響組別動(dòng)物數(shù)隱血蛋白糖 尿膽原 尿膽紅素(只)(mg/24h)
空白對(duì)照組20(-) (-) (-) 2.1±0.5(-)高劑量組 20(-) (-) (-) 2.1±0.2(-)低劑量組 20(-) (-) (-) 2.1±0.8(-)以上結(jié)果表明該藥對(duì)大鼠尿中蛋白、糖、尿膽原、尿膽紅素排出量無(wú)影響,亦無(wú)隱血出現(xiàn)。
(6)病理性組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果用藥2個(gè)月后,高低兩劑量組與對(duì)照組之心、肝、脾、肺、腎等主要臟器無(wú)論是肉眼還是病理形態(tài)學(xué)觀察均未見(jiàn)病理變化。
臟器系數(shù)變化見(jiàn)表26。
表26臟器系數(shù)變化數(shù)據(jù)表(X±SD)(n=20)臟器空白對(duì)照組 高劑量組 低劑量組肝臟4.25±0.58 4.23±0.46 4.20±0.60腎臟1.04±0.22 1.04±0.25 1.05±0.32心臟0.36±0.08 0.36±0.05 0.36±0.02肺臟0.67±0.06 0.66±0.09 0.67±0.04脾臟0.17±0.05 0.16±0.09 0.16±0.04甲狀腺 0.0135±0.0005 0.0134±0.0001 0.0132±0.0001腎上腺 0.052±0.0060.051±0.008 0.051±0.004睪丸0.50±0.04 0.51±0.06 0.51±0.01(n=10)以上結(jié)果顯示經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,兩個(gè)給藥組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明該藥對(duì)各臟器重量變化無(wú)影響。
結(jié)論復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑經(jīng)2個(gè)月大鼠給藥,結(jié)果表明各組動(dòng)物一般狀況、生長(zhǎng)發(fā)育、血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)均未見(jiàn)異常改變,病理組織學(xué)及肉眼尸檢亦未見(jiàn)病理變化,說(shuō)明該藥在本實(shí)驗(yàn)條件下是安全可靠的,無(wú)任何毒副作用。
討論通過(guò)結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)方法對(duì)益氣活血法組成本發(fā)明的方劑對(duì)治療冠心病心肌缺血進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察,較全面和深入地揭示了本發(fā)明防治冠心病的作用機(jī)理。
一、本發(fā)明對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo),經(jīng)大量臨床實(shí)踐總結(jié)出的中醫(yī)藥復(fù)方制劑,通過(guò)對(duì)其治療冠心病進(jìn)行的多項(xiàng)指標(biāo)的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究,充分肯定了其治療冠心病可靠的療效。
本實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)物模型以異丙腎上腺素(每次8mg/kg體重)連續(xù)3天大鼠皮下多點(diǎn)注射引起大鼠心肌發(fā)生類(lèi)似于人類(lèi)心肌缺血時(shí)的變化。光鏡下心肌病理檢查結(jié)果亦顯示出,模型組動(dòng)物心肌明顯的缺血損傷病理變化,造模24小時(shí)模型組動(dòng)物心肌細(xì)胞出現(xiàn)濁腫、空泡樣變以及心肌內(nèi)膜下局灶性肌纖維腫脹、斷裂甚至溶解壞死等病理變化,對(duì)照組及治療組造模后24小時(shí)動(dòng)物心肌的病變均明顯輕于模型組。此外,還進(jìn)行了電子顯微鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)的觀察,同樣顯示出,模型組動(dòng)物心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的漸進(jìn)性病理改變,肌原纖維排列紊亂、肌節(jié)縮短、肌絲溶解、肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫脹嵴斷裂呈現(xiàn)絮狀、水鞘圖樣及空泡樣改變以及細(xì)胞核異形變核內(nèi)異染色質(zhì)邊集,閏盤(pán)排列紊亂,出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象,溶酶體明顯增多等,而對(duì)照組和治療組動(dòng)物心肌超微結(jié)構(gòu)的病變明顯減輕,尤其是治療組動(dòng)物心肌電鏡下超微結(jié)構(gòu)清晰,幾乎接近正常,而且可見(jiàn)明顯增多豐富的發(fā)育良好的線粒體及肌細(xì)胞間顯著增多豐富的毛細(xì)血管。
本發(fā)明可緩解冠心病患者的臨床癥狀及改善心電圖作用。研究結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明可顯著的防治心肌缺血損傷。
二、本發(fā)明對(duì)血脂的影響冠心病絕大部分是由冠狀動(dòng)脈內(nèi)粥樣斑塊的存在限制了對(duì)心肌的血液供應(yīng),心肌發(fā)生缺血而導(dǎo)致的。近年來(lái)臨床病理研究證實(shí)冠狀動(dòng)脈的變化是冠脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上又有血小板聚集,血管收縮,血栓形成而導(dǎo)致冠脈的狹窄和堵塞,而導(dǎo)致心肌嚴(yán)重缺血。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟與脂質(zhì)代謝紊亂有密關(guān)系。高膽固醇血癥可使血管內(nèi)皮通透性增強(qiáng),高脂血癥又可使血小板聚集和血栓形成。高脂血和血小板在冠脈硬化內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖和病變發(fā)生上產(chǎn)生協(xié)同作用,促使了冠脈粥樣病灶的形成。血漿脂質(zhì)過(guò)高,尤其是低密度脂蛋白(LDL)過(guò)高,已肯定是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的一個(gè)發(fā)病因素。但高密度脂蛋白(HDL)對(duì)冠心病有保護(hù)作用。一是因?yàn)樗械闹鞍子谢厥漳懝檀嫉淖饔茫欢且驗(yàn)镠DL在乳糜微粒和極低密度脂蛋白(VLDL)的水解過(guò)程做為一種清潔劑,以利于動(dòng)脈壁的巨噬細(xì)胞對(duì)殘?jiān)臄z取,低HDL水平既可能減少對(duì)膽固醇的清除,又可能引起富含甘油三脂顆粒水解后“殘?jiān)钡姆e累,殘?jiān)姆e累可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。由此可見(jiàn),血脂、血流變學(xué)的變化在冠心病的研究中是不容忽視的。本課題臨床及實(shí)驗(yàn)研究均表明,治氣虛血瘀型冠心病時(shí)可改善血流變和降低血液粘稠度作用,降低血清總膽固醇、甘油三脂,升高HDL的作用,且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析優(yōu)于地奧心血康組。
三、本發(fā)明對(duì)心肌缺血損傷能量代謝障礙正常生理?xiàng)l件下,心肌主要利用外源性能量基質(zhì)產(chǎn)能;缺血條件下內(nèi)源性糖原分解則成為心肌能量的主要來(lái)源。正常情況下,葡萄糖和脂肪酸分別代謝成為乙酰輔酶A,在線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。缺血時(shí)則發(fā)生不同程度代謝變化,使脂肪酸利用增多,糖類(lèi)利用減少,因脂肪酸供能較葡萄糖供能耗氧多,故使氧利用率下降,同時(shí)脂肪酸代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞膜有損害作用。如果缺血時(shí)間很長(zhǎng),則發(fā)生心肌細(xì)胞溶解和壞死。此時(shí)心臟的能源供應(yīng)仍主要是脂肪酸。除非缺血十分嚴(yán)重,脂肪酸攝取停止。血流完全阻斷時(shí),無(wú)血液向組織運(yùn)送葡萄糖,糖原成為糖酵解底物的主要來(lái)源,同時(shí)乳酸堆積致細(xì)胞內(nèi)PH降低。抑制磷酸果糖激酶使糖酵解減少。
實(shí)驗(yàn)研究觀察到大鼠缺血心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生了明顯的病理變化,ATP酶的活性亦明顯低于正常組。電子顯微鏡下所見(jiàn),模型組大鼠心肌細(xì)胞多數(shù)線粒體發(fā)生腫大、嵴斷裂溶解呈現(xiàn)絮狀、水鞘圖樣及空泡樣改變,而且還可見(jiàn)線粒體膜下及基質(zhì)內(nèi)含有大量片狀、斑狀、顆粒狀電子致密物質(zhì)(鈣鹽沉積),對(duì)照組和復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑治療組病變均明顯減輕,尤其是治療組,鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)含有極豐富的發(fā)育較好的線粒體,僅可見(jiàn)少量的灶性絮狀樣變,線粒體內(nèi)未見(jiàn)鈣鹽沉積;ATP酶活性的檢測(cè)結(jié)果則表明,心肌缺血損傷模型大鼠心肌細(xì)胞Na+-K+ATP酶,Ca2+-Mg2+ATP酶活性均顯著低于正常組大鼠。而復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑則具有顯著提高和恢復(fù)ATP酶活性的作用,而且其作用明顯優(yōu)于對(duì)照組,并具有一定的量效關(guān)系。此外,在對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察中,我們還發(fā)現(xiàn),模型組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲及線粒體間糖原顆粒明顯減少并散在,而對(duì)照組和復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑治療組大鼠心肌細(xì)胞肌絲及線粒體間糖原顆粒豐富,由此可見(jiàn),心肌缺血損傷嚴(yán)重地?fù)p害和阻斷了心肌細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化過(guò)程,增強(qiáng)了無(wú)氧糖酵解途徑。此研究可見(jiàn),缺血損傷造成了心肌細(xì)胞嚴(yán)重的能量代謝障礙,同時(shí)揭示了本發(fā)明通過(guò)保護(hù)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),尤其是線粒體,加強(qiáng)和恢復(fù)氧化磷酸化過(guò)程,提高ATP酶活性,從而達(dá)到顯著改善缺血心肌能量代謝的作用機(jī)理。
四、本發(fā)明對(duì)心肌缺血損傷血管內(nèi)皮功能障礙冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)建立、血管新生的影響血管內(nèi)皮細(xì)胞分布于全身各組織器官,其主要功能是調(diào)節(jié)心臟、循環(huán)功能和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,通過(guò)調(diào)節(jié)血管和血流等穩(wěn)性,參與全身組織器官功能的調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明,血管內(nèi)皮細(xì)胞除了完成血液和組織液的代謝交換以外,還可以產(chǎn)生和分泌十余種生物活性物質(zhì),是機(jī)體最大的內(nèi)分泌腺,對(duì)血管舒縮功能進(jìn)行調(diào)節(jié)和具有選擇性滲透屏障作用之外,還在抗血栓形成、血管生長(zhǎng)及代謝等方面起重要作用。
內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的收縮血管活性物質(zhì)包括內(nèi)皮素(ET)血栓素A2(TXA2),血管緊張素II(Ang II)等。內(nèi)皮素是目前所知的最強(qiáng)血管收縮因子。內(nèi)皮素能引起冠狀動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮,導(dǎo)致整個(gè)冠脈血流量明顯下降。這樣在內(nèi)皮素作用下,一方面心肌耗氧量在增加,另一方面心肌的冠脈供氧量在下降;盡管內(nèi)皮素有較強(qiáng)的心臟變時(shí)和變力,但與同時(shí)存在的冠脈血流量下降,及內(nèi)皮素導(dǎo)致的外周血管阻力強(qiáng)烈增加,整體來(lái)講,內(nèi)皮素作用下心輸出量是降低的,對(duì)心臟是呈負(fù)性作用。
內(nèi)皮細(xì)胞合成與釋放的舒張血管活性物質(zhì)包括內(nèi)皮來(lái)源的血管舒張因子(EDRF,即NO)及前列環(huán)素(PGI2)等。目前認(rèn)為NO是血管平滑肌張力和血流的主要調(diào)節(jié)因子。NO和前列環(huán)素對(duì)血管有重要的保護(hù)作用,它們是血管平滑肌收縮和增生的強(qiáng)大抑制因子,同時(shí)也抑制血小板的聚集,抑制血小板和白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮表面的粘附。抑制平滑肌細(xì)胞分裂增殖;減少膠原纖維、彈力纖維的產(chǎn)生;清除自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。內(nèi)皮源性一氧化氮(EDNO)對(duì)血管內(nèi)皮功能完整性的重要作用包括3個(gè)方面①、保持血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張活性;②維持血管內(nèi)膜無(wú)血栓形成表面;③維持血管內(nèi)膜的非增殖狀態(tài)。因此改善或逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,已成為當(dāng)前冠心病防治研究中的重要內(nèi)容。ET、NO為內(nèi)皮細(xì)胞分泌的兩個(gè)主要血管活性物質(zhì),生理情況下,二者在維持血管舒縮平衡,抗血小板聚集,防止血管內(nèi)凝血系統(tǒng)有重要的保護(hù)作用。病理情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂可以產(chǎn)生一系列負(fù)性結(jié)果。一方面各種舒血管物質(zhì)如NO、前列腺素分泌減少,另一方面各種縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮依賴(lài)收縮因子、ET、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血栓素等生成增多,引起血管痙攣、收縮反應(yīng)。
近年來(lái)醫(yī)學(xué)界已取得了一致認(rèn)識(shí)即冠狀血管存在側(cè)枝。正常情況下,側(cè)枝沒(méi)有功能,只有當(dāng)心肌缺氧時(shí)才發(fā)揮功能,并有所發(fā)展。冠脈側(cè)枝的發(fā)展有三種形式(1)擴(kuò)張使原有的側(cè)枝擴(kuò)張、開(kāi)放,從而從無(wú)功能發(fā)展到有功能。(2)增粗血管壁細(xì)胞分裂、增殖,從而使血管口徑增大。(3)新生血管壁細(xì)胞高度增生,以生成新的側(cè)枝血管。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管張力的重要調(diào)節(jié)者。它所分泌的ET、PGI2、EDRF(NO)共同維持著血管的緊張度,調(diào)節(jié)著冠脈血流量。
通過(guò)對(duì)心肌缺血大鼠血漿ET及血清NO水平并結(jié)合病理形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果顯示,心肌缺血損傷大鼠血清NO水平顯著降低,血漿ET升高,而且電子顯微鏡下觀察可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少、核體積變大,異染色質(zhì)成塊邊集,甚至部分內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡早期的形態(tài)學(xué)改變。本發(fā)明則可顯著降低心肌缺血大鼠ET和提高血清NO水平。電鏡下可見(jiàn)治療組大鼠心肌細(xì)胞間豐富的發(fā)育良好的內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,本發(fā)明通過(guò)保護(hù)缺血心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制ET釋放,促進(jìn)NO的生成和釋放,以及提高自由基清除系統(tǒng)活性,降低NO的滅活速率,從而達(dá)到改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化染色的方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)各組大鼠進(jìn)行了心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FaVIII)觀察。結(jié)果顯示,異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血損傷模型動(dòng)物,F(xiàn)aVIII的蛋白表達(dá)略強(qiáng)于正常組(P<0.05)。本發(fā)明治療組大鼠心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的FaVIII蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),與模型組相比,具有極顯著性差異(P<0.005)。同時(shí)電鏡下,亦觀察到,治療組肌細(xì)胞間呈現(xiàn)極豐富的發(fā)育良好的毛細(xì)血管和微小血管,其中含有大量管腔較大,常染色質(zhì)及細(xì)胞器豐富的新生毛細(xì)血管。此結(jié)果提示,F(xiàn)aVIII的強(qiáng)表達(dá)可能在缺血心肌新血管的生成中起了重要作用。
五、本發(fā)明對(duì)心肌缺血損傷細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡(apoptosis)是近年來(lái)分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。冠脈供血不能滿足心肌對(duì)能量的需要時(shí)就發(fā)生心肌缺血,一旦缺血存在,心肌組織不僅缺氧和代謝障礙,同時(shí)毒性代謝產(chǎn)物蓄積,引起缺血性損傷,如繼續(xù)發(fā)展則導(dǎo)致心肌死亡。近年來(lái)研究表明,細(xì)胞凋亡是一種不同于細(xì)胞壞死的生理死亡過(guò)程,在機(jī)體生命活動(dòng)過(guò)程中調(diào)控著細(xì)胞增殖與更新間的平衡。細(xì)胞凋亡致病的方式各異,對(duì)無(wú)再生能力的成熟心肌細(xì)胞發(fā)病主要取決于凋亡破壞的方式與范圍;對(duì)有再生能力的平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞取決于細(xì)胞增殖的平衡,事實(shí)表明血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有促凝作用,能促發(fā)和加重動(dòng)脈粥樣硬化病變。近年研究證實(shí)心肌梗死(AMI)的梗死區(qū)及周邊區(qū)有細(xì)胞凋亡發(fā)生。Kajstura等研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡是AMI時(shí)心肌損傷的主要形式,而細(xì)胞壞死是隨后發(fā)生的。AMI中細(xì)胞凋亡伴有bcl-2表達(dá)降低Fax表達(dá)增加,認(rèn)為心室機(jī)械負(fù)荷可能影響此二基因?qū)Υ婊钚募〖?xì)胞的調(diào)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMI心肌細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)增加131倍,提示心肌細(xì)胞缺血壞死與Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),此實(shí)驗(yàn)證明凋亡是AMI心肌細(xì)胞死亡的重要形式,而細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能與抗細(xì)胞凋亡基因與促凋亡基因表達(dá)失衡有關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用原位末端標(biāo)記法進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的檢測(cè),同時(shí)應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)了Fas、Bcl-2的基因蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,心肌缺血模型組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的發(fā)生率較高,同時(shí)促凋亡基因Fas的蛋白表達(dá)明顯上升。而本發(fā)明對(duì)促凋亡基因Fas蛋白表達(dá)顯著減輕,而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)則增強(qiáng),此結(jié)果顯示本發(fā)明可抑制細(xì)胞凋亡或減輕細(xì)胞凋亡對(duì)心肌的損傷。
六、本發(fā)明對(duì)自由基的影響目前許多研究表明,心肌組織缺血缺氧與自由基有密切關(guān)系。在心肌組織缺血缺氧是自由基可以從心肌細(xì)胞內(nèi)外兩個(gè)空間中產(chǎn)生。心肌中的黃嘌呤氧化酶在氧化次黃嘌呤過(guò)程中產(chǎn)生氧自由基。心肌組織缺血缺氧時(shí)自由基大量產(chǎn)生及自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。心肌缺血改變了自由基生成和自由基清除之間的平衡。心肌組織中產(chǎn)生大量的自由基。自由基作用于細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸,使膜上脂質(zhì)過(guò)氧化。膜脂過(guò)氧化后改變了膜結(jié)合酶,受體和離子通道,引起心肌胞漿的鈣離子過(guò)負(fù)荷,并進(jìn)而鈣鹽在線粒體中的積累,抑制心肌能量的產(chǎn)生,促使了膜上的蛋白質(zhì)和磷脂交聯(lián),引起蛋白質(zhì)不可逆的抑制;氧化膜結(jié)合酶活性中心上的巰基,導(dǎo)致酶活性的喪失;脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的激活,可以使含有大量磷脂酶的溶酶體活化,釋放出磷脂酶和被激活的膜結(jié)合磷脂酶能破壞磷脂雙層膜并產(chǎn)生溶血磷脂和游離脂肪酸,通過(guò)其洗滌作用又能誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化的激活,這一系列的連鎖反應(yīng),引起膜對(duì)鈣離子的通透性增加,而鈣離子又再激活磷脂酶和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),這種急性循環(huán)的持續(xù)進(jìn)行,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞從可逆性損傷發(fā)展至不可逆性損傷,直至細(xì)胞死亡。
本研究臨床觀察結(jié)果顯示,本發(fā)明明顯的提高SOD活性,減少LPO的作用,與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)。說(shuō)明本發(fā)明有明顯的抗氧化作用七、本發(fā)明對(duì)組織纖溶系統(tǒng)的影響纖溶系統(tǒng)主要功能是清除血管中的纖維蛋白,防止血栓形成,維持血液通暢。生理狀態(tài)下組織型纖溶酶原激活劑tPA和組織型纖溶酶原抑制劑(PAI)是處于動(dòng)態(tài)平衡中。冠心病患者tPA釋放的能力降低,而PAI活性增高,并且tPA和PAI活性呈負(fù)相關(guān),如果兩者平衡失調(diào),均可導(dǎo)致血栓形成,tPA選擇性溶解血栓纖維蛋白。動(dòng)脈粥樣硬化時(shí),受損的內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放tPA能力下降,而PAI釋放增多,導(dǎo)致局部纖溶功能降低,使纖溶蛋白沉積于血管壁上不能溶解,久之形成血栓,促使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,加重心肌缺血。實(shí)驗(yàn)表明,本發(fā)明治療冠心病患者,血漿tPA水平提高,PAI水平下降,提示本藥能調(diào)節(jié)tPA和PAI平衡,改善冠心病心絞痛患者纖溶功能。
八、本發(fā)明作用機(jī)制的綜合分析冠心病屬于中醫(yī)“胸痹”、“心痛”、厥心痛“等病的范疇,其病因病機(jī)有虛實(shí)兩個(gè)方面本虛為氣虛、陽(yáng)虛、陰虛、血虛;標(biāo)實(shí)有瘀血、痰濁、氣滯、寒凝。且在疾病發(fā)展過(guò)程中,又有陰損及陽(yáng)、陽(yáng)損及陰、痰瘀互結(jié)、氣滯血瘀等,虛實(shí)兼見(jiàn),相互夾雜。結(jié)合冠心病多發(fā)于中老年人,發(fā)病率隨著年齡增高而增加,臨床多有不同程度的臟氣虛衰的癥候,如氣短、乏力、勞累后胸痛加重等,目前對(duì)其病因病機(jī)的認(rèn)識(shí),多以本虛為重點(diǎn),認(rèn)為瘀血阻脈是建立在內(nèi)臟虧損的基礎(chǔ)上,治療強(qiáng)調(diào)以補(bǔ)為通、補(bǔ)中寓通、通補(bǔ)兼施,著眼于整體功能的調(diào)節(jié),達(dá)到氣盈血行,血脈通利,胸痛自解的目的。綜合冠心病中醫(yī)補(bǔ)中寓通的治法,有益氣活血、溫陽(yáng)活血、益氣養(yǎng)陰活血,養(yǎng)血活血等,其中益氣活血是近年來(lái)治療冠心病的主要治法。本發(fā)明是以益氣活血為組方原則,博采眾家之長(zhǎng),經(jīng)大量臨床實(shí)踐總結(jié)歸納而成。
綜合分析本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果,不僅證實(shí)了本發(fā)明具有顯著的抗心肌缺血損傷的作用,而且從細(xì)胞及分子水平揭示了本發(fā)明具有多重的作用機(jī)制。中醫(yī)治療冠心病的優(yōu)勢(shì)在于人體的整體調(diào)節(jié),注重氣血的關(guān)系,改善機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化、有害刺激的適應(yīng)態(tài),以調(diào)理陰陽(yáng)氣血,使之建立新的平衡。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1、本發(fā)明具有顯著抗心肌缺血損傷的作用。
2、本發(fā)明具有顯著的改善心肌缺血損傷大鼠心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+ATPase、Na+-K+ATPase活性的作用,本發(fā)明有顯著改善缺血心肌能量代謝的作用。
3、心肌缺血損傷大鼠血漿ET明顯上升,血清NO水平明顯下降,血管內(nèi)皮細(xì)胞有凋亡發(fā)生,本發(fā)明能夠顯著上調(diào)缺血損傷大鼠血清NO水平及降低血漿ET水平,并顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的再生,提示本發(fā)明具有改善缺血損傷大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能障礙的作用。
4、本發(fā)明可使FaVIII表達(dá)輕度增強(qiáng),具有加速和增強(qiáng)側(cè)支循環(huán)的建立和新血管再生的作用。
5、本發(fā)明能夠顯著抑制和阻斷心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,并顯著減輕心肌損傷的程度,提示細(xì)胞凋亡在心肌缺血損傷病理演變中起重要作用,本發(fā)明能夠通過(guò)抑制和阻斷心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡的發(fā)生而起到保護(hù)心肌的作用。
6、本發(fā)明可顯著下調(diào)Fas基因的蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2基因的蛋白表達(dá),提示Fas基因、Bcl-2基因可能參與了缺血損傷心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程。本發(fā)明抑制和阻斷細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用可能與調(diào)節(jié)此二基因的表達(dá)有關(guān)。
7、本發(fā)明可明顯緩解冠心病患者的臨床癥狀,可改善心電圖。同時(shí)復(fù)方黃芪無(wú)糖顆粒沖劑可降低患者的LDL-C,升高患者HDL-C,改善血液流變學(xué)指標(biāo)。
8、本發(fā)明急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)表明,該藥安全可靠,無(wú)任何毒副作用。
9、本發(fā)明療效確切,無(wú)毒副作用,為治療冠心病的理想藥物。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例是將本發(fā)明制成無(wú)糖顆粒沖劑。取黃芪100g,黨參30g,丹參30g,元胡50g,三七10g,降香10g,桂枝10g,甘草10g,加水煎煮3次,三次均加水8倍量,每次煎煮90min,保持80-90℃熱浸1小時(shí),合并三次煎液,濾過(guò),濾液減壓濃縮至稠膏(約占原體積的二分之一)冷卻后慢慢加入2倍量的乙醇,快速充分?jǐn)嚢杌靹蚝?,靜置12-14小時(shí),濾取上清液,減壓回收乙醇至相對(duì)密度1.30-1.35(50℃熱測(cè))的清膏,取清膏1份,糊精1份及乙醇適量,混勻,過(guò)10目篩制成顆粒,于60-70℃干燥,然后分裝。
權(quán)利要求
1.一種治療冠心病的中藥,其特征在于它是由黃芪、黨參、桂枝、甘草、丹參、元胡、降香、三七組成,它們之間的重量份數(shù)比是黃芪10-20份、黨參4-6份、桂枝1-2份、甘草1-2份、丹參4-6份、元胡4-10份、降香1-2份、三七1-2份。
全文摘要
本發(fā)明是由黃芪10-20份、黨參4-6份、桂枝1-2份、甘草1-2份、丹參4-6份、元胡4-10份、降香1-2份、三七1-2份組成。本發(fā)明具有顯著的抗心肌缺血損傷作用及多重的作用機(jī)制,它可改善心肌細(xì)胞能量代謝,改善內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能障礙,加速和增強(qiáng)側(cè)肢循環(huán)的建立和血管的新生,抑制和阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本發(fā)明對(duì)冠心病的治療療效顯著,作用持久,并且無(wú)任何毒副作用。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1509732SQ0215691
公開(kāi)日2004年7月7日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者于忠學(xué) 申請(qǐng)人:于忠學(xué)
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