專利名稱：一種防治糖尿病的植物提取物及其制備方法與藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從紅豆杉(Taxus spp)，尤其是云南紅豆杉Taxusyunnanensis Cheng et L.K.Fu、美麗紅豆杉Taxus chinensis var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu等中提取的防治糖尿病的植物提取物，其制備方法及其藥物用途。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的老齡化進(jìn)程加快，糖尿病已經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病。目前，糖尿病的發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚，它的治療主要是用藥物降低高血糖和防治并發(fā)癥。胰島素和主要口服降血糖化學(xué)合成藥的發(fā)明和應(yīng)用給糖尿病患者帶來希望，但它們本身仍分別存在低血糖反應(yīng)、乳酸中毒等嚴(yán)重藥物副作用，影響了它們的使用和療效(王中孝，山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000 31(6)555-556)。尋找和開發(fā)高效、低毒、安全可靠的新型降血糖物質(zhì)是人類亟待解決的課題。
我國中醫(yī)藥學(xué)文獻(xiàn)記載，紅豆杉葉具利尿通經(jīng)作用，可用于治療糖尿病(全國中草藥匯編下冊(cè)(第二版)主編謝宗萬，人民衛(wèi)生出版社，722)，紅豆杉木材治糖尿病殊效(甘偉松，藥用植物學(xué)，1991，140)。但紅豆杉中具抗糖尿病活性的化學(xué)成分的研究和現(xiàn)代藥效學(xué)毒理學(xué)研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從藥用植物紅豆杉，尤其是云南紅豆杉Taxusyunnanensis Cheng et L.K.Fu、美麗紅豆杉Taxus chinensis var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu等紅豆杉中提取、分離的具有抗糖尿病活性的毒性低的天然植物提取物，所述提取物的主要有效成分為myo-肌醇衍生物類化合物，含量可達(dá)60％以上。
本發(fā)明還提供了一種從藥用植物紅豆杉中提取具抗糖尿病的植物提取物的方法，所述方法包括用溶劑提取，得浸膏，將浸膏經(jīng)兩相萃取，柱層析，收集含有myo-肌醇衍生物類化合物的流份，濃縮、過濾、干燥，得到植物提取物粉末。其中提取所用的有機(jī)溶劑例如是乙醇、甲醇、丙酮和它們的含水物等，兩相萃取所用的溶劑是水不相溶性有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚。所述層析例如為大孔樹脂柱層析、葡聚糖G或改性葡聚糖柱層析、纖維素柱層析、活性炭柱層析。最終產(chǎn)物為晶狀粉末，主要有效成分為myo-肌醇衍生物類化合物，含量可達(dá)60％以上，甚至75％以上。
本發(fā)明還提供了一種含有上述提取物以及一種或多種輔助劑和/或賦型劑的藥物組合物。所述藥物組合物可以被制備成針劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等藥物劑型。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述提取物用于制備治療糖尿病的藥物的用途。所述藥物能顯著降糖尿病高血糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖的吸收、降低血脂以及改善自由基代謝和保護(hù)胰島β細(xì)胞，而且其毒性極低。所述藥物可用于預(yù)防和治療糖尿病及其糖尿病性心腦血管方面并發(fā)癥，其它與糖代謝紊亂有關(guān)的疾病，改善自由基代謝，預(yù)防和治療II型糖尿病以及糖尿病性心腦血管并發(fā)癥。
更具體地說，本發(fā)明所述從藥用植物紅豆杉中提取防治抗糖尿病的植物提取物的方法包括將紅豆杉的根，莖或葉等部位粉碎成粗粉；用例如乙醇、甲醇、丙酮、它們的含水物或它們的混合物等溶劑在0℃至回流的溫度下，優(yōu)選室溫至回流的溫度下，更優(yōu)選在回流的溫度下提取，所用溶劑的量優(yōu)選為1∶1至20(重量/體積)，優(yōu)選1∶2至10(重量/體積)，更優(yōu)選1∶3至6(重量/體積)，優(yōu)選提取1-5次；經(jīng)減壓濃縮得浸膏，將浸膏用水不相溶性有機(jī)溶劑(例如乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚)/水兩相萃取，除去親脂性有機(jī)層，所述萃取劑優(yōu)選為1∶0.5至10(體積/體積)的有機(jī)溶劑/水；合并水層，濾過，用柱層析分離，所述層析例如為大孔樹脂柱層析(例如D101型、MN-200型(PUROLITE)等)、葡聚糖G或改性葡聚糖柱層析(例如Sephadex-LH-20等)、纖維素柱層析以及活性炭柱層析，用相應(yīng)的洗脫劑洗脫，同時(shí)監(jiān)測(cè)洗脫液；收集含有myo-肌醇衍生物類化合物的流份，減壓濃縮、靜置、過濾得固形物，用例如乙醇、甲醇、丙酮、甲乙酮、它們的含水物或它們的混合物重結(jié)晶，干燥得植物提取物粉末。最終產(chǎn)物為晶狀粉末，主要有效成分為myo-肌醇衍生物類化合物，含量達(dá)60％以上，甚至75％以上。
本發(fā)明所述方法中對(duì)柱層析洗脫液的監(jiān)測(cè)可以是用以下方法取洗脫液10ml置圓底燒瓶中減壓蒸干，加0.01mol/L的高碘酸鈉溶液2ml使溶解后，移至一試管中，滴加濃硝酸一滴，溶解后，滴加硝酸銀試液，有白色沉淀產(chǎn)生為正反應(yīng)(注高碘酸根氧化植物提取物中的主要成分，其本身被還原為碘酸根，滴加硝酸銀后，有白色碘酸銀沉淀產(chǎn)生)。
本發(fā)明所述提取物的主要有效成分myo-肌醇衍生物類化合物的含量可以用下述高效液相(HPLC)方法檢測(cè)含量測(cè)定 取本品約25mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加稀硫酸-醋酐液(1∶50)0.65ml，置水浴加熱20min，冷卻至室溫，加甲醇15ml，搖勻，加水至刻度，搖勻，得供試品溶液。HPLC色譜條件C18柱，5μm，4.6×250mm；檢測(cè)波長220nm；進(jìn)樣20μl；流動(dòng)相，甲醇-水(50∶50)，使用前經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜抽濾并脫氣，流速1.0ml/min.。
本發(fā)明所述植物提取物可與常規(guī)輔助劑和/或賦型劑混合，制備成各種劑型，用于預(yù)防或治療糖尿病，尤其用于治療II型糖尿病。針劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等都為可供選擇的藥物劑型。
膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑等劑型可以含有一種或多種常用賦型劑-填料和增容劑如淀粉，微晶纖維等；粘合劑如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等；致濕劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣等；吸收劑如高嶺土等；潤滑劑如滑石粉等。
藥用賦型劑可以是固體、半固體、液體等各種形態(tài)的，配方輔助劑可以是各種類型的。
溶液劑可以含有一般的溶劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑等，如水、乙醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯等。
膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等劑型可以用已知的常規(guī)方法制備，可以將植物提取物與一種或多種賦型劑混合，制備劑型。
對(duì)于非腸道給藥的劑型，溶液或乳劑度應(yīng)是無菌和等滲的。
優(yōu)選實(shí)施方案以下將在實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳盡的說明。但應(yīng)理解這些實(shí)施例僅為說明之目的，而非用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1植物提取物的制備1紅豆杉粗粉60kg，以4倍體積90％乙醇回流提取三次，合并提取液濃縮成稠狀溶液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，用1∶1(體積/體積)的氯仿/H2O兩相萃取，合并水層，濾過，上大孔樹脂柱(D101型，國產(chǎn))，以蒸餾水、含水乙醇(乙醇5％-20％)梯度洗脫，各洗脫液分別用鑒別試液鑒別，合并顯正反應(yīng)的洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至干，乙醇重結(jié)晶，過濾得晶狀粉末，抽干，于70℃下干燥，得植物提取物(微黃色粉末)，收率0.10％。用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，其中myo-肌醇衍生物類化合物含量達(dá)81％。
實(shí)施例2植物提取物的制備2紅豆杉粗粉70kg，以3倍體積80％甲醇于50℃提取三次，合并提取液，濃縮成漿狀溶液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，用1∶1(體積/體積)的乙酸乙酯/H2O兩相萃取，合并水層，濾過，上大孔樹脂柱(MN-200型)，以蒸餾水、含水乙醇(乙醇5％-20％)梯度洗脫，各洗脫液分別用鑒別試液鑒別，合并顯正反應(yīng)的洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至干，丙酮重結(jié)晶，過濾得晶狀粉末，抽干，于70℃下干燥，得植物提取物(類白色粉末)。收率0.12％。用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，其中myo-肌醇衍生物類化合物含量達(dá)75％。
實(shí)施例3植物提取物的制備3紅豆杉粗粉65kg，以4倍體積75％丙酮于45℃提取三次，合并提取液濃縮成稠狀溶液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，用二氯甲烷/H2O兩相萃取，合并水層，濾過，上活性碳(藥用規(guī)格)柱，以蒸餾水、含水乙醇(乙醇5％-30％)梯度洗脫，各洗脫液分別用鑒別試液鑒別，合并顯正反應(yīng)的洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至干，甲醇重結(jié)晶，過濾得晶狀粉末，抽干，于70℃下干燥，得植物提取物(淡微黃色粉末)，收率0.13％。用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，其中myo-肌醇衍生物類化合物含量達(dá)66％。
實(shí)施例4膠囊劑的制備處方每粒0.2g，含植物提取物25mg。
微晶纖維素175g植物提取物25g1000粒首先將輔料于研磨容器中，之后加入植物提取物，研磨混合10-30分鐘，至均勻止。將混勻的藥粉，灌裝于1號(hào)膠囊中，隨機(jī)抽樣每粒裝量控制在0.2g。
實(shí)施例5片劑的制備植物提取物25g，微晶纖維素49g，硬脂酸鎂1g，充分混合；混合物用單沖壓片機(jī)壓成直徑6mm，重300mg的片劑，每片含植物提取物100mg。
實(shí)施例6顆粒劑的制備植物提取物20g，加玉米淀粉180g，充分混合，加適量乙醇(60％)制成軟材，過12目篩造顆粒，經(jīng)干燥后得顆粒劑，每1g顆粒劑含植物提取物100mg。
以下用按照實(shí)施例1所制得的植物提取物進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和毒理學(xué)研究。
一、主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(一)植物提取物對(duì)四氧嘧啶誘發(fā)小鼠血糖升高的影響1.實(shí)驗(yàn)材料昆明種小鼠，體重20-24g，雄性降糖靈(Phenformine，陽性對(duì)照)(江蘇省金壇市制藥廠)四氧嘧啶(美國Sigma公司)葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司)2.實(shí)驗(yàn)方法[1，2]隨機(jī)取出小鼠10只為正常組，其余小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶65mg/kg。根據(jù)血糖值分為5組，每組10只，其中一組作為模型對(duì)照組，另外4組分別按0.1ml/10g體重經(jīng)口給予植物提取物25、50、100mg/kg和降糖靈75mg/kg，正常組及模型對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)7天。取血，分離血清，以葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，并對(duì)胰腺進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。
3.結(jié)果與正常組相比，對(duì)照組小鼠血糖極顯著升高(420.5±96.8mg/dl)。與對(duì)照組相比，植物提取物的小劑量組有降低高血糖的趨勢(shì)，而中、大劑量組和降糖靈組極顯著地降低四氧嘧啶誘發(fā)的高血糖，植物提取物的降糖作用呈劑量依賴性，植物提取物100mg/kg(113.7±40.9mg/dl)和植物提取物50mg/kg(225.3±80.3mg/dl)組的作用強(qiáng)于降糖靈75mg/kg組。病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明，與模型對(duì)照組相比，植物提取物各劑量組的胰島數(shù)量和胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，而降糖靈組胰島數(shù)目和胰島細(xì)胞數(shù)目略微增加。病理組織學(xué)檢查證實(shí)了植物提取物的作用優(yōu)于降糖靈。
(二)植物提取物對(duì)葡萄糖誘發(fā)的小鼠血糖升高的影響1.實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物昆明種小鼠，體重20-23g，雌性降糖靈(Phenformine，陽性對(duì)照)(江蘇省金壇制藥廠)50％葡萄糖注射液(江蘇常州國營武進(jìn)制藥廠)葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司)
2.實(shí)驗(yàn)方法[4]取小鼠72只，隨機(jī)分為6組，其中4組分別按0.1ml/10g體重經(jīng)口給予植物提取物25、50、100mg/kg和降糖靈75mg/kg，正常組及模型對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)7天。除正常組外，其余各組腹腔注射葡萄糖2g/kg，正常組注射等體積的生理鹽水，注射后30、60、90、120分鐘，測(cè)定血糖。
3.結(jié)果與正常組相比，模型對(duì)照組小鼠腹腔注射葡萄糖后30，60、90、120分鐘，血糖極顯著升高。與模型對(duì)照組相比，植物提取物的中小劑量組在腹腔注射葡萄糖后30，60、90分鐘，顯著降低葡萄糖誘發(fā)的高血糖；植物提取物的大劑量組和降糖靈組在腹腔注射葡萄糖后30，60、90、120分鐘，極顯著降低葡萄糖誘發(fā)的高血糖；植物提取物的作用基本呈劑量依賴性，植物提取物100mg/kg有極顯著的的降糖作用(90分鐘138.4±9.3mg/dl；正常組104.1±13.7mg/dl；對(duì)照組162.9±11.6mg/dl)，與降糖靈75mg/kg相當(dāng)。
(三)植物提取物對(duì)腎上腺素誘發(fā)的小鼠血糖升高的影響1.實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物昆明種小鼠，體重20-24g，雌性優(yōu)降糖(Glibenclamide，陽性對(duì)照)(天津太平洋制藥有限公司)鹽酸腎上腺素注射液(武漢制藥集團(tuán)股份有限公司)葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司)肝糖原測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)2.實(shí)驗(yàn)方法[3]取小鼠72只，隨機(jī)分為6組，其中4組分別按0.1ml/10g體重經(jīng)口給予植物提取物25、50、100mg/kg和優(yōu)降糖10mg/kg，正常組及模型對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)7天。除正常組注射等體積的生理鹽水外，其余各組腹腔注射腎上腺素0.2mg/kg，注射后30分鐘，測(cè)定血糖，同時(shí)取肝臟，以蒽酮法測(cè)定肝糖原。
3.結(jié)果與正常組相比，模型對(duì)照組小鼠血糖極顯著升高。與模型對(duì)照組相比，植物提取物顯著降低腎上腺素誘發(fā)的高血糖(25mg/kg，197.7±33.2mg/dl)。同時(shí)，模型對(duì)照組小鼠肝糖原極顯著降低。與模型對(duì)照組相比，植物提取物極顯著升高低下的肝糖原含量(25mg/kg，4.73±1.38mg/g肝組織)。
以上植物提取物藥效研究結(jié)果表明植物提取物能顯著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的高血糖，能顯著降低腎上腺素誘發(fā)的高血糖，并使低下的肝糖原回升，能抑制葡萄糖的吸收，對(duì)葡萄糖引起的血糖升高有顯著的耐糖作用，能保護(hù)胰島β細(xì)胞，可用于治療糖尿病。另外，四氧嘧啶大鼠和鏈脲霉素小鼠模型中，血糖、血清甘油三酯、膽固醇、丙二醛顯著升高，血清胰島素和超氧化物歧化酶活力顯著降低。植物提取物能顯著降低升高的血糖，血清甘油三酯、膽固醇、丙二醛含量，回升胰島素水平和超氧化物歧化酶的活力(降糖靈無此作用)。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)1.武玉鵬等 胰康降血糖作用 中醫(yī)藥研究1997，13(1)57-592.徐淑云等主編 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) 第二版 人民衛(wèi)生出版社19941275-12783.張冰等 菊苣膠囊對(duì)小鼠血糖水平的影響 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)1999，22(1)28-304.陳衛(wèi)輝等 麥冬多糖對(duì)正常和實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血糖的影響 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志1998，15(4)21-23二、急性毒性實(shí)驗(yàn)各取正常小鼠20只，雌雄各半，分別以口服和靜脈注射植物提取物(高劑量已達(dá)允許的最大濃度和小鼠最大給藥體積)方式進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果動(dòng)物無一死亡，健康情況良好、皮毛光澤、眼紅明亮、活動(dòng)度好。7天或14天后處死小鼠，肉眼觀察主要臟器，均無異常。
由于該植物提取物毒性極低，無法測(cè)出小鼠口服和靜脈注射的LD50。因此進(jìn)一步測(cè)試小鼠一日口服植物提取物最大耐受量(＞37.0g/kg)，觀察動(dòng)物的反應(yīng)，14天后處死，肉眼觀察主要臟器。結(jié)果動(dòng)物無一死亡，健康情況良好、皮毛光澤、眼紅明亮、活動(dòng)度好。14天后處死動(dòng)物，肉眼觀察各臟器，均無異常。結(jié)果表明，該植物提取物毒性極低或無毒。
權(quán)利要求
1.一種從紅豆杉(Taxus spp)中提取的防治糖尿病的植物提取物，其特征在于主要有效成分為myo-肌醇衍生物類化合物，含量達(dá)60％以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的植物提取物，其特征在于所述紅豆杉是云南紅豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)、南方紅豆杉(Taxus chinensisvar.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu)。
3.一種從紅豆杉(Taxus spp)中提取具抗糖尿病的植物提取物的方法，所述方法包括用溶劑提取，得浸膏，將浸膏經(jīng)兩相萃取，柱層析，收集含有myo-肌醇衍生物類化合物的流份，濃縮、過濾、干燥，得到植物提取物粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述紅豆杉是云南紅豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)、南方紅豆杉(Taxus chinensisvar.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于提取所用的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮、它們的含水物或它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于兩相萃取所用的溶劑是水不相溶性有機(jī)溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所用的有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在所述層析為大孔樹脂柱層析、葡聚糖G或改性葡聚糖柱層析、纖維素柱層析、活性炭柱層析。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于植物提取物為晶狀粉末，主要有效成分為myo-肌醇衍生物類化合物，含量達(dá)60％以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于植物提取物的主要有效成分myo-肌醇衍生物類化合物含量達(dá)75％以上。
11.根據(jù)權(quán)利要求3-10的方法所制備的提取物。
12.一種治療糖尿病的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1或2所述的植物提取物，與一種或多種輔助劑和/或賦型劑混合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物組合物，其特征在于其可以被制備成針劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等藥物劑型。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2的植物提取物用于制備治療糖尿病的藥物的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其特征在于所述藥物能顯著降糖尿病高血糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖的吸收、降低血脂以及改善自由基代謝和保護(hù)胰島β細(xì)胞，而且其毒性極低。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其特征在于所述藥物可用于預(yù)防和治療糖尿病及其糖尿病性心腦血管方面并發(fā)癥，其它與糖代謝紊亂有關(guān)的疾病，以及改善自由基代謝。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其特征在于所述藥物可用于預(yù)防和治療II型糖尿病以及糖尿病性心腦血管并發(fā)癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從紅豆杉(Taxus spp)，尤其是云南紅豆杉Taxusyunnanensis Cheng et L.K.Fu、美麗紅豆杉Taxuschinensis var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu等中提取的防治糖尿病的植物提取物，其制備方法及其藥物用途。植物提取物粉末主要成分myo－肌醇衍生物類化合物含量可達(dá)60％以上。
文檔編號(hào)A61K31/337GK1488344SQ0214430
公開日2004年4月14日 申請(qǐng)日期2002年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者梁敬鈺, 吳斐華, 鮑官虎, 程奇蕾 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)