專(zhuān)利名稱(chēng)：攜載基因支架及其制造方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及一種具有預(yù)防再狹窄作用的攜載基因支架。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多疾病的發(fā)病機(jī)理在基因水平上得以闡明，這使得從基因水平診斷和根治疾病成為可能。在醫(yī)治心臟病、腫瘤、糖尿病等方面利用基因轉(zhuǎn)移和調(diào)位的治療方法正在深入研究。例如將抗血栓形成基因?qū)胄难軆?nèi)，使之在血管內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到抑制血栓形成，防止血管堵塞的目的。然而怎樣將基因向生物體內(nèi)靶向輸送或局部定位，這一關(guān)鍵性的技術(shù)問(wèn)題尚未得到解決。美國(guó)Micheal Simons等人曾用一種聚醚載體，將基因加入這種載體的凝膠中，然后將其送入動(dòng)物的頸動(dòng)脈中(Nature，359(3)，67-70，1992.9)。這種方法的缺點(diǎn)在于該凝膠遇到血流沖擊后會(huì)很快溶解于血液中，根本無(wú)法定位于血管的某一部位，因此無(wú)法達(dá)到靶向輸送基因的目的。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述攜帶基因支架的制備方法。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述血管支架在心血管及外周血管阻塞病變介入治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的發(fā)明人設(shè)想將抑制平滑肌細(xì)胞增生和遷移的基因和抑制血栓形成的基因吸附于帶有涂層的支架表面，可以使基因在支架置入血管局部高效表達(dá)，從而達(dá)到安全有效地抑制支架置入后再狹窄的作用。將基因牢固地粘附在血管支架上，可以隨血管支架定位于血管的任何部位，從而實(shí)現(xiàn)靶向輸送或局部定位基因的目的。
本發(fā)明所述及的血管支架包括球囊擴(kuò)張支架和自擴(kuò)張支架，其結(jié)構(gòu)形式已經(jīng)在中國(guó)專(zhuān)利01246774.x以及其他有關(guān)文獻(xiàn)中進(jìn)行了公開(kāi)描述，本發(fā)明不再贅述。它們主要用于冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、腹主、胸主動(dòng)脈以及其他血管的阻塞病變。
本發(fā)明的攜載基因支架包括支架和覆蓋在支架表面的吸附層和涂布在吸附層表面的載體治療基因?qū)印?br> 在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，在吸附層與支架之間可加一底層，用以提高吸附層與支架的結(jié)合力。
所說(shuō)的底層為一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的聚合物，包括丙交酯、乙交酯、ε-己內(nèi)酯的均聚物和兩者之間或三者的共聚物、纖維素類(lèi)、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、阿拉伯膠、西黃蓍膠、海藻酸鈉、白明膠、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙稀酸丁酯、乙烯-乙烯醇共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物以及上述聚合物的混合物。
吸附層為一種含有經(jīng)過(guò)交聯(lián)處理的分子量大于10,000的蛋白質(zhì)的組合物，包括97-100wt％的蛋白質(zhì)，0-3wt％的添加劑。
所述及的蛋白質(zhì)可以是明膠、膠原或白蛋白，優(yōu)選的是明膠。
根據(jù)不同的用途、目的或改進(jìn)涂層的某種性能，可以在蛋白質(zhì)涂層中加入一種或多種添加劑，添加劑包括增塑劑、表面活性劑、交聯(lián)劑或/和各種具有協(xié)助治療某種疾病的特定藥物等。
所述及的增塑劑包括甘油、脂肪酸、醚類(lèi)、礦物油或/和硅油等，以增加涂層的柔性；所述及的表面活性劑包括十二烷基磺酸鈉、烷基季胺鹽或吐溫類(lèi)，用以改善蛋白質(zhì)溶液的鋪展性能；所述及的交聯(lián)劑包括醛類(lèi)、二酮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)或環(huán)氧類(lèi)化合物中的一種及其混合物，其作用是破壞蛋白質(zhì)載體的生物活性以及固定蛋白質(zhì)載體。
所述及的特定藥物包括抗凝劑(如肝素鈉)，抗血小板沉積劑(如Tirofiban)，抗平滑肌細(xì)胞增生劑(如Rapamycin)，用以降低病人并發(fā)癥或心臟不良事件的發(fā)生率。
所述及的載體治療基因?qū)又械妮d體治療基因選自通過(guò)細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒、高分子材料及其他載體介導(dǎo)的基因如Keratin8基因、VEGF基因、EGF基因、PTEN、尿激酶前體(Pro-UK)基因、一氧化氮合酶(NOS)基因等和反義寡核苷酸，如反義C-myc等。載體治療基因，通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的過(guò)度增殖，或者促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，或者阻止血管平滑肌細(xì)胞的遷移，或者抑制血管平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度增生，達(dá)到防止血管再狹窄的目的，并且可攜帶預(yù)防血栓形成的基因或雙基因以達(dá)到多種生物學(xué)效應(yīng)。
優(yōu)選的介導(dǎo)細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞；優(yōu)選的病毒包括腺病毒和腺輔助病毒載體；優(yōu)選的質(zhì)粒包括pc DNA 3.1、pB322衍生體或pUC衍生體。
所述及的高分子材料為醫(yī)藥學(xué)上可接受的高分子材料。
上述載體治療的基因的制備方法為一種本領(lǐng)域公知的方法，簡(jiǎn)述如下1.人誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶基因質(zhì)粒的構(gòu)建，2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌(菌株編號(hào)DH5α)-70℃保存，3.使用QIAGEN公司的去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒及方法提純質(zhì)粒。
本發(fā)明所述的涂層厚度為0.1-100微米。
本發(fā)明具有預(yù)防再狹窄涂層的攜帶基因支架的制備方法包括下列步驟1.底層涂覆涂覆的方法可以是浸涂或噴涂，然后進(jìn)行干燥。
2.吸附層溶液的配制將蛋白質(zhì)溶解于水和/或有機(jī)溶劑，根據(jù)需要加入添加劑，攪拌均勻，配制成蛋白質(zhì)濃度為0.1％-40wt％，更準(zhǔn)確地說(shuō)是0.5％-15wt％，添加劑的濃度為0-3wt％。
3.吸附層的涂覆和交聯(lián)可以采用高能輻射交聯(lián)法或化學(xué)交聯(lián)法。
(1)高能輻射交聯(lián)法用γ-射線照射涂覆在支架上的蛋白質(zhì)涂層，使其產(chǎn)生交聯(lián)。
(2)化學(xué)交聯(lián)可采用均相交聯(lián)或非均相交聯(lián)。均相交聯(lián)是先將需用量的化學(xué)交聯(lián)劑加入配制好的蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻后進(jìn)行涂層，然后進(jìn)行干燥；或者在蛋白質(zhì)溶液涂于血管支架表面后，將需用量的交聯(lián)劑加于涂層上，然后進(jìn)行干燥；(3)非均相交聯(lián)是在蛋白質(zhì)溶液涂于血管支架表面后，用交聯(lián)劑蒸汽交聯(lián)，然后進(jìn)行干燥。
所述及的化學(xué)交聯(lián)劑可以選用醛類(lèi)，如甲醛、乙醛、戊二醛等；二酮類(lèi)，如丁二酮、己二酮等；異氰酸酯類(lèi)，如甲苯二異氰酸酯、己二異氰酸酯等或環(huán)氧類(lèi)化合物，如環(huán)氧氯丙烷中的一種或多種。
化學(xué)交聯(lián)劑的用量為每100克蛋白質(zhì)中加入0.01-10克(交聯(lián)劑按100wt％濃度計(jì))。
干燥時(shí)可將涂有蛋白質(zhì)涂層的血管支架放入烘箱中，或在自然環(huán)境中進(jìn)行干燥。
4.載體治療基因?qū)訉⑤d體治療的基因原液或溶解于溶劑中，然后將涂覆了吸附層的支架浸泡在該溶劑中，使載體治療的基因吸附在吸附層表面，干燥后獲得本發(fā)明的支架。
所說(shuō)的溶劑包括水、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMAC)中的一種，優(yōu)選的為水，濃度以0.5％-5％為適宜。
載體治療基因?qū)拥暮穸韧ㄟ^(guò)調(diào)整溶液的濃度和涂覆次數(shù)來(lái)控制。
本發(fā)明公開(kāi)的攜帶基因支架表面涂層無(wú)掛膜、掛絲，分布均勻，無(wú)開(kāi)裂、剝落現(xiàn)象。
本發(fā)明與現(xiàn)有其它技術(shù)相比，具有的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的血管支架的吸附層是一種可以攜載治療性目的基因的蛋白質(zhì)涂層。蛋白質(zhì)涂層之所以能夠強(qiáng)烈地吸附基因，首先是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是基因的表達(dá)物，蛋白質(zhì)分子上有大量可與基因形成氫鍵和其它價(jià)鍵的位點(diǎn)。其次，蛋白質(zhì)涂層是一種水凝膠，它對(duì)基因等水溶性物質(zhì)的強(qiáng)烈吸附是不言而喻的。本發(fā)明的蛋白涂層的原料來(lái)自機(jī)體組織，有很好的生物相容性，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后自然被機(jī)體吸收、代謝、沒(méi)有毒副作用。同時(shí)因?yàn)檩d體治療基因被強(qiáng)烈地吸附于血管支架表面蛋白質(zhì)吸附層上，所以基因很容易隨血管支架被固定于治療部位，達(dá)到靶向輸送或局部定位基因的目的。
圖2為自擴(kuò)張支架。
將涂有該涂層的不銹鋼血管內(nèi)支架浸泡于腺病毒載體或質(zhì)粒(pcDNA.3.1)介導(dǎo)的LacZ基因原液中1分鐘，取出后用球囊導(dǎo)管將其植入小型豬冠狀動(dòng)脈中。七天后對(duì)該冠狀動(dòng)脈段進(jìn)行xGal染色分析。結(jié)果是試驗(yàn)段冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜可見(jiàn)部分細(xì)胞核染成深藍(lán)色，這表明LacZ基因在該段冠狀動(dòng)脈高效轉(zhuǎn)染。同時(shí)，將不攜帶Lac Z基因的蛋白質(zhì)涂層不銹鋼血管支架進(jìn)行同樣的對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果是沒(méi)有發(fā)生實(shí)驗(yàn)段股動(dòng)脈的細(xì)胞核藍(lán)染。這充分說(shuō)明蛋白質(zhì)涂層可以攜載基因，并成功地將基因輸送至靶部位。另外，該支架吸附腺病毒載體介導(dǎo)的Pro-UK基因或質(zhì)粒(pc DNA 3.1)介導(dǎo)的NOS基因植入小型豬冠狀動(dòng)脈，過(guò)30天后與裸支架比較，可明顯抑制支架內(nèi)平滑肌細(xì)胞增生，預(yù)防再狹窄。
實(shí)施例2配制100ml濃度為2 wt％聚甲基丙稀酸丁酯四氫呋喃溶液，采用噴涂的方法涂底層，介質(zhì)流量0.5ml/min，噴淋時(shí)間100秒。表干后在支架表面形成一底層，40℃干燥12小時(shí)。
配制100ml濃度為2wt％的明膠水溶液，加入1.0克甘油、混合均勻。不銹鋼血管支架浸涂后在20℃下干燥10小時(shí)，然后再將支架浸入濃度為37％的甲醛溶液1分鐘，取出后于-4℃冷凍干燥24小時(shí)，用丙酮浸提去殘留的甲醛，從而在血管支架表面上形成一層牢固的柔性的吸附層。
將涂有該涂層的不銹鋼血管內(nèi)支架浸泡于pcDNA3.1質(zhì)粒載體介導(dǎo)的人iNOS合成酶基因原液中10分鐘，自然干燥10分鐘-12小時(shí)。
實(shí)施例3配制100ml濃度為2wt％的乙烯-乙烯醇共聚物DMF溶液，采用噴涂的方法涂底層，介質(zhì)流量0.2ml/min，噴淋時(shí)間100秒。表干后在支架表面形成一底層，80℃減壓干燥12小時(shí)。
配制100ml 5wt％濃度的明膠水溶液，加入1.0克甘油、混合均勻。不銹鋼血管支架浸涂后在20℃下干燥10小時(shí)，然后再將支架浸入濃度為10wt％的戊二醛溶液60分鐘，取出后于20℃下減壓干燥20小時(shí)，用丙酮浸提去殘留的戊二醛，從而在血管支架表面上形成一層牢固的柔性的吸附層。
將涂有該涂層的不銹鋼血管內(nèi)支架浸泡于pcDNA3.1質(zhì)粒載體介導(dǎo)的人iNOS合成酶基因原液中90分鐘，自然干燥12小時(shí)。
實(shí)施例4配制100ml 2wt％(W聚甲基丙稀酸丁酯/W乙烯-乙烯醇共聚物＝1/4)DMSO溶液，采用噴涂的方法涂底層，介質(zhì)流量0.3ml/min，噴淋時(shí)間100秒。表干后在支架表面形成一底層，80℃干燥12小時(shí)，用丙酮清洗，干燥后備用。
配制100ml 1wt％濃度的明膠水溶液，加入1.0克甘油、混合均勻。不銹鋼血管支架浸涂后在20℃下減壓干燥10小時(shí)，然后再將支架懸于甲醛溶液上方，保持溶液溫度25℃，用毛細(xì)管鼓入N2，對(duì)支架進(jìn)行蒸汽交聯(lián)2小時(shí)，取出后于20℃下干燥20小時(shí)。從而在血管支架表面上形成一層牢固的柔性的吸附層。
將涂有該涂層的不銹鋼血管內(nèi)支架浸泡于pcDNA3.1質(zhì)粒載體介導(dǎo)的人iNOS合成酶基因原液中60分鐘，自然干燥12小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種攜載基因支架，其特征在于包括支架和覆蓋在支架表面的吸附層和涂布在吸附層表面的載體治療基因?qū)樱綄影?7-100wt％的經(jīng)過(guò)交聯(lián)處理的分子量大于10,000的蛋白質(zhì)，0-3wt％的添加劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支架，其特征在于，蛋白質(zhì)為明膠、膠原或白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的支架，其特征在于，蛋白質(zhì)為明膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支架，其特征在于，添加劑包括增塑劑、表面活性劑、交聯(lián)劑或/和各種具有協(xié)助治療疾病的活性藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的增塑劑包括甘油、脂肪酸、醚類(lèi)、礦物油或/和硅油。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的表面活性劑包括十二烷基磺酸鈉、烷基季胺鹽或吐溫類(lèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的交聯(lián)劑包括醛類(lèi)、二酮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)或環(huán)氧類(lèi)化合物中的一種或其混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的特定藥物包括抗凝劑、抗血小板沉積劑、抗平滑肌細(xì)胞增生劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的支架，其特征在于，抗凝劑為肝素鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的支架，其特征在于，抗血小板積集劑為tirofiban、eptifibatide、abciximab。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的支架，其特征在于，抗平滑肌細(xì)胞增生劑為Rapamycin。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的支架，其特征在于，在吸附層與支架之間設(shè)有用以提高吸附層與支架的結(jié)合力的底層，所說(shuō)的底層為一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的聚合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的支架，其特征在于，所述及的聚合物包括丙交酯、乙交酯、ε-己內(nèi)酯的均聚物和兩者之間或三者的共聚物、纖維素類(lèi)、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、阿拉伯膠、西黃蓍膠、海藻酸鈉、白明膠、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙稀酸丁酯、乙烯-乙烯醇共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物及其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的支架，其特征在于，所述及的載體治療基因?qū)又械妮d體治療基因選自由細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒、高分子材料及其他載體介導(dǎo)的基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的支架，其特征在于，所述及的基因?yàn)镵eratin8基因、VEGF基因、EGF基因、PTEN、尿激酶前體(Pro-UK)基因、一氧化氮合酶(NOS)基因或反義寡核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的支架，其特征在于，反義寡核苷酸為反義C-myc。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的支架，其特征在于，介導(dǎo)細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的支架，其特征在于，介導(dǎo)病毒包括腺病毒和腺輔助病毒載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的支架，其特征在于，介導(dǎo)質(zhì)粒包括pcDNA 3.1，pB322衍生體或pUC衍生體。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的支架，其特征在于，高分子材料為醫(yī)藥學(xué)上可接受的高分子材料。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支架，其特征在于，載體治療基因?qū)雍穸葹?.1-100微米。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的支架的制備方法，其特征在于包括下列步驟(1)底層涂覆涂覆的方法為浸涂或噴涂，然后進(jìn)行干燥；(2)吸附層溶液的配制將蛋白質(zhì)溶解于水和/或有機(jī)溶劑，加入添加劑，蛋白質(zhì)濃度為0.1％-40wt％，添加劑的濃度為0-3wt％；(3)吸附層的涂覆和交聯(lián)；(4)載體治療基因?qū)訉⑤d體治療的基因原液或溶解于溶劑中，然后將涂覆了吸附層的支架浸泡在該溶劑中，使載體治療的基因吸附在吸附層表面，干燥后獲得本發(fā)明的支架。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的支架的制備方法，其特征在于蛋白質(zhì)濃度為0.5％-15wt％。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的支架的制備方法，其特征在于用γ-射線照射蛋白質(zhì)涂層使其產(chǎn)生交聯(lián)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的支架的制備方法，其特征在于先將需用量的化學(xué)交聯(lián)劑加入配制好的蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻后進(jìn)行涂層，然后進(jìn)行干燥；或者在蛋白質(zhì)溶液涂于血管支架表面后，將需用量的交聯(lián)劑加于涂層上，然后進(jìn)行干燥。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的支架的制備方法，其特征在于在蛋白質(zhì)溶液涂于血管支架表面后，用交聯(lián)劑蒸汽交聯(lián)，然后進(jìn)行于燥。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的支架的制備方法，其特征在于所述及的化學(xué)交聯(lián)劑為醛類(lèi)、二酮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)，己二異氰酸酯或環(huán)氧類(lèi)化合物中的一種或多種化學(xué)交聯(lián)劑的用量為每100克蛋白質(zhì)中加入0.01-10克。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的支架的制備方法，其特征在于所述及的化學(xué)交聯(lián)劑為醛類(lèi)、二酮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)，己二異氰酸酯或環(huán)氧類(lèi)化合物中的一種或多種，化學(xué)交聯(lián)劑的用量為每100克蛋白質(zhì)中加入0.01-10克。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的支架在心血管及外周血管阻塞病變介入治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種攜載基因支架及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將抑制平滑肌細(xì)胞增生和遷移的基因和抑制血栓形成的基因吸附于帶有涂層的支架表面，可以使基因在支架置入血管局部高效表達(dá)，從而達(dá)到安全有效地抑制支架置入后再狹窄的作用，實(shí)現(xiàn)靶向輸送或局部定位基因的目的。本發(fā)明的血管支架的吸附層是一種可以攜載治療性目的基因的蛋白質(zhì)涂層，蛋白質(zhì)分子上有大量可與基因形成氫鍵和其它價(jià)鍵的位點(diǎn)。本發(fā)明的蛋白涂層的原料來(lái)自機(jī)體組織，有很好的生物相容性，沒(méi)有毒副作用。同時(shí)因?yàn)檩d體治療基因被強(qiáng)烈地吸附于血管支架表面蛋白質(zhì)吸附層上，所以基因很容易隨血管支架被固定于治療部位，達(dá)到靶向輸送或局部定位基因的目的。
文檔編號(hào)A61M29/00GK1408446SQ02136779
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月3日
發(fā)明者張一 , 高潤(rùn)霖, 王建科, 唐智榮, 何水英, 周順華 申請(qǐng)人:微創(chuàng)醫(yī)療器械(上海)有限公司