專利名稱：一種基因工程新藥－安琪抗栓因子的高效生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用基因工程技術(shù)高效生產(chǎn)新型抗栓藥物安琪(Anqi)因子的方法。
背景技術(shù)：
血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及骨質(zhì)破壞吸收長期以來嚴(yán)重影響著人類的健康，因其發(fā)病機(jī)制尚未被完全認(rèn)識，一直缺乏有效的治療方法。近年來，隨著關(guān)于細(xì)胞間相互作用的學(xué)說——細(xì)胞粘附理論的不斷完善，細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附、轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為是以上疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一種三肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)和其相應(yīng)配體的結(jié)合是細(xì)胞相互作用的必需環(huán)節(jié)，阻斷此環(huán)節(jié)的研究將對以上疾病的發(fā)病機(jī)制和治療有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。安琪因子是一種存在于蝰蛇蛇毒中的天然蛋白分子(Echistatin)，共有49個(gè)氨基酸，分子量5400Da，其24-25-26位氨基酸為Arg-Gly-Asp(精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)三肽序列，即RGD序列。安琪因子中的RGD序列及其它活性結(jié)構(gòu)(尤其是其特有的C-末端)使它具有多種生物學(xué)功能。安琪因子可選擇性地抑制活化血小板和纖維蛋白原的結(jié)合，并抑制血小板聚集正調(diào)節(jié)通路中蛋白因子的活化而具有抗血栓的作用；安琪因子可抑制破骨細(xì)胞的功能，抑制骨質(zhì)吸收過程；安琪因子也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制由TGF因子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等抗腫瘤功能。
安琪因子分子量小、RGD序列及其與周圍序列所形成的空間結(jié)構(gòu)使該物質(zhì)在作用效果、免疫原性、副作用、基因工程制備方面具有明顯的優(yōu)勢，成為目前全球抗栓、抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。經(jīng)國內(nèi)外專家科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，安琦因子顯示出抗栓、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用，具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
由于蛇毒來源少、提取困難且價(jià)格昂貴，難以用傳統(tǒng)提取工藝大量制備安琪因子，采用基因工程技術(shù)制備安琪因子是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。有學(xué)者已制備了重組Echistatin并證實(shí)其具有與野生蛋白同等的功效。但目前所使用的制備方法均以科學(xué)實(shí)驗(yàn)為目的，產(chǎn)率低且活性不穩(wěn)定，不適于其進(jìn)一步開發(fā)和大量制備。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是運(yùn)用基因工程技術(shù)制備抗栓藥物——安琪因子，主要是通過對目的基因的全新設(shè)計(jì)以及對傳統(tǒng)制備工藝的合理改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)安琪因子的高效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明運(yùn)用基因工程、蛋白質(zhì)工程及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了人工全合成的安琪因子基因，利用原核表達(dá)載體pBV220在大腸桿菌DH5α中以包涵體形式獲得高效表達(dá)。運(yùn)用該表達(dá)體系可大幅度降低安琪因子的生產(chǎn)成本，從而創(chuàng)立了一套獨(dú)特高效的大規(guī)模制備重組安琪因子的生產(chǎn)工藝，這將帶來抗栓藥物及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的更新?lián)Q代，具有極大的社會經(jīng)濟(jì)效益和商業(yè)前景。
下面將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明以運(yùn)用基因工程技術(shù)高效制備安琪因子為目的，通過對目的基因的全新設(shè)計(jì)以及對傳統(tǒng)制備工藝的合理改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)安琪因子的高效表達(dá)。
采用通常的技術(shù)改進(jìn)手段，如上游表達(dá)載體序列的優(yōu)化、下游工程的改良等，對安琪因子的表達(dá)量的提高無明顯效果。本發(fā)明從異源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平的另一重要影響因素——基因的密碼子構(gòu)成入手，對安琪因子基因進(jìn)行了全面的設(shè)計(jì)與合成。
同一種氨基酸乃至蛋白質(zhì)多肽分子，根據(jù)密碼子的簡并性，可由不同的DNA序列來編碼。不同生物種對蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子的喜好性是不同的。采用大腸桿菌的喜好密碼子替代安琪因子基因原有的密碼子，并充分考慮密碼子間的合理組合，是提高安琪因子表達(dá)量的可行手段。
本發(fā)明根據(jù)各種密碼子在大腸桿菌中的使用頻率以及密碼子的常見組合，保留安琪因子基因的氨基酸序列不變，選用大腸桿菌的喜好密碼子取代安琪因子基因DNA序列中的非喜好密碼子，設(shè)計(jì)了全新的安琪因子基因DNA序列(圖1)。
根據(jù)所設(shè)計(jì)的DNA序列，采用全基因分段合成和PCR拼接的策略，構(gòu)建人工合成的安琪因子基因。
用EcoR I和Pst I完全酶切全長的安琪因子基因，插入經(jīng)EcoR1和Pst I雙切的pBV220原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒pBV220-Anqi(圖2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。陽性克隆37℃過夜活化后，采用溫度誘導(dǎo)的表達(dá)方式使其表達(dá)。離心收集菌體，加入100μl1X上樣緩沖液，100℃煮沸5min，15％SDS-PAGE電泳檢測安琪因子表達(dá)(圖3)，經(jīng)凝膠掃描分析，安琪因子表達(dá)量達(dá)到菌體蛋白的26％，比原有菌種的表達(dá)水平提高了約30％。
人工全合成的安琪因子的大量表達(dá)及純化將工程菌單菌落挑入5ml含60μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)入500ml含60μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至其進(jìn)入對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)入5升發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)至其OD600＝0.8，快速升溫至42℃，誘導(dǎo)6h，離心收集菌體，菌體濕重可達(dá)30g。
離心收集發(fā)酵的菌體經(jīng)TE緩沖液洗滌后，室溫下溶菌酶、2M鹽酸胍處理后，4℃超聲破菌，12000轉(zhuǎn)離心得到包涵體，以6M尿素在4℃懸浮包涵體，繼以8M鹽酸胍裂解包涵體，PBS復(fù)性。透析去除鹽酸胍后，離心取上清，HPLC純化，得到電泳純的半成品，加入穩(wěn)定劑后分裝為成品。
結(jié)果及產(chǎn)物活性測定由于安琪因子基因的成功改造，安琪因子的表達(dá)水平有了較大的提高，經(jīng)蛋白N端測序，結(jié)果證實(shí)純化蛋白為安琪因子，具有與野生安琪因子蛋白同等的功效。將純化的安琪因子半成品經(jīng)蛋白定量后，其活性IC50＝3.0*10-8，與標(biāo)準(zhǔn)的安琪因子蛋白多肽比活一致。
本發(fā)明還包括安琪因子的一種串聯(lián)表達(dá)模式，其特征在于它在DNA水平上，將安琪因子的DNA序列串聯(lián)為多聚體，并用原核或真核細(xì)胞表達(dá)安琪因子的串聯(lián)重復(fù)多聚體。
利用DNA限制性內(nèi)切酶中的同尾酶具有識別水解不同核苷酸序列，但產(chǎn)生相同的粘性末端，且當(dāng)二者的粘性末端相連后，該片段不能再被同尾酶識別切割的特點(diǎn)，通過將安琪因子的基因序列重復(fù)串聯(lián)為多聚體，在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大多為目標(biāo)肽段成分，表達(dá)效率高，生產(chǎn)成本低。
安琪因子的天然蛋白分子共有49個(gè)氨基酸，僅28位氨基酸為蛋氨酸，由多種具有相同生物學(xué)活性的蛇毒多肽的一級結(jié)構(gòu)揭示蛋氨酸28并非安琪因子多肽發(fā)揮生物學(xué)活性所必須(Huang等，J.Biol.Chem.26216157-16163，1987)。因此，用亮氨酸取代蛋氨酸28，并將蛋氨酸插入安琪因子基因單體分子間作為溴化氰裂解位點(diǎn)，將目標(biāo)肽段的多聚體斷裂加工為目標(biāo)肽段單體。
本發(fā)明利用同尾酶的特點(diǎn)，可以很方便地使目標(biāo)肽段單體分子定向克隆為多聚體，且多聚體的聚合度可以隨意選擇(2，3，4，5···體)。將同尾酶PstI(識別序列 )和Nsi I(識別序列 )的識別序列分別置于安琪因子多肽核苷序列的5’端和3’端，Pst I和Nsi I酶切產(chǎn)生的粘性末端相連后形成的序列 和 不能被Pst I和Nsi I酶識別切割，且兩對密碼子ATG，CAG是E.coli的喜好密碼子(分別編碼Met和Gln)。根據(jù)圖1的安琪因子DNA序列，設(shè)計(jì)安琪因子多肽單體及間隔片段的核苷酸序列如下 其中帶下劃線的核苷酸序列為插入序列，序列中的方框部分分別為Pst I和Nsi I的識別位點(diǎn)，用于安琪因子基因多聚體的拼接。Pst I識別序列之后的6個(gè)組氨酸密碼子用于表達(dá)產(chǎn)物的親和層析，其后的密碼子ATG編碼蛋氨酸，用于多聚體表達(dá)產(chǎn)物的斷裂加工。在Pst I識別序列之前以及Nsi I識別序列之后分別加上了核酸內(nèi)切酶EcoR I和BamH I的識別序列(斜體字母)，目的是為了將串聯(lián)好的多聚體能方便地裝入表達(dá)載體，在安琪因子單體及間隔片段的酶切拼接過程中，EcoR I和BamH I的識別位點(diǎn)均被去除，因而間隔片段并不包含EcoR I或BamH I的序列，該序列僅存在于安琪因子單體或重復(fù)片段多聚體的5’端或3’端。
根據(jù)上述設(shè)計(jì)的安琪因子單體序列，利用實(shí)施例一的方法進(jìn)行分段合成和PCR拼接，使成單體雙鏈。擴(kuò)增產(chǎn)物直接連到pUC18載體中，并轉(zhuǎn)導(dǎo)DH5α菌，插入序列經(jīng)測序鑒定，即可得到安琪因子單體基因質(zhì)粒pUCAnqi(1)。(括號內(nèi)1代表單體，2代表雙體，3代表三體，依此類推)。
安琪因子多聚體基因的構(gòu)建首先將pUCAnqi(1)分別用Nsi I/Hind III，以及Pst I/Hind III酶切，將Nsi I/Hind III酶切后純化回收的DNA大片段與Pst I/Hind III酶切后純化回收的DNA小片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)至JM109菌中擴(kuò)增DNA，此時(shí)可得到安琪因子基因的二聚體質(zhì)粒pUCAnqi(2)。將pUCAnqi(2)分別用Nsi I/Hind III，以及Pst I/Hind III酶切，將Nsi I/Hind III酶切后純化回收的DNA大片段與Pst I/Hind III酶切后純化回收的DNA小片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)JM109菌以擴(kuò)增DNA，即可得到安琪因子基因的四聚體質(zhì)粒pUC-Anqi(4)。重復(fù)上述方法即可得到安琪因子基因的八聚體質(zhì)粒pUC-Anqi(8)。將pUC-Anqi(4)用Nsi I/Hind III酶切并純化回收DNA大片段，將pUC-Anqi(8)用PstI/Hind III酶切并純化回收其DNA小片段，把這兩個(gè)基因片段連接后轉(zhuǎn)導(dǎo)JM109菌并擴(kuò)增DNA，由此得到安琪因子基因的12聚體質(zhì)粒pUC-Anqi(12)。將pUC-Anqi(12)和表達(dá)載體pBV220均用EcoR I/BamH I雙酶切，將pUC-Anqi(12)酶切產(chǎn)生的小片段與pBV220酶切產(chǎn)生的大片段連接并轉(zhuǎn)導(dǎo)至DH5α菌以擴(kuò)增安琪因子十二聚體基因表達(dá)質(zhì)粒pBV220-Anqi(12)。
將安琪因子十二聚體基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入DH5α菌中，挑單菌落培養(yǎng)過夜，過夜菌按2％接種至LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至其進(jìn)入對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)入5升發(fā)酵罐，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8，快速升溫至42℃，誘導(dǎo)6h，離心收集菌體。表達(dá)產(chǎn)物用Ni-sepharose親和層析純化，純化產(chǎn)物經(jīng)凝膠掃描分析，純度達(dá)90％以上。
安琪因子十二聚體的大量表達(dá)及純化將工程菌單菌落挑入5ml含50μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)入500ml含50μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至其進(jìn)入對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)入5升發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)至其OD600＝0.8，快速升溫至42℃，誘導(dǎo)6h，離心收集菌體，經(jīng)TE緩沖液洗滌后，溶菌酶、8M鹽酸胍處理后，超聲破菌，12000轉(zhuǎn)離心得到包涵體，以6M尿素在4℃懸浮包涵體，繼以8M鹽酸胍裂解包涵體，PBS復(fù)性。透析去除鹽酸胍后，離心取上清，過Ni-sepharose柱，得到電泳純的安琪因子十二聚體多肽。
將純化后的安琪因子多肽按1mg/ml的濃度溶于溴化氰溶液中(溴化氰溶液用70/％的甲酸配制，濃度為5mg/ml)。將反應(yīng)溶液在室溫置通風(fēng)櫥中反應(yīng)24h，以斷裂蛋氨酸的羧基參與形成的肽鍵。反應(yīng)完畢，加入8倍體積的10M NaOH以中和溴化氰，將降解產(chǎn)物超濾、脫鹽凍干。
將經(jīng)溴化氰降解處理的安琪因子多肽溶于1.8M的羥氨中，使肽段的濃度為0.25mg/ml。以0.1％的三氟醋酸為起始緩沖夜，以0.1％三氟醋酸+75％的乙腈為終極緩沖液，用C18反相色譜柱純化安琪因子多肽，收集安琪因子單體吸收峰，得到色譜純的安琪因子多肽。
實(shí)施例一安琪因子基因DNA序列的設(shè)計(jì)1在通用的DNA自動合成儀上采用亞磷酸酰胺法化學(xué)合成以下3段長度為70bp左右的DNA片段，編號分別為L1，L2，R1。其中L1的5’端含EcoR1位點(diǎn)，R1的3’端含Pst I位點(diǎn)，以便向表達(dá)載體插入。 序列中的方框部分表示該處是兩段DNA片段互補(bǔ)搭接之處2利用PCR反應(yīng)體系，搭橋法分步延長合成安琪因子基因片段(1)DNA片段L2，R1的鏈延長反應(yīng)根據(jù)設(shè)計(jì)，L2與R1的末端有20個(gè)堿基互補(bǔ)，這使兩鏈相連，在PCR反應(yīng)體系中，兩鏈末端部分互為模板發(fā)生鏈延長。反應(yīng)條件L25μl(0.1OD/μl)，R15μl(0.1OD/μl)，10x TaKaRa La buffer 10μl，dNTP(25mmol/l)16μl，H2O 63μl，反應(yīng)體系共100μl。94℃恒溫5min，55℃恒溫加入TaKaRa La Taq酶1μl后，恒溫5min，72℃，5min，即可得到由L2和R1拼接而成的兩條互補(bǔ)長鏈，名為L2-R1，為下一步PCR反應(yīng)的模板。
(2)DNA片段L1的鏈延長反應(yīng)與前一步同理，依據(jù)設(shè)計(jì)，L1與L2有20bp的互補(bǔ)序列，利用引物L(fēng)1進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件L1(0.01OD/μl)1μl，模板L2-R11μl，10×TaKaRa La buffer10μl，dNTP(25mmol/l)10μl，TaKaRa La Taq酶1μl后，H2O 77μl，反應(yīng)體系共100μl。94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循環(huán)。產(chǎn)物名為L1-L2-R1，即為合成的全長的安琪因子基因。實(shí)施例二人工全合成的安琪因子基因表達(dá)載體pBV220-Anqi的構(gòu)建及表達(dá)用EcoR I和Pst I完全酶切全長的安琪因子基因，插入經(jīng)EcoR1和Pst I雙切的pBV220原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒pBV220-Anqi，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，所選轉(zhuǎn)化克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定和DNA序列測定證明克隆正確。陽性克隆37℃過夜活化后，按1∶100比例轉(zhuǎn)接共5ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.8，轉(zhuǎn)42℃繼續(xù)培養(yǎng)6h，離心收集菌體，加入100μl 2×上樣緩沖液，100℃煮沸5min，15％SDS-PAGE電泳檢測安琪因子表達(dá)，經(jīng)凝膠掃描分析，安琪因子表達(dá)量達(dá)到菌體蛋白的26％，比原有菌種的表達(dá)水平提高了約30％。


圖1—安琪因子基因DNA序列圖2--重組質(zhì)粒pBV220-Anqi構(gòu)建3--SDS-PAGE電泳檢測安琪因子表達(dá)其中1DH5α-pBV220-Anqi篩選菌落5，42℃誘導(dǎo)表達(dá)5h后樣品2DH5α-pBV220-Anqi篩選菌落5，表達(dá)前樣品3DH5α-pBV220-Anqi篩選菌落4，42℃誘導(dǎo)表達(dá)5h后樣品4DH5α-pBV220-Anqi篩選菌落4，表達(dá)前樣品5DH5α-pBV220-Anqi篩選菌落3，42℃誘導(dǎo)表達(dá)5h后樣品6DH5α-pBV220-Anqi篩選菌落3，表達(dá)前樣品7DH5α空菌落樣品8分子量Marker
附錄序列表<110>牛勃<120>一種基因工程新藥--安琪抗栓因子的高效生產(chǎn)方法<160>4<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>147<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)...(147)<223>根據(jù)野生蛋白氨基酸序列，采用大腸桿菌喜好密碼子設(shè)計(jì)合成。<220><221>CDS<222>(1)...(147)<400>1gaa tgc gaa tcc ggt ccg tgc tgc cgt aac tgc aaa ttc ctg aaa gaa 48Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu1 5 10 15ggt act atc tgc aaa cgt gct cgt ggt gac gac atg gac gac tac tgc 96Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys20 25 30aac ggt aaa act tgc gac tgc ccg cgt aac ccg cac aaa ggt ccg gct 144Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala35 40 45act 147Thr<210>2<211>49<212>PRT<213>小蝰蛇種(Echis carinatus sp.)<400>2Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu1 5 10 15Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys20 25 30Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala35 40 45Thr<210>3<211>192<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_recomb<222>(1)...(6)<223>限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I的識別位點(diǎn)，為了將串聯(lián)好的多聚體能方便的裝入表達(dá)載體。<220><221>misc_recomb<222>(7)...(12)<223>限制性核酸內(nèi)切酶Pst I的識別位點(diǎn)，用于安琪因子基因多聚體的拼接。<220><221>CDS<222>(13)...(180)<220><221>Old_sequence<222>(115)...(117)<223>在不影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的前提下，為分離純化方便，改為亮氨酸密碼子。<220><221>misc_recomb<222>(181)...(186)<223>限制性核酸內(nèi)切酶Nsi I的識別位點(diǎn)，用于安琪因子基因多聚體的拼接。<220><221>misc_recomb<222>(187)...(192)<223>限制性核酸內(nèi)切酶Bam III的識別位點(diǎn)，為了將串聯(lián)好的多聚體能方便的裝入表達(dá)載體。<400>3gaa ttc ctg cag cac cac cac cac cac cac atg gaa tgc gaa tcc ggt 48His His His His His Hsi Met Glu Cys Glu Ser Gly1 5 10ccg tgc tgc cgt aac tgc aaa ttc ctg aaa gaa ggt act atc tgc aaa 96Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys15 20 25cgt gct cgt ggt gac gac ctc gac gac tac tgc aac ggt aaa act tgc 144Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr Cys30 35 40gac tgc ccg cgt aac ccg cac aaa ggt ccg gct act tgc gca gga tcc 192Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala Thr45 50 55<210>4<211>56<212>PRT<213>人工序列<220><221>NON_TER<222>(1)<220><221>MUTAGEN<222>(1)…(6)<223>此處的六個(gè)組氨酸殘基用于表達(dá)產(chǎn)物的純化。<220><221>MUTAGEN<222>(35)<223>天然蛋白質(zhì)此處為蛋氨酸，但此處蛋氨酸并非天然蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)活性所必須，為分離純化方便，將其改為亮氨酸。<220><221>NON_TER<222>(56)<400>4His His His His His His Met Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg1 5 10 15Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly20 25 30Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg35 40 45Asn Pro His Lys Gly Pro Ala Thr50 5權(quán)利要求
1.一種基因工程新藥安琪抗栓因子的高效制備方法，其特征在于人工設(shè)計(jì)編碼基因DNA序列，并采用全基因分段合成、PCR拼接獲得所說因子基因序列，通過將其串聯(lián)為多聚體與表達(dá)載體連接，構(gòu)建為重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化原核或真核細(xì)胞，表達(dá)安琪因子蛋白質(zhì)并進(jìn)行提取、分離與純化。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于人工設(shè)計(jì)編碼基因是選用大腸桿菌的喜好密碼子替代安琪因子基因DNA序列中的非喜好密碼子，并考慮密碼子間的合理組合，設(shè)計(jì)全新的安琪因子基因DNA序列如下1 atggaatgcg aatccggtcc gtgctgccgt aactgcaaat tcctgaaaga aggtactatc61 tgcaaacgtg ctcgtggtga cgacatggac gactactgca acggtaaaac ttgcgactgc121 ccgcgtaacc cgcacaaagg tccggctact
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征是采用全基因分段合成、PCR拼接，分步延長合成安琪因子基因片段L1、L2和R1L11 gggaattcat ggaatgcgaa tccggtccgt gctgccgtaa ctgcaaattc ctgaaagaag61 gtactatctL21 cctgaaagaa ggtactatct gcaaacgtgc tcgtggtgac gacatggacg actactgcaa61 cggtaaaaR11 agtagccgga cctttgtgcg ggttacgcgg gcagtcgcaa gttttaccgt tgcagtagtc61 g
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的制備方法，其特征是先以L2、R1兩鏈末端部分互為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得L2-R1PCR產(chǎn)物；再以L1與L2-R1互為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得安琪因子基因全序列。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于一種基因串聯(lián)表達(dá)模式，是在DNA水平上，將安琪因子的DNA序列串聯(lián)為多聚體，并用原核或真核細(xì)胞表達(dá)安琪因子基因串聯(lián)重復(fù)多聚體。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是根據(jù)安琪因子的DNA序列，設(shè)計(jì)安琪因子多肽單體及間隔片段的核苷酸序列 其中，劃線的核苷酸序列為插入間隔片段序列；方框部分序列為同尾酶如Pst1和Nst1的識別位點(diǎn)，在同尾酶識別位點(diǎn)前后加上合適的酶切位點(diǎn)如EcoR1和BamH1用于安琪因子基因多聚體的拼接。
7.如權(quán)利要求1或5所述的制備方法，其特征是利用同尾酶具有識別水解不同核苷酸序列但產(chǎn)生相同粘性末端、且當(dāng)二者的粘性末端相連后該片段不能再被同尾酶識別切割的特點(diǎn)，通過將安琪因子的基因序列重復(fù)串聯(lián)為多聚體，優(yōu)選在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得表達(dá)效率高、生產(chǎn)成本低的目標(biāo)肽段成分。
8.如權(quán)利要求1、5、6或7所述的制備方法，其特征是將編碼該因子的49個(gè)氨基酸中的第28位氨基酸(蛋氨酸)用亮氨酸取代，形成安琪因子突變體，并將蛋氨酸插入安琪因子基因單體分子間作為溴化氰裂解位點(diǎn)，以便在表達(dá)后純化時(shí)將目的肽段的多聚體斷裂加工為目標(biāo)肽段單體。
9.如權(quán)利要求1、5、6、7或8所述的制備方法，其特征是將該因子基因序列單體或串聯(lián)的多聚體分別與表達(dá)載體連接，構(gòu)建為重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，表達(dá)安琪抗栓因子蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1、5、6、7、8或9所述的制備方法，其特征是將表達(dá)的安抗琪栓因子蛋白質(zhì)從細(xì)胞中，經(jīng)溶菌、裂解、提取、純化，并經(jīng)溴化氰降解，最后得到色譜純化的安琪因子蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程新藥安琪抗栓因子的高效制備方法,其特征在于人工設(shè)計(jì)編碼基因DNA序列,并采用全基因分段合成、PCR拼接獲得所說因子基因序列,通過將其串聯(lián)為多聚體與表達(dá)載體連接,構(gòu)建為重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化原核或真核細(xì)胞,表達(dá)安琪因子蛋白質(zhì)并進(jìn)行提取、分離與純化,本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物大多為目標(biāo)肽段成分,表達(dá)效率高,生產(chǎn)成本低,市場前景很好。
文檔編號A61P7/00GK1384112SQ0212089
公開日2002年12月11日 申請日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者牛勃, 韓兵社, 楊琦, 向前, 閻占清, 解軍, 常冰梅, 楊濤, 郭勇, 李樂意 申請人:牛勃