專利名稱：分離和提純埃坡霉素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從樹脂中解吸埃坡霉素(epothilone)、尤其是埃坡霉素A和/或埃坡霉素B的新方法，并涉及包括所述解吸方法在內(nèi)的埃坡霉素的新的生產(chǎn)、后處理或提純方法或制造方法，以及某些溶劑用于從樹脂中解吸埃坡霉素的用途。
背景技術：
埃坡霉素A和B代表下式表示的、新的一類穩(wěn)定微管的細胞毒素活性成分(參見Gerth，K.等人，J.Antibiot.(抗生素雜志)49，第560-563頁(1966)) 其中R代表氫(埃坡霉素A)或甲基(埃坡霉素B)。
自從描述了這些埃坡霉素(見WO 93/10121)后，已經(jīng)公開了幾種合成和制造這兩種埃坡霉素和大量主要的埃坡霉素衍生物(以下統(tǒng)稱為“埃坡霉素”)的方法，例如在WO 99/03848、WO 00/49020、WO 00/49021、WO00/47584、WO 00/000485、WO 00/23452、WO 99/03848、WO 00/49019、WO 99/07692、WO 98/22461、WO 99/65913、WO 98/38192、WO 00/50423、WO 00/22139、WO 99/58534、WO 97/19086、WO 98/25929、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/31247、WO 99/42602、WO 99/28324、WO 00/50423、WO 00/39276、WO 99/27890、WO 99/54319、WO 99/54318、WO 99/02514、WO 99/59985、WO 00/37473、WO 98/08849、US 6,043,372、US 5,969,145、WO 99/40047、WO 99/01124和WO 99/43653中公開的那些。除了埃坡霉素A和埃坡霉素B以外，尤其是在WO 97/19086和WO 98/22461中描述的埃坡霉素D和E，在WO 98/22461中描述的埃坡霉素E和F，以及在WO 99/02514中描述的埃坡霉素顯示出令人感興趣的性能。
作為治療用途的實例，國際申請WO 99/43320描述了埃坡霉素作為抗增生疾病、尤其是抗腫瘤疾病藥劑的各種給藥方式，由于機理相似，該藥劑的作用方式與熟知的且市場化的抗癌藥劑Taxol相似。WO 99/39694公開了埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的一些具體的制劑。
與已經(jīng)確立的治療相比，尤其是在腫瘤對用Taxol治療已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的情況下，埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A且最優(yōu)選埃坡霉素B具有各種優(yōu)勢。因此，為了滿足預期需要，迫切需要大量合成它們的方法。
迄今為止，最有效的生產(chǎn)方法至少包括一些生物合成步驟和埃坡霉素從培養(yǎng)基或類似物質(zhì)中分離的步驟。
最初，通過粘細菌提取天然物質(zhì)，尤其是從細胞株SorangiumCellulosum Soce90(在German Collection of Microorganisms(德國微生物保存中心)以編號6773保藏，見WO 93/10121)提取埃坡霉素的描述見于文獻。為了獲得天然物質(zhì)、尤其是埃坡霉素的滿意濃度，以前總是將基于聚苯乙烯的吸附物樹脂如Amberlite XAD-1180(Rohm&Haas，法蘭克福，德國)加入培養(yǎng)基中以吸收該培養(yǎng)基。
但是，該方法的缺點是大規(guī)模生產(chǎn)會產(chǎn)生許多問題。閥門被樹脂球損壞，管道可能堵塞，設備可能因機械摩擦而受到較大磨損。樹脂球是多孔的，因此具有較大的內(nèi)表面積(約825m2/g樹脂)。由于包含在樹脂中的空氣不是高壓滅菌的，所以消毒成為問題。因此該方法不能在培養(yǎng)生產(chǎn)埃坡霉素的微生物過程中向其中添加樹脂而大規(guī)模地切合實際地進行。
因此，發(fā)現(xiàn)了一種生產(chǎn)埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的先進方法，該方法描述在WO 99/42602中。該方法包括埃坡霉素自生產(chǎn)埃坡霉素的微生物培養(yǎng)基的絡合，所述培養(yǎng)基包含環(huán)糊精或其它絡合物形成劑；無細胞培養(yǎng)基(例如所述培養(yǎng)基的濾液或離心液)與作為基質(zhì)的合成樹脂如基于苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的樹脂[如Amberlite XAD-16(Rohm&HaasGermany GmbH，法蘭克福，德國)或Diaion HP-20(Resindion S.R.L.，Mitsubishi Chemical Co.，米蘭，意大利)]混合以吸附埃坡霉素；以及尤其是用醇、最優(yōu)選用異丙醇的解吸。隨后，將水加入醇相，除去溶劑相(優(yōu)選通過蒸發(fā))；將所得殘余物在酯、尤其是乙酸乙酯或乙酸異丙酯存在下相分離；通常分子過濾(凝膠色譜法)干燥后的酯相；通過反相HPLC(優(yōu)選用腈/水混合物，例如乙腈/水混合物洗脫)分離所得埃坡霉素混合物；任選通過在水/醚混合物存在下的相分離進一步提純；優(yōu)選隨后進行在硅膠上的吸附色譜法以進一步除去雜質(zhì)；以及結晶/再結晶。
盡管該方法具有有益的進步且適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，但是仍然具有某些缺點。
例如，為了獲得足夠的純度，利用分子過濾步驟或硅膠吸附色譜法步驟或兩者是可行的。更多的困難來自在酯如乙酸乙酯存在下的相分離—該過程(尤其由于大工業(yè)規(guī)模的水/酯相的相分離時間較長)非常耗時，以及隨后的蒸發(fā)由于發(fā)泡和濺射也難于處理。
因此，本發(fā)明要解決的問題是盡可能多地避免上述困難，并發(fā)現(xiàn)分離吸附到樹脂中的埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的有利方法。
發(fā)明概述非常令人驚奇的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過簡單地用某些其它溶劑(如下面詳細說明的弱極性或非極性溶劑)替換用作解吸溶劑的醇，在獲得解決上述問題的方案方面就提供了實質(zhì)性突破，產(chǎn)生了附加優(yōu)點如改善的解吸和較高最終產(chǎn)率。其中的附加優(yōu)點是(i)較高的解吸選擇性；(ii)較高的埃坡霉素解吸量(這說明解吸更完全)；(iii)無需使用酯(例如乙酸乙酯)再提取且無需隨后的醚蒸發(fā)，其中使用酯再提取需要進行高度麻煩的水/酯相分離；(iv)無需分子過濾且通常無需吸附色譜法；(v)解吸需要的時間顯著減少；(vi)工藝步驟較少；(vii)污染危險減少(對具有高毒性的埃坡霉素非常重要)，和/或(viii)處理更好且更安全(取決于用于解吸(提取)的溶劑)；和(ix)同樣取決于溶劑，在反相色譜法分離后，出乎意料地甚至更少量的與埃坡霉素、尤其是埃坡霉素B極性相似的副產(chǎn)物或雜質(zhì)需要除去。這些和其它優(yōu)點可從下面的發(fā)明詳述中推論出。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個方面涉及一種用弱極性或非極性溶劑從樹脂、尤其是合成樹脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B、特別是埃坡霉素B的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及一種尤其當埃坡霉素在化學合成用的標準介質(zhì)或優(yōu)選在培養(yǎng)基中生產(chǎn)之后后處理(或提純)它們的方法，所述培養(yǎng)基特別是包含適于生產(chǎn)埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B的Sorangium屬微生物，尤其是粘細菌以及絡合物形成成分，所述方法包括使用弱極性或非極性溶劑將所述埃坡霉素從樹脂中解吸。
本發(fā)明的第三方面涉及弱極性或非極性溶劑用于從樹脂、尤其是合成樹脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B、特別是埃坡霉素B的用途。
以上和以下使用的通用術語優(yōu)選具有下面給定的含義術語“埃坡霉素”優(yōu)選涉及以下專利申請中提及的任何埃坡霉素或埃坡霉素衍生物WO 99/03848、WO 00/49020、WO 00/49021、WO 00/47584、WO 00/00485、WO 00/23452、WO 99/03848、WO 00/49019、WO 99/07692、WO 98/22461、WO 99/65913、WO 98/38192、WO 00/50423、WO 00/22139、WO 99/58534、WO 97/19086、WO 98/25929、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/31247、WO 99/42602、WO 99/28324、WO 00/50423、WO 00/39276、WO 99/27890、WO 99/54319、WO 99/54318、WO 99/02514、WO 99/59985、WO 00/37473、WO 98/08849、US 6,043,372、US 5,969,1 45、WO 99/40047、WO 99/01124和/或WO 99/43653，更優(yōu)選涉及埃坡霉素A且尤其是埃坡霉素B，但是在本發(fā)明的更寬范圍內(nèi)還涉及在WO 97/19086和WO 98/22461中描述的埃坡霉素D和E、在WO 98/22461中描述的埃坡霉素E和F或在WO99/02514中描述的埃坡霉素。此處引用所有這些文件，尤其是有關埃坡霉素衍生物和其中提到的優(yōu)選埃坡霉素衍生物的文件作為參考。
弱極性或非極性溶劑具有以下特征優(yōu)選的是在根據(jù)Snyder等人，J.Chromatogr.Sci.(色譜科學雜志)16，223(1978)確定的洗脫序中顯示出以下特征的溶劑或這些溶劑的混合物，其中xe是質(zhì)子受體參數(shù)(表示作為氫受體形成氫鍵的趨勢)，xd是質(zhì)子供體參數(shù)(表示作為氫供體形成氫鍵的趨勢)，以及xn是偶極參數(shù)(表示偶極特性)，條件是xe+xd+xn＝1xe＝0.20-0.40；xd＝0.15-0.36；以及xn＝0.38-0.60；優(yōu)選xe＝0.22-0.32；xd＝0.17-0.34；以及xn＝0.39-0.54.
在弱極性或非極性溶劑中，非常優(yōu)選低級烷基·低級烷基酮或環(huán)酮，例如丙酮、甲基·乙基酮、2-戊酮、甲基·異丁基酮或環(huán)己酮；更優(yōu)選醚，尤其是環(huán)醚，更尤其是四氫呋喃或二噁烷；甚至更優(yōu)選脂族鹵素化合物，尤其是低級烷基鹵化物，尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或最尤其是芳族溶劑，尤其是萘或(優(yōu)選)苯，或被1個或多個、優(yōu)選1-3個選自下列的基團取代的萘或(優(yōu)選)苯低級烷基，尤其是甲基、乙基或異丙基，低級烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，鹵素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低級烷氧基-低級烷基，尤其是乙氧基甲基；尤其是甲苯、乙苯、二甲苯(尤其是鄰-、間-或對二甲苯)，1，3，5-三甲基苯，假枯烯，連三甲苯，枯烯，異丙基甲苯，苯基鹵化物，尤其是氟代苯、氯代苯、溴代苯或碘代苯，低級烷氧基苯，尤其是乙氧基苯或甲氧基苯，或低級烷氧基-低級烷基苯，尤其是乙氧基甲基苯(芐基·乙基醚)；或兩種或更多種如2-4種這些溶劑的混合物；最優(yōu)選的是低級烷基苯，尤其是乙苯、二甲苯(尤其是鄰-、間-或對二甲苯)、1，3，5-三甲基苯、假枯烯、連三甲苯、枯烯、異丙基甲苯；以及最尤其是甲苯。
術語“弱極性或非極性溶劑”也包括以上和以下所述溶劑中兩種或更多種如2-4種這些溶劑的混合物。
前綴“低級”總是表示相應指定的基團含有優(yōu)選至多7個碳原子，特別是至多4個碳原子，并且是支化的或未支化的。低級烷基可以例如是未支化的或支化一次或多次的，且例如為甲基，乙基，丙基如異丙基和正丙基，丁基如異丁基、仲丁基、叔丁基或正丁基，或還為戊基如戊基或正戊基。
鹵素優(yōu)選為碘、溴、氯或氟。
烴優(yōu)選為含有4-32、更優(yōu)選4-20、甚至更優(yōu)選6-16個碳原子的有機化合物，且可以是脂族的，例如線性、支化或環(huán)狀的飽和烷烴如環(huán)己烷；具有1個或多個雙鍵和/或叁鍵的線性、支化或環(huán)狀(非芳族)有機化合物；或芳族烴。后者為未取代的或被1個或多個如至多3個選自下列的基團取代低級烷基，尤其是甲基、乙基或異丙基，低級烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，鹵素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低級烷氧基-低級烷基，尤其是乙氧基甲基；優(yōu)選被1-3個低級烷基取代。
醇優(yōu)選為羥基-低級烷烴，尤其是甲醇、乙醇、正丙醇或異丙醇。
樹脂尤其是合成樹脂，優(yōu)選基于苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的樹脂，更優(yōu)選Amberlite XAD-4或優(yōu)選Amberlite XAD-16[Rohm&HaasGermany GmbH，法蘭克福]或Diaion HP-20 [Resindion S.R.L.，MitsubishiChemical Co.，米蘭]。無需贅言，一種或多種埃坡霉素根據(jù)本發(fā)明從其中解吸的樹脂含有與之非共價鍵接觸(例如與之可逆結合或吸附)的埃坡霉素。換言之，在使用術語“樹脂”時，其用于指“含有一種或多種與之接觸、尤其與之可逆結合或吸附的埃坡霉素的樹脂”。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方式在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，該方法包括用上述或下述弱極性或非極性溶劑從樹脂中的解吸，還包括任何其它期望的或要求的提純步驟，優(yōu)選本發(fā)明中優(yōu)選描述的那些，以產(chǎn)生純凈形式的各種埃坡霉素，尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B。
埃坡霉素的后處理在產(chǎn)生包含待后處理埃坡霉素的反應產(chǎn)物的反應或方法之后進行，將該埃坡霉素(i)在溶于適當?shù)臉O性水性介質(zhì)后從化學反應混合物中分離，或(ii)更優(yōu)選從具有生產(chǎn)該埃坡霉素的微生物的培養(yǎng)基的上層清液(例如含有一種如WO 99/42602中描述的埃坡霉素的環(huán)糊精)中通過將培養(yǎng)基分離為液相(例如離心液或濾液)和固相(細胞)、尤其是通過過濾或離心分離(管式離心機或分離器)來分離。
在該預處理后，優(yōu)選直接將所述溶液((i))或液相((ii))與作為基質(zhì)的樹脂、尤其是合成樹脂、尤其是基于苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的樹脂(以下也簡稱為聚苯乙烯樹脂)如Amberlite XAD-16或Diaion HP-20混合(離心液與樹脂的體積比優(yōu)選為約10∶1-100∶1，優(yōu)選為約50∶1)。在優(yōu)選0.25-50小時、尤其是0.8-22小時的接觸時間后，例如通過過濾、沉降或離心分離將樹脂分離出來。需要的話，吸附后用強極性溶劑、優(yōu)選用水洗滌該樹脂。
然后，開始本發(fā)明的優(yōu)選后處理方法用弱極性或非極性溶劑、特別是用低級烷基鹵化物、尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或更優(yōu)選用芳族溶劑，尤其是萘或(優(yōu)選)苯，或被1個或多個、優(yōu)選1-3個選自下列的基團取代的萘或(優(yōu)選)苯低級烷基，尤其是甲基、乙基或異丙基，低級烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，鹵素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低級烷氧基-低級烷基，尤其是乙氧基甲基；最優(yōu)選用甲苯來進行埃坡霉素的解吸(本身構成本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方式)。必要或需要的話，該提取步驟可重復1次或多次，優(yōu)選0-3次，尤其是1次，以獲得更完全的解吸。
在可這樣獲得的(在重復提取的情況下，已合并)解吸的埃坡霉素溶液的后處理之后，優(yōu)選將用于解吸的溶劑從所得溶液中通過蒸發(fā)(蒸餾)、優(yōu)選通過在反應器內(nèi)并隨后在真空下在旋轉式汽化器內(nèi)濃縮而除去。
隨后，采用以下步驟進行進一步處理，其中通過用腈洗脫的反相色譜法進行的提純步驟是必須的，而其它步驟是任選的-解吸后使埃坡霉素結晶；尤其為使埃坡霉素B結晶，加入醇與烴的混合物，尤其是低級鏈烷醇與含有3-10個環(huán)原子的脂環(huán)烴的混合物，最尤其是甲醇與環(huán)己烷的混合物，其中所述混合物的體積比優(yōu)選是1∶10-10∶1，尤其是1∶3-3∶1。加入水引起快速相分離，并且例如利用旋轉式汽化器在真空下將醇相蒸發(fā)至干。之后將所得包含埃坡霉素B的提取物從適當?shù)娜軇┗旌衔?、尤其是從?脂環(huán)烴混合物、最優(yōu)選是從異丙醇/環(huán)己烷混合物中結晶，其中所述混合物的體積比優(yōu)選為1∶10-10∶1，更優(yōu)選為1∶6-6∶1，最優(yōu)選為1∶6-1∶4；-(必須的)在溶于適當溶劑、尤其是腈與水的混合物、優(yōu)選為乙腈/水混合物后，通過反相色譜法分離埃坡霉素，并用腈與水的混合物洗脫，其中所述溶劑混合物的體積比優(yōu)選為1∶10-10∶1，尤其為1∶3-1∶1，優(yōu)選特征在于該色譜法在反相材料的柱子中進行，該反相材料帶有烴鏈，例如含有18個碳原子的烴鏈，尤其是RP-18材料，以及使用包含腈、尤其是低級烷基腈、特別是乙腈的洗脫劑，特別使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物，其中腈與水的比例優(yōu)選為約1∶99-99∶1，基本為1∶9-9∶1，例如為2∶8-7∶3，例如3∶7或4∶6；并通過蒸發(fā)(蒸餾)從收集的包含埃坡霉素(尤其是埃坡霉素A或最尤其是埃坡霉素B)的級分中除去所述腈；需要的話，然后將含埃坡霉素的剩余水用酯、尤其是低級鏈烷酸的低級烷基酯、優(yōu)選乙酸異丙酯提取，隨后將含埃坡霉素的酯相蒸發(fā)(優(yōu)選首先在反應器內(nèi)，然后在真空下在旋轉式汽化器內(nèi))至干；(需要的話，起始的埃坡霉素溶液可以分流并分成一個以上的反相獨立流；)-僅當需要時(例如，作為解吸后結晶的替換)，進行吸附色譜法，特別是通過加入到硅膠柱中并用適當?shù)娜軇┗蛉軇┗旌衔?、尤其是?烴混合物如鏈烷酸的低級烷基酯/C4-C10烷烴、尤其是乙酸乙酯或乙酸異丙酯/正己烷的混合物洗脫，其中優(yōu)選所述酯與烴的比例為99∶1-1∶99，優(yōu)選為10∶1-1∶10，例如4∶1；-以及最后的再結晶，例如從適當?shù)娜軇┗蛉軇┗旌衔镏性俳Y晶，該溶劑例如包括酯、酯/烴混合物或醇，尤其是乙酸乙酯或乙酸異丙酯/甲苯的1∶10-10∶1、優(yōu)選2∶3混合物(埃坡霉素A)或甲醇或乙酸乙酯(埃坡霉素B)；在該方法中，必要和/或需要的話，在所使用的各步驟之間，將所得溶液或懸浮液濃縮，和/或特別通過沉降、過濾或離心分離溶液/懸浮液將液體和固體組分彼此分離。上述和下述更精確的定義可優(yōu)選用于上述各步驟中。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方式還涉及一種用于分離吸附到合成樹脂中的埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A或最尤其是埃坡霉素B的方法，該方法包括(i)用弱極性或非極性溶劑、特別是用低級烷基鹵化物、尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或更優(yōu)選用芳族溶劑，尤其是萘或(優(yōu)選)苯，或被1個或多個、優(yōu)選1-3個選自下列的基團取代的萘或(優(yōu)選)苯低級烷基，尤其是甲基、乙基或異丙基，低級烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，鹵素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低級烷氧基-低級烷基，尤其是乙氧基甲基；最優(yōu)選用甲苯；或在本發(fā)明的更寬范圍內(nèi)用兩種或更多種這些溶劑的混合物將埃坡霉素從所述合成樹脂中解吸；以及(ii)在溶于適當溶劑、尤其是腈與水的混合物、優(yōu)選為乙腈/水混合物后，通過反相色譜法分離埃坡霉素，并用腈與水的混合物洗脫，其中所述混合溶劑的體積比優(yōu)選為1∶10-10∶1，尤其為1∶3-1∶1，優(yōu)選特征在于該色譜法在反相材料、尤其是RP-18材料的柱子中進行，該材料帶有烴鏈，
例如含有18個碳原子的烴鏈，以及使用包含腈、尤其是低級烷基腈、特別是乙腈的洗脫劑，特別使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物，其中腈與水的比例優(yōu)選為約1∶99-99∶1，基本為1∶9-9∶1，例如為2∶8-7∶3，例如3∶7或4∶6。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，上一段落中的從步驟(i)起始且包括步驟(ii)的方法還包括任何其它期望或需要的提純步驟，優(yōu)選本發(fā)明中優(yōu)選描述的那些，以產(chǎn)生純凈形式的各種埃坡霉素，尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B。
后處理的準備優(yōu)選按下述進行埃坡霉素的吸附，尤其是從化學反應混合物中或更優(yōu)選從微生物培養(yǎng)液的上層清液中的吸附可按WO 99/42602中所述或類似方法實現(xiàn)；簡言之，在離心液中發(fā)現(xiàn)有埃坡霉素，隨后將該離心液與合成樹脂、尤其是苯乙烯/二乙烯基苯共聚物樹脂如AmberliteXAD-16或Diaion HP-20直接混合(優(yōu)選離心液與樹脂的體積比為約10∶1-100∶1，優(yōu)選為約50∶1)并用攪拌器攪拌。在該步驟中，埃坡霉素轉移到樹脂中。在經(jīng)充分吸附的時間如約0.2-10小時的接觸時間后，通過離心分離或過濾將該樹脂分離出來。埃坡霉素在樹脂上的吸附也可以在色譜柱中進行，通過將該樹脂放置在柱內(nèi)并使離心液流過該樹脂。吸附后，用水洗滌該樹脂。
然后，開始本發(fā)明的優(yōu)選方法并按下述進行埃坡霉素從樹脂中的解吸優(yōu)選用根據(jù)本發(fā)明的弱極性或非極性溶劑、尤其是如上述或下述的優(yōu)選溶劑、尤其是二氯甲烷或最尤其是甲苯進行。然后盡可能地除去該溶劑，優(yōu)選直到獲得干燥殘余物為止。適當?shù)脑?，將該殘余物以較低體積溶于優(yōu)選上述比例的醇/烴混合物、尤其是甲醇/環(huán)己烷混合物中。蒸發(fā)醇相，優(yōu)選至干，然后將該醇提取物從優(yōu)選上述比例的醇(尤其是異丙醇)與烴(尤其是環(huán)己烷)的混合物中結晶。然后將所得固體結晶物質(zhì)溶于優(yōu)選如上所述的腈/水混合物、尤其是體積比為2∶3的乙腈/水混合物中，并且需要的話，將所得料液在分流成一個以上支流后倒入制備型反相柱中。隨后，用腈/水混合物、尤其是剛才提到的混合物洗脫。通過蒸發(fā)(蒸餾)從所得含有埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B的級分中除去所述(乙)腈，并且將所得水相用酯、尤其是乙酸異丙酯提取。然后蒸發(fā)酯提取物，優(yōu)選至干，并隨后再結晶所得物質(zhì)，例如將埃坡霉素A級分直接從酯/烴混合物(例如乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3)中結晶，埃坡霉素B級分從酯(尤其是乙酸乙酯)或優(yōu)選從醇(尤其是甲醇)中結晶。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甲苯是高選擇性的洗脫劑(解吸劑)，它可在一半用異丙醇(WO 99/42602所用)所需的解吸時間內(nèi)達到約100％的產(chǎn)率。令人驚奇的是，與異丙醇解吸相比，用甲苯解吸后，解吸的埃坡霉素量增加，例如增至130％。(盡管從理論角度看，這一點初步看來是不可能的，但它恰恰說明了本發(fā)明的主要優(yōu)點所述結果與負載樹脂的分析相關。由于該分析用異丙醇解吸，因此不得不采用不完全解吸作為基礎，從而一開始就導致分析值降低，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該值具有欺騙性)。埃坡霉素混合物(未經(jīng)或經(jīng)先前的結晶)可直接施加到反相柱中。本發(fā)明方法在溶劑量、攪拌速率和溫度方面變得高度穩(wěn)定。而對于攪拌下的醇(例如乙醇或異丙醇)，可能顯示出兩步解吸，其中第一批包含埃坡霉素的物質(zhì)在第一時間段內(nèi)解吸(可由具有兩個分布峰的聚苯乙烯XAD-16中發(fā)現(xiàn)的孔度分布來解釋)，經(jīng)另一時間段后，第二批解吸—這一不期望的行為在使用甲苯或二氯甲烷時沒有觀察到，因為其中所有物質(zhì)在第一時間階段內(nèi)就已解吸。在類似條件下，在使用異丙醇解吸埃坡霉素A和B的情況下，一個實施例中發(fā)現(xiàn)蒸發(fā)殘余物為40g，在使用二氯甲烷的情況下，蒸發(fā)殘余物為3.3g，在使用甲苯的情況下蒸發(fā)殘余物僅0.9g，從苯乙烯/二乙烯基苯共聚物樹脂中解吸后，從如WO 99/42602中所述的包含環(huán)糊精的培養(yǎng)基上層清液中獲得例如17-18g％埃坡霉素B，這表明純度高得多。盡管甲苯具有最顯著的優(yōu)點，但二氯甲烷由于其低沸點而具有易于除去的優(yōu)點。
埃坡霉素A和B的分離也可以通過進行這里公開的色譜法以它的模擬移動床(SMB)方式來實現(xiàn)。SMB-色譜法廣泛用于分離二元混合物，例如分離手性固定相上的外消旋物，它們例如是石化工業(yè)中的SORBEX方法，像Parex或Molex，或糖工業(yè)中的SAREx方法。與間歇色譜法相比，SMB-色譜法具有連續(xù)逆流單元操作的優(yōu)點，該操作使生產(chǎn)率提高且流動相消耗降低。幾個用于展開SMB-色譜法方法的系統(tǒng)工序已為本領域熟練技術人員所知。這些工序描述在例如R.-M.Nicoud，M.Bailly，J.Kinkel，R.M.Devant，T.R.E.Hampe和E.Küsters，Proceedings of the 1stEuropean Meeting onSimulated Moving Bed Chromatography(第一屆歐洲模擬移動床色譜法會議會刊)，(1993)，ISBN 2-905-267-21-6，第65-88頁；E.Küsters，G.Gerber和F.D.Antia，Chromatographia(色譜學)，40(1995)387；T.Prll和E.Küsters，J.Chromatogr.A(色譜學雜志A)，800(1998)135；或C.Heuer，E.Küters，T.Plattner和A.Seidel-Morgenstern，J.Chromatogr.A，827(1998)175中。用SMB色譜法分離埃坡霉素A和B的基本參數(shù)可以直接從傳統(tǒng)的LC分離獲取。優(yōu)選地，反相硅膠(RP 18)作為固定相，水/乙腈混合物作為流動相。流速(分別對于各個SMB區(qū)和切換時間)的最終設定可由E.Küters等人在Chromatographia，40(1995)387中公開的簡單流程圖獲取，或者對如J.Chromatogr.A，800(1998)135和J.Chromatogr.A，827(1998)175中公開的吸附等溫線的仔細估算后來確定。提取物和殘余物流的后處理也可按為傳統(tǒng)LC分離所述的方法進行。
本發(fā)明最優(yōu)選涉及下列實施例中描述的工藝和方法。
實施例下列實施例用于闡述本發(fā)明，但并不限制其范圍。注意由于埃坡霉素毒性高，必要的話，處理埃坡霉素時必須采取適當?shù)谋Ｗo措施。實施例1埃坡霉素B的后處理工序將591.7kg負載的樹脂(負載有來自培養(yǎng)基的埃坡霉素A和B的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物樹脂XAD-16)通過攪拌該樹脂分兩批進行解吸，其中每批用720升甲苯(分四份)攪拌約8小時。使用吸濾器將甲苯相從樹脂中分離。合并的甲苯相分兩批、每批用250升水洗滌。相分離后，將甲苯提取物在1000升的反應器內(nèi)濃縮到約20-40升，之后在真空下在旋轉式汽化器內(nèi)濃縮至干。結果得到4.095kg含有209g埃坡霉素B的甲苯提取物。將該甲苯提取物溶于16.5升甲醇和24.5升環(huán)己烷中。在加入0.8升水后，立即發(fā)生相分離。將甲醇部分在真空下在旋轉式汽化器內(nèi)蒸發(fā)至干，得到1.025kg含有194g埃坡霉素B的蒸發(fā)殘余物。之后將甲醇提取物在由2.05升異丙醇和10.25升環(huán)己烷組成的溶劑混合物中結晶，得到0.4kg含有184g埃坡霉素B的結晶物質(zhì)。將該晶體溶于3.2升體積比為2/3的乙腈/水混合物中，并且將所得料液以三支獨立支流轉移至制備型反相柱(25kg RP-18球形硅膠，YMC-Gel ODS-A120；5-15μm；Waters Corp.，Milford，Massachusetts，USA)中。以體積比為2/3的乙腈/水混合物作為流動相進行洗脫，流速為2.3升/分鐘；埃坡霉素A的停留時間為77-96分鐘，埃坡霉素B的停留時間為96-119分鐘。用UV探測儀在250nm處監(jiān)測分級。蒸餾除去(三支流的)合并的埃坡霉素B級分中的乙腈，剩余的水相用504升乙酸異丙酯提取。將乙酸異丙酯提取物在630升的反應器內(nèi)濃縮到大約20-40升，并且之后在真空下在旋轉式汽化器內(nèi)濃縮至干。埃坡霉素B級分的蒸發(fā)殘余物的重量為170g，依照HPLC(外標)其含量為98.4％。最后將所得物質(zhì)于0-5℃下在2.89升甲醇中結晶，得到150g埃坡霉素B純結晶物。
熔點124-125℃；埃坡霉素B的1H-NMR數(shù)據(jù)(500MHz-NMR，溶劑DMSO-d6。相對于TMS的化學位移δ，以ppm表示。s表示單峰，d表示雙峰，m表示多重峰)δ(多重性)積分(H的數(shù)量)7.34(s) 16.50(s) 15.28(d) 15.08(d) 14.46(d) 14.08(m) 13.47(m) 13.11(m) 12.83(dd) 12.64(s) 32.36(m) 22.09(s) 32.04(m) 1
1.83(m) 11.61(m) 11.47-1.24(m)41.18(s) 61.13(m) 21.06(d) 30.89(d+s，重疊) 6∑＝41實施例2制造埃坡霉素B的不同解吸方法的比較將通過WO 99/42602描述的方法制備的、各360ml負載有來自粘細菌培養(yǎng)液的埃坡霉素A和B的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物樹脂XAD-16的水懸浮液(相當于194g濕AmberliteXAD-16)在下表給出的條件下于攪拌(普通的實驗室錨式攪拌器)的、底部具有燒結的玻璃料的玻璃反應器(自制固相間歇反應器，內(nèi)徑10cm×20cm長，以下稱為“攪拌器/玻璃料”)內(nèi)用溶劑提取。表1制造埃坡霉素B的解吸方法的比較起始樹脂(負載有吸附的埃坡霉素的樹脂)-#1001，理論負載70mg/360ml樹脂懸浮液(相當于70mg/194g濕XAD-16)-#1003，理論負載114mg/360ml樹脂懸浮液(相當于114mg/194g濕XAD-16)


a沒有優(yōu)化；在提取2次的情況下，損失約5％產(chǎn)率。b用水反萃取3次，保留極性成分c 3次相分離中的第一次進行一夜d與乙酸乙酯蒸發(fā)殘余物相比，可以更好地在硅膠上對該物質(zhì)進行色譜分離e相當于約25-30g蒸發(fā)殘余物f烘箱干燥一周末(高度真空)g可能是有關所用時間的強烈第一相分離的結果h回收第一次提取為700ml；第二次提取為660ml；第三次提取為680mli回收第一次提取為670ml；第二次提取為710ml；第三次提取為720mlj加水的必要性還沒有得到證實k簡化原始所存在水的除去(XAD-16被所用水覆蓋)l鑒于方案8、11和12的結果以及所有使用甲苯的實驗的洗脫曲線，不能排除使用較少量樹脂。“Erl./mag.St.”代表錐形瓶中的磁力攪拌。“Methylenchloride”(“Methylenchl.”)為二氯甲烷“Stir./Frit”代表攪拌器/玻璃料“RT”代表室溫從這些實驗和其它數(shù)據(jù)可以推論與異丙醇相比，用二氯甲烷提取具有更好的選擇性，更短的提取時間(大約縮短到1/2)，更快的溶劑蒸餾(二氯甲烷的沸點約40℃，異丙醇的沸點為81-83℃)，不再需要費時且非常麻煩的乙酸乙酯/水相分離，不再需要第二次溶劑蒸餾，因此可使用更少的工藝步驟，結果產(chǎn)生更低的污染危險，更好且更安全的處理；可以以一半體積(例如在1000升的反應器內(nèi)，而不是在2000升的反應器內(nèi))進行后處理；產(chǎn)物埃坡霉素B具有更好的純度分布(與埃坡霉素B極性類似的副產(chǎn)物更少)，并且如在使用乙酸乙酯提取的情況下，蒸發(fā)殘余物不發(fā)生濺射和起泡。對于使用甲苯的解吸，獲得了與異丙醇提取相比更高的產(chǎn)率(約100％，而不是約80％)，可以觀察到更好的選擇性(使用異丙醇時，約10倍量的副產(chǎn)物被解吸)，提取時間顯著縮短(大約縮短到1/3)，用異丙醇解吸后的復雜過濾得到簡化(使用異丙醇的提取難于在更大規(guī)模上實施)，不再需要第二次溶劑蒸餾，后處理可以在更小的反應器內(nèi)進行(再一次，例如可以用1000升的反應器代替2000升的反應器)，可以省去硅膠色譜法(解吸后的蒸發(fā)殘余物已經(jīng)含有約40％的埃坡霉素A/B混合物)，并且解吸后的蒸發(fā)殘余物不表現(xiàn)出在用乙酸乙酯提取的殘余物中觀察到的起泡和濺射。
權利要求
1.一種從樹脂中解吸埃坡霉素的方法，所述方法使用弱極性或非極性溶劑。
2.如權利要求1所述的方法，其中待解吸的埃坡霉素是埃坡霉素A或埃坡霉素B。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述樹脂是合成樹脂。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述樹脂是基于苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的合成樹脂。
5.如權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中所述弱極性或非極性溶劑選自低級烷基鹵化物和芳族溶劑或兩種或更多種這些溶劑的混合物。
6.如權利要求5所述的方法，其中使用的芳族溶劑選自萘，苯或被一個或多個選自下列的基團取代的萘或苯低級烷基、低級烷氧基、鹵素、硝基和低級烷氧基-低級烷基。
7.一種分離吸附到合成樹脂中的埃坡霉素的方法，該方法包括(iii)用弱極性或非極性溶劑從所述合成樹脂中解吸埃坡霉素；以及(iv)在溶于適當溶劑后通過反相色譜法分離埃坡霉素并用腈與水的混合物洗脫。
8.如權利要求1-7中任意一項所述的方法，還包括任何其它期望或需要的提純步驟，以得到純凈形式的各種埃坡霉素。
9.一種從反應混合物中后處理埃坡霉素的方法，所述方法包括-用弱極性或非極性溶劑、特別是用低級烷基鹵化物或芳族溶劑解吸埃坡霉素，其中該解吸步驟可以重復進行以獲得更完全的解吸；-通過蒸發(fā)從所得溶液中除去用于解吸的溶劑；-解吸后任選使埃坡霉素結晶；尤其為使埃坡霉素B結晶，加入醇與烴的混合物、尤其是低級鏈烷醇與含有3-10個環(huán)原子的脂環(huán)烴的混合物，將醇相蒸發(fā)至干，并將埃坡霉素B從適當?shù)娜軇┗旌衔镏?、尤其是從?脂環(huán)烴的混合物中結晶；-(必須步驟)在將來自先前步驟的殘余物溶于適當溶劑、尤其是腈與水的混合物后，通過反相色譜法分離埃坡霉素，并用腈與水的混合物洗脫，優(yōu)選特征在于該色譜法在反相材料的柱子中進行，該反相材料帶有烴鏈、尤其是包含含有18個碳原子的烴鏈的RP-18材料，以及使用包含腈、尤其是低級烷基腈的洗脫劑，特別使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物；并通過蒸發(fā)從收集的包含埃坡霉素的級分中除去所述腈；需要的話，然后將含埃坡霉素的剩余水用酯、尤其是低級鏈烷酸的低級烷基酯提取，隨后將含埃坡霉素的酯相蒸發(fā)至干；-任選通過吸附色譜法、特別是通過加入到硅膠柱中并用適當?shù)娜軇┗蛉軇┗旌衔锵疵摱M一步提純；-以及最后將提純的埃坡霉素從適當?shù)娜軇┗蛉軇┗旌衔镏性俳Y晶；在該方法中，必要和/或需要的話，在所使用的各步驟之間，將所得溶液或懸浮液濃縮，和/或特別通過沉降、過濾或離心分離溶液/懸浮液將液體和固體組分彼此分離。
10.如權利要求9所述的方法，其中埃坡霉素從樹脂中的解吸使用弱極性或非極性溶劑、尤其是權利要求5或6中提到的優(yōu)選溶劑進行；然后盡可能地除去該溶劑，優(yōu)選直到獲得干燥殘余物為止，適當?shù)脑?，將該殘余物以較低體積溶于醇/烴混合物中；蒸發(fā)醇相，優(yōu)選至干，然后將該醇提取物從醇與烴的混合物中結晶，并然后將所得固體結晶物質(zhì)溶于如權利要求8所述的腈/水混合物、尤其是體積比為2∶3的乙腈/水混合物中，并且需要的話，將所得料液在分流成一個以上支流后倒入制備型反相柱中；隨后用腈/水混合物洗脫；然后通過蒸發(fā)從所得含有埃坡霉素的級分中除去所述腈，并且將所得水相用酯提??；然后蒸發(fā)所述酯提取物并隨后再結晶所得物質(zhì)。
11.如權利要求7、9或10中任意一項所述的方法，其中埃坡霉素A和B的分離通過模擬移動床(SMB)色譜法實現(xiàn)。
12.弱極性或非極性溶劑用于從樹脂中解吸埃坡霉素的用途。
13.如權利要求12所述的用途，其中所述弱極性或非極性溶劑選自低級烷基鹵化物和芳族溶劑，尤其是萘，苯或被一個或多個選自下列的基團取代的萘或苯低級烷基、低級烷氧基、鹵素、硝基和低級烷氧基-低級烷基，或為兩種或更多種這些溶劑的混合物；所述樹脂為合成樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從樹脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或埃坡霉素B的方法，并涉及包括所述解吸方法在內(nèi)的埃坡霉素的新的生產(chǎn)、后處理或提純方法或制造方法，以及某些溶劑用于從樹脂中解吸埃坡霉素的用途。
文檔編號A61K31/335GK1479741SQ01820141
公開日2004年3月3日 申請日期2001年12月5日 優(yōu)先權日2000年12月7日
發(fā)明者E·屈斯特斯, H·昂特內(nèi)赫爾, E 屈斯特斯, 嗇諍斬 申請人:諾瓦提斯公司