專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生產(chǎn)現(xiàn)成可用的加載抗原或未加載抗原的冷藏成熟樹(shù)突細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備現(xiàn)成可用的冷藏成熟樹(shù)突細(xì)胞的方法，尤其是用于制備含有這類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞的疫苗的方法，其中在合適的成熟刺激物存在下培養(yǎng)未成熟樹(shù)突細(xì)胞，并且將如此獲得的成熟樹(shù)突細(xì)胞冷凍。在冷凍之前或之后，可以給所述樹(shù)突細(xì)胞加載抗原。本發(fā)明也涉及用按照本發(fā)明的方法獲得的疫苗，還涉及含有加載抗原的冷凍成熟樹(shù)突細(xì)胞的組合物。
背景技術(shù)：
樹(shù)突細(xì)胞(在下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“DC”)是抗原呈遞細(xì)胞，通過(guò)與淋巴細(xì)胞相互作用而影響免疫系統(tǒng)。大多數(shù)DC表現(xiàn)出免疫刺激活性。這些典型的DC在體內(nèi)可以以不同方式誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞的形成(“天然佐劑”)。特別是，在外周組織中存在的未成熟DC具有結(jié)合抗原并且由其制備免疫原性MHC肽復(fù)合體(“抗原加工模式”)的能力。當(dāng)成熟誘導(dǎo)刺激物例如炎性細(xì)胞因子作用時(shí)，這些未成熟DC發(fā)育為通過(guò)增加粘著分子和共同刺激分子的形成的有效T細(xì)胞刺激物(“T細(xì)胞刺激模式”)。同時(shí)，所述細(xì)胞遷移到二級(jí)淋巴器官，以選擇并刺激罕見(jiàn)的抗原特異性T細(xì)胞?？梢员砻鳎瑥慕M織或血液分離出并且在體外加載抗原的DC在作為成熟DC注射回體內(nèi)之后具有免疫原性。最近，已經(jīng)表明DC在健康人和癌癥患者體內(nèi)都可以誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞免疫和CD8+T細(xì)胞免疫。在有免疫能力的健康受治療者中，一次加強(qiáng)注射成熟DC，可以不僅增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的頻率，而且也增強(qiáng)其官能親和力。由于這些原因，DC(尤其是成熟DC)是目前極具前景的誘導(dǎo)人類(lèi)抗腫瘤和抗感染的有效T細(xì)胞應(yīng)答的佐劑。
DC應(yīng)用于免疫治療的一個(gè)先決條件是開(kāi)發(fā)允許從增殖性CD34+前體細(xì)胞或從非增殖性或很少增殖的CD14+單核細(xì)胞前體細(xì)胞產(chǎn)生大量培養(yǎng)DC的技術(shù)。衍生于單核細(xì)胞的DC目前是常用的，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀字苽?，無(wú)需用任何細(xì)胞因子預(yù)處理供體，并且所得的DC群體相當(dāng)均一并且已被很好地表征。例如，可以在(GM-CSF+IL-4)中培養(yǎng)通常6-7天的培養(yǎng)期間，在無(wú)胎牛血清(FCS)的情況下，可以從貼壁單核細(xì)胞制備未成熟DC，然后通常讓其成熟1-3天，用自體單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)所述成熟。已經(jīng)證明為樹(shù)突細(xì)胞或其前體細(xì)胞提供有效的冷藏是極其困難的，除非在FCS存在下(Taylor等(1990)Cryobiology 27，269；Makino等(1997)Scand.J.Immunol.45，618)。然而，由于在疫苗接種時(shí)必須不能存在FCS，所以仍必需從新鮮血液、新鮮的白細(xì)胞提取(leucapheresate)產(chǎn)物或者從新鮮白細(xì)胞提取產(chǎn)物的冷凍PBMC(“外周血單核細(xì)胞”)等份樣品新鮮制備DC，以供每次DC疫苗接種用(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。冷凍PBMC也有在解凍后所述細(xì)胞必須首先培養(yǎng)數(shù)天以便分化為DC的缺點(diǎn)。Lewalle等(2000)J.Immunol.Methods 240，69-78公開(kāi)了一種冷凍未成熟DC的方法，但僅獲得收率不好的存活細(xì)胞(第71頁(yè)，左欄頂部)。在WO 99/46984中也公開(kāi)了借助GM-CSF和IL-4冷凍從單核細(xì)胞制備的未成熟樹(shù)突細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種含有成熟DC的組合物，例如疫苗，所述DC可以貯存延長(zhǎng)的時(shí)間，而活性沒(méi)有相當(dāng)大的損失，并且可以在需要時(shí)在短時(shí)間內(nèi)給予。
按照本發(fā)明使用的DC最好來(lái)源于用所述疫苗治療的同一患者(自體的)。另一方面，所述DC也可以來(lái)源于其它患者(異體的)，例如來(lái)源于正常志愿者的白細(xì)胞提取物，如例如Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 283，1-15中所述。
出乎意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅通過(guò)在具有特定成熟刺激物的合適“成熟混合劑”存在下培養(yǎng)獲得的完全成熟的DC(在下文也簡(jiǎn)稱(chēng)為“天然DC”)，在無(wú)FCS下冷凍和解凍后以高百分比存活，并且具有與新鮮制備的成熟DC相當(dāng)?shù)拿庖叽碳せ钚浴Ｔ谟盟龀墒旎旌蟿┡囵B(yǎng)期間，未成熟DC分化為成熟DC。一種特別優(yōu)選的成熟混合劑含有白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和“腫瘤壞死因子α”(TNFα)。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種制備現(xiàn)成可用的冷藏成熟樹(shù)突細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)提供未成熟的樹(shù)突細(xì)胞(DC)；(b)在含有成熟混合劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟DC以獲得成熟DC，其中所述成熟混合劑具有一種或多種成熟刺激物；(c)在不含任何異種血清的冷凍介質(zhì)中冷凍所述成熟DC；(2)一種上述(1)中限定的適用于從冷藏成熟DC制備疫苗的方法；(3)冷凍的加載抗原的成熟樹(shù)突細(xì)胞，尤其是可用方法(1)獲得那些樹(shù)突細(xì)胞；(4)一種疫苗，所述疫苗包含(3)中限定的樹(shù)突細(xì)胞；和(5)一種發(fā)現(xiàn)冷凍DC的有利條件的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供未成熟DC；(b)在不同成熟刺激物存在下用所述未成熟DC進(jìn)行不同的培養(yǎng)；(c)然后在有或無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述DC，優(yōu)選在無(wú)細(xì)胞因子的情況下進(jìn)行培養(yǎng)；(d)在有或無(wú)細(xì)胞因子的所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1天后，測(cè)定活細(xì)胞的比率；且(e)確立給出最高存活率的成熟刺激物。
在本發(fā)明的方法(1)和(2)中，首先培養(yǎng)未成熟DC，在所述培養(yǎng)基中加入具有一種或多種成熟刺激物的合適成熟混合劑。合適的成熟刺激物包括IL-1例如IL-1β等、IL-6、TNF-α、前列腺素例如PGE2等、IFN-α、脂多糖和其它細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)物例如MPL(單磷酰脂質(zhì)A)、脂磷壁酸質(zhì)等、磷酸膽堿、鈣離子載體、佛波醇酯例如PMA、熱激蛋白、核苷酸例如ATP等、脂肽、Toll樣受體的人工配體、雙鏈RNA例如poly-IC等、免疫刺激性DNA序列、CD40配體等。按照本發(fā)明，尤其優(yōu)選所述培養(yǎng)基或成熟混合劑含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα，或者所述成熟混合劑是單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MCM)或補(bǔ)充PGE2的MCM。在方法(1)和(2)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以在所述培養(yǎng)步驟期間或之后給所述DC加載抗原。在成熟和任選地加載抗原后，將所述DC在不含任何異種血清例如FCS的冷凍介質(zhì)中冷凍。在本申請(qǐng)含義內(nèi)的“異種血清”是一種不是來(lái)源于人類(lèi)的血清。然而，按照本發(fā)明，有可能使用自體血清或血漿(它來(lái)源于與所述DC相同的人)和異體血清或血漿(它來(lái)源于與所述DC不同的人)。
本申請(qǐng)含義內(nèi)的未成熟DC是與所述成熟DC相比僅表達(dá)少量I類(lèi)和II類(lèi)MHC分子以及粘著或共同刺激分子(例如特別是CVD86、CD80、CD40)、在合適成熟刺激物下將分化為成熟DC的CD83(和/或p55/fascin和/或DC-LAMP)陰性(或僅弱陽(yáng)性和/或至一定的低百分比)白細(xì)胞。
本申請(qǐng)含義內(nèi)的成熟DC是在成熟刺激物作用下已經(jīng)從未成熟DC發(fā)育的、表現(xiàn)出CD83(和/或p55/fascin和/或DC-LAMP)以及II類(lèi)和I類(lèi)MHC分子和粘著或共同刺激分子(尤其是CD86、CD80、CD40)的表達(dá)增強(qiáng)的白細(xì)胞。此外，成熟DC與未成熟DC相比表現(xiàn)出T細(xì)胞刺激能力明顯增強(qiáng)(例如與未成熟DC相反，它們甚至在DC∶T之比為大約≤1∶100的同種異體MLR中也表現(xiàn)出明顯刺激活性；另外，本申請(qǐng)含義內(nèi)的成熟DC的一個(gè)特征是這樣一種事實(shí)這些DC是穩(wěn)定的，即即使在無(wú)細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)1-2天或更長(zhǎng)時(shí)間，這些DC也將保持其成熟表型和強(qiáng)T細(xì)胞刺激能力的特性。相反，尚未完全成熟的DC不穩(wěn)定，將分化為未成熟DC，即例如分化為貼壁巨噬細(xì)胞。
所述未成熟DC可以由各種已知來(lái)源提供。未成熟DC的前體細(xì)胞通常是非增殖性CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞(PBMC；單核細(xì)胞)或增殖性CD34陽(yáng)性細(xì)胞。例如，PBMC可以從白細(xì)胞提取產(chǎn)物中分離。正如已描述的，PBMC可以分化為未成熟DC(Thurner等(1999)J.Exp.Med.190，1669)。因此，可以在IL-4(或IL-13；Romani等(1996)J.Immunol.Methods 196，137-151)和GM-CSF(“粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子”)存在下，培養(yǎng)所述PBMC。從CD14陽(yáng)性細(xì)胞，通過(guò)在GM-CSF和IFNα存在下培養(yǎng)，也可以制備未成熟DC(Santini等(2000)J.Exp.Med.191，1777-1788)。從CD34陽(yáng)性單核細(xì)胞，通過(guò)在GM-CSF、SCF(“干細(xì)胞生長(zhǎng)因子”)和TNFα存在下培養(yǎng)，可以獲得未成熟DC。也可以直接從新鮮血液中獲得未成熟樹(shù)突細(xì)胞，例如在Nestle等(1998)Nat.Med.4,328中所述。預(yù)先生成的CD11c+和CD11c-DC(O-Doherty等(1994)Immunology 82，487-493)和M-DC8-DC(Schakel等(1999)Pathobiology67，287-290)也存在于血液中。這些DC也可以從血液中分離，可以進(jìn)一步用于按照本發(fā)明的方法中。
所述培養(yǎng)基中各種成熟刺激物的優(yōu)選濃度在0.1ng/ml至100μg/ml、優(yōu)選1ng/ml至10μg/ml的范圍。對(duì)于本發(fā)明的特別優(yōu)選的成熟混合劑而言，成熟刺激物的濃度為0.1-100ng/ml IL-1β、0.1-100ng/mlIL-6、0.1-10μg/ml PGE2和0.1-100ng/ml TNFα(最優(yōu)選這些特定成熟刺激物的濃度為大約10ng/ml IL-1β、10 ng/ml IL-6、1μg/ml PGE2和10ng/ml TNFα)。所述的濃度是所述物質(zhì)在培養(yǎng)所述DC的細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度。在上述活性物質(zhì)存在下使所述DC成熟的一種可能是在單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MCM)存在下培養(yǎng)所述未成熟DC。MCM含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα。它可以通過(guò)在無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)PBMC而獲得，如例如在Romani等(1996)J.Immunol.Methods 196，137中所述。當(dāng)用MCM使所述DC成熟時(shí)，所述培養(yǎng)基含有1-100％、優(yōu)選5-25％的MCM。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述DC的成熟通過(guò)添加MCM和限定量的PGE2來(lái)實(shí)現(xiàn)。換句話(huà)說(shuō)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MCM以最佳的可能方式使DC成熟的能力的變化可以通過(guò)添加PGE2(最好在上述濃度范圍內(nèi))來(lái)抵消。然而，按照本發(fā)明，最好通過(guò)添加已確定的最適量的活性物質(zhì)IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα來(lái)使所述DC成熟。這意味著用所述各種活性物質(zhì)的純化制劑制備所述成熟組合物。從而與用MCM或MCM+PGE2成熟相比，獲得更好的結(jié)果。IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα是可得到的，為GMP(“良好生產(chǎn)操作規(guī)程”)級(jí)。通常，通過(guò)在所述物質(zhì)存在下培養(yǎng)至少1小時(shí)、優(yōu)選2小時(shí)、更優(yōu)選至少6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述成熟。按照本發(fā)明，特別優(yōu)選成熟時(shí)間為6-96小時(shí)，優(yōu)選18-36小時(shí)(當(dāng)使用白細(xì)胞提取物用作原料時(shí))或36-60小時(shí)(當(dāng)用新鮮血液或血沉棕黃層作為原料時(shí))。
按照本發(fā)明，在上述成熟步驟期間和/或之后，給所述DC加載至少一種抗原或抗原-抗體復(fù)合體。按照本發(fā)明，可以在冷凍期間或者之后，完成所述抗原加載。如果在冷凍之后實(shí)現(xiàn)加載，則僅在解凍之后給所述DC加載抗原。然而，優(yōu)選在將所述DC冷凍之前加載抗原。其優(yōu)點(diǎn)是，所述DC在解凍后立即可用。
本申請(qǐng)含義內(nèi)的抗原是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、肽和由其衍生的分子(例如糖基化化合物或具有其它化學(xué)修飾的化合物)，但也可以是編碼它們的核酸、病毒、完整的原核或真核細(xì)胞或其片段或凋亡的細(xì)胞?！凹虞d抗原”是指使所述DC細(xì)胞表面的MHC分子“呈遞”肽、即肽與所述MHC分子形成復(fù)合體的過(guò)程。雖然有可能通過(guò)特定的肽直接加載所述MHC分子，但是必須首先加工蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)片段)，即首先由所述細(xì)胞攝取蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)片段)。在胞內(nèi)切割所述蛋白質(zhì)并給MHC加載肽后，MHCII-肽復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表面。合適的抗原主要包括蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。所述蛋白質(zhì)可以是天然來(lái)源的，或者是重組制備的。由于成熟和加載蛋白質(zhì)抗原，包含加入的所述抗原的肽片段的MHCII-肽復(fù)合體將在細(xì)胞表面上形成。培養(yǎng)基中所述蛋白質(zhì)抗原的濃度通常為0.1-100μg/ml，優(yōu)選為1-50μg/ml、最優(yōu)選為1-10μg/ml。
如果用蛋白質(zhì)(即具有超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基的多肽)作為抗原，則所述加載最好在所述DC成熟期間進(jìn)行。這使得由MHCII分子特別有效地呈遞所述抗原片段。所述蛋白質(zhì)(片段)不必在整個(gè)成熟期期間存在，但在成熟期的至少部分時(shí)間內(nèi)存在，所述成熟組合物和所述蛋白質(zhì)(片段)應(yīng)該同時(shí)存在。蛋白質(zhì)抗原的實(shí)例包括通常用作陽(yáng)性對(duì)照抗原的KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)。MAGE-3蛋白質(zhì)為腫瘤抗原的實(shí)例，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或HIV-1 gp-160蛋白質(zhì)是適用于病毒性疾病治療的蛋白質(zhì)的實(shí)例。
當(dāng)所述加載用“短多肽”或蛋白質(zhì)片段(例如具有至多50個(gè)氨基酸殘基、準(zhǔn)確嵌入所述DC表面的MHC分子中的短多肽)進(jìn)行時(shí)，除上述在成熟期間加載之外，也有可能在成熟后、即在冷凍之前或再解凍之后進(jìn)行加載。在這種成熟后加載時(shí)，將所述短多肽加入到經(jīng)洗滌的DC中。
加載抗原的另一種可能是在培養(yǎng)基中添加凋亡的或裂解的細(xì)胞。然后所添加的細(xì)胞被所述DC吞噬。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，除MHCII類(lèi)分子外，也可以有效地加載I類(lèi)分子。例如，已經(jīng)表明，甚至在加入蛋白質(zhì)(尤其是具有顆粒性質(zhì)的蛋白質(zhì))時(shí)，呈遞也發(fā)生于MHC I類(lèi)分子上。例如，不在Mage-3腫瘤蛋白或肽存在下培養(yǎng)所述DC，而是可以將含有Mage-3的細(xì)胞片段(或壞死的或凋亡的腫瘤細(xì)胞)加入到所述DC。
通過(guò)使DC例如與腫瘤細(xì)胞融合，也可以給DC加載抗原。這種融合可以用聚乙二醇或電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，通過(guò)轉(zhuǎn)染或病毒感染，給所述DC加載抗原。從而將編碼抗原的核酸導(dǎo)入到所述DC中或誘導(dǎo)其表達(dá)。例如，可以以合適的方式進(jìn)行DNA或RNA轉(zhuǎn)染或者用腺病毒感染。因此，加載MHC I類(lèi)分子也是可能的。例如，也可以轉(zhuǎn)染從腫瘤細(xì)胞制備的RNA。關(guān)于轉(zhuǎn)染，可以使用常用的方法，例如電穿孔。
如上所述，可以在成熟期期間或成熟期之后加入特定的抗原肽(即“短多肽”)，以便直接加載I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子?？梢栽诩尤胨龀墒旖M合物之前將所述肽抗原加入至所述細(xì)胞，但最好是同時(shí)或者在此后加入所述肽抗原。所述抗原加載優(yōu)選進(jìn)行至少10分鐘，更優(yōu)選進(jìn)行1-24小時(shí)，最優(yōu)選進(jìn)行3-12小時(shí)。
所述肽(即“短多肽”)通常具有至少8個(gè)氨基酸。這類(lèi)肽最好具有8-12個(gè)氨基酸(MHCI)或8-25個(gè)氨基酸(MHCII)。在培養(yǎng)基中用于加載的所述肽的濃度通常為0.01-1000μM，優(yōu)選為0.1-100μM，最優(yōu)選為1-20μM。
可以由MHC分子呈遞的所有肽都可以認(rèn)為是可以使用的肽。優(yōu)選來(lái)源于得自病原體的蛋白質(zhì)的肽。這些肽也可以是表現(xiàn)出天然存在的氨基酸序列變異的肽。這類(lèi)變異通常是一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代。肽抗原的實(shí)例是氨基酸序列為GILGFVFTL(SEQ ID NO1)的流感病毒基質(zhì)肽(IMP)、或者序列為ELAGIGILTV(SEQ ID NO2)的Melan-A類(lèi)似肽。其它可能的肽的實(shí)例示于圖26中。
除“肽/蛋白質(zhì)脈沖”之外，也可以進(jìn)行“肽/蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)載(transloading)”，來(lái)給DC加載抗原。
如上所述，也可以給所述DC加載抗原-抗體復(fù)合體。用于此目的的合適抗原包括所有上述抗原。按照本發(fā)明的“抗原-抗體復(fù)合體”是這類(lèi)抗原與合適抗體的復(fù)合體，例如抗原-IgG或抗原-IgE復(fù)合體。在Reynault，A.等，J.Exp.Med.189(2)371-80(1999)中描述了給DC加載這類(lèi)抗原，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
在成熟和任選的給所述DC加載抗原后，可以在冷凍介質(zhì)中冷凍所述成熟DC。除所述血清組分外，冷凍介質(zhì)還可以含有一種或多種低溫防護(hù)劑(例如0.1-35％(v/v)，優(yōu)選5-25％)。合適的低溫防護(hù)劑最好包括以下化合物DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯、無(wú)機(jī)鹽等。優(yōu)選的低溫防護(hù)劑是DMSO，它優(yōu)選以5-25％(v/v)、更優(yōu)選10-20％(v/v)、最優(yōu)選約10％DMSO的濃度包含于冷凍介質(zhì)中。所述冷凍介質(zhì)可以含有非異種血清組分，優(yōu)選濃度為2-90％(w/v)，優(yōu)選5-80％(w/v)，其中特別優(yōu)選人血清白蛋白，優(yōu)選濃度為10-30％(w/v)。然而，更優(yōu)選冷凍介質(zhì)含有自體血清或血漿來(lái)代替人血清白蛋白。它也可以含有人異體血清或混合血清。此外，冷凍介質(zhì)也可以含有作為添加劑的一種或多種衍生于糖類(lèi)的多元醇化合物，尤其是選自葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤蘚醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇、D-乳糖等的多元醇化合物，濃度優(yōu)選為2-30％、更優(yōu)選5-10％、最優(yōu)選約5％(w/v)。最優(yōu)選的冷凍介質(zhì)是含有約10％DMSO和約5％葡萄糖的純自體血清。通常，在冷凍之前將所述細(xì)胞離心以將其濃縮，然后溶解于冷凍介質(zhì)中。
冷凍介質(zhì)中細(xì)胞的優(yōu)選濃度為1-100×106細(xì)胞/ml，最優(yōu)選的濃度范圍為約5×106細(xì)胞/ml至20×106細(xì)胞/ml。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在冷凍之前或解凍之后使所述DC與抗凋亡分子接觸，提高了DC存活率。因此，在按照本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在冷凍之前或解凍之后，使所述DC與一種能夠抑制細(xì)胞凋亡的分子接觸。優(yōu)選的抗凋亡分子包括CD40配體(CD40L)(Morris等(1999)J.Biol.Chem.274，418)、TRANCE(Wong等(1997)J.Exp.Med.186，2075)或RANKL(Anderson等(1997)Nature 390，175)。最好是，將至少一種所述分子在所述DC冷凍之前或解凍之后加入到培養(yǎng)基中達(dá)至少10分鐘，優(yōu)選至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少4小時(shí)。在培養(yǎng)基中的優(yōu)選濃度是1ng/ml至5μg/ml(RANKL/TRANCE)和1ng/ml至1μg/ml(CD40L)。特別優(yōu)選的濃度為0.5-1μg/ml(RANKL/TRANCE)和0.1-0.5μg/ml(CD40L)。
在所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在免疫抑制性白介素-10(IL-10)或其它免疫/成熟調(diào)節(jié)劑例如維生素D3及其衍生物、富馬酸及其衍生物例如酯等、霉酚酸mofetil等存在下，進(jìn)一步培養(yǎng)所述DC。如此處理的細(xì)胞不用于刺激免疫系統(tǒng)，而是誘導(dǎo)對(duì)特定抗原的耐受。所述介質(zhì)中這些調(diào)節(jié)劑和IL-10的濃度為1-1000ng/ml，優(yōu)選10-100ng/ml。
按照實(shí)施方案(4)，本發(fā)明也涉及可按照本發(fā)明的方法獲得的疫苗。除所述加載抗原的成熟DC外，按照本發(fā)明的疫苗還可以含有藥學(xué)上可接受的佐劑。在將按照本發(fā)明的疫苗解凍后，可以加入藥學(xué)上可接受的并且有利于給藥的各種物質(zhì)。
按照實(shí)施方案(3)，本發(fā)明也涉及冷凍的加載抗原的成熟樹(shù)突細(xì)胞。按照本發(fā)明的這些細(xì)胞可以是藥用組合物的一部分，所述藥用組合物除含有所述細(xì)胞外，還含有適用于給予人類(lèi)的有用的添加劑。
本發(fā)明首次提供了含有加載抗原的成熟DC并且可以冷凍的疫苗。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是所述DC在解凍后的存活率非常高。在所述冷凍DC解凍后，基于冷凍DC的數(shù)目，通常獲得高于75％、優(yōu)選高于85％的存活DC。先前在未加入FCS的情況下，未曾達(dá)到解凍DC的這樣高存活率。然而，這是達(dá)到有效免疫刺激的一個(gè)重要先決條件。將加載抗原的成熟DC冷凍的一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是可以制備并冷凍多個(gè)等份的疫苗。因此，所述疫苗在需要可立即獲得，并且可以無(wú)需漫長(zhǎng)的培養(yǎng)步驟而在非常短的時(shí)間內(nèi)應(yīng)用。通過(guò)僅在冷凍和再解凍后給成熟DC加載抗原，有可能根據(jù)相應(yīng)的環(huán)境，對(duì)所述DC進(jìn)行可變的加載。例如，當(dāng)發(fā)生疫苗接種所用的肽之一過(guò)度刺激或?qū)λ鲭闹划a(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)時(shí)，可以在加載中去除這種肽。
令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了發(fā)現(xiàn)冷凍DC的合適方法，改變立即冷凍參數(shù)例如冷凍介質(zhì)和冷卻速率和在解凍后立即測(cè)定存活率是不夠的。這種立即存活率不一定對(duì)應(yīng)于在無(wú)細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)數(shù)天的新鮮制備DC的存活率。
而是，在冷凍之前所用的成熟方法或成熟刺激物也對(duì)所述細(xì)胞存活率起重要作用。因此，本發(fā)明也基于這樣的一種認(rèn)識(shí)按照本發(fā)明的成熟刺激物不僅導(dǎo)致DC完全成熟，而且產(chǎn)生可以比通過(guò)其它刺激物成熟的DC存活率更佳的DC。迄今為止，由所述冷凍來(lái)看，根本未考慮過(guò)所述成熟刺激物。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使冷凍DC的方法優(yōu)選的良好方法是借助不同的成熟刺激物使DC成熟，然后測(cè)試在不加入任何細(xì)胞因子的情況下在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的存活率作為示值讀數(shù)。使用誘導(dǎo)最具活力的DC的成熟刺激物來(lái)制備DC制劑，然后將所述制劑冷凍。
因此，本發(fā)明的另一方面是發(fā)現(xiàn)冷凍DC的有利條件的方法，其中提供未成熟DC，并且在各種成熟刺激物存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，隨后在有或無(wú)細(xì)胞因子(最好是無(wú)細(xì)胞因子)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，在有或無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1天后測(cè)定存活細(xì)胞的比率，最后確定給出最高DC存活率的成熟刺激物。然后用這種成熟刺激物制備DC，并將所述DC冷凍。最好僅在無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2天、最優(yōu)選在培養(yǎng)至少3天后，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目。
附圖描述

圖1顯示了冷凍容器中的細(xì)胞濃度對(duì)解凍后DC收率的影響。從健康成人的白細(xì)胞提取產(chǎn)物制備成熟DC，其中首先通過(guò)在GM-CSF+IL-4中培養(yǎng)6天，將貼壁單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲闯墒霥C，然后用由TNFα+IL-1β+IL-6+PGE2組成的四組分混合劑(參見(jiàn)實(shí)施例1)培養(yǎng)1天使其成熟。將成熟(第7天)DC以-1℃/min的冷凍速率，在純自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中以不同的細(xì)胞密度(DC數(shù)目/ml)冷凍。在使所述成熟DC解凍后，立即(＝d7)和在培養(yǎng)數(shù)天(1天后＝d8，2天后＝d9等)后，測(cè)定活DC的收率(以冷凍DC數(shù)目的百分率表示)。后一種測(cè)定在完全培養(yǎng)基中但在不加入GM-CSF或IL-4的情況下進(jìn)行，因?yàn)檫@種硬“洗出試驗(yàn)”是一種已經(jīng)建立的確定DC是否實(shí)際完全成熟和穩(wěn)定的方法。以10×106成熟DC/ml冷凍，得到最佳結(jié)果(第7天時(shí)p＜0.05，在所有其它天時(shí)p＜0.01；n＝3)。
圖2顯示了各種冷凍介質(zhì)對(duì)再解凍后DC收率的影響。如圖1的圖解說(shuō)明中所述制備DC，將等分樣品以10×106DC/ml的濃度在HSA+10％DMSO、自體血清+10％DMSO以及自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖(終濃度)中冷凍。如關(guān)于圖1所述的方法測(cè)定冷凍和再解凍后的DC收率。在自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中冷凍，得到最佳結(jié)果(第8天時(shí)p＜0.05；n＝4)。
圖3顯示了與“洗出試驗(yàn)”中冷凍和再解凍的DC相比的新鮮DC的存活率。如關(guān)于圖1所述方法制備成熟d7 DC，然后新鮮制備所述DC以及冷凍(-1℃/min)，在純自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中，細(xì)胞密度為10×106DC/ml)并且在液氮?dú)庀嘀匈A存3小時(shí)以上后再解凍。如在圖1中所述，DC在無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中(“洗出試驗(yàn)”)培養(yǎng)數(shù)天。活DC的收率以第7天時(shí)占接種到各孔中的DC總數(shù)的百分比表示。在新鮮制備的DC和冷凍/解凍DC之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(n＝4)。
圖4表明，所述冷凍和再解凍沒(méi)有改變成熟DC的特征性形態(tài)。如圖1中所述制備的成熟d7 DC或者立即再進(jìn)一步培養(yǎng)2天，或者在冷凍、在也到液氮?dú)庀嘀匈A存至少3小時(shí)然后再解凍后進(jìn)一步培養(yǎng)。甚至在無(wú)細(xì)胞因子(“洗出試驗(yàn)”)的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)后，未冷凍DC(左圖)和冷凍/再解凍DC(右圖)都保持穩(wěn)定的非貼壁細(xì)胞。
圖5表明，所述冷凍和再解凍沒(méi)有改變成熟DC的特征性表型。通過(guò)FACS分析，分析如關(guān)于圖1所述的方法新鮮制備的成熟d7 DC的表型(新鮮DC，第7天)。將等分樣品冷凍，在液氮?dú)庀嘀匈A存至少3小時(shí)，再解凍，隨后立即(冷凍/再解凍d7 DC)或者在無(wú)細(xì)胞因子(“洗出試驗(yàn)”)的情況下再培養(yǎng)3天后(冷凍/再解凍d10 DC)，測(cè)定其表型。甚至在除去細(xì)胞因子和再培養(yǎng)3天后，冷凍/再解凍成熟d7 DC仍保持成熟DC的特征性表型(CD14-，CD83均一的++)。
圖6表明，所述冷凍和再解凍沒(méi)有改變成熟DC在初次同種異體MLR(“混合白細(xì)胞反應(yīng)”)中的刺激能力。如關(guān)于圖1所述方法制備成熟d7 DC，新鮮制備的未冷凍DC的同種刺激功效與等份的已經(jīng)經(jīng)過(guò)冷凍和再解凍(在液氮中貯存3小時(shí)后)的這些DC的同種刺激功效相當(dāng)。
圖7表明，所述冷凍和再解凍沒(méi)有改變成熟DC誘導(dǎo)強(qiáng)IMP特異性CTL應(yīng)答的能力。給新鮮制備的或冷凍/再解凍的HLA-A2.1+成熟d7 DC加載流感病毒基質(zhì)肽(＝IMP)GILGFVFTL(SEQ ID NO1)或者不經(jīng)超聲處理，然后不添加任何細(xì)胞因子用自體CD8+T細(xì)胞(T∶DC之比＝10∶1)培養(yǎng)。另外，純化CD8+T細(xì)胞在無(wú)DC±加入IMP的情況下培養(yǎng)。7天后，收獲所述T細(xì)胞，用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測(cè)定，檢查其細(xì)胞學(xué)活性。經(jīng)過(guò)或未經(jīng)10μg/ml IMP脈沖處理的T2細(xì)胞用作靶細(xì)胞。
圖8表明，所述冷凍和再解凍沒(méi)有改變成熟DC誘導(dǎo)強(qiáng)IMP特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(HLA-A2.1/肽四聚體分析)的能力。給新鮮制備的或冷凍/再解凍的HLA-A2.1+成熟d7 DC加載IMP(就冷凍/再解凍細(xì)胞而言，在冷凍之前或解凍之后)，或者所述細(xì)胞不經(jīng)超聲處理而在不添加任何細(xì)胞因子的情況下與自體PBMC的非貼壁部分(PBMC∶DC之比＝30∶1)共同培養(yǎng)7天后，收獲所述細(xì)胞，用HLA-A2.1/IMP四聚體(X軸)和抗CD8(Y軸)雙染色。對(duì)于新鮮DC和冷凍DC而言，IMP-肽特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)充(在該圖中以四聚體結(jié)合CD8+T細(xì)胞的百分比表示)相當(dāng)。在冷凍之前或解凍之后給DC加載沒(méi)有產(chǎn)生差異。
圖9表明，與CD40L接觸進(jìn)一步提高了解凍DC的存活率。如關(guān)于圖1所述方法制備成熟d7-DC。在解凍后，加入可溶性初級(jí)(primary)CD40L(100ng/ml)達(dá)4小時(shí)，然后洗滌DC，并且如圖3的圖解說(shuō)明中所述在無(wú)細(xì)胞因子(“洗出試驗(yàn)”)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天。立即(＝d7)和在培養(yǎng)數(shù)天(1天后＝d8，2天后＝d9等)后，測(cè)定活DC的收率(以冷凍DC的百分率表示)。用CD40L處理DC，得到提高的存活率，尤其是在進(jìn)一步培養(yǎng)2天之后(第10天和第11天p＜0.01；n＝5)。
圖10表明，可以在冷凍之前給DC成功地加載蛋白質(zhì)抗原。通過(guò)的第6天加入模型抗原破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)(10μg/ml)，在未成熟期中對(duì)DC進(jìn)行脈沖處理。然后在第7天收獲成熟DC，并如圖3的圖解說(shuō)明中所述將其冷凍。TT脈沖處理的冷凍DC同新鮮制備的TT脈沖處理的成熟DC一樣，具有刺激性。
圖11表明，可以在冷凍之前給DC成功地加載蛋白質(zhì)抗原?；蛘咴诶鋬鲋盎蚪鈨鲋?，給冷凍/解凍(參見(jiàn)圖3)的HLA-A2.1+成熟d7DC加載melan-A類(lèi)似肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO2)，或者所述細(xì)胞不經(jīng)超聲處理而在不添加任何細(xì)胞因子的情況下與自體PBMC的非貼壁部分(PBMC∶DC之比＝20∶1)共同培養(yǎng)7天后，收獲所述細(xì)胞，用HLA-A2.1/Melan-A四聚體(X軸)和抗CD8(Y軸)雙染色。對(duì)于在冷凍之前或者在解凍之后已經(jīng)加載的冷凍DC而言，Melan-A-肽特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)充(在該圖中以四聚體結(jié)合CD8+T細(xì)胞的百分比表示)相當(dāng)。也參見(jiàn)圖8。
圖12顯示了實(shí)施例6中所述的在接種疫苗的患者體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)KLH的輔助細(xì)胞1型應(yīng)答。
圖13-15顯示了實(shí)施例7的結(jié)果。
圖16顯示了實(shí)施例8實(shí)驗(yàn)建立的圖解說(shuō)明。在圖17和18中總結(jié)了實(shí)施例8的結(jié)果。
圖17A顯示了加載腫瘤細(xì)胞裂解液或壞死腫瘤細(xì)胞并且隨后冷藏后的DC總數(shù)。
圖17B顯示了加載腫瘤細(xì)胞裂解液或壞死腫瘤細(xì)胞并且隨后冷藏后的DC的同種刺激功效。
圖17C顯示了腫瘤加載和冷藏后FACS分析的結(jié)果。
圖18A顯示了加載凋亡腫瘤細(xì)胞并且隨后冷藏后的DC總數(shù)測(cè)定結(jié)果。
圖18B顯示了加載凋亡MEL 526黑素瘤細(xì)胞并且隨后冷藏后的DC的同種刺激功效。
圖18C顯示了在冷藏之前和之后Mage-1肽脈沖處理的DC上MAGE-1/HLA-A1 Ag表達(dá)的FACS分析結(jié)果。
圖18D顯示了以不同方式加載的DC上在冷藏之前和之后MAGE-1/HLA-A1復(fù)合體表達(dá)(通過(guò)抗MAGE-1/HLA-A1復(fù)合體的抗體檢測(cè))的比較。
圖19顯示了實(shí)施例9實(shí)驗(yàn)建立的圖解說(shuō)明，其中比較了冷藏或未冷藏的腺病毒感染的樹(shù)突細(xì)胞。在圖20-23中總結(jié)了實(shí)施例9的結(jié)果。
圖20顯示了冷藏后腺病毒感染的樹(shù)突細(xì)胞的回收率。腺病毒-GFP感染的DC在冷凍和再解凍后的回收率與經(jīng)模擬處理(未轉(zhuǎn)染的)DC的回收率相當(dāng)。
圖21冷藏后腺病毒感染的樹(shù)突細(xì)胞的CD4 T細(xì)胞刺激活性?？梢钥闯觯洳貨](méi)有改變腺病毒感染的DC的同種刺激活性。
圖22A和22B表明，在冷藏或未冷藏的腺病毒感染的DC中觀(guān)察到相似的表型。
圖23A和23B顯示了冷藏或未冷藏的腺病毒感染的DC的表型。
圖24圖示了與冷藏或未冷藏的RNA電穿孔DC相比的實(shí)施例10的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。結(jié)果總結(jié)于圖25-27中。
圖25表明，EGFP-RNA電穿孔DC冷藏后的回收率與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的回收率相似。
圖26表明，冷藏沒(méi)有改變EGFP-RNA轉(zhuǎn)染DC的同種刺激能力。
圖27表明，RNA轉(zhuǎn)染的DC的表型與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的所述表型相似。
圖28顯示了可以用于本發(fā)明方法中的MHCI類(lèi)和II類(lèi)限制的黑素瘤和流感病毒肽?？s寫(xiě)AS＝氨基酸，NT＝核苷酸，NP＝核蛋白，ana*＝類(lèi)似肽a頻率最高的DR4亞型，大約80％b頻率最高的DR4亞型，大約80％c迄今為止，已經(jīng)描述了30種不同的HLA DR13等位基因。顯示了DRB1*1301和DRB1*1302的限制，DRB1*1301和DRB1*1302結(jié)合在一起占DR13等位基因的80％。有可能其它DR13等位基因也呈遞所述肽。d所述表位由這第二種HLA DP4等位基因的呈遞不如等位基因DPB1*0401有效。
以下實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但對(duì)本發(fā)明并沒(méi)有任何的限制。實(shí)施例1測(cè)定新鮮制備的未成熟DC和用不同成熟刺激物成熟的DC的存活率。
測(cè)試以下不同的成熟刺激物-單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基，如已描述的制備和使用(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)；-10ng/ml TNFα；-10ng/ml TNFα+1μg/ml PGE2；-10ng/ml TNFα+10ng/ml IL-1β+100U/ml IL-6+1μg/ml PGE2(“成熟混合劑”)；-至多1.0μg/ml馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌(Salmonella abortus equi)的LPS；-雙鏈RNA(poly-IC，20μg/ml)；-50-1000ng/ml CD40L。
從PBMC制備單核細(xì)胞衍生DC作為完全培養(yǎng)基，使用具有20μg/ml慶大霉素、2mM谷氨酰胺和1％熱失活(56℃，30分鐘)的人自體血漿的RPMI 1640。按照已描述的方法，從健康細(xì)胞提取供體制備白細(xì)胞提取產(chǎn)物，作為單核細(xì)胞分離產(chǎn)物(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。然后在淋巴細(xì)胞制備(lymphoprep)時(shí)，通過(guò)離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，按照已描述的方法，從所述PBMC的粘附塑料的部分制備DC(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。為此，通過(guò)在具有重組人GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得未成熟DC。第6天，向所述DC中加入上述不同的成熟刺激物，第7天，收獲成熟DC，在無(wú)細(xì)胞因子的情況下再進(jìn)一步培養(yǎng)2天。培養(yǎng)2天后的存活率(以接種的DC的百分比)為未成熟DC為38.25％；(IL-1β+IL-6+PGE2+TNFα)成熟的DC為76.2％；TNFα成熟的DC為13.5％；(TNFα+PGF2)成熟的DC為37.0％；(poly-IC)成熟的DC為31.8％；和CD40L成熟的DC為49.6％(在500ng/ml下)。
所述差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。實(shí)施例2成熟(第7天)DC如下冷凍將DC以不同的濃度(5、20、40、60和100×106/ml)重懸于冷凍容器內(nèi)的或者純自體血清或者20％人血清白蛋白(HSA；由補(bǔ)充200g人血漿蛋白與至少95％白蛋白的1000ml電解質(zhì)溶液構(gòu)成；DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg，Baden-Baden，Germany)中。將所形成的DC懸浮液與下文所述的不同冷凍溶液以1∶1混合，然后立即轉(zhuǎn)移到1.0ml或1.8ml冷凍容器中。此后，立即將容器在“低溫冷凍容器(Cryo Freezing Container)”(Nalgene Cryo1℃Freezing Container，冷卻速率-1℃/ml)冷卻至-80℃，最后轉(zhuǎn)移到液氮?dú)庀嘀?，在此將其保持至多?shù)月。a)冷凍介質(zhì)-HSA+DMSO±葡萄糖[由20％HSA溶液(參見(jiàn)上文)+10、15、20和25％(v/v)DMSO±葡萄糖(Glukosteril 40％TM，F(xiàn)resenius，Germany，有效成分葡萄糖一水合物)構(gòu)成，以2％、4％、6％、10％、20％或30％(v/v)加入]；-血清+DMSO±葡萄糖[由純自體血清+20％(v/v)DMSO±葡萄糖構(gòu)成，以2％、4％、6％、10％、20％或30％加入]；-紅細(xì)胞冷凍液(Erythrocyte Freezing SolutionTM)[Erythrocyte
Freezing SolutionTM(Fresenius，Dreieich，Germany)，由38％甘油、2.9％山梨醇和0.63％氯化鈉的無(wú)菌水溶液構(gòu)成]；-細(xì)胞加工液(Cell Processing SolutionTM)+DMSO(Fresenius，Dreieich，Germany，由6％羥乙基淀粉在0.9％氯化鈉中的溶液構(gòu)成，通常用于紅細(xì)胞的沉降)+10％或15％(v/v)DMSO。b)解凍條件對(duì)于使冷凍成熟(第7天)DC解凍，檢查以下四種方法1.使DC在56℃水浴中解凍，然后不經(jīng)洗滌，于37℃和5％CO2下，在Teflon培養(yǎng)皿(Rotilabo boxes，Roth，Karlsruhe，Germany)內(nèi)的10-20ml冰冷的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充800 U/ml GM-CSF和500 U/ml IL-4)中孵育2小時(shí)，然后收獲DC，并且以150×g于22℃離心10分鐘。隨后，對(duì)所述細(xì)胞計(jì)數(shù)，再次接種到Teflon培養(yǎng)皿上的具有GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中(細(xì)胞密度1×106/ml)，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，收獲細(xì)胞以供進(jìn)一步使用。
2.如1中所述，在Teflon培養(yǎng)皿上于37℃和5％CO2下2小時(shí)的靜息期后，使冷凍成熟(第7天)DC解凍，收獲細(xì)胞(以150×g，22℃下離心10分鐘)以供進(jìn)一步使用。
3.如1中所述，在組織培養(yǎng)皿(Falcon Becton Dickinson Labware，New Jersey，USA)上于37℃和5％CO2下2小時(shí)的靜息期后，使冷凍成熟(第7天)DC解凍，收獲細(xì)胞(以150×g，22℃下離心10分鐘)以供進(jìn)一步使用。
4.使冷凍成熟(第7天)DC在56℃水浴中解凍，然后加入到10ml冰冷的“Hank氏平衡鹽溶液”(Bio Whitaker)中，立即于4℃以133g離心12分鐘。隨后，收獲細(xì)胞以供進(jìn)一步使用。c DC存活率的確立通過(guò)在未添加GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少4天以上(＝“洗出試驗(yàn)”)，檢查冷凍和再解凍DC的存活率，將其與按照已描述的方法(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)從未冷凍或冷凍的等份PBMC中新鮮制備的DC的存活率相比。用細(xì)胞計(jì)數(shù)器(CassyCell Counter and Analyser System，Model TT，Scharfe System，Reutlingen，Germany；該系統(tǒng)使用“脈沖面積分析”并且允許測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞大小和體積以及是否存在活細(xì)胞)，并且也通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)錐蟲(chóng)藍(lán)染色作為對(duì)照，測(cè)定活DC的相應(yīng)量。
首先，檢查DC濃度的影響，其中以10×106成熟DC/ml冷凍，得到最佳結(jié)果。結(jié)果示于圖1中。
其次，檢查DMSO濃度(5-12.5％v/v終濃度)的影響。DMSO濃度的變化對(duì)解凍DC的存活率沒(méi)有顯著性影響。
下一步，檢查HSA或純自體血清是否得到更好的存活率，以及添加葡萄糖(終濃度1％、2％、3％、5％、10％和15％v/v)是否提高存活率。結(jié)果示于圖2中。如果HSA被自體血清所替代，則數(shù)天后DC的存活率可再現(xiàn)地提高。以5％(v/v)的終濃度加入葡萄糖，進(jìn)一步改善了所述結(jié)果。
也檢查了各種市售的冷凍介質(zhì)例如Erythrocyte FreezingSolutionTM或Cell Processing Solutin Freseniu)。然而，與已經(jīng)測(cè)試的所述冷凍介質(zhì)相比，這些冷凍介質(zhì)得到結(jié)果較差。
此外，檢查了在b)下所述的各種解凍條件，以將在解凍后所述細(xì)胞經(jīng)歷的逆境減至最小。所測(cè)試的四種方法中沒(méi)有一種顯示出明顯優(yōu)于其它方法。
成熟(第7天)DC如實(shí)施例1中所述方法制備，并且在以下條件下冷凍冷卻速率1℃/min，在純自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中，細(xì)胞密度10×106/ml。在液氮?dú)庀嘀匈A存至少3小時(shí)后，將細(xì)胞解凍。解凍后，直接測(cè)定活DC的百分比(＝D7)。接種等份的DC，如實(shí)施例1c)中所述，在無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基(“洗出試驗(yàn)”)中培養(yǎng)至多4天后，測(cè)定存活率(n＝20)。結(jié)果示于下表中。
在解凍(第7天)和在“洗出試驗(yàn)”(第8-11天)后冷凍/解凍DC的收率。
實(shí)施例3在存活率和T細(xì)胞刺激活性方面，最佳成熟和冷凍的DC等同于新鮮制備的DC。
a)首先，檢查冷凍和再解凍DC的存活率是否與從同一供體新鮮制備的DC的存活率相當(dāng)。因此，如實(shí)施例2)中所述使用“洗出試驗(yàn)”。結(jié)果示于圖3中。發(fā)現(xiàn)在解凍的DC和從同一供體新鮮制備的DC之間沒(méi)有差異。
此外，解凍DC的形態(tài)和表型可與新鮮制備的DC相比。用倒置顯微鏡(Leika DM IRB，Leika Mikroskopie und Systeme GmbH，Wetzler，Germany)檢查細(xì)胞的形態(tài)，并通過(guò)照相術(shù)記錄。用一系列單克隆抗體檢查并且在FACScan設(shè)備(Becton Dickinson，New Jersey，USA)上，如已描述的方法(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)檢查細(xì)胞群體的表型。死細(xì)胞由于其散射光的特性而被分選出。結(jié)果示于圖4和圖5中。冷凍和再解凍DC在數(shù)天內(nèi)保持其特征性形態(tài)特性及其表型。
b)然后，也檢查再解凍DC是否也保持其功能特性。
1.因此，檢查再解凍DC是否可以與新鮮制備的未冷凍成熟DC一樣有效地誘導(dǎo)初次同種異體MLR。該試驗(yàn)如已描述的方法進(jìn)行(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。以直至2×105同種異體T細(xì)胞/孔的分級(jí)劑量，將DC加入到平底96孔板中，在RPMI 1640(補(bǔ)充慶大霉素、谷氨酰胺和5％同種異體熱失活人血清(混合血清))中共同培養(yǎng)4-5天，通過(guò)在共同培養(yǎng)的最后12-16小時(shí)內(nèi)加入3H-胸苷(4μCi終濃度/ml)，測(cè)定增殖。結(jié)果示于圖6中。冷凍和再解凍DC與新鮮制備的成熟DC一樣有效地誘導(dǎo)初級(jí)同種異體MLR。
2.也檢查冷凍和再解凍DC可以有多有效地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。為此，測(cè)量了IMP脈沖處理的成熟DC對(duì)IMP(流感病毒基質(zhì)肽)特異性CTL的誘導(dǎo)。這種方法當(dāng)在無(wú)T細(xì)胞輔助和外源IL-2的情況下進(jìn)行時(shí)，對(duì)于成熟DC是特異性的。通過(guò)刺激純化CD8+T細(xì)胞(按照供應(yīng)商的說(shuō)明，用磁性細(xì)胞分選/MACS和CD8微珠，從PBMC中分離的，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，或者在具有DC的非貼壁PBMC部分(從來(lái)自HLA-A2.1+供體的自體PBMC制備)的其它實(shí)驗(yàn)中，實(shí)現(xiàn)流感病毒基質(zhì)A2.1肽(IMP)或Melan-AA2.1肽特異性的CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)，其中所述具有DC的非貼壁PBMC部分在不加入細(xì)胞因子的情況下，用HLA-A2.1限制的IMP(GILGFVFTL[SEQ ID NO1]，10μM，于37℃1小時(shí)，以1×106DC/ml的完全培養(yǎng)基)脈沖處理或者用Melan-A類(lèi)似肽(ELAGIGILTV[SEQ IDNO2]，10μM)以1∶10或1∶30的DC/T比脈沖處理7天，或者未經(jīng)所述脈沖處理。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)裂解測(cè)定(Bhardwaj等(1994)J.Clin.Invest.94，797)，或者通過(guò)于37℃四聚體染色(Whelan等(1999)J.Immunol.163，4342)，對(duì)CTL定量。以不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定的靶細(xì)胞，是IMP脈沖處理(10μg/ml，37℃，1小時(shí))的T2A1細(xì)胞、未經(jīng)脈沖處理的T2A1細(xì)胞和K562靶細(xì)胞(所有細(xì)胞都用51Cr標(biāo)記)。所有實(shí)驗(yàn)以80倍過(guò)量的K562細(xì)胞進(jìn)行，以便阻斷自然殺傷細(xì)胞活性。用公式(特異性釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)×100，計(jì)算特異性裂解(％)。制備可溶性IMP和Melan A/HLA A2.1四聚體，如已描述的方法(Whelan等，1999)采用流式細(xì)胞術(shù)，于37℃分析T細(xì)胞的生成。將1μl四聚體(0.5-1mg/ml)加入到約60μl(在離心和傾注上清液后在容器中剩下的體積)培養(yǎng)基中的2×106細(xì)胞中于37℃達(dá)15分鐘，所述培養(yǎng)基由補(bǔ)充慶大霉素、谷氨酰胺和5％同種異體熱失活人血清(混合血清)的RPMI 1640構(gòu)成。隨后，不經(jīng)洗滌，將細(xì)胞冷卻，并在冰上與抗人CD8的三重染色單克隆抗體(Caltag Laboratories，Burlingame，California)一起孵育15分鐘。在3個(gè)洗滌步驟之后，在FACScan設(shè)備(Becton Dickinson)上分析細(xì)胞。
結(jié)果示于圖7和圖8中。
DC的冷凍和解凍并不改變成熟DC誘導(dǎo)強(qiáng)IMP特異性CTL反應(yīng)的能力。此外，所述冷凍和解凍也沒(méi)有改變成熟DC誘導(dǎo)強(qiáng)IMP特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力，如HLA-A2.1/肽四聚體分析所示。
這些實(shí)驗(yàn)表明，在冷凍和解凍后，獲得與新鮮制備的DC絕對(duì)等同的活DC。實(shí)施例4為了達(dá)到提高的冷凍和再解凍DC的存活率，將以下不同的抗凋亡刺激物以不同的濃度和在不同時(shí)間加入到所述DC中1.重組鼠或人三聚體TRANCE(Wong等(1997)J.Exp.Med.
186，2075)，以100、200、500ng/ml加入；2.RANKL(Anderson等(1997)Nature 390，175)，以10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和1μg/ml加入；3.可溶性三聚體CD40L(Morris等(1999)J.Biol.Chem.274，418)，以50、100和500ng/ml加入。
所述DC于37℃經(jīng)過(guò)所述不同的抗凋亡刺激物在冷凍前培養(yǎng)的最后12-16小時(shí)過(guò)夜處理、在冷凍前處理4小時(shí)(細(xì)胞密度1×106，在具有GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中)、以及在解凍后處理4小時(shí)(細(xì)胞密度1×106，在具有GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中)。
將解凍DC短暫暴露于所述抗凋亡刺激物，與在冷凍前處理DC一樣有效，達(dá)到提高的存活率，然而通常在“洗出試驗(yàn)”中僅在3天后可見(jiàn)。然而，CD40L(圖9)和TRANCE/RANKL(結(jié)果未顯示)得到相似的結(jié)果。結(jié)果表明，加入CD40L或TRANCE/RANKL將DC的存活率提高至超過(guò)第3天。實(shí)施例5為了檢查是否可以在冷凍前成功地給DC加載抗原，給DC加載破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)(作為蛋白質(zhì)抗原的例子)或IMP(作為模型肽)。對(duì)于用TT脈沖處理，從得自白細(xì)胞提取產(chǎn)物的新鮮的或冷凍的等份PBMC制備DC(參見(jiàn)上文)。在第5天將10μg/ml TT加入所述未成熟細(xì)胞中。第7天收獲成熟DC，所述DC或者不冷凍，或者在冷凍和解凍后(4小時(shí)后)，檢查其在PBMC中誘導(dǎo)TT特異性增殖反應(yīng)的能力。因此，將分級(jí)劑量的未經(jīng)脈沖處理和TT脈沖處理的DC加入到PBMC中(10×104/孔)，在第5天，按照已描述的方法用3H-胸苷脈沖處理(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。對(duì)于加載IMP，或者在冷凍之前，或者在解凍之后，DC用10μM肽脈沖處理(1小時(shí)，37℃，1×106DC/ml完全培養(yǎng)基)。如上所述測(cè)試成功呈遞IMP的能力。
冷凍的TT脈沖處理DC具有與新鮮制備的TT脈沖處理DC相同的刺激特性(圖10)。兩種DC都在冷凍前加載了IMP或Melan A，在解凍后加載的那些DC同樣好地刺激IMP特異性CTL或Melan-A特異性CTL(圖8和圖11)。這些結(jié)果表明，有可能制備已經(jīng)加載抗原并且在解凍后可以立即使用的等份冷凍成熟DC。實(shí)施例6對(duì)IV期黑素瘤患者，用按照本文所示方法制備和加載抗原的加載肽和加載蛋白質(zhì)的DC進(jìn)行疫苗接種。圖12表明在所有接種的患者體內(nèi)都誘導(dǎo)了抗KLH的輔助細(xì)胞1型應(yīng)答。每位患者都接受一次4×106成熟DC和本申請(qǐng)中所述的成熟組合物(例如圖1和圖3)的皮下給藥，所述成熟DC是用GM-CSF和白介素-4從白細(xì)胞提取產(chǎn)物制備的。為此，同時(shí)加入10μg/ml的濃度的對(duì)照抗原KLH和所述成熟組合物，然后分成多份冷凍所述DC。在接種前和所述4×106DC的一次給藥后14天，取血，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Elispot測(cè)定進(jìn)行檢查(加入10μg/ml KLH至500,000 PBMC中，并測(cè)量產(chǎn)生干擾素-γ或IL-4的細(xì)胞數(shù)；未加入KLH的背景幾乎為0)。發(fā)現(xiàn)在接種之前，在KLH呈遞時(shí)，沒(méi)有產(chǎn)生干擾素-γ或白介素-4，而在一次接種加載KLH的DC后14天，在所有患者體內(nèi)都誘導(dǎo)了產(chǎn)生干擾素-γ、但不產(chǎn)生白介素-4或僅產(chǎn)生極少量的T細(xì)胞(在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)從PBMC取出CD4細(xì)胞表明，所述反應(yīng)性細(xì)胞是CD4陽(yáng)性輔助性T細(xì)胞)。實(shí)施例7來(lái)自實(shí)施例6研究的一位患者接受了數(shù)次DC接種，其中4×106的每種再解凍DC加載了在圖13、14或1 5中所述的肽(即分別為每4×106DC僅一種肽)，并且經(jīng)皮下注射。分別在第一次接種之前和各個(gè)后續(xù)接種后14天、以及在下一次接種的臨接種前，取血，并且如Thurner等(1999)J.Exp.Med.190，1669-1678的材料和方法中所述的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Elispot測(cè)定。用于接種的DC如圖8和圖11的圖面說(shuō)明中以及實(shí)施例5中所述的方法制備，并且僅在解凍后加載相應(yīng)的肽。正如從圖13-15中可以看出的，誘導(dǎo)了針對(duì)幾種I類(lèi)肽(圖13和圖14)和II肽(圖15)的免疫。從表I可以看出所使用肽的特征。注意到，所述特定患者的HLA型為HLA-A2.1+和HLA-A3+以及HLA-DR 13+、HLA-DP4+(但為DR4-)。圖13表明在一次接種后，誘導(dǎo)了針對(duì)流感病毒肽NP-A3和IMP-A2的免疫(#2是指取血并且在給予第二次疫苗接種之前不久進(jìn)行Elispot測(cè)量)，并且顯示了在另一次接種后免疫增強(qiáng)，但對(duì)于未用于接種的EBV-A2和IV-9-A2肽沒(méi)有變化。圖14表明誘導(dǎo)了針對(duì)4種I類(lèi)限制的腫瘤肽、明顯且明確針對(duì)Melan A-A2.1肽的免疫。圖15表明誘導(dǎo)了針對(duì)兩種II類(lèi)限制的腫瘤肽(Mage 3-DR13和Mage 3-DP4)的免疫，但沒(méi)有誘導(dǎo)針對(duì)酪氨酸酶-DR4和GP 100 DR4(這是陰性對(duì)照，因?yàn)樗龌颊呤荄R4陰性的，因此所述DC不能加載這些肽)的免疫。實(shí)施例8在用腫瘤細(xì)胞制劑(腫瘤細(xì)胞裂解液、壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞)進(jìn)行抗原加載后樹(shù)突細(xì)胞的冷藏可以從白細(xì)胞提取法中，大量產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞(DC)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了允許分次使用這些細(xì)胞來(lái)接種的冷藏成熟DC的方法。迄今為止，成熟DC在使用前加載對(duì)應(yīng)于腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的免疫優(yōu)勢(shì)序列的肽。在此處所述實(shí)驗(yàn)中(參見(jiàn)圖16)，檢查加載了不同腫瘤細(xì)胞制劑并且隨后成熟的未成熟DC是否也可以冷藏。
腫瘤細(xì)胞制劑為了制備腫瘤細(xì)胞制劑，使用Me1526黑素瘤細(xì)胞系。Me1526細(xì)胞用RPMI洗滌，通過(guò)重復(fù)于57℃加熱和隨后在液氮中冷卻來(lái)處理。然后，借助超聲裝置破碎所述細(xì)胞材料。由于加熱/冷凍循環(huán)誘導(dǎo)壞死，所以含有所有細(xì)胞組分的這種腫瘤細(xì)胞制劑在下文中被稱(chēng)為壞死細(xì)胞材料。為了獲得裂解液，我們?cè)谶@些步驟之后進(jìn)行了超離心，以除去細(xì)胞組分，并且在Centricon離心管中進(jìn)行所述蛋白質(zhì)的純化。根據(jù)Bradford分析的結(jié)果，我們使用具有較高活性的蛋白質(zhì)部分，即≥10kDa的蛋白質(zhì)部分。凋亡腫瘤細(xì)胞用寬范圍的UVB輻射裝置誘導(dǎo)，并且用AnnexinV試驗(yàn)證實(shí)。
DC的產(chǎn)生按照實(shí)驗(yàn)性免疫治療中所用的技術(shù)，從白細(xì)胞提取法產(chǎn)生DC。將PBMC接種到Nunc Cell Factories中，用補(bǔ)充1000 IU/mlGM-CSF和500 IU/ml IL-4的RPMI(1％自體熱失活血漿)培養(yǎng)。第5天，使用未成熟的DC，然后用所述的腫瘤細(xì)胞制劑以1∶1的濃度加載4小時(shí)。
加載在5ml聚丙烯反應(yīng)容器中于37℃和5％CO2下進(jìn)行加載。加載后，將所述DC接種到12ml組織培養(yǎng)皿中，用由TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2構(gòu)成的成熟混合劑培養(yǎng)24小時(shí)。
冷凍/解凍按照已描述的方法(Feuerstein B.等，J.Immunol.Methods 24515-29(2000))，將一半相應(yīng)加載的DC分別在1.8ml Nunc冷凍小瓶中于-80℃冷藏3小時(shí)。此后，按照所述已描述的方法將所述細(xì)胞再次解凍，并且于37℃和5％CO2下在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)。隨后，分析DC的該部分以及未冷凍的部分，并用于其它實(shí)驗(yàn)中。
所述的實(shí)驗(yàn)建立在圖16中以流程表顯示。
細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力在進(jìn)行所述加載和冷藏后，用錐蟲(chóng)藍(lán)和顯微鏡，確定所述DC的總細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力。最初，使用5×105DC。我們發(fā)現(xiàn)與未冷藏細(xì)胞相比相當(dāng)?shù)募?xì)胞計(jì)數(shù)以及加載且冷藏的DC的活力沒(méi)有差異(圖17A、18A)。可以觀(guān)察到，加載使細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，但冷藏沒(méi)有使細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，尤其是使用壞死細(xì)胞時(shí)。
功能性為了測(cè)試功能能力，進(jìn)行混合白細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)(MLR)。在同種異體MLR中使用加載DC(與同種異體白細(xì)胞一起孵育4天)，然后用放射性胸苷(3H-胸苷)脈沖處理13小時(shí)。對(duì)于冷藏和未冷藏加載DC而言，獲得了相當(dāng)?shù)耐N刺激功效(圖17B、18B)。
表型為了評(píng)價(jià)與抗原呈遞相關(guān)的表面分子的表達(dá)和所述DC的功能條件，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行FACS分析。對(duì)于不同加載方法和在冷藏后，都發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)?shù)谋砻姹磉_(dá)模式(圖17C)。
直接抗原檢測(cè)為了直接檢測(cè)腫瘤抗原，使用識(shí)別HLA-A1環(huán)境(即Mage-1肽和HLA-A1分子的復(fù)合體)中的MAGE-1的抗體。不同加載的DC用該抗體染色，并且在FACS中分析。當(dāng)使用加載肽(20μgMAGE-1肽3小時(shí)/ml)的DC時(shí)，發(fā)現(xiàn)在冷藏后，可以檢測(cè)到一定百分比的MAGE-1/A1抗原，所述百分比與未冷藏時(shí)檢測(cè)的百分比相當(dāng)(圖18C)。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)可以斷定，所述冷藏并不導(dǎo)致抗原的損失。
在另一實(shí)驗(yàn)中，用MAGE-1/A1抗體測(cè)定不同加載方法的效力。用所述腫瘤細(xì)胞制劑(所用的黑素瘤細(xì)胞系表達(dá)Mage-1抗原)，可以達(dá)到顯著的加載，達(dá)到所述肽脈沖處理的大約20％的抗原密度(圖18D)?？梢砸韵喈?dāng)?shù)牧繖z測(cè)到冷藏前后MAGE-1/HLA-A1復(fù)合體的表達(dá)(相對(duì)于未加載DC的背景計(jì)算為陽(yáng)性)。
結(jié)論也可以表明，本發(fā)明的方法不僅允許有效地冷藏未加載DC或加載肽或蛋白質(zhì)的DC(如實(shí)施例1-7所示)，而且也允許同樣有效地冷藏加載(腫瘤)細(xì)胞制劑(簡(jiǎn)單的壞死腫瘤細(xì)胞、從腫瘤細(xì)胞制備的裂解液、或者凋亡腫瘤細(xì)胞)的DC?！坝行У亍笔侵冈诶鋬鰰r(shí)，i)解凍后與未冷凍DC相比，細(xì)胞的損失≤25％，ii)解凍DC具有與未冷凍DC相當(dāng)?shù)腡細(xì)胞刺激能力(在同種異體MLR中測(cè)試)，和iii)抗原和T細(xì)胞受體的配體(即特異性MHC肽復(fù)合體)的表面表達(dá)在所述冷凍和解凍過(guò)程后得以保留(在一種模型中，通過(guò)借助特異性識(shí)別特定肽/MHC復(fù)合體即MAGE-1/HLA-A1復(fù)合體的單克隆抗體直接檢測(cè)所述復(fù)合體所示的)。實(shí)施例9在借助腺病毒轉(zhuǎn)染加載抗原后冷藏樹(shù)突細(xì)胞可以采用按照本發(fā)明的方法，以這樣的方式冷凍用腺病毒轉(zhuǎn)染的樹(shù)突細(xì)胞，使得樹(shù)突細(xì)胞的特性與未轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞的特性不相上下。為此，成熟DC用含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA的腺病毒載體(AD5)，以500的感染復(fù)數(shù)(MO)感染2小時(shí)。洗滌2次后，將細(xì)胞以10×106DC/ml的濃度在HSA和10％DMSO的5％葡萄糖(終濃度)溶液中冷凍并貯存4小時(shí)。解凍后，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除測(cè)定細(xì)胞活力?；罴?xì)胞的回收率以冷凍DC的百分比示于圖20中。
此外，可以表明，腺病毒感染的DC的同種刺激或性未因冷藏而改變。因此，用adeno-GFP以500的MOI感染成熟DC，并且如上所述進(jìn)行冷藏。在再解凍并且培養(yǎng)24小時(shí)或72小時(shí)后，所述樹(shù)突細(xì)胞與同種異體CD4+T細(xì)胞(2×105/孔)在圖21所述的條件下共同培養(yǎng)。4天后，所述細(xì)胞用[3H]-胸苷脈沖處理16小時(shí)，然后測(cè)定摻入的放射性。在圖21中，顯示了三次計(jì)數(shù)的平均值與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。單獨(dú)的T細(xì)胞或單獨(dú)的DC的所述數(shù)值總是低于1000/min。
此外，如上所述將成熟DC與adeno-GFP以500的MOI一起冷藏。在再解凍和所述的培養(yǎng)時(shí)間后，所述細(xì)胞用CD83、CD25、CD86、CD80特異性抗體、然后用PE綴合的山羊/小鼠IG(Fab’)2片段復(fù)染。結(jié)果示于圖22A中。在使用HLA 1類(lèi)、HLA-DR和CD40特異性抗體的一個(gè)類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中，獲得示于圖22B中的結(jié)果。實(shí)施例10在借助RNA轉(zhuǎn)染加載抗原后冷藏樹(shù)突細(xì)胞可以采用按照本發(fā)明的方法，以這樣的方式冷凍用RNA轉(zhuǎn)染的樹(shù)突細(xì)胞，使得樹(shù)突細(xì)胞的特性與未轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞的特性不相上下。所述DC在未成熟期可以用RNA轉(zhuǎn)染，然后使其成熟，以成熟DC冷凍(未顯示)。最好是用RNA轉(zhuǎn)染已經(jīng)成熟的DC，然后冷藏。結(jié)果總結(jié)于圖25-27中。
因此，成熟的樹(shù)突細(xì)胞用RPMI洗滌2次，在Optimix試劑盒(EQUIBIO，Maidstone Kent，UK)的洗滌溶液中洗滌1次。使DC在Opttimix培養(yǎng)基中的終濃度為40×106DC/ml。然后將0.1ml細(xì)胞懸浮液與40μg體外轉(zhuǎn)錄的EGFp RNA在1.5ml反應(yīng)容器中混合。于室溫孵育最多3分鐘后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)0.4cm間距的電穿孔比色杯中，用Gene PulserII(Biorad，Munich，Germany)以260V的電壓和150μF電容脈沖處理。對(duì)照DC未加RNA而進(jìn)行脈沖處理。將細(xì)胞以10×106DC/ml的濃度在HSA(與10％DMSO和5％葡萄糖(終濃度))中冷凍并貯存4小時(shí)。解凍后，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除測(cè)定細(xì)胞活力?；罴?xì)胞的回收率以冷凍DC的百分比示于圖25中。
在EGFP RNA存在下電穿孔處理成熟DC，并且如上所述進(jìn)行冷藏。在再解凍并且培養(yǎng)48小時(shí)后，所述樹(shù)突細(xì)胞與同種異體CD4+T細(xì)胞(2×105/孔)在圖26所述的條件下共同培養(yǎng)。4天后，所述細(xì)胞用[3H]-胸苷脈沖處理16小時(shí)，然后測(cè)定摻入的放射性。在圖26中，顯示了三次重復(fù)測(cè)定的平均值(與標(biāo)準(zhǔn)偏差)。單獨(dú)的T細(xì)胞或單獨(dú)的DC的所述數(shù)值總是低于1000/min。
RNA電穿孔處理的DC的冷藏，并不改變DC表型標(biāo)記。因此，在有或無(wú)EGFP RNA時(shí)電穿孔處理成熟DC并如上所述冷藏。在再解凍并且培養(yǎng)48小時(shí)后，用圖27中所述的小鼠單克隆抗體和PE綴合的抗小鼠IG(Fab’)2片段復(fù)染，然后進(jìn)行FACS分析。圖27中的右下圖涉及EGFP陽(yáng)性DC，而右上圖涉及EGFP/DC標(biāo)記雙陽(yáng)性DC。
序列表<110>Schuler，Gerold<120>用于生產(chǎn)現(xiàn)成可用的加載抗原或未加載抗原的冷藏成熟樹(shù)突細(xì)胞的方法<130>010589wo/JH/ml<140><141><160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>1Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>Mart1/MelanA類(lèi)似肽(AA 26-35)<400>2Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>流感病毒<400>3Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met1 5 10<210>4<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述gp100類(lèi)似肽，AA 209-217<400>5Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val1 5<210>7<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val1 5 10<210>8<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu1 5<210>9<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val1 5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>10Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>11Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>12Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述酪氨酸酶類(lèi)似肽，AA 243-251<400>14Lys Ser Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>15Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Val Tyr Phe Phe Leu Pro Asp His Leu1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe1 5<210>23<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5 10<210>24<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述酪氨酸酶類(lèi)似肽，AA 450-462<400>24Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Val Pro Asp Ser Phe Gln Asp1 5 10<210>25<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Trp Asn Arg Gln Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp1 5 10 15<210>26<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu1 5 10<210>27<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種制備現(xiàn)成可用的冷藏成熟樹(shù)突細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)提供未成熟的樹(shù)突細(xì)胞(DC)；(b)在含有成熟混合劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟DC以獲得成熟DC，其中所述成熟混合劑具有一種或多種成熟刺激物；(c)在不含任何異種血清的冷凍介質(zhì)中冷凍所述成熟DC。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在所述冷凍之前或在將所述冷凍DC再解凍之后，給所述DC加載抗原或抗原-抗體復(fù)合體。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中(i)所述未成熟DC從CD14+單核細(xì)胞或者從CD34+細(xì)胞制備；和/或(ii)所述未成熟DC直接從血液中分離；和/或(iii)所述未成熟DC或其前體細(xì)胞通過(guò)白細(xì)胞提取法獲得；和/或(iv)所述未成熟DC或其前體細(xì)胞從新鮮血液或骨髓獲得。
4.權(quán)利要求1-3中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述成熟刺激物選自IL-1例如IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素例如PGE2、IFN-α、脂多糖和其它細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)物例如MPL(單磷酰脂質(zhì)A)和脂磷壁酸質(zhì)、磷酸膽堿、鈣離子載體、佛波醇酯例如PMA、熱激蛋白、核苷酸例如ATP、脂肽、Toll樣受體的人工配體、雙鏈RNA例如poly-IC、免疫刺激性DNA序列、CD40配體等，所述培養(yǎng)基或所述成熟混合劑尤其含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα，或者所述成熟混合劑是單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MCM)或補(bǔ)充PGE2的MCM。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述未成熟DC在存在0.1-100ng/mlIL-1β、0.1-100ng/ml IL-6、0.1-10μg/ml PGE2和0.1-100ng/ml TNF-α的情況下培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其特征在于，加入到所述DC中以使其成熟的所述活性物質(zhì)IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα得自所述各種活性物質(zhì)的純化制劑。
7.權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中(i)所述成熟進(jìn)行至少1小時(shí)，最好進(jìn)行至少6小時(shí)；和/或(ii)在所述成熟期間，更換所述培養(yǎng)基中的所述成熟混合劑，和/或?qū)㈩~外的成熟刺激物加入到所述培養(yǎng)基中；和/或(iii)向所述培養(yǎng)基中加入免疫/成熟調(diào)節(jié)劑，尤其是選自IL-10、富馬酸及其酯、霉酚酸mofetil和維生素D3的免疫/成熟調(diào)節(jié)劑。
8.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述冷凍介質(zhì)含有(i)5-25％(v/v)的一種或多種低溫防護(hù)劑，尤其是選自DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯和無(wú)機(jī)鹽的低溫防護(hù)劑，更優(yōu)選DMSO；和/或(ii)2-30％(w/v)的一種或多種多元醇化合物，尤其是選自葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤蘚醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇和D-乳糖的多元醇化合物，更優(yōu)選葡萄糖；和/或(iii)2-90％(w/v)的非異種血清組分，尤其是自體血清或血漿或者同種異體血清或血漿，更優(yōu)選人血清白蛋白、自體血清、同種異體人血清或混合血清。
9.任一前述權(quán)利要求的方法，其特征在于，所述細(xì)胞以5×106至100×106細(xì)胞/ml的濃度冷凍。
10.權(quán)利要求2-9中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中在冷凍之前給所述DC加載抗原或抗原-抗體復(fù)合體。
11.權(quán)利要求2-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中給所述DC加載的所述抗原是一種蛋白質(zhì)或具有至少8個(gè)氨基酸的其片段，將所述蛋白質(zhì)或片段加入到所述培養(yǎng)基中，尤其是以0.01-1000μM的濃度加入，最好同時(shí)在所述培養(yǎng)基中含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α。
12.權(quán)利要求2-10中一項(xiàng)的方法，其中給所述DC加載編碼所述抗原的DNA分子或RNA分子。
13.權(quán)利要求2-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)片段、細(xì)胞或細(xì)胞碎片或核酸序列用作所述抗原-抗體復(fù)合體中的所述抗原，并且所述抗體是IgG或IgE類(lèi)之一。
14.權(quán)利要求1-13中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述DC在冷凍之前或者在再解凍之后，接觸能夠抑制細(xì)胞凋亡的分子，其中所述能夠抑制細(xì)胞凋亡的分子最好選自CD40配體、TRANCE和RANKL。
15.權(quán)利要求1-14中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中超過(guò)所述冷凍DC數(shù)目的75％、最好超過(guò)85％的所述DC在所述DC的所述冷凍和再解凍之后存活。
16.權(quán)利要求1-15中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述方法適用于從成熟冷藏DC制備疫苗。
17.一種發(fā)現(xiàn)冷凍DC的有利條件的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供未成熟DC；(b)在不同成熟刺激物存在下用所述未成熟DC進(jìn)行不同的培養(yǎng)；(c)然后在有或無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述DC，優(yōu)選在無(wú)細(xì)胞因子的情況下進(jìn)行培養(yǎng)；(d)在有或無(wú)細(xì)胞因子的所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1天后，測(cè)定活細(xì)胞的比率；且(e)確立給出最高存活率的成熟刺激物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中在有或無(wú)細(xì)胞因子的所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2天、優(yōu)選至少3天后，測(cè)定所述活細(xì)胞的比率。
19.冷凍的加載抗原的成熟樹(shù)突細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞，所述細(xì)胞可采用權(quán)利要求1-16中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法獲得。
21.一種疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求19或20的樹(shù)突細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)現(xiàn)成可用的、加載抗原或未加載抗原的冷藏成熟樹(shù)突細(xì)胞的方法，尤其是用于生產(chǎn)含有所述樹(shù)突細(xì)胞的疫苗的方法，其中在合適的成熟刺激物存在下培養(yǎng)未成熟的樹(shù)突細(xì)胞，并且將如此獲得的成熟樹(shù)突細(xì)胞冷凍?？梢栽诶鋬鲋敖o所述樹(shù)突細(xì)胞加載抗原。本發(fā)明也涉及可以按照本發(fā)明的方法獲得的疫苗，還涉及含有加載抗原的冷凍成熟樹(shù)突細(xì)胞的組合物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1471575SQ01817741
公開(kāi)日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2001年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月24日
發(fā)明者杰羅爾德·許勒, B·許勒?qǐng)D爾納, 杰羅爾德 許勒, 脹級(jí) 申請(qǐng)人:杰羅爾德·許勒, 杰羅爾德 許勒