專利名稱：抗trk－c拮抗劑的單克隆抗體的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗trkC促效單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及此類抗體在預(yù)防和/或治療細(xì)胞退化方面的應(yīng)用，包括與急性神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)損傷和慢性神經(jīng)退化疾病有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損害，包括周圍神經(jīng)病。
相關(guān)技術(shù)的描述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是一族小型堿性蛋白，它在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持中起著非常重要的作用。這一族中最早被鑒定且可能是了解得最徹底的是神經(jīng)生長因子(EGF)，它對于漸進(jìn)性感覺以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的交感神經(jīng)元起著重要的的作用(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.U.，Physiol.Rev.48，534-569；Thoenon，H.等，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.109，145-178。盡管知道NGF已經(jīng)有很長時(shí)間，包括小鼠下頜下腺的一種同系物，其活化形式通常被稱為2.5S NGF，但是在多年以后才鑒定出順序相關(guān)但有類似功能的性質(zhì)不同的多肽。
首先是一種被稱為腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的因子，它被Leibrock，J.等(Nature341，149-152)克隆并測序。這種因子通常是從豬腦中純化的(Barde，Y.A.等，EMBOJ.1，549-553)，但直到它的cDNA被克隆和測序，它與NGF的同源性才變得顯而易見。NGF和BNDF之間總的氨基酸序列同一性約是50％?；谶@一發(fā)現(xiàn)，Leibrock等推測，沒有理由認(rèn)為BDNF和NGF是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族中具有相同結(jié)構(gòu)和功能特征的唯一成員。
實(shí)際上，還發(fā)現(xiàn)了與NGF和BDNF關(guān)系密切的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。一些小組鑒別了一種原來稱為神經(jīng)因子(NF)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，它現(xiàn)在被稱為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)(Ernfors等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87.5454-5458；Hohn等，Nature344，339；Maisonpierre等，Science247，1446；Rosenthal等，Neuron4，767；Jones和Reichardt，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，8060-8064；Kaisho等，F(xiàn)EBS Lett.266，187；NT-3與NGF和BDNF(NT-2)共享約50％的氨基酸。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4和-5(NT-4和NT-5)也已經(jīng)加入到這一家族(美國專利5,364,769號，發(fā)表于1994年11月15日；Hallbook，F(xiàn).等，Neuron6，845-858；Berkmeier，L.R.等，Neuron7，857-866；Ip等，Proc.Natl.Acad.Sci USA89，3060-3064)。最初由Berkmeier等(同上)描述的哺乳動(dòng)物的分子(以后被認(rèn)為是非洲爪蟾屬NT-4的的同系物)通常被稱為NT-4/5。此外，在哺乳動(dòng)物中鑒別了一種酸性同源蛋白質(zhì)，它被稱為是NT-6(Berkemeir等，Somat.CellMol.Genet.18(3)233-245)。最近，另一種來自于劍尾魚屬的魚的同源蛋白質(zhì)也被NT-6標(biāo)記(Gotz等，Nature372266-269)。有兩種蛋白質(zhì)在文獻(xiàn)中被描述為NT-7，一種來自鯉魚(鯉屬)的克隆(Lai等，Mol.Cell.Neurosci.11(1-2)64-76)，一種來自于斑馬魚(擔(dān)尼魚屬)(Nilsson等，F(xiàn)EBS Letters424(3)285-90)。敘述的最后三種魚神經(jīng)營養(yǎng)蛋白都沒有在魚以外被描述，它們與任何哺乳類神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的關(guān)系還不清楚。斑馬魚神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-7(zNT-7)的氨基酸序列與魚神經(jīng)生長因子(NGF)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-6(NT-6)的關(guān)系比任何其它的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白更加密切。然而，zNT-7與魚NGF和NT-6的關(guān)系一樣密切(分別有65％和63％氨基酸序列同一性)說明它代表了一種性質(zhì)不同的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白序列。zNT-7在成熟蛋白質(zhì)中部的β-轉(zhuǎn)角區(qū)域含有15個(gè)氨基酸殘基。重組體zNT-7能夠與人p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合，并誘導(dǎo)大鼠trkA受體酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化作用，雖然它不及大鼠NGF有效。zNT-7不與大鼠trkB或trkC相互反應(yīng)，這說明它與NGF有類似的受體特異性。我們假設(shè)，在神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的進(jìn)化樹中，NGF亞科的多樣化發(fā)生在硬骨魚的進(jìn)化過程中，它隨后出現(xiàn)了幾個(gè)額外的在結(jié)構(gòu)與功能上與NGF有關(guān)的成員，比如zNT-7和NT-6。
與其它的多肽生長因子相似，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白通過與細(xì)胞表面受體相互反應(yīng)影響它們的靶細(xì)胞。根據(jù)我們現(xiàn)有的知識，有兩類跨膜糖蛋白作為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的受體。平衡結(jié)合研究顯示，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白應(yīng)答神經(jīng)元具有一種普通的低分子量(65-80kDa)、低親和力受體(LNGFR)—也被稱為p75NTR或p75，它結(jié)合NGF、BDNF和NT-3(KD為2×10-9M)和大分子量(130-150kDa)、高親和力(KD為10-11M)受體，它們是酪氨酸激酶受體的trk家族的成員。
trk受體家族的第一個(gè)成員是trA，它最初被認(rèn)為是因原肌球蛋白序列轉(zhuǎn)運(yùn)入其催化域而導(dǎo)致的致癌轉(zhuǎn)化的結(jié)果(Martin-Zanca等，Mol.Cell.Biol.9(1)24-33)。以后的工作將trkA鑒定為NGF的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。隨后，另外兩種相關(guān)受體，小鼠和大鼠的trkB(Klein等，EMBO J.8，3701-3709；Middlemas等，Mol.Cell.Biol.11，143-153；公布于1991年11月6日的歐洲專利455,460號)以及豬、小鼠和大鼠的trkC(Lamballe等，Cell66，967-979；公布于1993年1月13日的歐洲專利522,530號)被鑒定作為trk受體家族的成員。trk受體的結(jié)構(gòu)十分類似，但可變剪接通過產(chǎn)生兩種已知形式的trkA，三種已知形式的trkB(兩種沒有功能性的酪氨酸激酶域)以及至少四種形式的trkC(有一些沒有功能性酪氨酸激酶域，兩種在酪氨酸激酶域中有小的插入片段)從而增加了這一家族的復(fù)雜性。
p75和trk受體的作用是有爭論的。通常被接受的是，trk受體酪氨酸激酶在使特定神經(jīng)營養(yǎng)蛋白具有結(jié)合特異性方面起重要作用，然而，表達(dá)trkA的細(xì)胞系不僅結(jié)合NGF還結(jié)合NT-3和NT-4/5(但不結(jié)合BDNF)，表達(dá)trkB的細(xì)胞結(jié)合BDNF、NT-3、NT-4和NT-4/5(但不結(jié)合NGF)，相反，已報(bào)道表達(dá)trkC的細(xì)胞僅僅結(jié)合NT-3(不與其它的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合)。此外，在模型系統(tǒng)中顯示，由可變剪接事件產(chǎn)生的各種形式的trk受體可以活化不同的細(xì)胞內(nèi)信號途徑，因此，可以認(rèn)為它們在體內(nèi)介導(dǎo)不同的生理功能。還不清楚表達(dá)給定trk受體的細(xì)胞在沒有p75時(shí)是否以低的親和力還是以高的親和力與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合(Meakin和Shooter，TrendsNeurosci.15，323-331)。
用各種細(xì)胞系發(fā)表的研究結(jié)果是混淆的，它們提示p75對于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反應(yīng)性是必需的或是非必需的。僅僅表達(dá)p75的細(xì)胞系在平衡時(shí)以類似的低親和力與NGF、BDNF、NT-3和NT-4結(jié)合，但結(jié)合速度常數(shù)是顯著不同的。其結(jié)果是，盡管結(jié)合p75是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的共同特性，但說明p75受體可能也在配體辨別中起作用(Rodriguez-Tebar等，EMBO J.11，917-922)。由于trk受體通常被認(rèn)為是生物學(xué)上重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體，最近證明，在缺乏trkA表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞中，大概通過p75，NGF仍能夠引發(fā)生物學(xué)行為的深刻變化(Hermann等，Mol.Cell.Biol.4，1205-1216)。Davies等(Neuron11，565-574)報(bào)道了研究結(jié)果，研究了p75基因中攜帶無效突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，p75在介導(dǎo)胚胎神經(jīng)元對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的存活反應(yīng)中的作用。他們發(fā)現(xiàn)p75增強(qiáng)了NGF依賴性皮膚感覺神經(jīng)元對NGF的敏感性?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多研究表明，p75能夠介導(dǎo)至少一些神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的生物學(xué)效應(yīng)。這一領(lǐng)域仍有一些爭議，但已經(jīng)發(fā)覺p75信號能夠控制細(xì)胞死亡和軸突生長物。(Barker，PA，Cell Death Diff.5346-356；Bredesen等，Cell Death Diff.5357-364；Casaccia-Bonnefil等，CellDeath Diff.5357-364；Raoul等，Curr.Op.Neurobiol.10111-117；Davies，AM，Curr.Biol.10R198-R200)。重要的是，p75的刺激能夠改變刺激trkC的作用(Hapner等，Developm.Biol.20190-100)。
全長天然trkA、trkB和trkC受體的胞外域有五個(gè)功能域，這是根據(jù)同源性，或換句話說是根據(jù)在各種其它蛋白質(zhì)中鑒定的類似結(jié)構(gòu)確定的。從成熟trk受體的氨基酸序列的N末端開始，這些域依次為1)從人trkA的第1個(gè)氨基酸到約第32個(gè)氨基酸，從人trkB的第1個(gè)氨基酸到約第36個(gè)氨基酸，以及從人trkC的第1個(gè)氨基酸到約第48個(gè)氨基酸是第一個(gè)半胱氨酸富集的域；2)從trkA中約第33個(gè)氨基酸到約第104個(gè)氨基酸，從trkB中約第37個(gè)氨基酸到約第108個(gè)氨基酸，以及從trkC中約第49個(gè)氨基酸到約第120個(gè)氨基酸是亮氨酸富集的域；3)從trkA中約第105個(gè)氨基酸到約第157個(gè)氨基酸，從trkB中約第109個(gè)氨基酸到約第164個(gè)氨基酸，以及從trkC中約第121個(gè)氨基酸到約第177個(gè)氨基酸是第二個(gè)半胱氨酸富集的域；4)從trkA中約第176個(gè)氨基酸到約第234個(gè)氨基酸，從trkB中約第183個(gè)氨基酸到約第239個(gè)氨基酸，以及從trkC中約第196個(gè)氨基酸到約第257個(gè)氨基酸是第一個(gè)免疫球蛋白樣的域；5)從trkA中約第264個(gè)氨基酸到約第330個(gè)氨基酸，從trkB中約第270個(gè)氨基酸到約第334個(gè)氨基酸，以及從trkC中約第288個(gè)氨基酸到約第351個(gè)氨基酸是第二個(gè)免疫球蛋白樣的域。
神經(jīng)營養(yǎng)蛋白對周圍神經(jīng)元和中央神經(jīng)元有明顯但重疊的作用。這些作用的范圍包括，在確保發(fā)育中的神經(jīng)元存活中起決定性作用(感覺和交感神經(jīng)元中的NGF)，以及對神經(jīng)元的形態(tài)起相對較弱的作用(浦肯野細(xì)胞上的NT-3)。這些作用使人們對將神經(jīng)營養(yǎng)蛋白用作某些神經(jīng)退化性疾病的治療劑產(chǎn)生了興趣。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NT-3促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖，其結(jié)果是，這提示NT-3能用于治療中性禾細(xì)胞減少癥、傳染性疾病和腫瘤(發(fā)表于2000年6月18日的美國專利6,015,552號)。
還研究了神經(jīng)營養(yǎng)蛋白在控制心血管發(fā)展和調(diào)節(jié)血管對損傷的反應(yīng)的作用(Donovan等，NatureGenetics14210-213；Donovan等，A.J.Path.147309-324；Kraemer等，Arteriol.Thromb.and Vasc.Biol.191041-1050)。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白被描述為控制血管發(fā)生和血管完整性的潛在的治療劑(公布于2000年5月4日的PCT公布WO 00/24415號)。
除了它們在治療細(xì)胞退化(比如由于神經(jīng)退化性疾病和急性神經(jīng)元損傷造成)以及潛在的血管生成方面的希望，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白也有一些缺點(diǎn)。一個(gè)顯著的缺點(diǎn)是缺乏特異性。大多數(shù)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白與一種以上的受體有交叉反應(yīng)。例如，NT-3這種優(yōu)選的trkC受體酪氨酸激酶的配體還結(jié)合并活化trkA和trkB(Barbacid，J.Neurobiol.251386-1403；Barbarcid，Ann.New York Acad.Sci.766442-458；Ryden和Ibanez，J.Biol.Chem.2715623-5627；Belliveau等，J.Biol.Chem.136375-388；Farinas等，Neuron21325-334)。其結(jié)果是，很難設(shè)計(jì)目標(biāo)為特異性神經(jīng)元群體的治療。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療的另一個(gè)限制是，已知神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(包括NT-3)能夠引發(fā)痛覺過敏(Chaudhry等，Muscle and Nerve23189-192)。此外，某些神經(jīng)營養(yǎng)蛋白比如NT-3在嚙齒類動(dòng)物中有差的藥物動(dòng)力學(xué)和生物利用率特性，這就產(chǎn)生了有關(guān)它們在人類臨床應(yīng)用方面的嚴(yán)重問題(Haase等，J.Neurol.Sci.160S97-S105，Helgren等在J.Neurol.17(1)372-82中所用的劑量，以及以下數(shù)據(jù))。
由此，對開發(fā)治療神經(jīng)退化性疾病以及急性細(xì)胞損傷，且沒有現(xiàn)有神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的缺點(diǎn)的新的治療劑有很大的需求。
發(fā)明概要本發(fā)明基于抗trkC促效單克隆抗體的發(fā)展和特征，在trkC受體的胞外域中直接針對抗原表位，它模擬trkC受體的天然配體NT-3的生物學(xué)活性，但沒有NT-3的一些已知的損害。本發(fā)明還證實(shí)了這些促效抗體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中治療神經(jīng)病的用途。在預(yù)防或治療細(xì)胞退化中，比如神經(jīng)細(xì)胞損傷，尤其是與周圍神經(jīng)病等神經(jīng)退化性疾病相關(guān)的或是由于外傷、毒性劑、外科手術(shù)(暫提這些)等外界因素造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷，抗trkC促效單克隆抗體提供了優(yōu)于NT-3的許多優(yōu)點(diǎn)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抗trkC的促效單克隆抗體，它(a)和trkA或trkB沒有顯著的交叉反應(yīng)；并且(b)識別trkC第5域中的抗原表位。
本發(fā)明的某些促效抗體還能識別trkC第4域中的抗原表位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些與人和嚙齒類(比如大鼠或小鼠)trkC結(jié)合的抗體可以是鼠嵌合抗體(包括人源化的)或人抗體。這些抗體模擬天然trkC配體、NT-3的至少一種活性，因此可有效預(yù)防和/或治療各種包括細(xì)胞退化在內(nèi)的疾病，這些疾病包括(例如)神經(jīng)病，比如順氯氨鉑或吡哆醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病，或是糖尿病性的神經(jīng)病，以及(那里的細(xì)胞退化包括骨髓細(xì)胞的退化)血細(xì)胞機(jī)能不全的疾病，比如白細(xì)胞減少癥，包括嗜酸性細(xì)胞減少癥和/或嗜堿細(xì)胞減少癥、淋巴細(xì)胞減少癥、單核細(xì)胞減少癥和中性白細(xì)胞減少癥。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的促效抗體顯示了優(yōu)于NT-3的特性，例如，當(dāng)施用于患者時(shí)不會造成痛覺過敏，且與NT-3相比，它提高生物利用率和/或較高的比活。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種含有以下CDR的抗trkC抗體重鏈選自SEQ IDNOs1、2、3、4和5的CDR1；選自SEQ ID NOs6、7、8、9、10和11的CDR2；以及選自SEQ ID NOs12、13、14、15、16和17的CDR3。
再在另一方面，本發(fā)明涉及一種含有以下CDR的抗trkC抗體輕鏈選自SEQ IDNOs18、19、20、21、22、23和24的CDR1；選自SEQ ID NOs25、26、27、28、29和30的CDR2；以及選自SEQ ID NOs31、32、33、34、35和36的CDR3。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種含有以下CDR的鼠抗trkC抗體重鏈(a)有式XaaWXaaXaaWVK(SEQ ID Mo37)的CDR1，其中位置1上的Xaa是F或Y；位置3上的Xaa是I或M；位置4上的Xaa是E或H；(b)有式EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa(SEQ ID Mo38)的CDR2，其中位置3上的Xaa是L或Y；位置5上的Xaa是G或S；位置6上的Xaa是S或N；位置7上的Xaa是D或G；位置8上的Xaa是N或R；位置16上的Xaa是G或S；以及(c)式有KNRNYYGNYVV(SEQ ID Mo12)或KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ ID Mo13)的CDR3。
仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種含有以下CDR的人抗trkC抗體重鏈(a)式有XaaXaaXaaYYWXaa(SEQ ID Mo39)的CDR1，其中位置1上的Xaa是S或I；位置2上的Xaa是G或S；位置3上的Xaa是G、T或Y；位置7上的Xaa是S或N；(b)有式XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS(SEQ ID Mo40)的CDR2，其中位置1上的Xaa是Y或R；位置3上的Xaa是Y或F；位置4上的Xaa是Y或T；位置8上的Xaa是S或R；位置10上的Xaa是N或Y；以及(c)選自式有DRDYDSTGDYYSYYGMDV(SEQ ID Mo14)；DGGYSNPFD(SEQ ID Mo15)；ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV(SEQ ID Mo41)的CDR3，其中位置8上的Xaa是A或T；位置16上的Xaa是D或A。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種抗trkC促效單克隆抗體，其所含重鏈含有與輕鏈相連的如權(quán)利要求14所述的鼠抗trkC抗體重鏈的CDR。這種抗體優(yōu)選是人或含有人框架殘基，且優(yōu)選與trkA和trkB沒有顯著的交叉反應(yīng)。在使用過程中，抗體有最廣泛的定義，并且特別包括抗體片段，比如Fv片段，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’或F(ab’)2片段。包括所有種類和同種型的抗體，但是IgG，尤其是IgG-2和IgG-4是優(yōu)選的。
仍在另一方面，本發(fā)明涉及編碼鼠或人抗trkC促效單克隆抗體重鏈或輕鏈或其片段的分離的核酸。在特定的實(shí)施例中，此核酸是2000年6月21日保藏于ATCC的核酸分子，編號為PTA-2133、PTA-2134、PTA-2135、PTA-2136、PTA-2137、PTA-2138、PTA-2139、PTA-2140、PTA-2141、PTA-2142和PTA-2143。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種含有編碼上述抗體重鏈和/或輕鏈的核酸分子的載體。本發(fā)明還涉及用這種核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用這種核酸轉(zhuǎn)化的雜交瘤細(xì)胞系以及用這種雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種與藥學(xué)上可接受的載體混合的、含有效量的如上所述抗trkC促效單克隆抗體的藥物組合物。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療與細(xì)胞退化有關(guān)的疾病或癥狀的方法，包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的如本文所述的抗trkC促效單克隆抗體。
仍在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)病或神經(jīng)退化性疾病，或修補(bǔ)受損神經(jīng)細(xì)胞的方法，包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的如本文所述的抗trkC促效單克隆抗體。神經(jīng)病可以是，例如，周圍神經(jīng)病，包括(但不限于)糖尿病性的神經(jīng)病和大纖維感覺神經(jīng)病。神經(jīng)退化性疾病可以是，例如，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、亨特氏病。受損的神經(jīng)元可以是周圍的，比如感覺神經(jīng)元(如背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(比如來自脊索的神經(jīng)元)，或是中央神經(jīng)元，損傷可以是由于各種外部和內(nèi)部因素造成的，包括外傷、暴露于神經(jīng)毒素、代謝疾病、傳染性因子等。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)周圍神經(jīng)元的發(fā)育、增殖、維持或再生的方法，包括使此類神經(jīng)元與有效量的本發(fā)明的一種抗體接觸。
仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種在哺乳動(dòng)物受試者中治療(包括預(yù)防)有關(guān)細(xì)胞退化的疾病或癥狀的方法，方法是在此類受試者的細(xì)胞中引入編碼抗trkC抗體的核酸。這種方法(基因療法)最好涉及對神經(jīng)病或神經(jīng)退化性疾病的治療，或是修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞。由此，受體細(xì)胞最好是神經(jīng)細(xì)胞。
再在另一方面，本發(fā)明涉及含有遺傳物質(zhì)(核酸)的傳遞載體，這種遺傳物質(zhì)能夠編碼適合基因療法使用的抗trkC的抗體。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)血管生成的方法，它通過傳遞有效量的本發(fā)明的抗trkC的抗體以誘導(dǎo)血管生成。傳遞特別包括施用抗體并傳遞編碼抗體的核酸(如，在基因療法中)。
再在另一方面，本發(fā)明涉及一種獨(dú)立的可編碼選自SEQ ID No58、SEQ ID No59、SEQ ID No60、SEQ ID No61、SEQ ID No62、SEQ ID No63、SEQ ID No64、SEQ ID No65、SEQ ID No66、SEQ ID No67、SEQ ID No68、SEQ ID No69、SEQ ID No70和SEQ ID No71的鼠或人抗trkC促效抗體的重鏈或輕鏈的核酸分子。本發(fā)明還涉及由一種或多種獨(dú)立的核酸分子編碼的多肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種用編碼鼠或人抗trkC促效抗體的重鏈、輕鏈或這兩條鏈的核酸轉(zhuǎn)化的完整細(xì)胞。
附圖簡述

圖1A-D顯示了用KIRA(A和B)和PC12軸突生長物測定法(C和D)證實(shí)的各種人(A和C)和鼠(B和D)單克隆抗體抗trkC受體的促效活性。KIRA刺激緩沖液(F12/DMEM 50∶50，含有2％的小牛血清白蛋白[BSA，Intergen公司，Purchase，紐約]和25mM Hepes，通過0.2μm的濾膜過濾)中，用單克隆抗體純化的蛋白質(zhì)A稀釋至27μg/ml。然后在刺激培養(yǎng)基中以1∶3的比例稀釋單克隆抗體(共8種稀釋物；濃度從0.01-180nM Nab)。然后用NT-3或Mab(在復(fù)制中測定的稀釋物)刺激GD轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)6小時(shí)，并按實(shí)施例的描述進(jìn)行測定(圖1A，人Mab；圖1B，鼠Mab)。如實(shí)施例中所描述的，在PC12軸突生長物測定法中對純化的Mab的促效活性進(jìn)行測定。用全長的人trkC轉(zhuǎn)染大鼠的PC12細(xì)胞，并以1000細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染三天后，以三倍的量在含有trkC轉(zhuǎn)染子的孔中加入Mab(濃度為0.002-2.7nM)，并在37℃再溫育3天。然后使用相差顯微鏡分析細(xì)胞，并對超過細(xì)胞直徑兩倍的帶有軸突的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
圖2以6.1.2抗體作為代表性的例子，顯示了抗trkC促效單克隆抗體與trkC特異性結(jié)合。
圖3證明，抗trkC促效單克隆抗體比大志trkC更有效地識別人trkC。單克隆抗體與大鼠trkC結(jié)合的能力是用受體的免疫粘附素構(gòu)建物確定的。將TrkC(人trkC-gD或大鼠trkC-IgG)在微量滴定平板(將100μl 1μg/ml的溶液稀釋在50mM碳酸鹽緩沖液中，pH9.5)上固定過夜。洗滌并封閉平板。然后在含有0.5％BSA和0.05％Tween 20的PBS中將Mab稀釋至1μg/ml，將其加到合適的孔中(100μl/孔)，并在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌平板并加入合適的HRP共軛物(人Mab羊抗人κ-HRP為1∶5K；鼠Mab∶羊抗moIgG(Fc)-HRP為1∶5K)并在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌、顯影并閱讀平板。
圖4顯示了用競爭性ELISA進(jìn)行抗原表位作圖的代表性實(shí)例。在含有或不含有過量的各種未標(biāo)記的抗trkC單克隆抗體的情況下，將生物素化的人抗trkC 6.1.2單克隆抗體和固定的trkC一起培養(yǎng)。
圖5總結(jié)了用競爭性ELISA進(jìn)行抗原表位作圖的結(jié)果。
圖6A-C顯示了各種trkC嵌合體的示意圖(A)，以及它們用于對被各種促效的人(B)或鼠(C)的抗trkC單克隆抗體識別的trkC上的抗原表位進(jìn)行作圖。
圖7顯示了人trkC第4域和第5域的氨基酸序列，標(biāo)出了用作誘變的殘基，以解釋它們在被抗trkC促效單克隆抗體識別中的作用。
圖8顯示了與抗trkC單克隆抗體形成的復(fù)合物中trkC的三維剖面圖。特別顯示在被抗trkC抗體的CDR識別中可能起重要作用的trkC的氨基酸殘基。
圖9顯示了鼠和人抗trkC的促效單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列。此外，以黑體突出顯示了三個(gè)CDR區(qū)域(CDR1、CDR2和CDR3)。2250和2253重鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No1。2256重鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ IDNo2。6.1.2和2345重鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No3。6.4.1重鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No4。2349重鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No5。2250和2253重鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No6。2256重鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No7。6.1.2重鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No8。6.4.1重鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No9。2345重鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No10。2349重鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No11。2250和2253重鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No12。2256重鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No13。6.1.2重鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No14。6.4.1重鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No15。2345重鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No16。2349重鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No17。
圖10顯示了鼠和人抗trkC的促效單克隆抗體r輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列。此外，以黑體突出顯示了三個(gè)CDR區(qū)域(CDR1、CDR2和CDR3)。2250輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No18。2253輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No19。2256輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No20。6.1.2輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No21。6.4.1輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No22。2345輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No23。2349輕鏈的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No24。2250輕鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No25。2253輕鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No26。2256輕鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No27。6.1.2輕鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No28。6.4.1輕鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No29。2345和2349輕鏈的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No30。2250輕鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No31。2253輕鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No32。2256輕鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No33。6.1.2輕鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No34。6.4.1輕鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No35。2345和2349輕鏈的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No36。
圖11顯示了鼠和人抗trkC促效單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。還基于與數(shù)據(jù)庫中得到的CDR序列的同源性，顯示了這些序列所述的家族。
圖12顯示了抗trkC促效單克隆抗體在體內(nèi)有改進(jìn)的半衰期和生物利用率。
圖13顯示了抗trkC促效單克隆抗體對順氯氨鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病的功效。
圖14顯示了由吡哆醇神經(jīng)病導(dǎo)致的標(biāo)記表達(dá)的減少。
圖15顯示了抗trkC促效單克隆抗體對低劑量的吡哆醇作用的改善。
圖16顯示了抗trkC促效單克隆抗體對高劑量的吡哆醇作用的改善。
圖17顯示了抗trkC促效單克隆抗體對吡哆醇神經(jīng)病的改善。
圖18顯示了抗trkC促效單克隆抗體對吡哆醇誘導(dǎo)的梯狀物缺乏的改善。
圖19顯示了NT3，但不是抗trkC促效單克隆抗體，在治療劑量造成的痛覺過敏。
圖20顯示了人trkC受體(SEQ ID No56)的氨基酸序列，其中指出了第4域和第5域的分界線。
圖21(在第二頁)顯示了人trkC受體(SEQ ID No57)的核苷酸序列。
圖22顯示了抗trkC的促效單克隆抗體2250的重鏈(A；SEQ ID No58)和輕鏈(B；SEQ ID No59)的核苷酸序列。
圖23顯示了抗trkC的促效單克隆抗體2253的重鏈(A；SEQ ID No60)和輕鏈(B；SEQ ID No61)的核苷酸序列。
圖24顯示了抗trkC的促效單克隆抗體2256的重鏈(A；SEQ ID No62)和輕鏈(B；SEQ ID No63)的核苷酸序列。
圖25顯示了抗trkC的促效單克隆抗體2345的重鏈(A；SEQ ID No64)和輕鏈(B；SEQ ID No65)的核苷酸序列。
圖26顯示了抗trkC的促效單克隆抗體2349的重鏈(A；SEQ ID No66)和輕鏈(B；SEQ ID No67)的核苷酸序列。
圖27顯示了抗trkC的促效單克隆抗體6.1.2的重鏈(A；SEQ ID No68)和輕鏈(B；SEQ ID No69)的核苷酸序列。
圖28顯示了抗trkC的促效單克隆抗體6.4.1的重鏈(A；SEQ ID No70)和輕鏈(B；SEQ ID No71)的核苷酸序列。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述A.定義術(shù)語“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白”及其語法上的變體可以互相交換使用，它是指包含神經(jīng)生長因子(NGF)以及依次相關(guān)的同系物的多肽家族。NGF、腦衍生的生長因子(BDNF，也叫做NT-2)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4和5(NT-4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白6(NT-6)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白7(NT-7)迄今已被鑒定為這一家族的成員。
術(shù)語“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白”包括任何(人或非人)動(dòng)物種類的天然的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，以及它們的功能性的衍生物，無論是從天然來源通過重組DNA技術(shù)的方法、或化學(xué)合成、或這些方法的組合，或任何其它的方法制備的。“天然的”或“天然序列”神經(jīng)營養(yǎng)蛋白含有在任何人或非人的動(dòng)物種類中天然存在的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的氨基酸序列，包括天然存在的截短的或變體形式，以及天然存在的等位變體。
術(shù)語“trk”、“trk多肽”、“trk受體”以及其語法上的變體可以互相交換使用，它們是指受體酪氨酸激酶亞科的多肽，它們能夠結(jié)合至少一種天然的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。目前鑒定的這一家族的成員是trkA(p140trkA)、trkB和trkC。
表達(dá)“胞外域”或“ECD”用在這里是指任何享有天然存在的受體的胞外域的配體結(jié)合功能的多肽序列。胞外域的配體結(jié)合功能是指多肽與配體結(jié)合的能力。由于已發(fā)現(xiàn)較小的片段對于配體結(jié)合是足夠的，因此不必要包括完整的胞外域。截短的胞外域通常是可溶的。ECD一詞包含的多肽序列中，成熟受體的疏水跨膜序列(任選是跨膜域的C末端和/或N末端的1-20個(gè)氨基酸)已被刪除。
“抗trkC促效抗體”一詞是指一種抗體，它能結(jié)合并激活天然序列trkC受體和/或由trkC信號功能介導(dǎo)的下游途徑，因此能夠模擬受體天然配體(尤其是NT-3)的生物學(xué)活性。例如，促效抗體可以結(jié)合trkC受體的ECD域并因此導(dǎo)致受體的二聚化，其結(jié)果是活化了細(xì)胞內(nèi)的催化激酶區(qū)域。因此，這可能會刺激在體外和/或體內(nèi)表達(dá)受體的細(xì)胞的生長和/或分化。本發(fā)明的促效抗體最好能夠識別包括人trkC受體的第5域(從約第266個(gè)氨基酸至約381個(gè)氨基酸)和/或第4域(從約第178個(gè)氨基酸至約265個(gè)氨基酸)的至少部分在內(nèi)的抗原表位，或是非人(如鼠)trkC受體上的相應(yīng)的抗原表位。
當(dāng)與本發(fā)明的抗trkC促效抗體聯(lián)合使用時(shí)，“生物學(xué)活性”通常是指有和trkC的天然配體NT-3一樣的效應(yīng)子功能。效應(yīng)子功能最好是能夠結(jié)合并活化trkC受體酪氨酸激酶和/或有trkC信號功能介導(dǎo)的下游途徑。沒有任何限制，優(yōu)選的生物學(xué)活性包括促進(jìn)損傷細(xì)胞，尤其是體外或體內(nèi)的神經(jīng)元，包括周圍(交感、副交感、感覺和腸)神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中央(腦和脊索)神經(jīng)元，以及非神經(jīng)元細(xì)胞(如外周血淋巴細(xì)胞)的發(fā)育、增殖、維持和/或再生的能力。尤其優(yōu)選的生物學(xué)活性是治療(包括預(yù)防)神經(jīng)病，例如周圍神經(jīng)病或其它神經(jīng)退化性疾病、或修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞的能力。損害的神經(jīng)元可以是感覺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、副交感神經(jīng)元或腸神經(jīng)元(如背跟神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，以及中央神經(jīng)元(如來自脊索的神經(jīng)元)，損傷可由任何原因造成，包括外傷、毒性劑、外科手術(shù)、中風(fēng)、缺血、感染、代謝疾病、營養(yǎng)缺乏和各種惡性腫瘤。另一種特定的生物學(xué)活性是誘導(dǎo)血管生成的能力。
當(dāng)用在這里時(shí)，“治療”是指為獲得有益或所需臨床結(jié)果的方法。為了本發(fā)明的目的，有益或所需的臨床結(jié)果包括(但不限于)減輕癥狀、縮小疾病的范圍、穩(wěn)定(即，不再惡化)疾病的狀態(tài)，延遲或減緩疾病的發(fā)展、改善或減輕疾病的狀態(tài)、和緩解癥狀(無論部分或全部)，無論是可檢測或是不可檢測的?！爸委煛币部梢灾概c期望的存活期相比(如果未接受治療)，延長存活期。“治療”是以防治疾病發(fā)展或改變疾病的病狀為目的進(jìn)行的干涉。由此，“治療”是指治療性的手段和預(yù)防性或防御性的措施。需要治療的目標(biāo)包括那些已經(jīng)患病以及那些需要預(yù)防疾病的目標(biāo)。特別地，治療可以是直接的預(yù)防、減慢或減少損傷的細(xì)胞退化的病狀，比如神經(jīng)細(xì)胞的病狀，也可以用其它治療劑使細(xì)胞(如神經(jīng)元)對治療更敏感。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，治療減少或減慢了靶神經(jīng)元功能的衰退并/或刺激靶神經(jīng)元功能的恢復(fù)。
(慢性)神經(jīng)退化性疾病或急性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的“病狀”包括所有影響患者保持良好狀態(tài)的現(xiàn)象，包括(但不限于)神經(jīng)元機(jī)能失常、退化、損傷和/或死亡。
“神經(jīng)退化性疾病”和“神經(jīng)退化性障礙”以最廣泛的含義使用，包括所有障礙與神經(jīng)退化和/或機(jī)能失常有關(guān)的病狀，包括(但不限于)周圍神經(jīng)??；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙，比如肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS，Lou Gehrig氏病)、面神經(jīng)麻痹、以及各種與脊髓肌萎縮或麻痹有關(guān)的癥狀；以及其它人神經(jīng)退化疾病，比如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癲癇、多發(fā)性硬化、亨延頓舞蹈癥、唐氏綜合癥、神經(jīng)性耳聾和梅尼埃爾氏病。
“周圍神經(jīng)病”是一種影響周圍神經(jīng)的神經(jīng)退化性障礙，經(jīng)常以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)或自主神經(jīng)功能失調(diào)的一種或組合的形式出現(xiàn)。周圍神經(jīng)病可以是，例如，通過遺傳獲得的，由系統(tǒng)性疾病引起的，或是有毒性劑(比如神經(jīng)毒性藥物，如抗腫瘤藥物或是工業(yè)或環(huán)境污染)引起的?！爸車杏X神經(jīng)病”以周圍感覺神經(jīng)元的退化為特征，它可以是自發(fā)性的，可能是作為(例如)糖尿病(糖尿病性神經(jīng)病)、癌癥中抑制細(xì)胞的藥物治療(如用化學(xué)治療劑，如長春新堿、順氯氨鉑、氨甲蝶呤、3’-疊氮-3’-脫氧胸腺嘧啶，或紫杉烷，如紫杉醇[TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，普林斯頓，新澤西州]和多烯紫杉醇[TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，安東尼市，法國])、酒精中毒、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)或遺傳型素質(zhì)的后果發(fā)生。遺傳獲得性的周圍神經(jīng)病包括(例如)雷弗素姆氏病、克拉伯氏病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、法布萊氏病、德雅蘭-素塔斯綜合征、無β脂蛋白血癥以及沙-馬-圖(CMT)病(也被稱為腓側(cè)肌萎縮)或遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病(HMSN))。大多數(shù)類型的周圍神經(jīng)病發(fā)展緩慢，時(shí)間超過幾個(gè)月或幾年。在臨床實(shí)踐中，此類神經(jīng)病被稱為是慢性的。有時(shí)一種神經(jīng)病發(fā)展迅速，時(shí)間超過幾天，這被稱為是急性的。周圍神經(jīng)病通常一起影響感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，以致造成混合性的感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病，但已知也有單純的感覺神經(jīng)病和單純的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病。
在本發(fā)明的內(nèi)容中使用的“毒性劑”一詞是指一種物質(zhì)，它通過其化學(xué)作用，損害、削弱或抑制神經(jīng)系統(tǒng)的組分的活性。毒性劑(也被稱為“神經(jīng)毒劑”)的名單包括(但不限于)化學(xué)治療劑(比如上面所列出的那些)、酒精、金屬、工業(yè)毒素、食品和藥物的污染等。
出于治療的目的，“哺乳動(dòng)物”是指歸類于哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)畜、以及動(dòng)物園的動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸?，比如狗類、馬類、羊類、貓類、牛類等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。
“trkC免疫粘附素”一詞可以和“trkC免疫球蛋白嵌合體”交換使用，它是指trkC的一部分(通常是其胞外域)與免疫球蛋白序列結(jié)合形成的嵌合分子。免疫球蛋白序列最好是(但這不是必需的)免疫球蛋白的恒定區(qū)。這一領(lǐng)域中已知結(jié)合到合適的免疫球蛋白恒定區(qū)序列(免疫粘附素)的由受體序列構(gòu)建的嵌合體。在文獻(xiàn)中報(bào)道的免疫粘附素包括T細(xì)胞受體*的融合(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，842936-2940)；CD4*的融合(Capon等，Nature337525-531；Traunecker等，Nature，33968-70；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.9347-353；Bym等，Nature，344667-670)；L-選擇蛋白(歸巢受體)的融合(Watson等，J.Cell.Biol.，1102221-2229；Watson等，Nature，349164-167)；CD44*的融合(Aruffo等，Cell，611303-1313)；CD28*和B7*的融合(Linsley等，J.Exp.Med.，173721-730)；CTLA-4*的融合(Lisley等，J.Exp.Med.174561-569)；CD22*的融合(Stamenkovic等，Cell，661133-11144)；TNF受體的融合(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810535-10539；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.，272883-2886；Peppel等，J.Exp.Med.，1741483-1489)；NP受體的融合(Bennett等，J.Biol.Chem.26623060-23067)；以及IGE受體α*的融合(Ridgway等，J.Cell.Biol.，115摘要1448)，其中，星號(*)表示受體是免疫球蛋白亞科的成員。
本發(fā)明的上下文中，“獨(dú)立的”核酸或多肽是從動(dòng)物源或人源中存在的雜質(zhì)核酸或多肽中鑒別并分離的核酸或多肽。出于診斷或探測目的，可以用下面的有關(guān)診斷測定的討論中描述并定義的標(biāo)記來標(biāo)記核酸或多肽。
通常，術(shù)語“氨基酸序列變體”是指與參考(如天然序列)多肽相比，在它們的氨基酸序列中有一些不同的分子。氨基酸改變可以是在天然的氨基酸序列中進(jìn)行取代、插入、缺失或是任何所需的此類變化的結(jié)合。
術(shù)語“DNA序列編碼”、“DNA編碼”和“核酸編碼”是指沿著一條脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷的順序或序列。這些脫氧核糖核苷的順序決定了沿著多肽鏈的氨基酸的順序。因此，DNA的順序編碼氨基酸的順序。
術(shù)語“可復(fù)制的表達(dá)載體”和“表達(dá)載體”是指一條DNA，通常是雙鏈的，可以在它當(dāng)中插入一條外源DNA。外源DNA被定義為異源DNA，它是在宿主細(xì)胞中沒有自然發(fā)現(xiàn)的DNA。載體被用來將外源或異源DNA轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞。一旦在宿主細(xì)胞中，載體可以不依賴宿主染色體DNA復(fù)制，并且可以產(chǎn)生載體和其插入(外源)DNA的幾份拷貝。此外，載體含有必要的元件以使其能夠?qū)⑼庠碊NA翻譯到多肽中。因此，由外源DNA編碼的許多多肽的分子可以迅速合成。
“調(diào)控序列”一詞是指在特定宿主生物中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合原核生物的調(diào)控序列(例如)包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)，其它還了解不多的序列。已知真核細(xì)胞可以利用啟動(dòng)子、多腺苷化信號以及增強(qiáng)子。
當(dāng)核酸與另一種核酸序列有功能關(guān)系時(shí)，這種核酸是“可操作地連接”的。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)，則可操作地連接到多肽的DNA上；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則可操作地連接到編碼序列上；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位以促進(jìn)翻譯，則可操作地連接到編碼序列上。通常，“可操作地連接”意味著被結(jié)合的DNA序列是鄰接的，并且，就分泌前導(dǎo)區(qū)而論，則是鄰接的并且在閱讀階段。但是增強(qiáng)子沒有要鄰接的。連接是通過在合適的限制位點(diǎn)上連接完成的。如果不存在此類位點(diǎn)，則需根據(jù)常規(guī)的實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭或接頭。
在本發(fā)明的上下文中，“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以交換使用，所有的此類名稱都包括后代。因此，“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的(宿主)細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由它們衍生的培養(yǎng)物，而不必考慮轉(zhuǎn)移的數(shù)量。還可以理解為，由于故意的或非故意的突變，所以所有后代的DNA含量不是正好相同的。被篩選出的與原始的轉(zhuǎn)化細(xì)胞有同樣功能或生物活性的突變型后代也包括在內(nèi)。這里使用了不同的名稱，從上下文將會清楚。
本文定義了“外源”元件，它指對細(xì)胞而言是外來的核酸序列，或者與細(xì)胞是同源的，但位于通常未發(fā)現(xiàn)這一元件的宿主細(xì)胞的核酸內(nèi)。
“抗體”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。當(dāng)抗體對特定抗原顯示結(jié)合特異性時(shí)，免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一類的多肽是(例如)在低水平通過淋巴系統(tǒng)以及在增加的水平通過骨髓瘤產(chǎn)生的。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，它由兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，不同的免疫球蛋白同種型的重鏈中二硫鍵的數(shù)目是不同的。每條重鏈和輕鏈還含有規(guī)則地分隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端是可變區(qū)(VH)，隨后是若干恒定區(qū)。每條輕鏈的一端是可變區(qū)(VL)，另一端是恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)成一直線，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)成一直線。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變”是指可變區(qū)的某些部分在抗體中的序列是高度不同的，并且被用在各個(gè)特定的抗體對其特定的抗原的結(jié)合和特異性中。然而，可變性甚至并沒有完全分布在抗體的可變區(qū)中。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個(gè)被稱為高變區(qū)的片段上?？勺儏^(qū)的較高度保守的部分被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)分別含有四個(gè)FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4)，大多數(shù)采用由三個(gè)高變區(qū)連接的片層構(gòu)型，這形成了環(huán)連接，有時(shí)還形成部分片層結(jié)構(gòu)。各條鏈的高變區(qū)被FR緊靠在一起，并且和其它鏈的高變區(qū)一起，有助于形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public HealthService，美國國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)、馬里蘭州(1991)，第647-669頁)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但有各種效應(yīng)物的功能，比如參與抗體依賴性細(xì)胞毒性中的抗體。
本文使用的術(shù)語，“高變區(qū)”是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34{L1}、50-56{L2}、89-97{L3}以及重鏈可變區(qū)中的殘基31-35{H1}、50-65{H2}、95-102{H3}；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，美國國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)、馬里蘭州(1991))和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基(即輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32{L1}、50-52{L2}、91-96{L3}以及重鏈可變區(qū)中的殘基26-32{H1}、53-55{H2}、96-101{H3}；Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196901-917(1987))?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是除了這里定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變區(qū)殘基。
抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，每個(gè)片段都只有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余的“Fc”片段，它們的名字代表了容易結(jié)晶的能力。木瓜蛋白酶處理產(chǎn)生有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并能交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是最小的抗體片段，它含有完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)。這一區(qū)域含有緊密但非共價(jià)結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈的可變區(qū)的二聚體組成。這一構(gòu)型中，各個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用，以確定在VH-VL二聚體的表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？偟膩碚f，六個(gè)高變區(qū)賦與抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即便是一個(gè)可變區(qū)(或Fv的一半，僅僅含有三個(gè)對抗原特異的高變區(qū))也能夠識別并結(jié)合抗原，盡管其親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段不同于Fab片段，它在重鏈CH1區(qū)域的羧基末端加入幾個(gè)殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH在這里是指恒定區(qū)的半胱氨酸殘基上帶有一個(gè)游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最初是與Fab’片段配對產(chǎn)生的，在它們之間含有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它的化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
來自任何脊椎動(dòng)物的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列可以被分成一類或兩類清楚可辨的類型，叫做κ()和λ()。
根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的類型。有五種主要的免疫球蛋白類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些可以被進(jìn)一步分成子類(同種型)，比如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。與不同類型的免疫球蛋白相對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別被稱為、、、、和，不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。
術(shù)語“抗體”在這里以最廣泛的含義使用，且特別地包括人、非人(比如鼠)和人源化單克隆抗體(包括全長的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如，雙特異性抗體)以及抗體片段，只要它們有所需的生物學(xué)活性即可。
“抗體片段”包括全長抗體的一部分，通常是抗原結(jié)合部分或其可變區(qū)?？乖蔚睦影‵ab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙特異抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
本文用的術(shù)語“單克隆抗體”指從基本上同源抗體的群體中得到的抗體，即除了可以小量存在的天然存在的突變，包含群體的各個(gè)抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的，針對單一的抗原位點(diǎn)。此外，與常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，它通常包括針對不同決定子(表位)的不同抗體，美國單克隆抗體針對抗原上的單一決定子。修飾劑“單克隆”表明了從抗體的同源群體中獲得的抗體的特性，且不能理解為需要用任何特定的方法產(chǎn)生抗體。例如，Kohler等，Nature 256495(1975)，首先描述了采用雜交瘤方法或采用重組DNA方法(見，例如，美國專利4,816,567號)制備了用于本發(fā)明的單克隆抗體。例如，采用Clackson等，Nature 352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)描述的方法也可以從噬菌體抗體文庫分離“單克隆抗體”。
這里的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈部分與抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，這些抗體衍生自特定的中或?qū)儆谔囟ǖ目贵w類或亞類，剩余的鏈與抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，這些抗體衍生自另一個(gè)種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類或亞類，以及這類抗體的片段，只要它們顯示所需的生物活性(美國專利4,86,567號；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是嵌合抗體，它含有衍生自非人免疫球蛋白的極小序列。人源化抗體多半是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)殘基被非人種(供體受體)，如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物(具有所需的特異性、親和性和能力)的高變區(qū)殘基所替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基所替代。此外，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。所作的這些修飾進(jìn)一步改進(jìn)了抗體的性能。總的來說，人源化抗體基本上包括至少一種，和通常兩種可變區(qū)，其中所有的或基本上所有的高變區(qū)與非人免疫球蛋白序列的高變區(qū)相符號，所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的RF。人源化抗體還任選地包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的一部分。進(jìn)一步的詳述參見Jones等，Nature 351522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包括抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)存在于單一多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包括VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，它使得sFv能夠形成所需的結(jié)構(gòu)用于抗原結(jié)合。有關(guān)sFv的綜述，抗原參見Pluckthun在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“雙特異抗體”是指有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，這些片段包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)合在同一個(gè)多肽鏈(VH-VL)上。通過使用一個(gè)過短而不能在同一鏈上的兩個(gè)區(qū)域間進(jìn)行配對的接頭，這些區(qū)域不得不與另一鏈的互補(bǔ)區(qū)域配對，從而產(chǎn)生了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙特異抗體被更加具體的描述在，例如，歐洲專利404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6449(1993)。
當(dāng)用在本申請時(shí)，“線性抗體”這種表達(dá)是指在Zapata等在ProteinEng.8(10)1057-1062(1995)中所描述的抗體。簡單地說，這些抗體包括一對串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-H-CH1)，它形成了一對抗原結(jié)合區(qū)域。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。
術(shù)語“抗原表位”被用來指(單克隆或多克隆)抗體在蛋白質(zhì)抗原上的結(jié)合位點(diǎn)。
抗原結(jié)合到天然序列人trkC的氨基酸序列內(nèi)第5域和/或第4域，或結(jié)合到天然序列非人trkC受體中等價(jià)的抗原表位上，被稱為“抗原表位作圖”。在這一領(lǐng)域中已知有很多方法用來作圖并表征抗原表位在蛋白質(zhì)上的位置，包括溶解抗體-抗原復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，競爭性測定，基因片段表達(dá)測定，以及以合成肽為基礎(chǔ)的測定，這些方法被描述在(例如)Harlow and Lane，Using Antibodies，a LaboratoryManual的第11章中，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約州，1999。競爭性ELISA特別描述在實(shí)施例1中。根據(jù)基因片段表達(dá)測定，編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框被隨意切割或被特定的遺傳結(jié)構(gòu)切割，同時(shí)確定了表達(dá)的蛋白質(zhì)片段與要測試的抗體的反應(yīng)性?；蚱慰梢?例如)通過PCR產(chǎn)生，然后在體外在放射性氨基酸存在下將其轉(zhuǎn)錄并翻譯到蛋白質(zhì)中。然后通過免疫沉淀和凝膠電泳確定抗體與放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)片段的結(jié)合。使用出現(xiàn)在噬菌體顆粒(噬菌體文庫)表面上的隨機(jī)肽序列的大型文庫還可以鑒別某些抗原表位?；蛘?，可以測試確定的重疊肽片段的文庫以便在簡單的結(jié)合測定中與測試抗體結(jié)合。后面一種方法適用于確定約5-15個(gè)氨基酸的線性抗原表位。
當(dāng)兩個(gè)抗體識別一樣的或空間上重疊的抗原表位時(shí)，抗體結(jié)合“基本上一樣的抗原表位”作為參考抗體。最廣泛使用且快速確定兩個(gè)抗原表位是否與一樣的或空間上重疊的抗原表位結(jié)合的方法是競爭性測定，采用標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體，這種方法適用于所有不同的形式。通常，抗體被固定在96孔的平板上，用放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記測定未被標(biāo)記的抗體阻斷標(biāo)記的抗體結(jié)合的能力。競爭性ELISA在實(shí)施例1中描述。
本文使用的術(shù)語氨基酸或氨基酸殘基是指如下面所描述的天然存在的L氨基酸或D氨基酸以及它們相應(yīng)的變體。這里使用了常用的一個(gè)或三個(gè)字母的縮寫來代表氨基酸(Bruce Alberts等，Molucular Biology of the Cell，GarlandPublishing公司，紐約州(第三版，1994)。
雜交最好是在“嚴(yán)格條件”下進(jìn)行，是指(1)采用低離子強(qiáng)度和高的洗滌溫度，例如，0.015氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，溫度為50C，或(2)在雜交過程中使用變性劑，比如甲酰胺，例如，用50％(體積/體積)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5，以及750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，溫度為42C。另一實(shí)施例使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6/8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhard溶液、超聲處理的鮭魚精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％的硫酸葡聚糖，溫度為42C，在42C用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌。
B.實(shí)施本發(fā)明的方法本發(fā)明涉及人和非人的促效單克隆抗體(包括后者的人源化形式)，它模擬trkC受體的天然配體NT-3的某些生物學(xué)性質(zhì)。生產(chǎn)鼠和人抗trkC抗體的常規(guī)技術(shù)在這一領(lǐng)域中是熟知的并將在下面描述。此外，更詳細(xì)的，在實(shí)施例1中提供了對促效抗體的選擇。
1.抗體制備(i)多克隆抗體制備多克隆抗體的方法在這一領(lǐng)域中是已知的?？梢栽诓溉閯?dòng)物中(例如)通過一次或多次注射免疫劑和(如果需要的話)佐劑來產(chǎn)生多克隆抗體。通常，免疫劑和/或佐劑將通過多次皮下和腹膜內(nèi)注射注射到哺乳動(dòng)物中?？捎糜谑姑庖邉┡c已知在被免疫的哺乳動(dòng)物中能夠產(chǎn)生免疫的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，此類蛋白質(zhì)有血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑?？墒褂玫淖魟┑睦影ǜナ贤耆魟┖蚆PL-TDM。
(ii)單克隆抗體可以使用Kohler等，Nature，256495(1975)首次描述的使用雜交瘤法制備單克隆抗體，或使用重組DNA法(美國專利4,816,567號)制備。
在雜交瘤法中，小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，比如倉鼠或獼猴，按上述方法免疫以誘出淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與用于免疫的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。用合適的融合劑，比如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，第59-103頁，[學(xué)術(shù)出版社，1986])。
將制備的雜交瘤細(xì)胞接種到最好含有一種或多種能夠抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)的合適的培養(yǎng)基上并使其生長。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，供雜交瘤使用的培養(yǎng)基通常含有次黃嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)，在避免HGPRT缺陷細(xì)胞生長的條件下。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合，支持由選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并且對HAT培養(yǎng)基之類的培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，比如那些衍生自MOP-21和M.C.-11小鼠腫瘤的細(xì)胞系(來自索爾克研究院細(xì)胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，圣地亞哥，美國加利福尼亞州)和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(來自美國模式培養(yǎng)物保藏所，羅克維爾，美國馬里蘭州)的細(xì)胞系。人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細(xì)胞系也被敘述用來生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozhor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁，Marcel Dekker公司，紐約州，)。
對生長有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體的產(chǎn)量進(jìn)行測定。優(yōu)選用免疫沉淀法或通過體外結(jié)合測定，比如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)確定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
可以通過(例如)Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的斯卡查德分析來確定單克隆抗體的結(jié)合親和性。
在鑒定出能夠產(chǎn)生所需特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過限制性稀釋步驟將這些細(xì)胞亞克隆并用標(biāo)準(zhǔn)的方法使其生長(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第59-103頁(學(xué)術(shù)出版社，1986))。用于這一目的的合適培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞也可以在體內(nèi)生長，正如動(dòng)物中的腹水瘤一樣。
用常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，比如(例如)蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法，將亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水液或血清中合適地分離出來。
編碼單克隆抗體的DNA容易被分離，并用常規(guī)的方法(比如，使用能夠與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)測序。雜交瘤細(xì)胞是這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，就可以將DNA放入表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞之類不會產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，以在重組的宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。DNA也可以被修飾，例如，用編碼序列取代人的重鏈和輕鏈恒定區(qū)代替同源的鼠類序列，Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.81，6851(1984)，或在免疫球蛋白的編碼序列中共價(jià)地加入非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。用那種方法，就制得了具有抗trkC單克隆抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜交”抗體。
通常用此類非免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或用它們?nèi)〈景l(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)以產(chǎn)生含有一個(gè)對trk受體有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個(gè)對不同抗原有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合二價(jià)抗體。
還可以采用在合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法，包括那些與交聯(lián)劑有關(guān)的方法，在體內(nèi)制備嵌合或雜交抗體。例如，可以通過二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于此目的的合適的試劑包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞胺酸鹽。
下面將更加詳細(xì)的描述抗體的重組生產(chǎn)。
(iii)人源化抗體通常，人源化抗體中有一個(gè)或多個(gè)非人源的氨基酸殘基被引入。這些非人的氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)?？梢园凑誛inter和同事的方法[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)]，通過用嚙齒動(dòng)物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列，從而實(shí)質(zhì)性地進(jìn)行人源化。
由此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(Cabilly，同上)，其中比完整的人可變區(qū)少得多的序列被非人源的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些CRD殘基以及可能的話，一些FR殘基被嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
重要的是，抗體被人源化后保持有對抗原的高度親和力和其它良好的生物學(xué)性質(zhì)。為達(dá)到這個(gè)目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，人源化抗體是用親本和人源化序列的三維模型，通過測定親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法制備的。三維免疫球蛋白模型一般是存在的，且它們對于這一領(lǐng)域中的技術(shù)人員是熟悉的。圖示并顯示經(jīng)過選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可以獲得的。，對這些圖示的檢查使得能夠分析殘基在候選的免疫球蛋白序列的功能中所起的可能的作用，即分析殘基對候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的影響。用這種方法，可從共有序列和輸入序列中選擇并結(jié)合FR殘基，從而獲得所需的抗體特性，比如提高了對靶抗原的親和力。通常，CDR殘基直接并最主要的參與影響抗原結(jié)合。為了解進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可以參閱提交于192年8月21日的美國專利申請07/934,373號，這是提交于1991年6月14日的第07/715,272號申請的部分繼續(xù)申請。
(iv)人抗體可以用雜交瘤法制造人單克隆抗體。用來生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤已經(jīng)被描述，例如，Kozbor，J.Immunol.133.3001(1984)和Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，紐約州，1987)。
現(xiàn)在有可能生產(chǎn)能夠(在免疫作用后)在沒有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生具有人抗體所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)。例如，已描述在嵌合小鼠和種系突變的小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)的純合缺失會導(dǎo)致內(nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。在這種種系突變的小鼠中轉(zhuǎn)移種系的免疫球蛋白基因陣列導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。參見(例如)Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature362，255-258(1993)。
Mendez等(Nature Genetics 15146-156)進(jìn)一步改進(jìn)了這一技術(shù)并制得一系列被稱為“XenomouseII”的轉(zhuǎn)基因小鼠，當(dāng)和抗原攻擊時(shí)，產(chǎn)生高親和力的完整的人抗體。這是通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座的種系整合到如上所述的缺失內(nèi)源JH片段的小鼠中獲得的。XenomouseII擁有1,020kb的含有大約66個(gè)VH基因，完整的DH和JH區(qū)域以及三個(gè)不同的恒定區(qū)(μ、δ和χ)的人重鏈基因座，并擁有800kb的含有32Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因的人κ基因座。在這些小鼠中產(chǎn)生的抗體與在人中看到的抗體在所有方面都非常類似，這些方面包括基因重排、組裝和所有組成成分。人抗體最好以內(nèi)源抗體的形式表達(dá)，因?yàn)镴H片段的缺失阻止了在鼠基因座中的基因重排。
或者，可以用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature348，552-553)，用來自未免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成成分在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，抗體V區(qū)基因框內(nèi)被克隆入絲狀細(xì)菌噬菌體(比如M13或fd)的大或小包被蛋白質(zhì)基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇還導(dǎo)致了對編碼有這些特性的抗體的基因的選擇。因此，這種噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性?？梢杂酶鞣N形式進(jìn)行噬菌體展示，有關(guān)綜述可以參閱，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology3，564-571(1993)。V基因片段的幾種來源都可以供噬菌體展示使用。Clackson等，Nature 352，624-628(1991)從衍生自被免疫的小鼠的脾細(xì)胞的V基因的小隨機(jī)組合文庫中分離了不同陣列的抗噁唑酮抗體?？梢詷?gòu)建來自未免疫的人供體的V基因的各種組成成分，并且可以按照Marks等，J.Mol.Biol.222，581-598(1991)或Griffith等，EMBO J.12，725-734(1993)敘述的技術(shù)來分離不同陣列的抗原(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫反應(yīng)中，抗體基因以高速率累積突變(體細(xì)胞高變)。一些引入的變化將賦予較高的親和力，有高親和表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在隨后的抗原共和攻擊中優(yōu)先被復(fù)制和分化?？梢杂帽环Q為“鏈改組”的技術(shù)來模擬這種天然的過程(Marks等，Bio/Technol.10，779-783)。這一方法中，通過用來自未免疫供體得到的V區(qū)基因的天然存在的變體(各種組成成分)的各種組成成分連續(xù)取代重鏈和輕鏈V區(qū)基因，可以改進(jìn)由噬菌體展示獲得的“原代”人抗體的親和力。這種技術(shù)允許用nM范圍內(nèi)的親和力來產(chǎn)生抗體和抗體片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)描述了制造非常大的噬菌體抗體各種組成成分(也被稱為“整個(gè)母文庫(the mother-of-all libraries)”)的方法，Griffith等，EMBO J.(1994)(印刷中)報(bào)道了直接從這種大型噬菌體文庫中分離高親和力的人抗體的方法?；蚋慕M也可以用來從嚙齒動(dòng)物抗體中衍生出人抗體，這里的人抗體與開始的嚙齒動(dòng)物抗體有類似的親和性和特異性。根據(jù)這種方法(也被稱為“抗原表位印記”)，通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈或輕鏈V區(qū)基因被人V區(qū)基因的各種組成成分替代，從而產(chǎn)生了嚙齒動(dòng)物-人嵌合體。對抗原的選擇導(dǎo)致了能夠恢復(fù)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)，即控制(印記)選擇合作者的抗原表位的人變量的分離。當(dāng)這一過程被重復(fù)以替代剩下的嚙齒動(dòng)物V區(qū)時(shí)，就獲得了人抗體(參見PCT專利申請WO 93/06213號，公布于1993年4月1日)。不像通過CDR移植進(jìn)行傳統(tǒng)的人源化嚙齒動(dòng)物抗體，這種技術(shù)提供了完整的人抗體，它沒有嚙齒動(dòng)物源的構(gòu)架或CDR殘基。
(v)雙特異性抗體雙特異性抗體是單克隆，優(yōu)選是人的或人源化的抗體，它至少對兩種不同的抗原有結(jié)合特異性。在這里，一種結(jié)合特異性是對trkC受體的以提供促效抗體，另一種是對任何其它抗原的，優(yōu)選是另一種受體或受體亞基。例如，雙特異性抗體特異性結(jié)合trkC受體和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，或是trkC受體和另一種本發(fā)明范圍內(nèi)的trk受體。
制備雙特異性抗體的方法在這一領(lǐng)域中是已知的。通常，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)，這里的兩條重鏈有不同的特異性(Millstein和Cuello，Nature305，537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生了10中不同抗體分子的混合物，其中只有一種有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化通常是通過親和層析步驟完成的，這種方法頗煩瑣且產(chǎn)物的產(chǎn)量低。類似的步驟公開在PCT申請公開WO 93/08829號中(公布于1993年5月13日)和Traunecker等，EMBO10，3655-3659(1991)。
根據(jù)一個(gè)不同且更加好的方法，有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))被融合到免疫球蛋白恒定區(qū)序列上。最好是和含有至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。在至少一個(gè)融合體中存在含有輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1)較好。編碼免疫球蛋白重鏈配合體的DNA，如果需要的話，免疫球蛋白輕鏈被插入獨(dú)立表達(dá)的載體并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物中。當(dāng)用于構(gòu)建比例不等的三種多肽鏈提供了最佳產(chǎn)量時(shí)，這為調(diào)節(jié)實(shí)施例中的三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量，或當(dāng)這些比例不是特別重要時(shí)，也可以在一種表達(dá)載體中插入兩種或三種多肽鏈的編碼序列。在這一方法優(yōu)選的實(shí)施例中，雙特異性抗體由一條臂上具有第一種結(jié)合特異性的雜種免疫球蛋白重鏈組成，在另一條臂上有雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二種結(jié)合特異性)。人們發(fā)現(xiàn)，這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從不想要的免疫球蛋白鏈組合物中分離所需的雙特異性化合物，這是由于免疫球蛋白輕鏈僅在雙特異性分子的一半存在提供了簡單的分離途徑。這一方法敘述在公布于1994年3月3日的PCT公開第WO 94/04690號中。
為進(jìn)一步了解制備雙特異性抗體的方法，可以參閱，例如，Suresh等，Methodsin Enzymology121，210(1986)。
(vi)異共軛(heteroconjugate)抗體異共軛抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異共軛抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體組成。此類抗體(例如)試圖將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利4,676,980號)以及治療HIV感染(PCT申請公布第WO 91/00360和WO 92/200373號；歐洲專利03089號)?？梢杂萌魏畏奖愕慕宦?lián)法制備異共軛抗體。合適的交聯(lián)法在本領(lǐng)域中是已知的，且在美國專利4,676,980號中公開了許多交聯(lián)技術(shù)。
(vii)抗體片段某些實(shí)施例中，抗trkC抗體(包括鼠、人和人源化抗體，以及抗體變體)是抗體片段。已經(jīng)開發(fā)了各種生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)。通常，這些片段是通過蛋白水酶解消化完整的抗體得到的(參閱，例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods24107-117(1992)和Brennan等，Science 22981(1985))。然而，現(xiàn)在可以直接通過重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)這些片段。例如，F(xiàn)ab’-SH片段可以從大腸桿菌中直接回收并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab’)2片段(Carter等，Biol/Technology 10163-167(1992))。另一實(shí)施例中，F(xiàn)(ab’)2片段是用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab’)2分子的組裝而形成的。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離Fv、Fab或F(ab’)2片段。其它生產(chǎn)抗體片段的方法對于熟練的技術(shù)人員是顯見的。
(viii)抗體的氨基酸序列變體通過在抗trkC抗體DNA中引入合適的核苷酸改變或通過肽合成，可以制得抗trkC抗體的氨基酸序列變體。此類變體包括，例如，本文的實(shí)施例中抗trkC抗體的氨基酸序列內(nèi)有殘基缺失和/或殘基插入和/或殘基取代。缺失、插入和取代的任何組合都可以采用以獲得最終的構(gòu)建物，只要最終的構(gòu)建物具有所需的特征。氨基酸的改變還可以改變?nèi)嗽椿蜃凅w抗trkC抗體的翻譯后加工，比如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和位置。
鑒定抗trkC抗體的優(yōu)選誘變位置上的某些殘基或區(qū)域的有用方法被稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells在Science，2441081-1085(1989)中所描述的。這里，一個(gè)殘基或一組目標(biāo)殘基被鑒別(如，帶電荷的殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，并被中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)取代以便影響氨基酸和trkC抗原的相互反應(yīng)。然后在取代位點(diǎn)或?yàn)槿〈稽c(diǎn)引入進(jìn)一步的或其它的變體，從而使那些被證明對取代是功能敏感性的氨基酸位置得到澄清。因此，由于用來引入氨基酸序列變體的位置是預(yù)先確定的，故突變本身的性質(zhì)是不用預(yù)先確定的。例如，為分析給定位點(diǎn)上突變的性能，在靶密碼子或區(qū)域上進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并以所需活性對表達(dá)的抗trkC抗體變體進(jìn)行篩選。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，融合范圍可以從一個(gè)殘基到含有幾百個(gè)或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括有N-末端甲硫氨酰殘基的抗trkC抗體或與抗原表位標(biāo)記物融合的抗體?？箃rkC抗體分子的其它的插入變體包括將抗trkC抗體的N-或C-末端融合到能夠增加抗體的血清半衰期的酶或多肽上(見下)。
另一種類型的變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗trkC抗體分子中至少有一個(gè)氨基酸殘基被除去，并在這個(gè)位置上插入一個(gè)不同的殘基。倍受矚目的取代誘變位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也考慮了FR變化。表1在“優(yōu)選的取代”一欄下列出了保守性取代。如果此類取代導(dǎo)致了生物活性的變化，然后更加實(shí)質(zhì)性的變化，在表1中被稱為“示范性取代”，或根據(jù)氨基酸類型在下文中進(jìn)一步描述，可以被引入并對產(chǎn)物進(jìn)行篩選。
表1
在抗體的生物學(xué)特性中進(jìn)行的具體修飾是通過選擇取代完成的，這些取代在保持(a)取代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，作為片層或螺旋構(gòu)型，(b)位于靶位點(diǎn)的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小方面的作用顯著不同。按照側(cè)鏈的常規(guī)性質(zhì)可以將天然存在的殘基分成幾類(1)疏水性正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性cys、ser、thr；(3)酸性asp、glu；(4)堿性asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈定向的殘基gly、pro；以及(6)芳香性trp、tyr、phe。
非保守性取代需要將若干這些類型之一與另一種類型交換。
不涉及保持人源化或變體抗trkC抗體的適當(dāng)構(gòu)型的任何半胱氨酸殘基也可以被取代，通常是和絲氨酸，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常的交聯(lián)。相反地，半胱氨酸鍵可以被加到抗體上以改善其穩(wěn)定性(尤其當(dāng)抗體是抗體片段，比如Fv片段時(shí))。
一種特別優(yōu)選的取代變體類型包括取代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體)的一個(gè)或幾個(gè)高變區(qū)殘基。通常，為進(jìn)一步開發(fā)而選擇的所得變體與產(chǎn)生它們的親本抗體相比，將有改進(jìn)的生物學(xué)特性。一種方便的產(chǎn)生此類取代變體的方法是用噬菌體展示進(jìn)行親和力成熟。簡單地說，幾個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))被突變以在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基取代。由此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示，從作為融合體的絲狀噬菌體顆粒到包裝在各個(gè)顆粒內(nèi)的M13的基因III產(chǎn)物。然后按照本文公開的生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)對噬菌體展示的變體進(jìn)行篩選。為了鑒別候備的供修飾的高變區(qū)位點(diǎn)，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒別對抗原結(jié)合有顯著作用的高變區(qū)殘基?；蛘?此外，它有利于分析抗原-抗體復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)以鑒別抗體和人trkC之間的接觸點(diǎn)。根據(jù)本文描述的技術(shù)，這種接觸殘基和鄰近殘基是取代的候選者。一旦產(chǎn)生了此類變體，按這里的描述對變體平板進(jìn)行篩選，可以選擇在一項(xiàng)或多項(xiàng)有關(guān)測定中有突出特性的抗體以供進(jìn)一步改進(jìn)。
(ix)抗體的糖基化變體抗體在它們恒定區(qū)中的保守位點(diǎn)被糖基化(Jefferis和Lund，Chem.Immunol.6511l-128；Wright和Morrison，TibTECH1526-32)。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈影響蛋白質(zhì)的功能(Boyd等，Mol.Immunol.321311-1318；Wittwe和Howard，Biochem.294175-4180)，并且在糖蛋白部分之間的分子內(nèi)反應(yīng)會影響糖蛋白的構(gòu)型和它所表現(xiàn)的三維表面(Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner，Current Opin.Biotech.7409-416)。寡糖可以靶向一個(gè)給定的糖蛋白以根據(jù)特定識別結(jié)構(gòu)確定分子。例如，據(jù)報(bào)道，在無半乳糖基化的IgG中，寡糖部分“翻”出間-CH2空間，末端N-乙酰葡糖胺殘基變得能夠結(jié)合甘露糖結(jié)合蛋白(Malhotra等，Mature Med.1237-243)。用糖肽酶除去在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中制得的CAMPATH-1H(一種重組的人源化鼠單克隆IgG1抗體，它可以識別人淋巴細(xì)胞的CDw52抗原)中的寡糖，可以導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解(CMCL)完全減少(Boyd等，Mol.Immunol.321311-1318)，而用神經(jīng)氨酸酶選擇性除去唾液酸結(jié)果沒有DMCL的損失。已報(bào)道抗體的糖基化影響依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。特別地，據(jù)報(bào)道，用四環(huán)素調(diào)節(jié)β(1，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)，一種催化等分GlcNAc形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，表達(dá)的CHO細(xì)胞有改進(jìn)的ADCC活性(Umana等，Nature Biotech.17176-180)。
抗體的糖基化變體是抗體的糖基化模式被改變的變體。改變意味著刪除一個(gè)或多個(gè)在抗體中發(fā)現(xiàn)的糖類部分，向抗體添加一個(gè)或多個(gè)糖類部分，改變糖基化的構(gòu)成(糖基化模式)、糖基化的范圍等。例如，可以在編碼抗體的核酸序列中除去、改變和/或加入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來制得糖基化變體。
抗體的糖基化通常是N-連接或O-連接的。N-連接是指將糖類部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，是酶促將糖類部分結(jié)合到天冬氨酸側(cè)鏈的識別序列。因此，這些三肽序列中的任一個(gè)出現(xiàn)在多肽中都產(chǎn)生一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指N-乙酰葡糖胺、半乳糖或木糖等糖類中的一種結(jié)合到羥氨基酸上，通常是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
在抗體中加入糖基化位點(diǎn)通常是通過改變氨基酸序列實(shí)現(xiàn)的，這樣它就含有一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。這種改變也可以在原始抗體序列中加入一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基，或被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基取代來完成(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。
編碼抗trkC抗體的氨基酸序列變體的核酸分子是通過這一領(lǐng)域中已知的各種方法制備的。這些方法包括(但不限于)從天然來源中分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況下)或通過寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn)的)誘變、PCR誘變以及盒式誘變先前制得的抗trkC抗體的變體或非變體版本來制備。
不用改變劃線的核苷序列也可以改變抗體的糖基化(包括糖基化模式)。糖基化很大程度上依賴于用來表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞。既然作為潛在的治療劑用于重組糖蛋白表達(dá)的細(xì)胞類型，如抗體很少是天然細(xì)胞，可以考慮對抗體的糖基化模式進(jìn)行顯著的改變(參閱，例如Hse等，J.Biol.Chem.2729062-9070)。此外，對宿主細(xì)胞的選擇，在抗體的重組生產(chǎn)中影響糖基化的因素包括生長模式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)物密度、氧合作用、pH、純化方案等。各種方法都被提議用來在特定的宿主生物中改變糖基化模式，這些方法包括引入或過度表達(dá)某些參與寡糖生產(chǎn)的酶(美國專利5,047,335；5,510,261和5,278,299號)。糖基化或某些類型的糖基化可以通過酶的方法從糖蛋白中除去，例如用內(nèi)糖苷酶H(Endo H)。此外，可以通過遺傳工程方法改造重組宿主細(xì)胞，例如在加工某些類型的多糖時(shí)產(chǎn)生缺陷。這些技術(shù)和類似的技術(shù)在這一領(lǐng)域是熟知的。
通過常規(guī)的糖類測定可以容易地分析抗體的糖基化結(jié)構(gòu)，這些技術(shù)包括凝集素層析法、NMR、質(zhì)譜法、HPLC、GPC、單糖組成分析法、連續(xù)酶消化法，以及HPAEC-PAD，它根據(jù)電荷用高pH的陰離子交換色譜來分離寡糖。出于分析目的的釋放寡糖的方法是已知的，這些方法包括(但不限于)酶處理(通常用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)-β-半乳糖苷酶)、用強(qiáng)堿性環(huán)境消除以釋放主要的O-連接結(jié)構(gòu)、以及用無水肼釋放N-連接和O-連接的寡糖的化學(xué)方法。
(x)抗體的其它修飾這里所公開的抗trkC抗體還可以被制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體是用這一領(lǐng)域中已知的方法制備的，比如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774030(1980)；和美國專利4,485,045和4,544,545號中描述的方法。具有提高的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開在美國專利5,013,556號中。
特別有用的脂質(zhì)體可以和含有磷酯酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)成分用反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體是通過有規(guī)定孔徑的膜中擠出以產(chǎn)生有所需直徑的脂質(zhì)體。如Marin等，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所描述的，本發(fā)明抗體的Fab’片段通過二硫鍵交換反應(yīng)可以和脂質(zhì)體共軛。脂質(zhì)體中任選地含有一種化學(xué)治療劑(比如阿霉素)。參閱Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)1484(1989)。
通過使抗體與能夠?qū)⑶八?如，肽基化學(xué)治療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)化成活性抗癌藥物的前藥活化酶共軛，本發(fā)明的抗體也可以用在ADEPT中。參見，例如，WO 88/07378以及美國專利4,975,278號。
對ADEPT有用的免疫共軛物的酶組分包括任何能夠在此類途徑中作用于藥物前體以使其變成更有活性、細(xì)胞毒形式的酶。
用于本發(fā)明的方法中的酶包括(但不限于)用來將含有磷酸的前藥轉(zhuǎn)變成游離藥物的堿性磷酸酶；用來將含有硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)變成游離藥物的芳基硫酸酯酶；用來將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；蛋白酶類，比如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶以及組織蛋白酶(比如組織蛋白酶B和L)，可以用它們將含有肽的前藥轉(zhuǎn)變成游離藥物；用來轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代基的前藥的D-丙氨酰羧肽酶類；用來將糖基化的前藥轉(zhuǎn)變成游離藥物的糖類切割酶類，比如半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用來將與內(nèi)酰胺衍生的前藥轉(zhuǎn)變成游離藥物的內(nèi)酰胺酶；以及用來將分別與苯氧基乙?；虮揭阴；鶊F(tuán)在它們的氨基氮上衍生的藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素酰胺酶類，比如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗體，在此領(lǐng)域中也被稱為“抗體酶”，也可以被用來將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)變成游離的活性藥物(參閱，例如，Massey，Nature328457-458(1987))。可以按照這里的描述制備抗體-抗體酶共軛物以將抗體酶傳遞到腫瘤細(xì)胞種群中。
用此領(lǐng)域熟知的技術(shù)，比如使用上面討論的異雙功能交聯(lián)試劑可以將本發(fā)明的酶類共價(jià)連接到抗trkC抗體上?；蛘?，可以用此領(lǐng)域中熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建連接到本發(fā)明的酶的至少一個(gè)功能活性部分上的至少含有本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見，例如，Neuberger等，Nature 312604-608)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，可能需要使用抗體片段而不是完整的抗體。在這種情況下，可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。例如，這可以通過將補(bǔ)救受體結(jié)合的抗原表位摻入到抗體片段中實(shí)現(xiàn)(例如，通過突變抗體片段中合適的區(qū)域，或在肽標(biāo)記物中摻入抗原表位，然后再(例如)通過DNA或肽合成，將標(biāo)記物融合到抗體片段的任一端或中間)。參見公布于1996年10月17日的WO96/32478。
補(bǔ)救受體結(jié)合的抗原表位通常含有一個(gè)區(qū)域，其中Fc域的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)上的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似位置上。更加好的是，F(xiàn)c域的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)上的三個(gè)或更多的殘基被轉(zhuǎn)移。再好的是，抗原表位取自Fc域(比如來自IgG)的CH2域并被轉(zhuǎn)移到抗體的CH1、CH3或VH域或多個(gè)此類區(qū)域。或者，抗原表位取自Fc域的CH2域并被轉(zhuǎn)移到抗體的CL域或VL域，或這兩個(gè)域。
人源化或變體抗trkC抗體(包括糖基化變體)的共價(jià)修飾也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如果可行的話，它們可以通過化學(xué)合成或通過酶或化學(xué)切割抗體的方法制得。使抗體的靶向氨基酸殘基與能夠與選定的側(cè)鏈或N-或C末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生試劑反應(yīng)，可以在分子中引入抗體的其它類型的共價(jià)修飾。示范性的多肽的共價(jià)修飾描述在美國專利5,534,615號中，在此特別將其引入以供參考。優(yōu)選的抗體共價(jià)修飾類型包括將抗體連接到多種非蛋白質(zhì)聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧乙烯)中的一種上，例如在美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337號中提到的。
2.載體、宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的非人，例如鼠和人抗trkC的抗體(包括非人抗體的人源化版本)的分離的核酸，載體和包括核酸的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)抗體的重組技術(shù)。
為重組生產(chǎn)抗體，編碼它的核酸可以被分離并插入可復(fù)制的載體中以便進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以通過同源重組生產(chǎn)抗體，如美國專利5,204,244號中所描述的，在此特別將其引入以供參考。用常規(guī)的步驟容易分離并測序編碼單克隆抗體的DNA(例如，使用能夠與編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。許多載體都是可以獲得的。載體的成分通常包括(但不限于)以下中的一個(gè)或多個(gè)一個(gè)信、一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、一個(gè)增強(qiáng)子元件、一個(gè)啟動(dòng)子以及一段轉(zhuǎn)錄終止序列，例如，如出版于1996年7月9日的美國專利5,534,615號中所描述的，在此特別將其引入以供參考。
用來在載體中克隆或表達(dá)DNA的合適的載體細(xì)胞是原核生物、酵母或上述高等真核細(xì)胞。用于這一目的的合適的原核生物包括真細(xì)菌類，比如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性的生物，例如腸桿菌科(如，大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬(如，鼠傷寒沙門氏菌)、沙雷氏菌屬(如粘質(zhì)沙雷氏菌(serratia marcescans))和志賀氏菌屬，以及桿菌，如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(如，公布于1989年4月12日的DD 266,710中所描述的地衣芽孢桿菌)，假單胞菌屬如銅綠假單胞菌和鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，盡管其它菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)以及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些例子是為了闡述而不是限制。
除了原核生物，絲狀真菌或酵母之類的真核微生物也是編碼抗trkC抗體的載體的合適的克隆或表達(dá)宿主。低等真核宿主微生物中最常用的是釀酒酵母或普通的面包酵母。然而，一些其它的屬、種和菌株通常是可得到的和有用的，比如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母菌屬宿主如，例如，乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆弱克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.Wickeramii)(ATCC24，178)、沃爾特克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)以及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；耶羅威亞酵母屬(yarrowia)(歐洲專利402,226號)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(歐洲專利183,070號)；假絲酵母菌(Candida)；里西亞木霉(Trichoderma reesia)(歐洲專利244,234號)；粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)；西方許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及絲狀真菌如，例如，脈孢屬、青霉屬、彎頸霉(Tolypocladium)以及曲霉屬宿主(如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉)。
用來表達(dá)糖基化的抗trkC抗體的合適的宿主細(xì)胞是從多細(xì)胞生物中衍生的。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了各種桿狀病毒毒株及其變體以及來自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑尾果蠅(Drospophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的相應(yīng)允許的昆蟲宿主細(xì)胞。各種用于轉(zhuǎn)染的病毒菌株是公開可得到的，例如，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(NPV)的L-1變體和家蠶核型多角體病毒的Bm-5毒株，根據(jù)本發(fā)明，此類病毒在這里可被用作病毒，尤其是用來轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽牛花、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。
然而，人們對脊椎動(dòng)物的細(xì)胞的興趣最濃厚，且脊椎動(dòng)物的細(xì)胞在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中的繁殖已經(jīng)是常規(guī)的過程。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子是被SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)轉(zhuǎn)化的猴腎CV1品系；人胚胎腎臟品系(293或供懸浮培養(yǎng)的亞克隆的293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.3659)；幼年倉鼠腎臟細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216)；小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251)；猴腎臟細(xì)胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲青猴腎臟細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(Hela，ATCC CCL 2)；犬腎臟細(xì)胞(MDCK，ATCC CLL 34)；水牛大鼠肝臟細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝臟細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC 5細(xì)胞；以及FS4細(xì)胞。
用上述抗trkC抗體生產(chǎn)的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并將細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)的經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)以誘導(dǎo)啟動(dòng)子的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
用來生產(chǎn)本發(fā)明的抗trkC抗體的宿主細(xì)胞可以培養(yǎng)在各種培養(yǎng)基中。商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基，比如Ham’s F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Sigma)是適合培養(yǎng)宿主細(xì)胞的。此外，在Ham等，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)，美國專利序列號第4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利參考30,985中描述的任何培養(yǎng)基都可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。按照需要，可以在這些培養(yǎng)基中添加激素和/或其它生長因子(比如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(比如HEPES)、核苷酸(比如腺苷和胸苷)、抗生素(比如GENTAMYCINTM藥物)、微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的最終濃度存在的無機(jī)化合物)以及葡萄糖或等當(dāng)量的能源。還可以包括精通此領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的任何其它適宜濃度的必要添加物。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，就是前面選擇用以供表達(dá)的宿主細(xì)胞使用的條件，這對于此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員是顯而易見的。
當(dāng)采用重組技術(shù)時(shí)，可以在壁膜間隙中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗體，或直接分泌入培養(yǎng)基中。如果抗體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，作為第一個(gè)步驟，宿主細(xì)胞或裂解片段的顆粒碎片(例如)通過離心或超濾除去。Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分離分泌到大腸桿菌的壁膜間隙的抗體的步驟。簡單地說，將細(xì)胞漿在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氯(PMSF)中融解約30分鐘以上。通過離心可以除去細(xì)胞碎片。若抗體是分泌入培養(yǎng)基中，通常首先用商業(yè)上獲得的蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)將此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液濃縮。在以下任一步驟中可以含有PMSF之類的蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解作用，也可以加入抗生素以防止外來污染物的生長。
可以用(例如)羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析和親和層析法純化從細(xì)胞中制得的抗體組合物，親和層析是優(yōu)選的純化方法。作為親和配體的蛋白質(zhì)A的適合性依賴于存在于抗體中的任何免疫球蛋白Fc域的種類和同種型。蛋白質(zhì)A可用來純化抗體，這些擠體是基于人的1、2或4重鏈(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。對所有的小鼠同種型和人3都是推薦蛋白質(zhì)G(Guss等，EMBOj.515671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)通常是瓊脂糖，但其它的基質(zhì)也適用。與瓊脂糖相比，機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)，如受控的多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許較快的流速和較短的程序時(shí)間。當(dāng)抗體含有CH3域時(shí)，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，菲利浦斯勃格，新澤西州)對于純化是有用的。根據(jù)要回收的抗體，其它的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，比如在離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上層析、肝素SEPHAROSETM上層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(比如聚天冬氨酸柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸銨沉淀也是可行的。
在任何初步純化步驟之后，可以將含有感興趣的抗體以及雜質(zhì)的混合物進(jìn)行低pH疏水相互反應(yīng)層析，使用pH約在2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選低鹽濃度的(例如，約含0-0.25M鹽)。
3.抗trkC促效抗體的鑒定例如，可以用美國專利5,766,863和5,891,650中描述的激酶受體活化(KIRA)測定法鑒定促效抗體。這種ELISA型測定適合于定性或定量測量激酶的活化(通過測量受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(rPTK，如trk受體)激酶域的自身磷酸化)，并可用來對選定的rPTK的促效劑或拮抗劑進(jìn)行鑒定和表征。這種測定的第一個(gè)階段涉及激酶受體的激酶域的磷酸化，當(dāng)為trkC受體時(shí)，其中，受體出現(xiàn)在真核細(xì)胞的細(xì)胞膜上。這種受體可以是內(nèi)源受體或是編碼受體的核酸，或是可被轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中的受體構(gòu)建物。通常，在第一固相(例如，第一測定平板的一個(gè)孔)涂上此類細(xì)胞(通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系)基本上均勻的群體，這樣細(xì)胞就粘附在固相上了。通常，細(xì)胞是附著的并因此自然粘附在第一固相上。如果使用“受體構(gòu)建物”，它通常包括激酶受體和標(biāo)記多肽的融合。在測定的ELISA部分中，標(biāo)記多肽被捕獲劑(通常是捕獲抗體)識別。分析物，比如候選促效劑然后被加到含有粘附細(xì)胞的孔中，這樣，酪氨酸激酶受體(如trkC受體)就被暴露在分析物中(或與分析物接觸)。這種測定使得人們能夠識別所感興趣的酪氨酸激酶受體配體(如trkC)的促效劑配體。用這種測定有可能檢測酪氨酸激酶受體的拮抗劑。為檢測組織促效劑與受體結(jié)合的拮抗劑配體，粘附的細(xì)胞首先被暴露在可疑的拮抗劑配體中，然后暴露在促效劑配體中，這樣就可以測定受體結(jié)合的競爭性抑制和活化。同樣，這種測定可以確定與促效劑配體結(jié)合的拮抗劑從而降低或消除其與rPTK結(jié)合或活化rPTK的能力。為檢測此類拮抗劑，將可疑的rPTK的拮抗劑和促效劑一起培育，然后將粘附的細(xì)胞暴露在配體的這種混合物中。暴露在分析物中以后，用裂解緩沖液(其中含有可溶性的去污劑)溶解粘附的細(xì)胞并輕輕攪動(dòng)，由此釋放的細(xì)胞裂解液被直接置于測定的ELISA部分，而不需要將細(xì)胞裂解物濃縮或澄清。
然后對制得的細(xì)胞裂解物進(jìn)行測定ELISA階段。作為ELISA階段的第一個(gè)步驟，用與酪氨酸激酶受體特異性結(jié)合的捕獲劑(通常是捕獲抗體)包涂第二固相(通常是ELISA微量滴定平板的一個(gè)孔)，或者，如果是受體構(gòu)建物的話，就用與標(biāo)記多肽特異性結(jié)合的捕獲劑。對第二固相進(jìn)行了包涂，這樣捕獲劑就附著在第二固相上了。捕獲劑通常是單克隆抗體，但是，如這里的實(shí)施例所描述的，也可以使用多克隆抗體。然后將所得的細(xì)胞裂解物暴露在粘附的捕獲劑中(或與粘附的捕獲劑接觸)，這樣受體或受體構(gòu)建物就粘附在第二固相上(或被第二固相捕獲)。然后進(jìn)行洗滌步驟，以除去未結(jié)合的細(xì)胞裂解物，留下被捕獲的受體或受體構(gòu)建物。然后將粘附或捕獲的受體或受體構(gòu)建物暴露在能夠識別酪氨酸激酶受體中被磷酸化的酪氨酸殘基的抗磷酸酪氨酸的抗體中，或與這種抗體接觸。在優(yōu)選的實(shí)施例中，抗磷酸酪氨酸抗體共軛連接在(直接或間接)催化非放射性顯色試劑變色的酶上。故而可以通過隨后的試劑變色來檢測受體的磷酸化。這種酶可以直接結(jié)合在抗磷酸酪氨酸抗體上，或者共軛的分子(如，生物素)可以共軛連接在抗磷酸酪氨酸抗體上，且這種酶隨后可以通過共軛的分子結(jié)合到抗磷酸酪氨酸抗體上。最終，比如可以通過顯色劑的變色來測定抗磷酸酪氨酸抗體與被捕獲的受體或受體構(gòu)建物的結(jié)合。
初步鑒定后，可以通過已知用來測試靶生物活性的生物測定法進(jìn)一步確認(rèn)并精制促效抗體。例如，可以用實(shí)施例1中所描述的PC12軸突生長測定來檢測模擬NT-3活性的抗trkC單克隆抗體的作用，并在已知的神經(jīng)退化疾病的動(dòng)物模型，比如實(shí)施例2中所描述的順氯氨鉑和吡哆醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病的示范性動(dòng)物模型中確認(rèn)。
3.抗trkC的促效抗體的治療和診斷應(yīng)用本發(fā)明的抗trkC的促效抗體被認(rèn)為在治療(包括預(yù)防)與細(xì)胞退化或機(jī)能失常有關(guān)的病理學(xué)病癥是有效的。特別地，抗trkC的促效抗體是治療各種(慢性)神經(jīng)退化病癥和急性神經(jīng)細(xì)胞損傷的有希望的候選藥物。這類神經(jīng)退化病癥包括(但不限于)周圍神經(jīng)??；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙，比如肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS，Lou Gehrig氏病)、面神經(jīng)麻痹和各種與脊髓肌萎縮或麻痹有關(guān)的癥狀；以及其它人神經(jīng)退化疾病，比如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癲癇、多發(fā)性硬化、亨延頓舞蹈病、唐氏綜合癥、神經(jīng)性耳聾和梅尼埃爾氏病，以及急性神經(jīng)細(xì)胞損傷，例如由于外傷或脊索損傷造成的。
據(jù)信，本發(fā)明的抗trkC的抗體特別適合于治療周圍神經(jīng)病、影響周圍神經(jīng)的神經(jīng)退化性障礙，這大多數(shù)是由運(yùn)動(dòng)、感覺、感覺運(yùn)動(dòng)或自主神經(jīng)中的一種或幾種功能失調(diào)造成的。周圍神經(jīng)病可以是，例如，遺傳獲得的，可以是有全身疾病造成的，可以是由毒性劑(如神經(jīng)毒性藥物，例如抗癌劑或是工業(yè)或環(huán)境污染)導(dǎo)致的，或是可以是特發(fā)的。因此，周圍感覺神經(jīng)病的特征是周圍感覺神經(jīng)元功能退化、降低或衰竭，這可能是(例如)作為糖尿病(糖尿病性神經(jīng)病)、癌癥中抑制細(xì)胞的藥物治療(例如用長春新堿、順氯氨鉑、氨甲蝶呤或3’-疊氮-3’-脫氧胸腺嘧啶等化學(xué)治療劑治療)、酒精中毒、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)或遺傳素質(zhì)的后果發(fā)生。遺傳獲得性的周圍神經(jīng)病包括(例如)雷弗素姆氏病、克拉伯氏病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、法布萊氏病、德雅蘭-素塔斯綜合征、無β脂蛋白血癥以及沙-馬-圖(CMT)病(也被稱為腓側(cè)肌萎縮或遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病(HMSN))。
基于已被證實(shí)的trkC受體的天然配體NT-3對促進(jìn)周圍血淋巴細(xì)胞增殖的能力，本發(fā)明的抗trkC的促效抗體也可被用作治療中性白細(xì)胞減少癥、各種感染和腫瘤的治療劑。既然trkC的表達(dá)不限于神經(jīng)元，人們預(yù)期在不限制神經(jīng)細(xì)胞的情況下，可以用抗trkC的促效抗體來預(yù)防或治療通常以細(xì)胞退化為特征的障礙。
本發(fā)明的抗trkC的抗體也可被用來誘導(dǎo)血管生成，或治療其中需要誘導(dǎo)血管生成的病理癥狀/疾病。此類病理癥狀包括，例如，不考慮潛在病理的心臟缺血，包括腦循環(huán)不足造成的腦血管障礙。在治療創(chuàng)傷，包括潰瘍、鐮形細(xì)胞疾病的糖尿病并發(fā)癥和外科后創(chuàng)傷時(shí)可能也需要血管生成。
本發(fā)明的抗trkC的抗體還可用于診斷與細(xì)胞退化，尤其是上面所列的神經(jīng)退化疾病有關(guān)的疾病。
對于診斷用途，通常用可檢測的部分標(biāo)記抗體。可獲得各種各樣的標(biāo)記，它們通常被分成以下幾類(a)放射性同位素，比如35S、14C、125I、3H和131I。可以用(例如)Current Protocolsin Immunology，第1、2卷，Coligen等編，Wiley-Interscience，紐約。紐約州，(1991年出版)中描述的技術(shù)用放射性同位素標(biāo)記抗體，并通過閃爍計(jì)數(shù)來測定放射性。
(b)熒光標(biāo)記，如稀土金屬鰲合物(銪鰲合物)或熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、麗絲胺、藻紅蛋白和德克薩斯紅是可以獲得的?？梢杂?例如)Current Protocols in Immunology，(同上)所描述的技術(shù)使熒光標(biāo)記與抗體共軛。用熒光計(jì)可以將熒光定量。
(c)各種酶-底物標(biāo)記是可以獲得的，且美國專利4,275,149號提供了一些綜述。酶通常催化顯色底物的化學(xué)變化，這可以用各種技術(shù)來檢測。例如，酶可以催化底物變色，這可以通過分光光度測量。或者，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。上面描述了定量熒光改變的技術(shù)。用化學(xué)反應(yīng)可以使化學(xué)發(fā)光底物被電子學(xué)方法激發(fā)，然后可以發(fā)射出可被檢測的光(例如，用化學(xué)發(fā)光計(jì))或向熒光受體提供能量。酶標(biāo)記的例子包括熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利4,737,456號)、熒光素、2，3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶(如辣根過氧化物酶(HRPO))、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-β-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(比如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。將酶共軛連接到抗體上的技術(shù)描述在O’Sullivan等，制備用于酶免疫測定的酶-抗體共軛物的方法(Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay)，刊登于Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van Vunakis編)，學(xué)術(shù)出版社，紐約，73147-166(1981)。
酶-底物結(jié)合物的例子包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)和過氧化氫酶作為底物，其中過氧化氫酶氧化一種染料前體底物(例如，鄰二苯胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)和對硝基苯磷酸作為顯色底物；以及(iii)-D-半乳糖苷酶(-D-GAl)和顯色底物(例如，對硝基苯-D-半乳糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形酮酰-D-半乳糖苷酶。
對于精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，還可以獲得的許多其它酶-底物結(jié)合物。對于這些綜述可以參閱美國專利4,275,149和4,318,980號。
有時(shí)，標(biāo)記直接和抗體共軛連接。熟練的技術(shù)人員將意識到有很多方法都可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。例如，抗體可以和生物素共軛連接，且上面提到的三種標(biāo)記中的任何一種都可以和抗生物素蛋白共軛連接，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白特異性結(jié)合，因此，標(biāo)記可以這種非直接的方式與抗體共軛連接。或者，為使標(biāo)記非直接與抗體共軛連接，將抗體與小的半抗原(如，地高辛)共軛連接，并使一種不同類型的上面提到的標(biāo)記與抗半抗原抗體(如，抗地高辛抗體)共軛連接。因此，就可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記和抗體的非直接共軛連接。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，抗trkC抗體不需要被標(biāo)記，并且可以用與抗trkC抗體結(jié)合的標(biāo)記的抗體來檢測它的存在。
本發(fā)明的抗體可被用在任何一種已知的測定方法中，比如競爭性結(jié)合測定、直接和間接的夾心測定以及免疫沉淀測定。Zola，單克隆抗體技術(shù)手冊(MonoclonalAntibodiesA Manual of Technique)，第147-158頁(CRC出版公司，1987)。
競爭性結(jié)合測定依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與測試樣品分析物競爭與有限量的抗體結(jié)合的能力。測試樣品中trkC蛋白的量和變得與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量是成反比的。為了便于對變得結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量進(jìn)行測定，抗體在競爭前或后通常是不溶的，這樣就可以很方便地將結(jié)合到抗體上的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物與未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物分開。
夾心測定涉及使用兩種抗體，每一種都能夠與要測蛋白質(zhì)的不同的免疫原性部分或抗原表位結(jié)合。在夾心測定中，測試樣品分析物被固定在固相載體上的第一抗體結(jié)合，因此，第二抗體與分析物結(jié)合，這就形成了一種不溶的三部分復(fù)合體。參見，例如，美國專利4,376,110號。第二抗體自身可以被可檢測的部分標(biāo)記(直接夾心測定)，或者可以用可檢測部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體來檢測(間接夾心測定)。例如，一種類型的夾心測定是ELISA測定，這種方法中，可檢測的部分是酶。
這種抗體也可用于體內(nèi)診斷測定。通常，抗體用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標(biāo)記，這樣就可以用免疫閃爍照相法將感興趣的細(xì)胞或組織定位。
按照此領(lǐng)域已知的技術(shù)，這種抗體也可以用作病理學(xué)中的染色試劑。
據(jù)信，本發(fā)明的抗trkC促效抗體作為治療劑有許多優(yōu)于NT-3的地方，包括改進(jìn)的效果、改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(pK)和生物利用率，并且在施用后沒有痛覺過敏。
4.藥物制劑本發(fā)明抗體的治療制劑是為儲存制備的，方法是將有所需純度的抗體和任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.編(1980))混合，制成凍干制劑或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在用藥劑量和濃度對受體是無毒的，并且包括像磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它無機(jī)鹽之類的緩沖液；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(比如)氯化十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六烴季銨；殺藻胺、苯索氯銨；酚、丁基或芐基醇；烷基對羥基苯甲酸酯類，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽類；蛋白質(zhì)類，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸類，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi)的其它碳水化合物；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的反荷離子，如鈉離子；金屬復(fù)合物(例如，鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEETM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
這里的制劑還可以含有多于一種的被治療的特定征兆所必需的活性化合物，它們最好有互補(bǔ)的活性而相互之間不會有不利的影響。這類分子以足夠用于所需目的的量存在于組合物中。
這種活性成分可以被包載在微膠囊中，例如，可以通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合作用制備微膠囊，例如，膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、毫微顆粒和毫微囊劑)或巨乳劑中分別有羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸脂)微膠囊。此類技術(shù)描述在Remington’s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.編(1980)中。
供體內(nèi)施用的制劑必需是無菌的。這可以通過無菌濾膜過濾很容易的實(shí)現(xiàn)。
可以制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適的例子包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半透基質(zhì)，這些基質(zhì)以成型物體的形式出現(xiàn)，如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸脂)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919號)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron DepotTM(含有乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林的可注射的微球體)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類的聚合物能夠釋放分子超過100天，某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間則較短。當(dāng)膠囊化的抗體在體內(nèi)保留較長時(shí)間時(shí)，暴露在37℃的潮濕環(huán)境中會使它們變性或聚集，這會造成生物活性的喪失并有可能改變免疫原性。根據(jù)所涉及的機(jī)理可以設(shè)計(jì)出合理的穩(wěn)定的方法。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是由于通過硫-二硫交換在分子間形成了S-S鍵，可以通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制水分含量、用合適的添加劑以及改進(jìn)特定聚合物基質(zhì)組成以獲得穩(wěn)定性。
根據(jù)(例如)治療目的、用藥途徑和患者的狀況，有效量的本發(fā)明的抗體可以用于治療。由此，治療學(xué)家有必要對劑量進(jìn)行滴定并根據(jù)需要改變用藥途徑以獲得最佳療效。典型的日劑量可以從約1g/kg至100mg/kg或更多，這取決于上面提到的因素。通常，臨床醫(yī)師將施用一種本發(fā)明的分子直至劑量能夠提供所需的生物學(xué)功效。通過常規(guī)的測定很容易監(jiān)測這種治療的進(jìn)展。
可以通過此領(lǐng)域中已知的任何常規(guī)途徑給藥，這包括(但不限于)靜脈、皮下、局部、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、大腦內(nèi)、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和腹膜內(nèi)用藥。
4.基因治療編碼本發(fā)明抗體的核酸也可被用于各種(慢性)神經(jīng)退化性障礙和急性神經(jīng)細(xì)胞損傷，尤其是遺傳獲得的周圍神經(jīng)病的基因治療。已經(jīng)進(jìn)行了兩種基礎(chǔ)性的基因治療研究體外基因治療和體內(nèi)基因治療。在體外基因治療中，從受試者中取出細(xì)胞并在體外培養(yǎng)。在體外在細(xì)胞中引入一種功能性替換基因，在培養(yǎng)物中擴(kuò)增被修飾的細(xì)胞，然后再植入在受試者上。在體內(nèi)基因治療中，沒有從受試者中取出靶細(xì)胞。而是將被轉(zhuǎn)移的基因引入原位受體的細(xì)胞中，即在受體內(nèi)引入受體的細(xì)胞。
已經(jīng)報(bào)道并綜述了一些在人體中進(jìn)行體外基因治療研究，例如，Anderson，Science256808-813(1992)和Miller，Nature357455-460(1992)。
在幾種動(dòng)物模型中證實(shí)了體內(nèi)基因治療的成活力，如Felgner等在Nature349351-352(1991)中作了綜述。已經(jīng)報(bào)道了直接基因轉(zhuǎn)移，例如，將其轉(zhuǎn)移到肌肉組織中(Ferry等，Proc Natl.Acad.Sci.888377-8781；Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA892581-2584)；轉(zhuǎn)移到動(dòng)脈壁中(Nabel等，Science 2441342-1344)；以及轉(zhuǎn)移到神經(jīng)系統(tǒng)中(Price等，Proc.Natl.Acad.Sci.84156-160)。
由此，本發(fā)明還提供了適合將編碼抗trkC促效抗體的多核苷酸傳遞入細(xì)胞的傳遞載體(無論是體內(nèi)或體外)。通常，編碼抗體(例如線性抗體或抗體鏈)的多核苷酸將可操作地連接到啟動(dòng)子和異源多核苷酸上。適合將編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的傳遞載體包括非病毒載體和病毒載體。Verma和Somia，Nature389239-242(1997)。
各種用來傳遞編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸的非病毒載體是此領(lǐng)域已知的，并包含在本發(fā)明中。編碼抗trkC抗體的多核苷酸可以作為裸DNA被傳遞到細(xì)胞中(美國專利5,692,622號，WO 97/40163)。或者，編碼抗trkC抗體的多核苷酸可以通過各種方法與多種物質(zhì)(傳遞形式)連接傳遞至細(xì)胞，這些物質(zhì)包括(但不限于)陽離子脂質(zhì)、生物相容聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒被膜；金屬顆粒；以及細(xì)菌。傳遞載體可以是微粒。這些各種物質(zhì)的混合物或共軛物也可被用作傳遞載體。編碼抗體的多核苷酸可以和這些各種形式的輸遞非共價(jià)或共價(jià)連接。脂質(zhì)體可以被靶向特定的細(xì)胞類型，如，靶向腎小球上皮細(xì)胞。
病毒載體包括(但不限于)DNA病毒載體，如基于腺病毒的那些載體、單純皰疹病毒、痘病毒(如牛痘病毒)和細(xì)小病毒，包括腺伴隨病毒；和RNA病毒載體，包括(但不限于)逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠白血病病毒和慢病毒(如人免疫缺陷病毒)。Naldini等，Science272263-267(1996)。
可以用此領(lǐng)域已知的任何方法將含有編碼抗trkC抗體的多核苷酸的非病毒傳遞載體引入宿主細(xì)胞和/或靶細(xì)胞，比如用磷酸鈣共沉淀技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；電穿孔；電透化作用；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；射擊轉(zhuǎn)染；biolistic法(包括微粒轟擊、快速注射和針注射以及針筒注射)；或通過微注射。許多轉(zhuǎn)染的方法是此領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知的。
可以通過注射將病毒傳遞載體引入細(xì)胞?；蛘?，可以將病毒載體與上述任何非病毒傳遞載體合并以傳遞入細(xì)胞。例如，病毒載體可以和陽離子脂質(zhì)混合(Hodgson和Solaiman，Nature Biotechnol.14339-342)；或和薄片狀脂質(zhì)體混合(Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA743471；和Faller等，J.Virol.49269)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼本發(fā)明抗trkC抗體的重鏈和輕鏈(包括片段)的核酸將出現(xiàn)在同樣的多順反子表達(dá)載體上，比如美國專利4,965,196和4,713,339中公開的那些。多順反子表達(dá)載體含有編碼二級蛋白質(zhì)和所需蛋白質(zhì)的序列，其中的二級序列和所需序列由同一個(gè)啟動(dòng)子控制。這個(gè)編碼序列被翻譯終止和起始信號密碼子分開。二級序列的表達(dá)影響對所需蛋白質(zhì)序列表達(dá)的控制，和作為標(biāo)記用來選擇被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的二級蛋白質(zhì)的功能。
體內(nèi)基因治療中，可以通過，例如，靜脈(i.v.)注射向受體施用載體。合適的滴定度依賴于各種因素，比如特定載體的選擇、宿主、所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度以及被治療疾病的嚴(yán)重程度。
將通過以下非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1抗trkC促效單克隆抗體的生產(chǎn)和鑒定抗體的生產(chǎn)和同種型化如Mendez等(同上)所描述的在Frieund或Ribi佐劑中用20μg人trkC-IgG(Shelton等，J.Neurosci.15477-491)腹膜內(nèi)、通過后爪或皮下將野生型Balb/C小鼠或產(chǎn)生人IgG2或IgG4的轉(zhuǎn)基因小鼠(Xenomice，描述在Mendez等，Nature Genetics 15146-156)超免疫。將免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(X63.Ag8.653，ATCC羅克維爾，馬里蘭州)融合。用253只Xenomice和35只野生型Balb/C小鼠完成總共33個(gè)融合體。用trkC-IgG進(jìn)行直接ELISA對平板(共21,734個(gè)孔)進(jìn)行最初的篩選。ELISA篩選鑒定了684個(gè)trkC陽性的雜交瘤，然后對它們?nèi)窟M(jìn)行trkC KIRA(激酶活化的受體測定)以評價(jià)促效劑的活性。KIRA鑒定了14個(gè)Xenomouse衍生的和22個(gè)野生型Balb/C小鼠衍生的能夠分泌抗trkC促效抗體的雜交瘤。然后通過限制稀釋亞克隆這些雜交瘤，再次測定以確認(rèn)促效劑的活性，然后將它們注射進(jìn)Pristane-primed Balb/C小鼠或裸鼠以誘導(dǎo)腹水(Hongo等，Hybridoma 14253-260)。通過蛋白質(zhì)A親和層析純化存在于腹水中的單克隆抗體(Hongo等，同上)。Xenomouse和野生型Balb/C小鼠融合體的特定融合效率(陽性數(shù)目/被篩選的孔數(shù))都是3％。Xenomouse和野生型Balb/C小鼠融合體對促效單克隆抗體的發(fā)病率(促效劑/trkC ELISA陽性的數(shù)目)分別為3％和8％。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，用GIBCO BRL量尺(GIBCO BRL dipstick)或Zymed小鼠打印機(jī)同種型試劑盒(Zymed mouse-typer isotyping kit)鑒定鼠單克隆抗體的同種型。Xenomice是IgG2或IgG4品系的，產(chǎn)生抗體相應(yīng)的同種型。表1顯示了各種人和鼠抗trkC單克隆抗體的同種型。總共鑒定了8種人IgG2、6種人IgG4、7種鼠IgG1、10種鼠IgG2a和5種鼠IgG2b的單克隆抗體。根據(jù)KIRA測定的結(jié)果，具有最有效的促效活性的單克隆抗體(在表2中用星號表示)被選出以供進(jìn)一步鑒定。
表2人單克隆抗體(共14種)IgG2同種型(8種單克隆抗體)IgG4同種型(6種單克隆抗體)2.5.1*4.86.1.2*23376.4.1*233823422339234323482344*2349*2345*2346
鼠單克隆抗體(共22種)IgG1(7)IgG2a(10)IgG2b(5)IgG322492248*22522250*2272 22732253*2251 227722542255 22792256*2274 22802257227522602276227822812282對促效活性的測定a.KIRA測定法用兩種生物測定法來測定抗trkC單克隆抗體的NT-3促效活性。激酶活化的受體測定(KIRA)，在上面已經(jīng)詳細(xì)討論過了，根據(jù)用配體例如NT-3或促效單克隆抗體刺激，測量被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中trkC的酪氨酸磷酸化(Sadick等，Exp.CellRes.234354-361)。在KIRA刺激緩沖液(F12/DMEM 50∶50含有2％牛血清白蛋白(BSA；Intergen公司，Purchase，紐約)和25mM Hepes，經(jīng)0.2μm濾膜過濾)中將單克隆抗體稀釋至27μg/ml。繼續(xù)以1∶3的比例在刺激培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋單克隆抗體(共稀釋8次；濃度從0.01-180mM)。將中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(被和26種衍生自HSV糖蛋白D(gD)的氨基酸多肽標(biāo)記抗原表位融合的trkC穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染)接種(5×104細(xì)胞/孔)并使其生長在96孔的細(xì)胞培養(yǎng)平板上。然后用NT-3(作為陽性對照)或各種抗trkC單克隆抗體刺激這些細(xì)胞，用0.1；1.56；3.13；6.25；12.5；50和100ng/ml的連續(xù)稀釋。所有的稀釋物一式兩份測定6小時(shí)。用基本上如Sadick等(同上)描述的方法進(jìn)行測定。簡單地說，用Triton X-100裂解細(xì)胞，用抗gD抗原表位的抗體在ELISA中捕獲細(xì)胞裂解物中出現(xiàn)的trkC，用與酶適當(dāng)共軛的抗磷酸酪氨酸抗體檢測并定量磷酸化的trkC。不直接抗trkC的單克隆抗體(抗IL8IgG2Xenomous衍生的人抗體或抗gp120 IgG1鼠單克隆抗體)被用作陰性對照。如圖1(A和B)所示，所有選擇的抗trkC單克隆抗體都能模擬NT-3的活性，因?yàn)樗鼈兡軌虼碳rkC受體的酪氨酸磷酸化。人抗trkC單克隆抗體(圖1A)顯示了比鼠抗trkC單克隆抗體(圖1B)更加有效的促效活性。例如，最好的人抗trkC單克隆抗體比最好的鼠抗trkC單克隆抗體要有效10倍。此外，人單克隆抗體與NT-3幾乎同樣有效，尤其是在較低的濃度范圍時(shí)。
b.PC12軸突生長物測定法另一種用來測定抗trkC單克隆抗體的NT-3模擬活性的方法是PC12軸突生長物測定法。這種測定法測量了響應(yīng)合適配體刺激中由大鼠嗜鉻細(xì)胞(pheocytochroma cell)(PC12)形成的軸突的生長。這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源trkA，因此可以響應(yīng)NGF。然而，它們不表達(dá)內(nèi)源trkC，因此用trkC表達(dá)構(gòu)建物將它們轉(zhuǎn)染以便誘發(fā)對NT-3及其促效劑的響應(yīng)。用全長的人trkC轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞(Urfer等，Biochem.364775-4781；Tsoulfas等，Neuron 10975-990)并置于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)平板中(1000細(xì)胞/孔)。轉(zhuǎn)染三天后，加入三倍量的抗trkC單克隆抗體(濃度從0.0002-2.7nM)，并在37℃再溫育3天。然后用相差顯微鏡分析細(xì)胞，并對軸突超過細(xì)胞直徑兩倍的細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖1C和D所示，人和鼠抗trkC單克隆抗體能夠刺激軸突在PC12細(xì)胞中生長。與鼠抗trkC單克隆抗體(圖1D)相比，人抗trkC單克隆抗體(圖1C)顯示了更加有效的活性，這更加確證了在KIRA測定中觀察到的結(jié)果。此外，與KIRA測定結(jié)果一致，人抗trkC單克隆抗體顯示了和用NT-3獲得的結(jié)果大致類似的刺激。用上述兩種生物測定法獲得的結(jié)果證實(shí)了抗trkC單克隆抗體模擬trkC受體的天然配體NT-3活性的能力。
單克隆抗體的促效抗體是根據(jù)酪氨酸磷酸化的最大誘導(dǎo)評價(jià)的，并計(jì)算了KIRA測定和PC12軸突生長測定中磷酸化曲線的EC50。表3總結(jié)了各種抗trkC促效單克隆抗體的特征。
表3
檢測抗trkC抗體的特異性抗trkC單克隆抗體的特異性是用直接ELISA測定的。用作為捕獲抗原的受體trkA-IgG、trkB-IgG或trkC-IgG的免疫粘附素構(gòu)建物包涂微量滴定平板過夜(描述在Shelton等，J.Neurosci.15477-491)，使用100μl 1μl/ml溶液稀釋在50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中。用CD4-IgG(Capon等，Nature 337525-531)代替捕獲抗原作為陰性對照。將被包涂的平板和稀釋在含有0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中的各種濃度的抗trkC單克隆抗體(100μl，濃度為1μg/ml)在室溫培育1小時(shí)。洗滌除去多余的未結(jié)合的抗體后，加入適當(dāng)?shù)腍RP共軛物(人單克隆抗體羊抗人κ-HRP，稀釋1∶5000；鼠單克隆抗體羊抗鼠IgG(Fc)-HRP，稀釋1∶5000)并在室溫培育1小時(shí)。然后如前面的描述洗滌、顯影并閱讀平板(Hongo等，Hybridoma 14253-260)。圖2顯示了使用人抗trkC單克隆抗體6.1.2的代表性實(shí)施例。對trkC的結(jié)合是高度特異的，而對trkA和trkB則沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。類似的，其它的人和鼠抗trkC單克隆抗體也顯示了對trkC的特異性識別。
除了用trkC-gD而不是trkC-IgG作為人trkC的捕獲抗原外，用基本上如上所述的直接ELISA對各種抗trkC促效單克隆抗體與人trkC和大鼠trkC的結(jié)合進(jìn)行了比較。圖3顯示的結(jié)果表明，在人抗trkC單克隆抗體中，只有6.4.1明顯識別大鼠trkC，其余的對人trkC有特異性。類似的，在鼠單克隆抗體中，只有2256對大鼠trkC有顯著程度的識別，而其余的只對人trkC有特異性識別。
親和力研究抗trkC促效單克隆抗體的親和力用BIAcore-2000TM表面胞質(zhì)基因組共振(SPR)系統(tǒng)(BIAcore公司，皮斯卡塔市，新澤西州)測定。按照制造商的說明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺鹽酸(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化CM5生物傳感器芯片。在結(jié)合實(shí)驗(yàn)的第一系列中，抗原，gD-標(biāo)記的trkC，被稀釋在10mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中，并以0.09mg/ml的濃度注射到活化的芯片上。使用可變的暴露時(shí)間，獲得了四種抗原密度范圍14,000-17,000響應(yīng)單位(RU)、7000-9000RU、2000-3000RU和400-600RU。用乙醇胺封閉芯片。
在動(dòng)力學(xué)測量的第一系列中，將抗trkC抗體(IgG’s)稀釋到流動(dòng)緩沖液(含有0.05％Tween-20和0.01％疊氮化鈉的PBS)中，并在25℃以0.01mL/min的流速將0.03mL(667nM)注射到生物傳感器芯片上。用10mM HCL脈沖30秒，然后用100mMTris-HCl(pH8.0)脈沖1分鐘，再洗滌兩次，這樣就獲得了再生。
在實(shí)驗(yàn)的第二系列中，按上述固定IgG’s(0.1mg/ml，存在于10mM的醋酸鈉中，pH4.8)，不同的是抗體的密度被限制在1000-2000RU。然后在生物傳感器芯片上注射3.7-29nM的兩倍連續(xù)稀釋的gD-trkC，用于按以上所述進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測量。
每條動(dòng)力學(xué)曲線的解離階段與單一的解離速度指數(shù)(koff)是符合的，用簡單的1∶1 Langmuir結(jié)合模型(Lofas和Johnsson，1980)，這些速度被用來計(jì)算注射階段的締合速度(kon)。
計(jì)算了SPR測量的平衡解離常數(shù)Kd’s，并將其作為koff/kon的比例。
抗trkC抗體對gD-trkC的親和力是在SPR動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中用抗原或固定的抗體測量的。在采用低密度的固定抗原(0.4-0.6ng/mm2)的實(shí)驗(yàn)中測定的表觀親和力與在采用固定的IgG的實(shí)驗(yàn)中測定的數(shù)據(jù)通常是一致的(見表2)。然而，在較高密度的固定的gD-trkC時(shí)，各個(gè)抗體的表觀結(jié)合親和力變得漸漸嚴(yán)密多達(dá)10倍，這或許是由于被二價(jià)IgG結(jié)合的親合力效應(yīng)造成的(未顯示數(shù)據(jù))。一些情況下，當(dāng)trkC被注射到固定的IgG時(shí)，沒有檢測到結(jié)合。這可能是由于IgG的固定導(dǎo)致了抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間阻礙造成的。在所有的測試條件下，所有測試的抗體中，抗體2248有最高的表觀親和力(Kd＝5.6-8.5nM)。
表4用SPR測定的結(jié)合親和力。結(jié)果顯示了IgG’s與固定的gD-trkC(400-600RU)的結(jié)合以及gD-trkC與固定的IgG’s(1000-3000RU)的結(jié)合。NDB表示沒有可檢測的結(jié)合。
競爭性ELISA競爭性ELISA被用來獲得有關(guān)各種類別的基本信息，這些抗體屬于哪個(gè)類別取決于它們識別trkC上的抗原表位。在這一測定中，trkC-gD(1μg/ml)被用作捕獲抗原以涂布微量滴定平板。在被涂布的平板上單獨(dú)或在其它抗trkC單克隆抗體存在的情況下(這種單克隆抗體沒有被標(biāo)記，并且是過量使用的(50μg/ml)，以便與標(biāo)記的抗體比較)加入一種特殊生物素化的抗trkC單克隆抗體(1μg/ml)。如果生物素化的抗體和未標(biāo)記的抗體都識別同樣的或重疊的抗原表位，它們就會競爭以結(jié)合到固定的trkC上，這就減少了標(biāo)記的抗體的結(jié)合。如果它們識別不同且不重疊的抗原表位，它們之間就不會競爭，且標(biāo)記的抗體與固定的trkC的結(jié)合就不會收到影響。未標(biāo)記的人IgG2和小鼠IgG被用作陰性對照。圖4中代表性的數(shù)據(jù)顯示，所有的抗trkC單克隆抗體，除了鼠抗trkC 2248單克隆抗體外，都和標(biāo)記的人抗trkC 6.1.2單克隆抗體競爭以便與固定的trkC結(jié)合，這說明鼠22448抗體識別trkC上的抗原表位不同于所有其它的抗trkC抗體識別的抗原表位。有趣的是，當(dāng)未標(biāo)記的鼠單克隆抗體2248第一次與固定的trkC結(jié)合時(shí)，其它(生物素化的)抗體都不能接近它們的結(jié)合位點(diǎn)，這說明即便抗原表位是性質(zhì)不同的，空間阻礙可能起作用。這種成對的比較提供了有價(jià)值的信息，并且有助于按照抗原表位識別將針對同一抗原的抗體分成不同的種類。對這種比較的總結(jié)顯示在圖5中。結(jié)果說明，抗體可被分成兩種性質(zhì)不同的類別類別1包括除了2248以外的所有的單克隆抗體，而類別2包括2248。
用結(jié)構(gòu)域切換交換突變體進(jìn)行抗原表位作圖用嵌合體trkC(其中，各個(gè)結(jié)構(gòu)域被trkA或trkB相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域替換)進(jìn)行進(jìn)一步的抗原表位作圖。這種方法是可能的，因?yàn)榭箃rkC抗體和trkA和trkB沒有明顯的交叉反應(yīng)。采用這種結(jié)構(gòu)切換域突變體比缺失突變體有明顯的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域的缺失可能會破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，而用相應(yīng)的有類似大小和基本類似的氨基酸序列的，來自結(jié)構(gòu)域切換突變體中相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域取代一個(gè)結(jié)構(gòu)域可能保持二級結(jié)構(gòu)。trk受體的胞外域包含有如圖6A所示的5個(gè)域。D1和D3是半胱氨酸富集的域，D2是亮氨酸富集的域，D4和D5是免疫球蛋白樣的域。制得了用trkB或trkA相應(yīng)的域替換含有D1、D4和D5的trkC的結(jié)構(gòu)域切換突變體(Urfer等，EMBOJ.142795-2805)。野生型trkC和野生型trkA分別用作陽性和陰性對照。根據(jù)替換的域的來源命名了trkC的結(jié)構(gòu)域切換突變體。例如，s1B有trkB的D1域，s4B有trkB的D4域，s5B有trkB的D5域，s5A有trkA的D5域。所有這些突變體都作為免疫粘附素，即融合到IgG上表達(dá)，并純化。
用ELISA評價(jià)了各個(gè)抗trkC促效單克隆抗體與各種結(jié)構(gòu)域切換突變體的結(jié)合。羊抗人IgG的F(ab’)2片段被用來涂布微量滴定平板以捕獲免疫粘附素(以trkC-IgG、trkA-IgG和trkC的結(jié)構(gòu)域切換突變體作為免疫粘附素)的連續(xù)稀釋(100μg/ml-2.4ng/ml，100μl/孔，室溫一小時(shí))。在含有固定的免疫粘附素的平板中加入未標(biāo)記的人抗trkC的單克隆抗體或生物素化的鼠抗trkC的單克隆抗體(每孔100μl；1μg/ml，室溫一小時(shí))，洗滌以除去未結(jié)合的過量試劑，并和與HRP共軛連接的羊抗人κ或鏈霉抗生物素蛋白一起培育。如圖6B所示，所有的人抗trkC單克隆抗體都能夠識別用D1和D4域替換的trkC結(jié)構(gòu)域切換突變體。然而，用衍生自trkB或trkA的相應(yīng)的域替換D5域則不能被抗trkC抗體識別。結(jié)合的程度降到了與用陰性對照trkA觀察到的結(jié)果一樣低的水平。這些結(jié)果說明，所有測試的人抗trkC單克隆抗體識別定位在D5域中某處的抗原表位。
除了用與HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG Fc作為第二抗體外，用基本上一樣的方法對鼠抗trkC單克隆抗體進(jìn)行了類似的分析。與人抗trkC的抗體相比，D5域的替換不能夠結(jié)合所有被測試的鼠抗trkC單克隆抗體(圖6B)。此外，D4域的替換也破壞了2248鼠抗trkC抗體的結(jié)合。除了2248鼠抗體外，人和鼠的抗trkC促效單克隆抗體似乎識別第5域中的抗原表位，2248鼠抗體似乎另外識別第4域中的一個(gè)決定子。顯然2248抗原表位是一個(gè)與第4域和第5域的邊界重疊的線性抗原表位?；蛘撸?248抗體可能識別由不相鄰的抗原表位形成含有衍生自第4域和第5域的決定子的二級結(jié)構(gòu)。有趣的是，Urfer等(J.Biol Chem.2735829-2840)早就確定了trkC受體中第5域在介導(dǎo)與NT-3相互作用中的決定性作用。驚奇的是，這里描述的抗體也能結(jié)合trkC的抗原表位，這與NT-3識別的抗原表位有很大的重疊。由于NT-3和免疫球蛋白分子的相對大小和形狀這種結(jié)果是令人吃驚的。這些活化子可能的作用模式是以這種方式與兩種trkC分子的胞外域交聯(lián)，以將它們細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域帶到一起，交叉磷酸化并將它們活化。
在同源二聚體的NT-3中，已經(jīng)證明與trkC相互作用的分子的兩個(gè)區(qū)域在分子相對的側(cè)鏈上是正好相反的，相互之間相隔180度。這些區(qū)域之間的距離大約有16。另一方面，這里描述的免疫球蛋白分子中的兩個(gè)trkC相互作用位點(diǎn)不是正好相反的。除了trkC結(jié)合域以不同于NT-3的角度出現(xiàn)外，免疫球蛋白將使trkC結(jié)合域彼此分離，且分隔的距離比它們在NT-3中更大。這將隨著兩個(gè)Fab域的準(zhǔn)確角度而改變，但在50-150的范圍之內(nèi)。當(dāng)結(jié)合到trkC上同樣的位點(diǎn)時(shí)，要預(yù)見兩個(gè)作為NT-3的很不同的交聯(lián)劑和作為促效劑的促效單克隆抗體是困難的。
定點(diǎn)誘變定點(diǎn)誘變方法被用來確定第5域的被選定的個(gè)體氨基酸殘基在被抗trkC抗體識別中的作用。圖7顯示了人trkC第4域和第5域的氨基酸序列。除了L284、L286和E287殘基分別被變成E、H和K以外，所有打點(diǎn)的殘基都突變成了丙氨酸(Urfer等，J.Biol.Chem.2735829-5840)?？偣仓频昧?6個(gè)單個(gè)氨基酸突變，并評價(jià)了它們對結(jié)合抗trkC單克隆抗體的作用。表5中列出的值代表了結(jié)合到突變體的抗trkC抗體與野生型trkC的比例。為使變化最小并提供有效的比較，測定了各個(gè)抗體的各個(gè)突變體的EC50值，并用野生型trkC得到的EC50值進(jìn)行了分類。
表5 灰色區(qū)域說明指定的突變體對單克隆抗體的結(jié)合沒有初期效果，因此沒有再次測定。完全沒有單克隆抗體結(jié)合的突變以NB(“未觀察到結(jié)合”)表示。這一分析說明了trkC的氨基酸殘基L284、E287和N335在測試的抗trkC促效單克隆抗體識別中的主要作用。trkC第5域和NT3的復(fù)合體的模型顯示了與抗體的CDR緊密接觸的殘基的位置(圖8)。這一模型基于trkA的第5域與NGF的復(fù)合體的表層結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步了解細(xì)節(jié)可以參閱，例如Urfer等，J.Biol.Chem.(1998)，同上，或Ultsch等，J.Mol.Biol.290149-159(1999)。
抗體可變區(qū)的克隆和測序?yàn)楦玫牧私鈚rkC和抗trkC單克隆抗體之間相互作用的分子基礎(chǔ)，克隆了促效抗體的重鏈和輕鏈可變序列，并測定了DNA序列。用來自Stratagene(拉霍亞，加利福尼亞州)的RNA分離試劑盒，從產(chǎn)生人和鼠抗trkC單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中分離了所有的RNA。用SuperScript II系統(tǒng)(Life Technologies公司，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)和基于衍生自各個(gè)重鏈或輕鏈亞組的框架4序列的特殊的3’引物將RNA反轉(zhuǎn)錄入cDNA(Kabat和Wu，J.Immunol.1471709-1719)。然后用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer，福斯特市，加利福尼亞州)，在存在2.5M DMSO和特殊的基于重鏈和輕鏈的N-末端氨基酸序列的正向引物，以及用于cDNA合成的同樣的3’引物的情況下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物被亞克隆入含有人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的F(ab)’2載體(Carter等，Biol/Technology 10163-167)。VH和VL的5個(gè)克隆被測序并獲得了共有序列。
圖9顯示了推導(dǎo)出的抗trkC促效單克隆抗體的重鏈的氨基酸序列(2250，SEQ IDNo42；2253，SEQ ID No43；2256，SEQ ID No44；6.1.2，SEQ ID No45；6.4.1，SEQ ID No46；2345，SEQ ID No47；和2349，SEQ ID No48)。推導(dǎo)出的抗trkC促效單克隆抗體的輕鏈的氨基酸序列顯示在圖10中(2250，SEQ ID No49；2253，SEQ ID No50；2256，SEQ ID No51；6.1.2，SEQ ID No52；6.4.1，SEQ ID No53；2345，SEQ ID No54；和2349，SEQ ID No55)。在圖9和圖10中，互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)被標(biāo)成CDR1、CDR2和CDR3，相應(yīng)的氨基酸殘基以黑體顯示。圖11總結(jié)了各種抗trkC單克隆抗體的重鏈和輕鏈的CDR序列，并指出了它們所屬的各自的重鏈和輕鏈可變家族。
根據(jù)所確定的抗trkC促效單克隆抗體的重鏈和輕鏈CDR的氨基酸序列，有可能為這些區(qū)域中幾個(gè)提供一般的結(jié)構(gòu)式。對于鼠抗體，重鏈CRD1可以用結(jié)構(gòu)式XaaWXaaXaaWVK(SEQ ID No37)表示，其中位置1上的Xaa是F或Y；位置3上的Xaa是I或M；位置4上的Xaa是E或H。鼠重鏈CDR2可以用結(jié)構(gòu)式EIXaa Pxaa XaaXaa Xaa TNYNEKFK Xaa(SEQ ID No38)表示，其中位置3上的Xaa是L或Y；位置5上的Xaa是G或S；位置6上的Xaa是S或N；位置7上的Xaa是D或G；位置8上的Xaa是N或R；位置17上的Xaa是G或S。鼠重鏈CDR3可以用結(jié)構(gòu)式KNRNYYGNYVV(SEQ ID No12)或KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ ID No13)表示。對于人抗體，重鏈CDR1可以用結(jié)構(gòu)式XaaXaaXaaYYWXaa(SEQ ID No39)表示，其中位置1上的Xaa是S或I；位置2上的Xaa是G或S；位置3上的Xaa是G、T或Y；位置7上的Xaa是S或N。人重鏈CDR2可以用結(jié)構(gòu)式XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS(SEQID No40)表示，其中位置1上的Xaa是Y或F；位置3上的Xaa是Y或F；位置4上的Xaa是Y或T；位置8上的Xaa是S或R；位置10上的Xaa是N或Y。人重鏈CDR3可以用結(jié)構(gòu)式DRDYDSTGDYYSYYGMDV(SEQ ID No14)、DGGYSNPFD(SEQ ID No15)或ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV(SEQ ID No41)表示，其中位置8上的Xaa是A或T；位置16上的Xaa是D或A。
對這些抗體的N-末端肽序列的測定證實(shí)了推導(dǎo)出的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。在BioRad電轉(zhuǎn)移印跡槽中用250mA恒定電流在Millipore Immobilon-PSQ膜上進(jìn)行1小時(shí)電印跡(Matsudaira，J.Biol.Chem.26210035-10038)。用含50％甲醇中的0.1％的考馬斯藍(lán)R-250將PVDF膜染色0.5分鐘，并用50％甲醇中的10％醋酸褪色2-3分鐘。用水將膜徹底洗滌并在貯存于20℃前使其干燥。在裝有在線PTH分析器的型號494A Perkin-Elmer測序儀(Perkin-Elmer公司，福斯特市，加利福尼亞州)上進(jìn)行自動(dòng)蛋白質(zhì)測序。在6mm微型玻璃筒中對電印跡在PVDF膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。采用Nelson Analytical 760界面，用Justice Innovation軟件對峰進(jìn)行積分。在DECα上進(jìn)行序列翻譯(Henzel等，J.Chromatography40441-52)。表6總結(jié)了基于它們的N-末端序列的人和鼠抗trkC促效單克隆抗體的分類。
表6人抗trkC促效單克隆抗體 重鏈 輕鏈6.1.2 亞組IIκI6.4.1 亞組IIκI2345 亞組IIκIII2349 亞組IIκIII2.5.1 亞組IIκI2344 亞組IIκI鼠抗trkC促效單克隆抗體2248 亞組IIA κI2250 亞組IIA κI2253 亞組IIA κIV2256 亞組IIA κIII實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中抗trkC促效單克隆抗體對神經(jīng)病的作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
NT-3促效劑的主要用途是治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)病。已知與介導(dǎo)本體感覺和振動(dòng)感覺有關(guān)的大纖維有髓感覺神經(jīng)元，表達(dá)作為NT-3高親和受體的trkC。與大纖維有關(guān)的神經(jīng)病在糖尿病中是常見的，它也可以因響應(yīng)某些化學(xué)治療劑尤其是順氯氨鉑和吡哆醇而被誘導(dǎo)。NT-3在實(shí)驗(yàn)性糖尿病型神經(jīng)病和順氯氨鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病的動(dòng)物模型中是有效的。然而，由于嚙齒動(dòng)物模型中顯示的生物利用率差，NT-3的用途受到了嚴(yán)重限制。作為NT-3促效劑的抗trkC單克隆抗體的應(yīng)用提供了很多優(yōu)點(diǎn)，并排除了許多與使用NT-3有關(guān)的潛在的問題。
通過對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行靜脈或皮下注射測定了抗trkC促效單克隆抗體的體內(nèi)半衰期。圖12顯示了在大鼠中以1mg/kg靜脈(IV)注射或以5mg/kg皮下(subQ)注射后，不同時(shí)間單克隆抗體2256的血清水平。血清水平是用KIRA測定法測定的，以便根據(jù)它提高trkC的酪氨酸自發(fā)磷酸化的能力測定全功能抗體2256的量。這些數(shù)據(jù)說明，大鼠中單克隆抗體2256的半衰期為9天，皮下用藥后的生物利用率為69％。這些值與用其它抗體獲得的值是一致的，而與用NT3獲得的那些值卻明顯不同。在圖12中還顯示了用與單克隆抗體2256(1mg/kg，IV；5mg/kg subQ)一樣的劑量和途徑注射NT-3后所得的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)表明NT-3的血清半衰期約為4-5分鐘，皮下生物利用率為7％。這些數(shù)據(jù)表明，在生物利用率和體內(nèi)血清半衰期這些非常重要的性質(zhì)上，抗體比NT3有顯著的改進(jìn)。
已顯示，在兩個(gè)大纖維感覺神經(jīng)病的動(dòng)物模型中，NT-3可以保護(hù)或逆轉(zhuǎn)化學(xué)損傷的作用。很高劑量的NT3保護(hù)大纖維感覺神經(jīng)元免受高劑量吡哆醇的毒性作用，中等劑量的NT3逆轉(zhuǎn)施用順氯氨鉑的作用。盡管NT-3的組織分布以及這里所描述的促效單克隆抗體可能有很多不同，但重要的是確定單克隆抗體的體外活性是否能夠在動(dòng)物模型中轉(zhuǎn)變成療效。
為建立順氯氨鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病的動(dòng)物模型，連續(xù)16周每周兩次以1mg/kg的劑量腹膜內(nèi)(IP)向成年大鼠施用順氯氨鉑。此時(shí)，將大鼠分成4組。所有4組大鼠繼續(xù)每周接受兩次順氯氨鉑。除了繼續(xù)施用順氯氨鉑外，一組大鼠接受了每周三次的1mg/kg劑量的NT-3，一組接受了每周一次的1mg/kg劑量的單克隆抗體2256，一組接受了每周一次的1mg/kg劑量的單克隆抗體6.4.1，一組接受每周一次的鹽水。NT-3劑量是皮下給予的，而單克隆抗體和鹽水是靜脈施用的。這種處理方式持續(xù)了四周，即總共施用了20周的順氯氨鉑。
采用H-波記錄儀，從電生理學(xué)上檢測了這些動(dòng)物中大纖維感覺神經(jīng)元的功能(Gao等，Ann.Neurol.38(1)30-7)。從圖13顯示的數(shù)據(jù)中可以看出，在單獨(dú)用順氯氨鉑和鹽水處理的動(dòng)物中感覺傳導(dǎo)速度很慢。一周三次NT-3處理提高了這種較低的傳導(dǎo)速度，用單克隆抗體2256或單克隆抗體6.4.1每周處理一次的結(jié)果也是這樣。用單克隆抗體每周處理一次得到的提高的數(shù)量級至少與用NT-3每周處理三次得到的結(jié)果一樣大。
已知吡哆醇也誘導(dǎo)感覺神經(jīng)病，它主要損傷感覺神經(jīng)元的大的有髓亞群(Helegren等，J.Neurosci.17(1)372-82)。高劑量的NT3阻止這種神經(jīng)病的發(fā)展(Helgren等，同上)。用兩種不同劑量的吡哆醇(每天400mg/kg或600mg/kg，IP)處理動(dòng)物兩周會對DRG的大神經(jīng)元造成損傷。這種損傷可以通過已知被DRG中的大神經(jīng)元優(yōu)先表達(dá)或唯一表達(dá)的幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)量的減少來檢測。這些標(biāo)記的表達(dá)水平是通過用TAQMAN RT-PCR技術(shù)測量編碼它們的mRNA水平而檢測的。
用來檢測trkC促效劑作用的Taqman RT-PCRA.探針和引物NFLF-CAGCAGAACAAGGTCCTGGAA21MER(SEQ ID No72)R-AGCGGGAAGGCTCTGAGTG 19MER(SEQ ID No73)P-AGCTGTTGGTGCTGCGCCAGAA 22MER(SEQ ID No74)NSEF-TCCATTGAAGACCCATTCGAC21MER(SEQ ID No75)R-GCCGACATTGGCTGTGAAC 19MER(SEQ ID No76)P-AGGATGACTGGGCAGCTTGGTCCA 24MER(SEQ ID No77)TRKCF-CAGCCCACTGCACCATATCA 20MER(SEQ ID No78)R-CTGTATCCGGCCCAGCAT 18MER(SEQ ID No79)P-CCATGGCATCACTACACCTTCATCGCT 27MER(SEQ ID No80)CALRETF-TGGGAAAATTGAGATGGCAGA21MER(SEQ ID No81)R-GCTGCCTGAAGCACAAAAGG 20MER(SEQ ID No82)P-CGCAGATCCTGCCAACCGAAGAGA 24MER(SEQ ID No83)PARVALBF-GACACCACTCTTCTGGAAAATGC 23MER(SEQ ID No84)R-TTGCCAAACCAACACCTACCA21MER(SEQ ID No85)P-ATCGGACACCACCTGTAGGGAGGACC 26MER(SEQ ID No86)GAPDHF-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGT 21MER(SEQ ID No87)R-AATTTGCCGTGAGTGGAGTC 20MER(SEQ ID No88)P-CCATCAACGACCCCTTCATTGACCTC26MER(SEQ ID No89)探針和引物是用Primer Express(ABI-Perkin-Elmer)設(shè)計(jì)的。有關(guān)引物探針選擇的原則描述在Williams和Tucker(1999)的PCR applications，第365-75頁(學(xué)術(shù)出版社)。B.總RNA的制備和定量從磷酸緩沖鹽溶液灌注的大鼠中解剖出L4和L5。左側(cè)和右側(cè)被隔離在獨(dú)立的試管中。為得到用在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的總RNA，從對照大鼠中解剖出所有的DRG。用Qiagen Rneasy小柱分離總的RNA。按照各個(gè)制造商的說明將組織勻漿。按照制造商的說明，用Ribogreen Quantitation試劑盒(Molucular Probe)將總的RNA定量。C.RT-PCR每50μl反應(yīng)用25納克總RNA，不同的是，在標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)分別使用500、250、25或2.5納克。每個(gè)反應(yīng)含有25pmol的各寡核苷酸引物、0.2mM的各dNTP、100mM熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針、1X RT-PCR緩沖液(PE biosystems)、2.0mM MgCl2、20U RNA酶抑制劑、12.5MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT，PE biosystems)和2.5UAmplitaq Gold聚合酶(PE biosystems)。在48攝氏度下進(jìn)行30分鐘逆轉(zhuǎn)錄，然后在95攝氏度10分鐘使Amplitaq Gold活化并使RT失活，然后進(jìn)行PCR；在95攝氏度進(jìn)行40次循環(huán)，每次15秒鐘，然后在60攝氏度保持1分鐘或半分鐘。D.基因表達(dá)定量采用各個(gè)taqman run用對照RNA產(chǎn)生管家基因和感興趣的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過繪制與加入的對照總RNA的量的對數(shù)值比較的得自Taqman run的閾循環(huán)(Ct)值可以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。解出了所得的線性方程以得到RNA值的對數(shù)。插入實(shí)驗(yàn)的Ct值產(chǎn)生了實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)值的對數(shù)。這些值的10次冪使實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)達(dá)到了納克數(shù)量級。
從圖14中可見，用吡哆醇處理兩周導(dǎo)致神經(jīng)絲輕鏈(NFL)、神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、trkC和鈣視網(wǎng)膜蛋白(calretinin)表達(dá)中劑量依賴性下降。劑量依賴性和它們下降的數(shù)量級在標(biāo)記和標(biāo)記之間是不同的，這說明這些作為神經(jīng)元損傷標(biāo)記的蛋白質(zhì)有不同的敏感性。
在圖15中，顯示了單獨(dú)用兩倍劑量的單克隆抗體2256和低劑量(每天400mg/kg)的吡哆醇處理動(dòng)物的結(jié)果。NFL和NSE顯示在此水平的吡哆醇處理時(shí)提高了表達(dá)。用5mg/kg的單克隆抗體2256(subQ，每周)一起處理動(dòng)物完全阻止了這種表達(dá)的減少。1mg/kg劑量的單克隆抗體2256對這些蛋白質(zhì)的表達(dá)沒有明顯的作用。trkC和鈣視網(wǎng)膜蛋白的表達(dá)都沒有明顯受到這種低劑量吡哆醇處理的影響，但用5mg/kg的單克隆抗體2256處理使trkC的表達(dá)超過了對照水平。
當(dāng)用每天600mg/kg的較高吡哆醇劑量處理動(dòng)物時(shí)，NFL、NSE和鈣視網(wǎng)膜蛋白的表達(dá)降到了非常低的水平，而trkC的表達(dá)降到了對照值的約50％(圖16)。用1mg/kg或5mg/kg的單克隆抗體2256共同處理沒有完全阻止trkC和鈣視網(wǎng)膜蛋白表達(dá)的減少。在用單克隆抗體2256處理的動(dòng)物中，NFL和NSE的表達(dá)有些許保護(hù)傾向，但這沒有獲得統(tǒng)計(jì)顯著性。因此，使用損害大感覺神經(jīng)元的多生化標(biāo)記，單克隆抗體2256能夠改善吡哆醇處理的毒性。
為檢測吡哆醇神經(jīng)病的電生理學(xué)和行為學(xué)效果，每天兩次向大鼠注射400mg/kg的吡哆醇，共注射8天。用電生理學(xué)方法測試了它們的大直徑感覺傳入的功能，方法是在大腿和腓腸刺激坐骨神經(jīng)后，在足部的肌肉中記錄M-波(直接運(yùn)動(dòng))和H-波(反射感覺)的響應(yīng)(Gao等，Ann.Neurol.38(1)30-7)。從圖18可見，與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)響應(yīng)相比，用吡哆醇處理8天使感覺響應(yīng)的幅度大大減小。和單克隆抗體2256一起處理明顯阻礙了吡哆醇誘導(dǎo)的感覺幅度的減小。這與用很高劑量(每天20mg/kg)的NT3得到的效果是類似的。
還在行為上對用這種方法以吡哆醇處理的動(dòng)物的本體感受功能進(jìn)行了測試。訓(xùn)練它們穿過平行的梯子以躲避光亮和白噪聲的刺激從而進(jìn)入暗盒。從下面對動(dòng)物進(jìn)行錄像，它們的后爪在梯子橫檔上的位置質(zhì)量可以由隱蔽起來的觀察者讀出。每個(gè)爪位被記錄成好的位置(爪以跖骨前部著地，緊接在腳趾后面，用腳趾立即包住橫檔)，穩(wěn)固著陸(爪沒有碰到后腳趾，而是穩(wěn)固的放在橫檔上，腳趾通常沒有包住橫檔)、接近腳步犯規(guī)(爪僅僅以腳趾的最前端或以腳跟的后部碰到橫檔，但能夠支持體重)或腳步犯規(guī)(爪完全沒有碰到橫檔或放得很不好以致足不能支持體重并從梯子上掉下去)。通常，大鼠能夠非?？斓膶W(xué)會將它們的后爪正確放置，這要求對前爪所放的位置有出色的本體感覺。用吡哆醇處理后(400mg/kg，每天兩次，8天)，在這項(xiàng)任務(wù)上的表現(xiàn)下降了，好的定位下降了大約30％，而腳步犯規(guī)和接近腳步犯規(guī)都上升了(圖18)。在比期間用單克隆抗體2256一起處理動(dòng)物，使動(dòng)物在這項(xiàng)表現(xiàn)上保持了高得多的水平，好的定位下降較小而腳步犯規(guī)和接近腳步犯規(guī)上升較小。
總之，用生化、電生理學(xué)方法測量以及通過行為任務(wù)的表現(xiàn)，用單克隆抗體2256一起處理能夠改善吡哆醇的毒性效果。
在確信trkC單克隆抗體在治療上至少和NT-3一樣有效后，檢測了痛覺過敏的表觀負(fù)面作用。在嚙齒動(dòng)物(見圖19)和人(Chaudhary等，Muscle and Nerve23189-192)中觀察到了施用NT-3的副作用。大鼠被訓(xùn)練并用Hargreaves裝置檢測了它們后爪的熱靈敏度，然后在頸背皮下施用1mg/kg的單克隆抗體2256IV，或1mg/kg NT-3。在施用2、4和6小時(shí)后，再次測試大鼠的熱退縮時(shí)間。從圖19中可以看出，在用藥4和6小時(shí)后，NT-3的施用造成了明顯的熱痛覺過敏，而用trkC單克隆抗體2256則對熱痛覺沒有任何反應(yīng)。因此，在已知可有效逆轉(zhuǎn)或預(yù)防神經(jīng)病的劑量下，NT-3增加對痛覺的靈敏度，而單克隆抗體2256則沒有。
一種廣泛使用的化學(xué)治療劑順氯氨鉑，能誘導(dǎo)振動(dòng)感覺和本體感覺選擇性喪失的感覺神經(jīng)病。這里我們證明神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)生長因子家族的一名成員，在大鼠中能夠?qū)㈨樎劝便K誘導(dǎo)的下降的與H-反射相關(guān)的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)到正常的水平。NT-3治療糾正了背根神經(jīng)節(jié)中大感覺神經(jīng)元的神經(jīng)絲蛋白異常的胞質(zhì)分布，并糾正了由順氯氨鉑造成的腓腸神經(jīng)中有髓纖維數(shù)量的減少。NT-3依賴的順氯氨鉑神經(jīng)毒性的逆轉(zhuǎn)提示了用NT-3治療周圍感覺神經(jīng)病的可能性。
用高劑量的吡哆醇(維生素B6)慢性處理成年大鼠2-3周使本體感覺嚴(yán)重受損，這類似于在人中發(fā)現(xiàn)的用過量維生素或用化學(xué)治療劑順氯氨鉑處理的現(xiàn)象。吡哆醇的毒性表現(xiàn)為簡單和精確運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)功能的缺乏以及大直徑/大纖維脊椎感覺神經(jīng)元的退化。在走橫桿任務(wù)中，對用EMG記錄的周圍神經(jīng)刺激激發(fā)的H波進(jìn)行定量估計(jì)，在慢性吡哆醇處理中用神經(jīng)營養(yǎng)因子神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3；5-20mg/kg/天，s.c.)一起處理大大減輕了與吡哆醇毒性有關(guān)的行為學(xué)和電生理學(xué)的遺癥。此外，NT-3的施用預(yù)防了脊髓的背柱中感覺纖維的退化。這些數(shù)據(jù)與這一證據(jù)是一致的，即NT-3是肌肉感覺傳入的靶衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，并提示藥理學(xué)劑量的NT-3有利于治療大纖維感覺神經(jīng)病。生物材料的存儲以下雜交瘤細(xì)胞系和質(zhì)粒已于2000年6月21日保存于美國模式培養(yǎng)物保藏所，10801大學(xué)路，馬納薩斯，弗吉尼亞洲20110-2209，美國(ATCC)
雜交瘤/質(zhì)粒名稱 ATCC編號2.5.1 PTA-21516.1.2 PTA-21486.4.1 PTA-21502344PTA-21442345PTA-21462349PTA-21532248PTA-21472250PTA-21492253PTA-21452256PTA-2152DNA pXCA-2250HL PTA-2136DNA pXCA-2253HL PTA-2137DNA pXCA-2256HL PTA-2138DNA pXCA-6.1.2H PTA-2141DNA pXCA-6.4.1H PTA-2143DNA pXCA-2345HL PTA-2142DNA pXCA-2349HL PTA-2133DNA vegf4chim-6.1.2LPTA-2134DNA vegf4chim-6.4.1LPTA-2135DNA vegf4chim-2345L PTA-2139DNA vegf4chim-2349L PTA-2140保藏是在國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約(以下簡稱為布達(dá)佩斯條約)下進(jìn)行的。它保證從保藏之日起保持活性培養(yǎng)物30年。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，ATCC使這些生物可以獲得，并服從基因技術(shù)公司和ATCC之間的協(xié)議，這份協(xié)議保證，在公布相關(guān)美國專利或向公眾公開任何美國或外國專利申請后，無論哪個(gè)在先，公眾可以永久并無條件的獲得這些培養(yǎng)物的后代，并保證根據(jù)35 USC§122和按照其專員規(guī)則(包括特別涉及886 OG 638的37 CFR§1.12)授權(quán)的美國專利和商標(biāo)專員決定個(gè)人可以得到的后代。
至于歐洲專利局檢索的那些專利，保藏微生物的樣品直至歐洲專利局允許公開后或直至專利申請被拒絕或駁回或視為未提交后，由索要樣品的人提名的專家才可以獲得這種樣品。(條約28(4)EPC)本發(fā)明的受讓人同意，當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，如果保藏的培養(yǎng)物死亡或丟失或被破壞，他們將立即公告用同一培養(yǎng)物的活的樣品替換。保藏的菌種的利用率不能理解為許可在違反任何政府當(dāng)局根據(jù)其專利法授予的權(quán)利的情況下實(shí)施本發(fā)明。
上面的說明書被認(rèn)為足以使此領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明并未限制保藏的構(gòu)建物的范圍，因?yàn)榇鎯Φ膶?shí)施例只是為了闡述本發(fā)明的某些方面，功能等價(jià)的任何構(gòu)建物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這里保藏的材料不構(gòu)成一種允許，即本說明書不足以能實(shí)施本發(fā)明的任何方面，包括其最佳模式，且不能理解為限制了它們所代表的特別列出的權(quán)利要求的范圍。實(shí)際上，除了上面的描述，從前面的說明書中，對本發(fā)明作出的許多修改對于精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員都是顯而易見的，并都在附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
應(yīng)該理解，考慮到這里所含的說明，本發(fā)明關(guān)于特殊問題或情況的指導(dǎo)的申請是在此領(lǐng)域一般技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品的例子和分離、使用的代表性的過程和生產(chǎn)商將在下面顯示，但不是限制本發(fā)明。
在此全文引入說明書和參考資料中提到的所有的參考文獻(xiàn)以供參考。
序列表序列表<110>基因技術(shù)股份有限公司(Genentech，Inc.)B.德沃(Devaux，Brigitte)J.-A.S.弘勾(Hongo，Jo-Anne S.)L.G.普雷斯塔(Presta，Leonard G.)D.L.謝爾頓(Shelton，David L.)<120>抗TRK-C拮抗劑的單克隆抗體<130>GENENT.040QPC<140>60/238,319<141>2000-10-05<160>89<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>7<212>PRT<213>鼠<400>1Phe Trp Ile Glu Trp Val Lys1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>鼠<400>2Tyr Trp Met His Trp Val Lys1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Ile Ser Thr Tyr Tyr Trp Asn1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Ser Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>6<211>17<212>PRT<213>鼠<400>6Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>7<211>17<212>PRT<213>鼠<400>7Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ser<210>8<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>9<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>9Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>10<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>11<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>11Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>12<211>11<212>PRT<213>鼠<400>12Lys Asn Arg Asn Tyr Tyr Gly Asn Tyr Val Val1 5 10<210>13<211>15<212>PRT<213>鼠<400>13Lys Tyr Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10 15<210>14<211>18<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Asp Arg Asp Tyr Asp Ser Thr Gly Asp Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Met1 5 10 15Asp Val<210>15<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Asp Gly Gly Tyr Ser Asn Pro Phe Asp1 5<210>16<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Glu Arg Ile Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr Tyr Tyr Asn Gly Leu Asp1 5 10 15Val<210>17<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Glu Arg Ile Ala Ala Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr Asn Gly Leu Ala1 5 10 15Val<210>18<211>15<212>PRT<213>鼠<400>18Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His1 5 10 15<210>19<211>10<212>PRT<213>鼠<400>19Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr1 5 10<210>20<211>15<212>PRT<213>鼠<400>20Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn1 5 10 15<210>21<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>21Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly1 5 10<210>22<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22Lys Ser Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu1 5 10 15Ala<210>23<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>23Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Thr1 5 10<210>24<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>24Arg Ala Ser Gln Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ala1 5 10<210>25<211>7<212>PRT<213>鼠<400>25Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser1 5<210>26<211>7<212>PRT<213>鼠<400>26Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>27<211>7<212>PRT<213>鼠<400>27Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>28Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>29<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>29Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5<210>30<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>30Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>鼠<400>31Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>鼠<400>32Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>33<211>9<212>PRT<213>鼠<400>33Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Arg Thr1 5<210>34<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>34Leu Gln His Asn Ser Leu Pro Leu Thr1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>35Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr1 5<210>36<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>36Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Pro Ile Thr1 5 10<210>37<211>7<212>PRT<213>鼠<220><221>UNSURE<222>1<223>Xaa＝F或Y<221>UNSURE<222>3<223>Xaa＝I或M<221>UNSURE<222>4<223>Xaa＝E或H<400>37Xaa Trp Xaa Xaa Trp Val Lys1 5<210>38<211>17<212>PRT<213>鼠<220><221>UNSURE<222>3<223>Xaa＝L或Y<221>UNSURE<222>5<223>Xaa＝G或S<221>UNSURE<222>6<223>Xaa＝S或N<221>UNSURE<222>7<223>Xaa＝D或G<221>UNSURE<222>8<223>Xaa＝N或R<221>UNSURE<222>17<223>Xaa＝G或S<400>38Glu Ile Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Asn 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ggccgagctg 1680ctcaccaacc tgcagcatga gcacattgtc aagttctatg gagtgtgcgg cgatggggac 1740cccctcatca tggtctttga atacatgaag catggagacc tgaataagtt cctcagggcc 1800catgggccag atgcaatgat ccttgtggat ggacagccac gccaggccaa gggtgagctg 1860gggctctccc aaatgctcca cattgccagt cagatcgcct cgggtatggt gtacctggcc 1920tcccagcact ttgtgcaccg agacctggcc accaggaact gcctggttgg agcgaatctg 1980ctagtgaaga ttggggactt cggcatgtcc agagatgtct acagcacgga ttattacagg 2040ctctttaatc catctggaaa tgatttttgt atatggtgtg aggtgggagg acacaccatg 2100ctccccattc gctggatgcc tcctgaaagc atcatgtacc ggaagttcac tacagagagt 2160gatgtatgga gcttcggggt gatcctctgg gagatcttca cctatggaaa gcagccatgg 2220ttccaactct caaacacgga ggtcattgag tgcattaccc aaggtcgtgt tttggagcgg 2280ccccgagtct gccccaaaga ggtgtacgat gtcatgctgg ggtgctggca gagggaacca 2340cagcagcggt tgaacatcaa ggagatctac aaaatcctcc atgctttggg gaaggccacc 2400ccaatctacc tggacattct tggctagtgg tggctggtgg tcatgaattc atactctgtt 2460gcctcctctc tccctgcctc acatctccct tccacctcac aactccttcc atccttgact 2520gaagcgaaca tcttcatata aactcaagtg cctgctacac atacaacact gaaaaaagga 2580aaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaccgc 2607<210>58<211>360<212>DNA<213>鼠<400>58caggtccaac tgcagcagtc tggggctgag ctgatgcagc ctggggcctc agtgaagata 60tcctgcaagt ctactggcta cacattcagt aacttctgga tagagtgggt aaagcagagg 120cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gcagtgataa tactaactac 180aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagaaagaat 300cgtaactact atggtaacta cgttgtatgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360<210>59<211>330<212>DNA<213>鼠<400>59gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300tcggctcggg gacaaagttg gaaaaaacgg 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20<210>79<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>79ctgtatccgg cccagcat 18<210>80<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>80ccatggcatc actacacctt catcgct 27<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>81tgggaaaatt gagatggcag a 21<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>82gctgcctgaa gcacaaaagg 20<210>83<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>83cgcagatcct gccaaccgaa gaga24<210>84<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>84gacaccactc ttctggaaaa tgc 23<210>85<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>85ttgccaaacc aacacctacc a 21<210>86<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>86atcggacacc acctgtaggg aggacc 26<210>87<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>87cagtggcaaa gtggagattg t 21<210>88<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>88aatttgccgt gagtggagtc20<210>89<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>89ccatcaacga ccccttcatt gacctc 2權(quán)利要求
1.一種抗trkC促效單克隆抗體，其特征在于，(a)未顯示顯著的和trkA或trkB的交叉反應(yīng)；并且(b)識別trkC第5域中的抗原表位。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，它可進(jìn)一步識別trkC第4域中的抗原表位。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，它可以結(jié)合人和大鼠trkC。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，它是人抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，它是鼠抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，它是人源化的。
7.如權(quán)利要求1所述的抗體可有效治療順氯氨鉑或吡哆醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病。
8.如權(quán)利要求1所述的抗體可有效治療糖尿病型神經(jīng)病。
9.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，當(dāng)向患者施用時(shí)不會引起痛覺過敏。
10.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，它與NT-3相比提高了生物利用率。
11.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，它的比活性高于NT-3。
12.一種含有以下CDR抗trkC抗體重鏈選自SEQ ID NOs1、2、3、4和5號的CDR1；選自SEQ ID NOs6、7、8、9、10和11號的CDR2；以及選自SEQ IDNOs12、13、14、15、16和17號的CDR3。
13.一種含有以下CDR的抗trkC抗體輕鏈選自SEQ ID NOs18、19、20、21、22、23和24號的CDR1；選自SEQ ID NOs25、26、27、28、29和30號的CDR2；以及選自SEQ ID NOs31、32、33、34、35和36號的CDR3。
14.一種含有以下CDR的鼠抗trkC抗體重鏈(a)有XaaWXaaXaaWVK(SEQ ID No37)式的CDR1，其中位置1上的Xaa是F或Y；位置3上的Xaa是I或M；位置4上的Xaa是E或H；(b)有EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa(SEQ ID No38)式的CDR2，其中位置3上的Xaa是L或Y；位置5上的Xaa是G或S；位置6上的Xaa是S或N；位置7上的Xaa是D或G；位置8上的Xaa是N或R；位置16上的Xaa是G或S；以及(c)有KNRNYYGNYVV(SEQ ID No12)或KYYYGNSYRSWYFCV(SEQ ID No13)式的CDR3。
15.一種含有以下CDR的人抗trkC抗體重鏈(a)有XaaXaaXaaYYWXaa(SEQ ID No39)式的CDR1，其中位置1上的Xaa是S或I；位置2上的Xaa是G或S；位置3上的Xaa是G、T或Y；位置7上的Xaa是S或N；(b)有XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS(SEQ ID No40)式的CDR2，其中位置1上的Xaa是Y或R；位置3上的Xaa是Y或F；位置4上的Xaa是Y或T；位置8上的Xaa是S或R；位置10上的Xaa是N或Y；以及(c)有DRDYDSTGDYYSYYGMDV(SEQ ID No14)；DGGYSNPFD(SEQ ID No15)；ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV(SEQ ID No41)式的CDR3，其中位置8上的Xaa是A或T；位置16上的Xaa是D或A。
16.一種抗trkC促效單克隆抗體，它由含有如權(quán)利要求14所述的鼠抗trkC的抗體重鏈的CDR的重鏈和輕鏈結(jié)合組成。
17.如權(quán)利要求16所述的抗體包括人框架殘基。
18.如權(quán)利要求17所述的抗體，其特征在于，它沒有顯示顯著的和trkA和trkB的交叉反應(yīng)。
19.如權(quán)利要求17所述的抗體，它具有由兩個(gè)二硫鍵連接的抗體重鏈-輕鏈對組成的同四聚體結(jié)構(gòu)。
20.如權(quán)利要求17所述的抗體，其特征在于，它是選自Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段的抗體片段。
21.一種抗trkC促效單克隆抗體，它由如權(quán)利要求15所述的人抗trkC抗體重鏈和人抗體輕鏈結(jié)合組成。
22.如權(quán)利要求21所述的抗體，其特征在于，沒有顯示顯著和trkA和trkB的交叉反應(yīng)。
23.如權(quán)利要求22所述的抗體，它具有由兩個(gè)二硫鍵連接的抗體重鏈-輕鏈對組成的同四聚體結(jié)構(gòu)。
24.如權(quán)利要求22所述的抗體，其特征在于，它是選自Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段的抗體片段。
25.如權(quán)利要求22所述的抗體，其特征在于，它是IgG。
26.如權(quán)利要求25所述的抗體，其特征在于，它是IgG-2或IgG-4。
27.一種選自抗體2248、2250、2253和2256的鼠抗trkC促效單克隆抗體。
28.一種選自抗體6.1.2、6.4.1、2345、2349、2.5.1和2344的人抗trkC促效單克隆抗體。
29.如權(quán)利要求28所述的抗體選自抗體6.1.2、6.4.1、2345和2349。
30.一種編碼如權(quán)利要求27所述的鼠抗trkC促效單克隆抗體的分離的核酸分子。
31.一種編碼如權(quán)利要求28所述的人抗trkC促效單克隆抗體的分離的核酸分子。
32.一種于2000年6月21日以登記號PTA-2136、PTA-2137和PTA-2138保存于ATCC的核酸分子。
33.一種于2000年6月21日以登記號PTA-2133、PTA-2134、PTA-2135、PTA-2139、PTA-2140、PTA-2141、PTA-2142和PTA-2143保存于ATCC的核酸分子。
34.一種含有如權(quán)利要求30-33中任何一項(xiàng)所述的核酸分子的載體。
35.一種用如權(quán)利要求30-33中任何一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
36.一種用如權(quán)利要求30-33中任何一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的雜交瘤細(xì)胞系。
37.一種用如權(quán)利要求36所述的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。
38.一種編碼抗trkC促效單克隆抗體重鏈的分離的核酸分子，所述核酸分子選自SEQ ID No58、SEQ ID No60、SEQ ID No62、SEQ ID No64、SEQ ID No66、SEQ ID No68和SEQ ID No70。
39.一種編碼抗trkC促效單克隆抗體輕鏈的分離的核酸分子，所述核酸分子選自SEQ ID No59、SEQ ID No61、SEQ ID No63、SEQ ID No65、SEQ ID No67、SEQ ID No69和SEQ ID No71。
40.一種含有如權(quán)利要求38或39所述的核酸分子的載體。
41.一種用如權(quán)利要求38或39所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
42.一種用如權(quán)利要求38所述的核酸分子和如39所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
43.一種用如權(quán)利要求38或39所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的雜交瘤細(xì)胞。
44.一種用如權(quán)利要求38所述的核酸分子和如39所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的雜交瘤細(xì)胞。
45.一種用如權(quán)利要求43所述的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
46.一種用如權(quán)利要求44所述的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
47.一種由如權(quán)利要求38或39所述的核酸分子編碼的多肽。
48.一種由如權(quán)利要求38所述的核酸分子和如39所述的核酸分子編碼的含有多肽鏈的多肽。
49.一種藥物組合物，它含有有效量的如權(quán)利要求1、16和21中任何一項(xiàng)所述的抗trkC促效單克隆抗體，并與一種藥學(xué)上可接受的載體混合。
50.一種治療神經(jīng)病或神經(jīng)退化病癥、或修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞的方法，包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的如權(quán)利要求1所述的抗體。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)病選自周圍神經(jīng)病、糖尿病型神經(jīng)病和大纖維感覺神經(jīng)病。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)退化病癥是肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)細(xì)胞是感覺神經(jīng)元或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述感覺神經(jīng)元來自背跟神經(jīng)節(jié)。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來自脊髓。
56.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述施用方法是靜脈或皮下的。
57.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述施用方法是局部的。
58.一種增強(qiáng)周圍神經(jīng)元增殖、維持或再生的方法，包括使所述神經(jīng)元與有效量的如權(quán)利要求1、16或21所述的抗體接觸。
59.一種在哺乳動(dòng)物受試者中治療與細(xì)胞退化有關(guān)的疾病或癥狀的方法，該方法是在受試者的細(xì)胞中引入編碼如權(quán)利要求1所述的抗trkC抗體的核酸。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，疾病或癥狀選自神經(jīng)病、神經(jīng)退化疾病和神經(jīng)細(xì)胞損傷。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述核酸在體外被引入所述細(xì)胞。
63.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述核酸在體內(nèi)被引入所述細(xì)胞。
64.一種誘導(dǎo)血管生成的方法，包括以有效誘導(dǎo)血管生成的量傳遞如權(quán)利要求1所述的抗trkC抗體。
65.一種生產(chǎn)抗trkC抗體的方法，包括在與所述trkC的天然NT-3配體的結(jié)合位點(diǎn)重疊的位置上制備與trkC特異性結(jié)合的抗體。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述的抗體在與所述trkC的天然NT-3配體實(shí)際上一樣的位點(diǎn)與trkC結(jié)合。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述抗體與trkC第5域內(nèi)的抗原表位結(jié)合。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述trkC是天然人trkC多肽。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述抗原表位包括所述天然人trkC的L284、E287和N335氨基酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗trkC促效單克隆抗體，它模擬trkC的天然配體NT－3的某些生物活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及此類抗體在預(yù)防和/或治療細(xì)胞退化方面的應(yīng)用，包括與急性神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)損傷和慢性神經(jīng)退化疾病有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損害，包括周圍神經(jīng)病。
文檔編號A61K48/00GK1447857SQ01814421
公開日2003年10月8日 申請日期2001年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月22日
發(fā)明者B·德沃, J·-A·S·弘勾, L·G·普雷斯塔, D·L·謝爾頓 申請人:基因技術(shù)股份有限公司