專利名稱：一種治療咳嗽的新方法
相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明申請(qǐng)要求按照35USC§119(e)享有2000年5月23日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/206,591的優(yōu)先權(quán)權(quán)益。以上提到的申請(qǐng)?jiān)诖嗣鞔_而完整地引入以供參考和其它目的。對(duì)聯(lián)邦政府資助的研究的申明本發(fā)明由美國國立衛(wèi)生研究所的一項(xiàng)基金資助。美國政府在本發(fā)明中可以享有一定的權(quán)利。
另一方面，本發(fā)明也教導(dǎo)局部或全身使用大麻素失活抑制劑來緩解咳嗽，可單獨(dú)用藥或與大麻素受體促效藥聯(lián)合。
本發(fā)明中的藥物組合物和方法的特色是抑制咳嗽的起始和/或從上呼吸道到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞。特別的，本發(fā)明導(dǎo)致了咳嗽信號(hào)的外周抑制。不應(yīng)受任何理論的約束，相信本發(fā)明的藥物組合物通過激活CB1大麻素受體而隔斷了導(dǎo)致引起咳嗽的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在哺乳動(dòng)物的上呼吸道中發(fā)現(xiàn)了這種受體。本發(fā)明通過激活局部的CB1大麻素受體來從外周調(diào)控咳嗽的信號(hào)，而一直以來都認(rèn)為在上呼吸道內(nèi)內(nèi)源性大麻素參與過濾造成咳嗽的信號(hào)。本發(fā)明出人意外地達(dá)到了上述優(yōu)異的高期望值的鎮(zhèn)咳作用，而不引起煩燥不安的副作用以及中樞作用的大麻亞胺物質(zhì)(cannabiminetic)和鴉片藥所特有的成癮性。
本發(fā)明提供一種緩解或預(yù)防患者咳嗽的方法，該方法包括給患者一種有鎮(zhèn)咳作用的大麻素受體促效劑，但不引起任何明顯的精神癥狀。這類患者包括動(dòng)物或人類。例如，用于治療哺乳動(dòng)物咳嗽的一種方法可能包括于上呼吸道(例如通過氣霧劑)局部應(yīng)用一種有效劑量的含至少一種局部起作用的存在于藥學(xué)上可接受的賦形劑中的大麻素受體促效劑來局部應(yīng)用。
在本發(fā)明的方法當(dāng)中，一種根據(jù)本發(fā)明的大麻素受體促效劑或它的藥物組合物可以包括有通式I的大麻素受體促效劑 其中，X是N-R1或O；
R是一個(gè)飽和或不飽和的、手性或非手性的、有環(huán)或無環(huán)的、取代的或未取代的含11-29個(gè)碳原子的烴基，任意摻入多達(dá)6個(gè)氧原子或硫原子；R1、R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或含2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子；和n選自2-4。
當(dāng)R2是OH，且X是N-H時(shí)，它們可能通過羰基結(jié)合而形成一種雜環(huán)結(jié)構(gòu)，例如一種噁唑烷酮環(huán)?；蛘弋?dāng)R2是OH而X是N-H時(shí)，它們也可能結(jié)合成一種雜環(huán)結(jié)構(gòu)，如一種嗎啉環(huán)。
特別的，本發(fā)明涉及一種具有下述通式的酰胺家族，具有作為分子式II大麻素受體促效劑起作用 其中，R是飽和或不飽和的、取代的或未取代的含15-29個(gè)碳原子的烴基，任意摻入多達(dá)3個(gè)氧原子或硫原子；R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或含2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子；和n選自2-4。
當(dāng)R2是OH，而X是N-H時(shí)，它們可能結(jié)合而形成一種雜環(huán)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還涉及一種具有下述通式結(jié)構(gòu)的酯家族，作為具有分子式III大麻素受體促效劑起作用 其中，R是一個(gè)飽和或不飽和的、取代的或未取代的含15-29個(gè)碳原子的烴基，任意摻入多達(dá)3個(gè)氧原子；R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或含2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子；而且n選自2-4。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種具有下述通式結(jié)構(gòu)的酰胺家族，作為具有分子式IV的根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)源性大麻素失活抑制劑起作用 其中，R是一個(gè)多不飽和的、取代的或未取代的含18-22個(gè)碳原子的羥基；R2獨(dú)立選自取代或未取代的環(huán)烷基(C3-6)和取代或未取代的苯基(例如，P-羥苯基，P-羥基-O-甲基-苯基)。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種具有下述通式結(jié)構(gòu)的脂肪酸衍生物，作為具有分子式V的內(nèi)源性大麻素失活抑制劑起作用R1-X-R2其中，R1是一個(gè)飽和或多不飽和的、取代的或未取代的含6-22個(gè)碳原子的羥基；X是-C＝O或SO2-，而且R2是一種鹵素或鹵素取代的甲基。
與本發(fā)明的另一個(gè)目的相一致，揭示了用于治療咳嗽的藥物組合物，其中含有以下直接或間接作用的活性大麻素受體促效劑實(shí)例花生四烯酰乙醇胺(anandamide)，(R)-(+)花生四烯酰-11-羥基-21-丙胺，順式-7，10，13，16-二十二碳四烯酰乙醇胺，同型-δ-linoleyethanolamide，N-丙基-花生四烯酰乙醇胺，N-乙基-花生四烯酰乙醇胺，和2-花生四烯酰甘油酯。本發(fā)明也揭示了治療咳嗽的含以下大麻素失活抑制劑的藥物組合物N-(4-羥苯基)-花生四烯酰酰胺，十六烷基磺酰氟化物，和花生四烯酰三氟代甲基酮。
大麻素受體促效劑和/或大麻素失活抑制劑，以及可接受的藥物賦形劑，可能與其它物質(zhì)一起配制成氣霧劑、噴霧劑或溶液?？捎脕砦搿⒖诜蛭改c外給藥，例如靜脈注射。
局部起作用的大麻素受體促效劑和/或大麻素失活抑制劑以及可接受的藥物賦形劑，可以與其它至少另外一種治療藥聯(lián)合使用，這類治療藥選自抗感染化合物、全身性鎮(zhèn)咳藥和局部麻醉藥。
本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)是以附圖和以下的描述共同闡明的。本發(fā)明的其它特點(diǎn)、目的以及優(yōu)點(diǎn)根據(jù)說明書和附圖以及權(quán)利要求將是顯而易見的。
在此引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)、基因庫序列以及ATCC保藏物是作為各種參考目的明確引入的。


圖1A表示本發(fā)明中直接作用的大麻素化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式。
圖1B表示一種代表性的大麻素失活抑制劑(anandamide運(yùn)輸?shù)囊种苿?的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式。
圖1C表示另一種代表性的大麻素失活抑制劑(anandamide水解的抑制劑)的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式。
圖2A-C描述總結(jié)數(shù)據(jù)的條線圖，顯示anandamide在豚鼠中通過激活外周CB1型大麻素受體而抑制辣椒素引起的支氣管痙攣和咳嗽。結(jié)果以平均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差的方式表示，每種條件n＝3。星號(hào)表示P＜0.01。
圖2A是一個(gè)顯示辣椒素(Caps，mg/kg，靜脈給藥，縮寫為i.v.)在豚鼠支氣管平滑肌的收縮作用，以及香草精類受體拮抗劑辣椒素受體阻斷劑(capsazepine)(Cpz，0.2mg/kg，靜脈給藥)的拮抗作用的條線圖。
圖2B是一個(gè)顯示在存在或不存在CB1拮抗劑SR141716A(SR1，0.5mg/kg，靜脈給藥)或CB2拮抗劑SR144528(SR2，0.3mg/kg，靜脈給藥)時(shí)，anandamide(AEA，mg/kg，靜脈給藥)對(duì)辣椒素(30mg/kg)引起的支氣管痙攣的劑量依賴性抑制作用的條線圖。
圖2C是總結(jié)數(shù)據(jù)的條線圖，顯示在存在或不存在SR141716A(0.5mg/kg，靜脈給藥)或SR144528(0.3mg/kg，靜脈給藥)時(shí)，anandamide對(duì)辣椒素引起的咳嗽的抑制作用。
圖3A-E表示肌肉張力的條線圖和代表性描記曲線，顯示anandamide通過激活外周CB1大麻素受體，在切斷迷走神經(jīng)、阿托品處理的豚鼠中引起支氣管狹窄。星號(hào)表示P＜0.01。
圖3A是一個(gè)顯示在存在或不存在CB1拮抗劑SR141716A(SR1，0.2mg/kg，靜脈給藥)(每種條件下，n＝6)時(shí)，anandamide(AEA，mg/kg，靜脈給藥)對(duì)支氣管平滑肌的劑量依賴性作用總結(jié)的條線圖。
圖3B是一個(gè)顯示存在或不存在SR141716A(SR1，0.3mg/kg，靜脈給藥)(每種條件下，n＝6)時(shí)，總結(jié)anandamide(5-30mg/動(dòng)物，氣管內(nèi)給藥)的劑量依賴性作用的條線圖。在anandamide使用前15分鐘給予SR141716A。
圖3C是用以闡明在豚鼠軟組織條中，anandamide(100μM)對(duì)肌肉等長張力作用的代表性描記曲線，以及CB1拮抗劑SR141716A(1μM)對(duì)其的逆轉(zhuǎn)作用。
圖3D是與圖3C中相同的肺標(biāo)本條對(duì)組氨酸(His，10μM)的反應(yīng)，用于比較。向上的偏差是由反復(fù)對(duì)肺標(biāo)本條的沖洗造成的。
圖3E是一個(gè)總結(jié)在有anandamide(μM)時(shí)肺軟組織的劑量依賴性收縮，以及SR141716A(1μM)對(duì)該作用的拮抗作用(每種條件時(shí)，n＝6)。
圖4A-G表示CB1大麻素受體在大鼠肺軸突末端和末端前片斷中的定位。
圖4A-B表示用銀增強(qiáng)的金顆粒標(biāo)記的CB1大麻素受體(用細(xì)箭頭表示)，在一細(xì)支氣管軸突末端的連續(xù)切片中的定位。含小的電子半透明囊泡和大的致密核心囊泡(粗箭頭)的軸突末端包埋于膠原基質(zhì)中，由支氣管平滑肌細(xì)胞(BSM)包圍。
圖4C表示在某些情況下，在近囊泡叢處(箭頭頭部)可觀察到標(biāo)記的大麻素受體，表明是公認(rèn)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放位點(diǎn)。
圖4D-E表示不定層連續(xù)切片，表明眾多末端軸突包裹在一起形成神經(jīng)膠質(zhì)囊。
圖4F-G表示大麻素受體和神經(jīng)肽Y(NPY)共同定位的免疫反應(yīng)性。免疫金標(biāo)記的CB1受體可見于末端軸突膜上，標(biāo)記為α1和α2，由電子致密的NPY免疫反應(yīng)性所填充。N表示推定的神經(jīng)鞘細(xì)胞的細(xì)胞核。比例尺0.2μm(圖4B和4E的比例與圖4A和4D中相同)。
圖5A-B是一個(gè)條線圖，闡明CB1拮抗劑SR141716A對(duì)辣椒素引起的支氣管痙攣和咳嗽的內(nèi)在作用。結(jié)果以平均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差的方式表示，每個(gè)條件n＝6。星號(hào)表示P＜0.05。
圖5A是一個(gè)條線圖，總結(jié)了有無CB1拮抗劑SR141716A(0.2mg/kg，靜脈給藥)時(shí)，辣椒素(mg/動(dòng)物，氣管內(nèi)給藥)的支氣管收縮作用。
圖5B是一個(gè)條線圖，總結(jié)有無SR141716A(0.2mg/kg，靜脈給藥)時(shí)，辣椒素(0.3μm，4分鐘氣霧劑)致咳作用。
圖6A-C表示在大鼠肺組織中，anandamide的鈣依賴性生物合成。
圖6A-B是典型的高效液相色譜法/質(zhì)譜測量法描記曲線，描記內(nèi)源性anandamide的選擇性離子特性(質(zhì)量與電荷的比例m/z＝370，一種含鈉離子的加合物[M+Na+])和合成的[2H4]anandamide(m/z＝374，[M+Na+])選擇性離子特性，分別作為內(nèi)標(biāo)加入到樣品中。
圖6C是一個(gè)條線圖，總結(jié)EGTA(1mM)或Ca2+(3mM)對(duì)大鼠肺膜上anandamide生物合成的作用。Ca2+明顯刺激了anandamide的形成(平均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P＜0.05，n＝4)。
圖7A-F闡明了在大鼠肺組織中anandamide前體的結(jié)構(gòu)和其鈣依賴性合成。
圖7A-B表示alk-1-palmitoenyl-2-花生四烯酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺-N-花生四烯酰(NAPE1)和alk-1-硬脂酸-2-花生四烯酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺-N-花生四烯酰(NAPE2)各自的化學(xué)結(jié)構(gòu)。它們是兩種推測的anandamide前體。
圖7C-D是典型的高效液相色譜法/質(zhì)譜測量法描記曲線，分別描記NAPE1(m/z＝1009，去質(zhì)子化分子離子，[M-H]-)和NAPE2(m/z＝1039，[M-H]-)的選擇性離子特性。
圖7E-F是條線圖，總結(jié)與EGTA相比，通過與Ca2+(3mM)(平均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P＜0.05，n＝4)孵育可明顯刺激NAPE1和NAPE2的生物合成。以雙峰形式將NAPE2從柱中洗脫出來，并將兩個(gè)峰下的面積結(jié)合起來進(jìn)行定量。
多副圖中同樣的標(biāo)記符號(hào)表示同樣的成分。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供通過以下途徑緩解咳嗽的方法，(1)局部給予anandamide和其它大麻素化合物，例如以分子式I、II、III所示的化合物；和/或(2)局部或全身給予能增加上呼吸道中內(nèi)源性或外源性加入的大麻素水平的藥劑，其作用為抑制大麻素失活，例如那些以分子式IV和V表示的化合物。
定義除非另有定義，本發(fā)明中所采用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員普遍理解的意思。除非特別注明，在此使用的以下術(shù)語具有其被賦予的含義。
短語“給予一種藥物組合物”具體表現(xiàn)了該短語的普通使用方法，是指考慮藥物組合物的特性以及合適的給藥部位給予患者藥劑的任何合適的方法；例如在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是吸入到肺的。
這里使用的術(shù)語“減輕”是指在治療或減輕一種與咳嗽相關(guān)的損傷、病理、病情或癥狀中的任何成功的標(biāo)志，包括任何客觀或主觀指標(biāo)如消除；減輕癥狀或使患者對(duì)癥狀、損傷、病理或病情更具耐受性；降低癥狀或病情的頻率或持續(xù)時(shí)間；改進(jìn)患者的身體或心理的健康；以及預(yù)防咳嗽癥狀或病情的發(fā)作。對(duì)癥狀的治療或減輕可以基于任何客觀或主觀的指標(biāo)；包括患者的觀察結(jié)果、身體檢查或患者康樂感覺上的改進(jìn)。
這里使用的術(shù)語“anandamide”是指花生四烯酰乙醇胺，(例如，參見美國專利5631297)，是一種可激活大麻素受體的內(nèi)源性脂質(zhì)，效果與Δ9-四氫大麻酚相仿，為印度大麻和大麻的主要活性成分。anandamide類似物(等同物)在美國專利5977180，WO99/60987，WO99/64389中有描述。也見于美國專利6028084，6013648，5990170，5925672，5747524，5596106；EP0570920，WO94-12466。
這里使用的術(shù)語“局部起作用的大麻素”是指通式I、II或III的大麻素。例如，這類大麻素類似物(等同物)在美國專利5635530和5618955中有描述。
這里使用的術(shù)語“直接的大麻素受體促效劑”是指能與CB1型大麻素受體結(jié)合并將其激活的化合物。
這里使用的術(shù)語“間接大麻素受體促效劑”、“大麻素失活抑制劑”是指能封閉大麻素化合物的運(yùn)輸失活過程和/或降解的化合物，并最終導(dǎo)致大麻素物質(zhì)在其作用部位的積累。
這里使用的術(shù)語“內(nèi)源性大麻素”是指大麻素受體的內(nèi)源性促效劑或它的等同物。大麻素受體在如美國專利6013648中有描述。內(nèi)源性促效劑包括例如，2-花生四烯酰甘油或anandamide。也見于美國專利6028084，6017919，596106，5990170和Seltzman(1999)Curr.Med.Chem.6685-704。
這里使用的術(shù)語“咳嗽”是指咳嗽的動(dòng)作或與引起咳嗽有關(guān)的心理或生理的感覺，可通過給予一種藥物組合物而得到緩解，該藥物組合物能作為大麻素受體促效劑，抑制運(yùn)輸?shù)氖Щ?如細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸)，和/或抑制內(nèi)源性或外源性加入的大麻素物質(zhì)的水解?！翱人浴钡囊饬x很廣泛，并不只限于某種特定的疾病或引起這種病情的原因。
本發(fā)明并不局限于任何特定的作用機(jī)制，在一個(gè)實(shí)施方案中，如以下進(jìn)一步詳細(xì)描述的，本發(fā)明嘗試給予局部起作用的大麻素受體促效劑和/或給予大麻素失活抑制劑，可抑制大麻素物質(zhì)運(yùn)輸?shù)氖Щ?，?或抑制大麻素物質(zhì)anandamide水解。
短語“抑制大麻素失活”的意思是指任何可檢測到的細(xì)胞外自由大麻素物質(zhì)的數(shù)量的增加。由于本發(fā)明不局限于任何特定的機(jī)制，對(duì)失活的抑制可通過藥物組合物對(duì)細(xì)胞膜吸收大麻素物質(zhì)失活的抑制來實(shí)現(xiàn)，或通過抑制anandamide的水解。
術(shù)語“藥學(xué)可接受的賦形劑”具體體現(xiàn)了其普通用法，包括任何合適的藥劑賦形劑，包括例如水，鹽水，磷酸鹽緩沖液，Hank’s液，林格溶液，葡萄糖/鹽水，葡萄糖，乳糖，或蔗糖溶液、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、甘油、丙二醇、乙醇等。
術(shù)語“藥學(xué)有效的”和“治療有效的”是指在人或動(dòng)物中由于大麻素或大麻素樣受體的刺激而引起的咳嗽的抑制或預(yù)防的足夠劑量。術(shù)語“治療有效劑量”及其語法上的變通形式是指當(dāng)局部(如通過氣霧劑)或全身應(yīng)用(如口服)時(shí)，足夠產(chǎn)生所希望的治療效果的活性化合物的數(shù)量。
一般方法本發(fā)明的方法是使用通過提供局部起作用的大麻素、抑制大麻素的轉(zhuǎn)運(yùn)失活、和/或抑制anandamide水解來緩解咳嗽的化合物。多種可用于這類方法中的示范性化合物將描述于下。用于鑒定這類化合物的示范性常規(guī)方法也在這里進(jìn)行描述。用于鑒定對(duì)大麻素運(yùn)輸失活進(jìn)行抑制的示范性常規(guī)方法可在2000年7月6日提出的美國專利申請(qǐng)09/612326中找到。該申請(qǐng)的全部在此以參考的形式引用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的方法中有用的化合物(如花生四烯酰乙醇胺)可用多種程序和方法進(jìn)行合成，這些在科學(xué)性和專利性文獻(xiàn)中有很好的描述，例如Organic syntheses collectivevolumes，Gilman等人編輯，John Wiley&Sons Inc.公司，紐約，Venuti(1989)Pharm Res(藥物研究)，6867-873。本發(fā)明可與本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何方法或方案聯(lián)合使用，這在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中也很好地作了描述。因此，在討論與本發(fā)明相關(guān)的方法和實(shí)施例之前，只對(duì)幾種常規(guī)技術(shù)進(jìn)行描述。設(shè)計(jì)可用于本發(fā)明方法中的局部起作用的大麻素的結(jié)構(gòu)指導(dǎo)和篩選測驗(yàn)在本發(fā)明的方法中，藥物組合物包括給藥后可緩解咳嗽的化合物。這類化合物通過局部激活大麻素受體起作用。一種局部起作用化合物的例子是anandamide。
作為內(nèi)源性大麻素脂質(zhì)的anandamide(花生四烯酰乙醇胺)，其生物學(xué)作用被認(rèn)為是通過anandamide對(duì)CB1受體的激活而抑制咳嗽和支氣管痙攣的。這種作用通過這里描述的在局部起作用的大麻素的存在，應(yīng)用CB1和CB2受體拮抗劑的研究而使其理論化。該實(shí)驗(yàn)在下面進(jìn)行了更詳盡的描述。
更進(jìn)一步，正如這里所描述的，本發(fā)明中的方法已通過應(yīng)用本領(lǐng)域可以接受的動(dòng)物模型證實(shí)其能緩解咳嗽。特別的，大麻素及其鎮(zhèn)咳作用在豚鼠、大鼠和貓中進(jìn)行了觀察(Gordon R等人(1976)Eur.J.Pharmacol.(歐洲藥理雜志)，Vol.35(2)309-313)?？傊@些示范性的技術(shù)和指導(dǎo)提供了用于本發(fā)明方法中使用于藥物組合物的化合物選擇的清楚指標(biāo)。
大麻素，例如anandamide可在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過全身給藥或在呼吸道局部應(yīng)用時(shí)，可產(chǎn)生長遠(yuǎn)的抑制咳嗽和支氣管平滑肌收縮的作用。圖2A-C顯示在給予辣椒的辛辣成分辣椒素后，豚鼠支氣管痙攣和咳嗽的程度的條線圖。在大鼠中也得到了相似的數(shù)據(jù)(氣管內(nèi)給藥，10mg/動(dòng)物，最重支氣管痙攣的41±6％；30mg/動(dòng)物，55±12％；100mg/動(dòng)物，81±19％；均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝3)。在豚鼠中，這種作用可通過在辣椒素之前全身性給予anandamide化合物而得到消除(圖2B)。在大鼠中也得到了相似的結(jié)果(辣椒素，10mg/動(dòng)物，氣管內(nèi)給藥；最重支氣管痙攣的37.2±4.2％；給予anandamide后給予辣椒素，1mg/kg，靜脈給藥，14±7％，n＝3)。這種作用可由選擇性CB1大麻素拮抗劑SR141716A所完全逆轉(zhuǎn)，但最大劑量的CB2拮抗劑SR144528只能稍微降低這種作用。十六烷基乙醇胺是一種anandamide的結(jié)構(gòu)類似物，能在小鼠中抑制傷害感覺，但如Calignano等人(1998)Nature，394，277-281中所描述的，與CB1大麻素受體不反應(yīng)，在緩解辣椒素引起的支氣管痙攣時(shí)無效。當(dāng)作為氣霧劑給予清醒的豚鼠時(shí)，辣椒素可刺激上呼吸道C-纖維活性并引發(fā)咳嗽。全身性anandamide可減輕辣椒素引起的咳嗽，如圖2C所示，該作用可被CB1大麻酸受體的封閉所抵消。重要的是，氣霧化的anandamide也產(chǎn)生有效的鎮(zhèn)咳作用(圖2C)，而且不伴隨任何可見的大麻素中毒病癥。
除了在最高檢測劑量時(shí)(5mg/kg)，anandamide沒有直接的刺激支氣管作用，在最高劑量時(shí)，該化合物引起輕微的支氣管狹窄(11.8±5.9％的最大狹窄，均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝5)。為進(jìn)行研究這種反應(yīng)，檢測了anandamide在喪失了由迷走神經(jīng)產(chǎn)生的支氣管收縮緊張的麻醉嚙齒動(dòng)物中的效果。結(jié)果表示于圖3A-E。在迷走神經(jīng)切斷并給予了可消除迷走神經(jīng)影響的阿托品(一種膽堿能拮抗劑)后，如圖3A所示，無論SR141716A存在與否，全身應(yīng)用anandamide在豚鼠和大鼠中產(chǎn)生一種劑量依賴性的支氣管狹窄(靜脈給藥，1mg/kg，0±0％的最大支氣管痙攣；3mg/kg，12±1.7％；5mg/kg，18.3±1.2％；n＝3)。當(dāng)將anandamide通過氣管導(dǎo)管注射到豚鼠的支氣管導(dǎo)管(圖3B)或應(yīng)用到豚鼠肺實(shí)質(zhì)分離的標(biāo)本條時(shí)(圖3C-E)，觀察到了同樣的效果。圖3D是圖3C對(duì)組胺應(yīng)答中相同的肺標(biāo)本條的一個(gè)典型描記曲線。圖3E顯示由anandamide所引起的肺實(shí)質(zhì)的收縮以及SR141716A的拮抗作用。豚鼠肺標(biāo)本條中anandamide的緩慢應(yīng)答啟動(dòng)與在其它分離的組織中所得到的結(jié)果一致，例如Devane W等人(1992)Science 258，1946-1949，所描述的，而在這種準(zhǔn)備階段中anandamide的這種緩慢作用可能是由于有限的組織穿透和/或快速失活。
與這種可能性一致的是，anandamide運(yùn)輸?shù)囊种苿㎞-(4-羥苯基)-花生四烯酰胺在豚鼠中增強(qiáng)anandamide引起的肺標(biāo)本條的收縮(anandamide，50μM，0.336±0.07達(dá)因/mg組織；anandamide加N-(4)-羥苯基-花生四烯酰胺，28μM，0.638±0.06達(dá)因/mg組織；P＜0.05，n＝6)。CB1拮抗劑SR141716A在體內(nèi)和體外封閉了anandamide的支氣管狹窄作用(圖3A-E)，而CB2拮抗劑SR144528沒有這種效果。在氣管給予大麻素促效劑HU210后也有效地引起豚鼠支氣管肌肉收縮(0.1mg/動(dòng)物，10.0±0.6的最大支氣管痙攣；1mg/動(dòng)物，30±1.2％；10mg/動(dòng)物，60±2.2％；30mg/動(dòng)物，100％；n＝6)。
anandamide被認(rèn)為可激活香草精類(vanilloid)受體。然而，以可完全阻止辣椒素的作用的劑量(0.2mg/kg，靜脈注射)香草精類拮抗劑辣椒素受體阻斷劑對(duì)anandamide引起的支氣管痙攣沒有效果。這些結(jié)果表明去除迷走神經(jīng)興奮性緊張性揭示出由CB1大麻素受體介導(dǎo)的anandamide的支氣管收縮活性。
在局部給藥后，anandamide影響支氣管肌肉收縮性的能力提示，該化合物可能通過激活位于氣管內(nèi)的CB1大麻素受體可發(fā)揮其作用。為檢測這一可能性，通過一種抗大鼠CB1大麻素受體蛋白細(xì)胞內(nèi)C-末端的抗體，用電子顯微鏡測定了大鼠肺中CB1大麻素受體的超結(jié)構(gòu)定位。免疫金染色顯示大麻素受體存在于神經(jīng)纖維中，如圖4A-C所示分布于支氣管和細(xì)支氣管平滑肌細(xì)胞中，或分布于縱向和環(huán)形平滑肌層之間，其中幾個(gè)軸突包裹在一起形成神經(jīng)膠質(zhì)囊(圖4D-E)。所有的神經(jīng)束至少含一個(gè)CB1大麻素受體陽性軸突。
詳細(xì)評(píng)估(20個(gè)束含91個(gè)軸突，在隨后的至少25個(gè)連續(xù)切片中均為這種情形)提示，36％的軸突標(biāo)記了大麻素受體的抗體。標(biāo)記大麻素受體的金顆粒貼附于軸突質(zhì)膜的內(nèi)表面，或者位于釋放位點(diǎn)或者位于末端前片段。這與我們的抗體識(shí)別細(xì)胞內(nèi)CB1大麻素受體蛋白的C-末端的事實(shí)是一致的。具有大麻素受體免疫反應(yīng)性的軸突末端接近于平滑肌細(xì)胞(0.2-0.5mm)，而且含大量小顆粒囊泡以及少量致密核心囊泡(圖4A-B)。在某些情況下，有免疫反應(yīng)性的大麻素受體與聚集于質(zhì)膜的小囊泡簇鄰接，這很可能代表神經(jīng)遞質(zhì)的釋放位點(diǎn)(圖4C)。
在檢測CB1大麻素受體是否位于去甲腎上腺素能和/或非去甲腎上腺素能纖維上時(shí)，使用了免疫金染色CB1大麻素受體和免疫過氧化酶染色神經(jīng)肽Y(NPY)的結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)63％的具有NPY的軸突也同樣是CB1受體陽性的(圖4F-G)。然而，重要的是，觀察到許多NPY陰性的軸突具廣泛的染色，這提示去甲腎上腺素能和/或非去甲腎上腺素能纖維均表達(dá)大麻素受體。
如果不是特異的，主要在氣管神經(jīng)軸突末端觀察到大麻素受體的發(fā)現(xiàn)提示，anandamide通過一種預(yù)交聯(lián)的機(jī)制來調(diào)控咳嗽和支氣管平滑肌緊張性。確實(shí)，對(duì)氣管興奮性神經(jīng)傳遞的抑制可能對(duì)于anandamide對(duì)抗辣椒素引起的咳嗽和支氣管痙的抑制能力提供一種簡單的解釋。這種解釋進(jìn)一步由anandamide和其它大麻素促效劑抑制在外周組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放能力所支持。在缺乏膽堿能控制的動(dòng)物中，anandamide的收縮作用的根本機(jī)制目前仍未知。一個(gè)可能是anandamide對(duì)氣管擴(kuò)張介質(zhì)的抑制，這與CB1大麻素受體與NPY并置是一致的。另外，anandamide可能與平滑肌細(xì)胞上的大麻素受體相互作用。在肺平滑肌上檢測不到CB1大麻素受體的免疫反應(yīng)性可能是由所采用的技術(shù)的靈敏度不夠，或由于平滑肌上存在一種變異的，所使用的抗體不能識(shí)別的受體所造成的。有趣的是，Northern雜交分析提示II型肺胞細(xì)胞可能表達(dá)兩種不同種類的CB1大麻素受體mRNA。
為檢驗(yàn)內(nèi)源性大麻素調(diào)控氣管應(yīng)答的可能性，檢測了CB1和CB2拮抗劑對(duì)豚鼠支氣管痙攣和咳嗽的內(nèi)在效果。用SR141716A封閉CB1大麻素受體本質(zhì)上不影響刺激支氣管的結(jié)果，但通過氣管導(dǎo)管(圖5A-B)或靜脈注射(30mg/kg，只有辣椒素，55.3±8.2％最大支氣管痙攣；SR141716A后給予辣椒素，或0.5mg/kg，靜脈注射，92.34±3.4％；P＜0.05，n＝3)給藥后可顯著增強(qiáng)由辣椒素引起的支氣管痙攣和咳嗽。CB2拮抗劑SR144528沒有這種效果。盡管CB1拮抗劑的刺激支氣管作用可能是由于其相反的促效劑特性，但兩種證據(jù)提示該藥通過對(duì)大麻素的逆調(diào)控而起作用的。首先，在不存在辣椒素時(shí)，CB1拮抗劑無可見的效果是與相反的促效劑特性相悖的。其次，通過高效液相色譜(HPLC)與正離子電噴霧質(zhì)譜法(MS)分析顯示，anandamide在大鼠肺組織中是通過鈣離子激活機(jī)制而合成的(圖6A-B)。大鼠肺膜在鈣離子螯合劑EGTA(1mM)存在時(shí)，產(chǎn)生平均0.6±0.2pmol的anandamide/kg蛋白質(zhì)；在鈣離子(3mM)存在時(shí)，產(chǎn)生平均1.6±0.2pmol的anandamide/kg蛋白質(zhì)(平均數(shù)±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差，n＝4，在EGTA和鈣離子之間，p＜0.05，t檢驗(yàn))(圖6C)。在EGTA存在時(shí)，豚鼠肺膜產(chǎn)生0.9±0.3pmol的anandamide/kg蛋白質(zhì)；在鈣離子存在時(shí)，產(chǎn)生8.8±1.2pmol的anandamide/kg蛋白質(zhì)(n＝4，p＜0.0001，t檢驗(yàn))。
認(rèn)為anandamide起源于N-花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(NAPE)的酶切而產(chǎn)生，anandamide的生物合成是由鈣依賴性N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性所催化的，(Di Marzo，V等人，(1994)，Nature，372，686-691；SugiuraT等人，(1996)Eur J Biochem，240，53-62；Cadas H等人(1997)，J Neurosci，17，1226-1242。應(yīng)用負(fù)離子電噴霧HPLC/MS，鑒定了從大鼠肺膜的脂質(zhì)提取物的兩種NAPE分子，即描述于圖7A的alk-1-palmitoenyl-2-花生四烯酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺-N-花生四烯酰(NAPE1)，和描述于圖7B的alk-1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺-N-花生四烯酰(NAPE2)。鑒定是基于(1)合適質(zhì)量的去質(zhì)子化分子的出現(xiàn)(NAPE 1質(zhì)量/電荷(m/z)1009；NAPE2(m/z)1039)；(2)這類成分的光譜學(xué)特性，其特性是與合成的NAPE相似的(圖7C-D)。NAPE1和NAPE2在大鼠肺膜以鈣依賴的方式合成的。當(dāng)與EGTA(1mM)孵育時(shí)，該膜產(chǎn)生1.5±0.02pmol的NAPE1和檢測不到的NAPE2。當(dāng)與鈣離子(3mM)孵育時(shí)，產(chǎn)生4.4±0.5pmol的NAPE1和3.1±0.6pmol的NAPE2(n＝4，在EGTA和鈣離子之間，p＜0.05)(圖7E-F)。豚鼠肺膜也以鈣依賴的方式合成NAPE1和NAPE2。在嚙齒動(dòng)物中存在生物合成anandamide及其磷脂前體的鈣離子激活機(jī)制，支持了這種內(nèi)源性大麻素在氣管調(diào)節(jié)中起一定的作用。這也反過來提示對(duì)anandamide失活的抑制物(分子式為IV和IV的化合物)可能也通過其造成anandamide在其作用部位的累積來產(chǎn)生抑制咳嗽和支氣管擴(kuò)張的效果。
這些結(jié)果顯示，通過局部釋放的大麻素化合物如anandamide激活CB1大麻素受體，參與了對(duì)咳嗽和支氣管收縮的調(diào)控。然而，大麻素如何控制支氣管收縮可能依賴于支氣管肌肉的狀態(tài)。當(dāng)肌肉收縮時(shí)，例如當(dāng)辣椒素引起支氣管痙攣時(shí)，anandamide可能通過抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的預(yù)交匯釋放來抵消這種收縮。相反，當(dāng)平滑肌松馳時(shí)，正如在去除迷走神經(jīng)的收縮影響后所見到的，anandamides可能引起支氣管收縮。
總之，本發(fā)明的結(jié)果提示，在迷走神經(jīng)緊張未受損的動(dòng)物的氣管中局部應(yīng)用大麻素制劑，可導(dǎo)致對(duì)咳嗽的抑制。這種效果是由對(duì)定位于氣管神經(jīng)外周末端的CB1大麻素受體的激活所介導(dǎo)的。另外，結(jié)果提示局部或全身應(yīng)用內(nèi)源性大麻素失活的抑制劑也可以抑制咳嗽。由于在本實(shí)驗(yàn)中所使用的動(dòng)物模型可預(yù)測對(duì)人類的鎮(zhèn)咳作用和治療，因此，推測相應(yīng)的鎮(zhèn)咳效果也可以在由病理致咳病情所影響的人類中產(chǎn)生。這類病情包括，但不僅限于，持續(xù)性干咳、癌癥所引起的咳嗽、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑所引起的咳嗽。
本發(fā)明揭示了在哺乳動(dòng)物中，通過應(yīng)用至少一種直接或間接的大麻素受體促效劑來治療咳嗽的方法，該類促效劑可通過在上呼吸道的外州作用主動(dòng)緩解或預(yù)防咳嗽。該治療方法包括的一個(gè)步驟為給哺乳動(dòng)物投予緩解或預(yù)防咳嗽劑量的藥劑配方，其中至少包括一種以通式I、II、III、IV或V描述如下的化合物。
分子式I 其中，X是N-R1或O；R是一個(gè)飽和或不飽和的、手性或非手性的、有環(huán)的或無環(huán)的、取代的或未取代的含11-29個(gè)碳原子的烴基物，任意摻入多達(dá)6個(gè)氧原子或硫原子；R1，R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或含2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子；而且n選自2-4。
當(dāng)R2是OH，而X是N-H時(shí)，它們可能通過羰基結(jié)合而形成一種雜環(huán)結(jié)構(gòu)，例如一種噁唑烷酮環(huán)?；蛘弋?dāng)R2是OH而X是N-H時(shí)，它們也可能結(jié)合成一種雜環(huán)結(jié)構(gòu)，如一種嗎啉環(huán)。
分子式II 其中，R是一個(gè)飽和或不飽和的、取代的或未取代的含15-29個(gè)碳原子的烴基，任意摻入多達(dá)3個(gè)氧原子或硫原子；R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或含2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子；而且n選自2-4。
當(dāng)R2是OH，而X是N-H時(shí)，它們可能結(jié)合而形成一種雜環(huán)結(jié)構(gòu)。
分子式III 其中，R是一個(gè)飽和或不飽和的、取代的或未取代的含15-29個(gè)碳原子的烴基，任意摻入多達(dá)3個(gè)氧原子；R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或含2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子；而且n選自2-4。
分子式IV 其中，R是一個(gè)多不飽和的、取代的或未取代的含18-22個(gè)碳原子的羥基；R2獨(dú)立選自取代的或未取代的環(huán)烷基(C3-6)和取代的或未取代的苯基(例如，P-羥苯基，P-羥基-O-甲基-苯基)。
分子式VR1-X-R2其中，R1是一個(gè)飽和或多不飽和的、取代的或未取代的含6-22個(gè)碳原子的羥基；X是-C＝O或SO2-，而且R2是一種鹵素或鹵素替代的甲基。藥學(xué)配方在本發(fā)明的方法中所使用的藥物組合物可通過任何本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法給藥，例如胃腸外、體表、口服或局部給藥，如氣霧劑或皮下的方式。藥物組合物可以配制成任何方式，并可根據(jù)病情、疾病、程度或咳嗽的病因、病人的一般情況以多種劑量單位的形式給藥，以得到給藥及其它的優(yōu)選方法。用于實(shí)施本發(fā)明所述方法的常規(guī)檢測方案、配方和給藥途徑在專利和科學(xué)性文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述，例如新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，Maack Publishing Co.，Easton PA。
藥劑配方可根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何生產(chǎn)藥品的方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的藥物組合物可以包含其它活性劑，如抗炎化合物。藥學(xué)上可接受的化合物也可包含生理上可接受的化合物，可用來穩(wěn)定該組合物，或用來增加或減少藥劑和/或藥學(xué)組合物的吸收。一種配方可以與無毒性的藥學(xué)上可接受的適合于生產(chǎn)的賦形劑進(jìn)行混合。
用于口服的藥劑配方可使用藥學(xué)上可接受的、在本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的載體，以合適的劑量進(jìn)行配制。這類載體可將藥品配制成片劑、丸劑、粉劑、糖衣藥丸、膠囊、針劑、菱形劑、凝膠、糖漿、漿劑、懸液等單位劑量方式，以適合于被患者攝取?？诜巹┑闹苽淇赏ㄟ^將本發(fā)明中的大麻素與一種固體賦形劑相結(jié)合，隨意地碾成所要的混合物，如果需要，再加入合適的添加化合物后，將這些混合物處理成藥片或糖衣藥丸核心。合適的固體賦形劑如碳水化合物或蛋白質(zhì)填充物包括糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；從玉米、小麥、水稻、馬鈴署或其它植物所得到的淀粉；纖維素如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素鈉；和樹膠，包括阿拉伯樹膠和黃芪膠；以及蛋白質(zhì)，例如明膠和膠原。也可以加入崩解劑或增溶劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽，如藻酸鈉。
糖衣藥丸核心是用合適的糖衣如濃縮的糖溶液所包被，糖衣也可能含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、聚乙二醇，和/或二氧化鈦、漆溶液，和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。也可以在藥片或藥丸的糖衣中加入染料或顏料用來區(qū)分產(chǎn)品，或區(qū)分有效化合物的數(shù)量(如劑量)。本發(fā)明的藥劑制備物也可用于口服，如用明膠制成的適合吞咽的膠囊，以及柔軟的、封閉的膠囊再加以如甘油或山梨醇的糖衣。易吞咽的膠囊可以含有與填充物或粘合劑混合的活性劑，粘合劑例如乳糖或淀粉，潤滑劑如滑石、硬脂酸鎂，以及可選擇性地加入穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性劑可溶于或懸于合適的液體中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇，穩(wěn)定劑可有可無。
液體懸液可在其混合物中含一種活性劑(如N-4-羥苯基-花生四烯酰胺)，以及適合于液體懸液生產(chǎn)的賦形劑。這類賦形劑包括一種懸浮劑如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鹽，聚乙烯吡咯烷酮，黃芪樹膠，阿拉伯樹膠，以及分散劑或濕潤劑如天然產(chǎn)生的磷脂(如卵磷脂)，一種烯化氧和一種脂肪酸(如聚氧乙烯硬脂酸酯)的濃縮品，一種環(huán)氧乙烷和一種長鏈脂肪族醇的濃縮品(如十七碳乙烯氧十六烷醇)，一種環(huán)氧乙烷和從脂肪酸及己糖醇獲得的部分酯的濃縮品(聚氧乙烯單油酸山梨醇)，或環(huán)氧乙烷和一種從脂肪酸和己糖醇酐所得到的部分酯的濃縮品(如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)。液體懸液也可包含一種或多種防腐劑，如乙基或n-丙基p-羥基苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種增香劑以及一種或多種甜味劑如蔗糖、天冬甜素或糖精。配方可調(diào)整為重量克分子滲透濃度。
油基藥品對(duì)施用疏水的活性劑特別有用。油基懸液可通過在植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油、椰子油)，或在一種礦物油如液體石蠟；或在一種這類油的混合物中懸浮一種活性劑來配制(如N-4-羥苯基-花生四烯酰胺)。參見例如美國專利5716928，描述應(yīng)用精油或精油成分來增加生物可利用性，并降低口服疏水藥劑化合物的個(gè)體內(nèi)部和相互間的變化(也見于美國專利5858401)。油懸液可包含一種增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或十六烷醇?？杉尤胩鹞秳┤绺视?、山梨醇或蔗糖以提供一種美味的口服制劑。這些配方可通過添加一種抗氧化劑如抗壞血酸來保存。作為一種可注射的油性載體的例子，參見Minto(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.28193-102。
本發(fā)明的藥劑配方也可以是油溶于水的乳劑形式。油相可以是如上所述的植物油或礦物油，或它們的混合物。適合的乳化劑包括天然生成的樹膠，如阿拉伯樹膠和黃芪樹膠，天然生成的磷脂，如大豆卵磷脂，酯或從脂肪酸和己糖醇酐衍生而來的部分酯，如失水山梨糖醇單油酸酯，以及這些半酯與環(huán)氧乙烷的濃縮品，如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。乳劑可以包含甜味劑和增香劑，如糖漿和酏劑形式的配方中所用。這種配方還可以包含一種粘滑劑，一種防腐劑或一種著色劑素。
加水后適合制備成乳劑懸液的分散性的粉和顆粒可以經(jīng)與一種分散劑、懸浮劑和/或濕潤劑混合而配制，以及一種或多種防腐劑。合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑由前面提到的例子加以證明。也可以存在另外的賦形劑，如甜味劑、增香劑和著色劑。
在本發(fā)明的方法中，藥劑化合物也可以通過鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)的途徑給藥，包括吸入法、粉劑和氣霧劑配方(例如類固醇吸入劑，見Rohatagi(1995)J Clin.Pharmacol.351187-1193；Tjwa(1995)Ann.Allergy Asthma Immunol.75107-111)。例如，可將氣霧劑配方置于可加壓的噴射劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)饧捌渌愃莆铩Ｒ部梢詫⑺幤分瞥刹粔嚎s的制備物如在噴霧器或霧化器中。典型的，這種藥劑是在一種液態(tài)的藥學(xué)可接受的緩沖液中施用。
在本發(fā)明的方法中，藥劑化合物可經(jīng)皮下給藥，通過一種局部途徑，制成涂藥棒、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、乳膏、軟膏、糊劑、膠胨、涂劑、粉劑和氣溶膠。
在本發(fā)明的方法中，藥劑化合物也可以通過微球的方式給藥以便在體內(nèi)緩慢釋放。例如，微球可通過皮內(nèi)注射該藥物給藥，這樣可以皮下緩慢釋放，參見Rao(1995)；J Biomater Sci Polyn Ed 7623-645；作為生物可降解的或可注射的凝膠的配方，參見Gao(1995)Pharm.Res.12857-863(1995)；或作為微球口服，參見如Eyles(1997)J.Pharm.Pharmacol.49669-674。經(jīng)皮和皮內(nèi)途徑均可經(jīng)受持續(xù)注射，從幾周至幾個(gè)月。
在本發(fā)明的方法中，藥物組合物可以鹽的形式提供，可與多種酸配制，包括但不僅限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。作為對(duì)應(yīng)的自由堿形式，鹽更易溶于水或其它質(zhì)子溶劑中。在其它情況下，優(yōu)選的制備物可能是一種溶于1mM-50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露糖，pH4.5-5.5的凍干粉，干粉在使用前溶于緩沖液。
在本發(fā)明的方法中，藥物組合物可經(jīng)胃腸外給藥，如通過靜脈給藥(IV)。這些配方一般包括活性劑溶于一種藥品可接受的載體所形成的溶液?？梢允褂玫妮d體和溶劑是水和林格溶液，后者是一種等滲氯化鈉。另外，無菌的固定油類傳統(tǒng)上可用作溶劑或懸浮液介質(zhì)。基于這個(gè)目的，可采用任何溫和的固定油類，包括合成的單酸甘油酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可用于注射劑的制備。這些溶液是無菌的，而且一般沒有不需要的物質(zhì)。這些配方可由傳統(tǒng)的、熟知的消毒技術(shù)滅菌。配方可以含有藥品許可的輔助物質(zhì)，以用來接近生理?xiàng)l件如pH的調(diào)整和緩沖試劑，毒性調(diào)節(jié)試劑，如醋酸鹽、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等?；钚栽噭┰谶@些配方中的濃度可以有很大的變化，主要以液體的體積、粘度、體重等，與所選擇的特異的給藥模式及患者的需要相協(xié)調(diào)。對(duì)于IV給藥，配方可以是無菌的注射制備物，如一種無菌的注射水溶液或油狀的懸浮液。這種懸浮液可用那些合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑制備。無菌的注射制備物也可以是溶于一種無毒性胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，如一種1，3-丁二醇溶液。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的配方可通過應(yīng)用脂質(zhì)體給藥，脂質(zhì)體可與細(xì)胞膜融合或內(nèi)吞，如通過利用貼附于脂質(zhì)體上的配體，或直接貼附于寡核苷酸，它可與細(xì)胞的表面膜蛋白受體結(jié)合而導(dǎo)致內(nèi)吞。通過采用脂質(zhì)體，特別是當(dāng)脂質(zhì)體表面攜帶對(duì)靶細(xì)胞有特異性的配體或者是直接特異于一種特定的器官，其可以在體內(nèi)將活性劑傳送到靶細(xì)胞。參見美國專利6063400；6007839；Al-Muhammed(1996)JMicroencapsul.13293-306；Chonn(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6698-708；Ostro(1989)Am.J.Hosp.Pharm.461576-1587。
在本發(fā)明的方法中，藥物組合物的給藥劑量是足以緩解咳嗽。足以發(fā)揮這種作用的藥物組合物的量被定義為“治療有效劑量”。作為這種用途的劑量的時(shí)間表和有效數(shù)量，即“劑量制度”依賴于多種因素，包括病程和/或病的嚴(yán)重程度、病情、或其它引起咳嗽的原因，咳嗽的嚴(yán)重程度，病人的一般健康狀況，病人的身體狀況，年齡等。在計(jì)算一個(gè)病人的劑量制度時(shí)，也需要考慮給藥方式。
劑量制度也需考慮本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，即活性劑的吸收率、生物利用度、新陳代謝率、清除率等(參見Hidalgo-Aragones(1996)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.58611-617；Groning(1996)Pharmazie 51337-341；Fotherby(1996)Contraception5459-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.841144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie 50610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24103-108；最近的Remington’s，見上)。本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)狀允許臨床醫(yī)生決定每個(gè)單個(gè)病人、每種活性劑、每種疾病或治療條件的劑量制度。藥學(xué)所用的提供給相似的組合物的指導(dǎo)可用于決定劑量制度的指導(dǎo)，例如實(shí)施本發(fā)明的方法中注射的任何CB1大麻素受體激活劑的劑量時(shí)間表和劑量水平。
配方的單一或多個(gè)可給藥根據(jù)所需的劑量和頻率及病人的耐受性來制定。配方應(yīng)當(dāng)提供足夠數(shù)量的活性劑以有效地治療咳嗽。在一個(gè)實(shí)施例中，大麻素化合物如anandamide在溶液中的濃度，在藥學(xué)可接受的賦形劑中是約0.1-100mg/劑。作為另一個(gè)例子，口服N-4-羥苯基花生四烯酰胺的典型的藥劑配方是每天的量約為0.5-20mg/kg體重/天。在一個(gè)選擇性的實(shí)施方案中，所使用的劑量是1-4mg/kg體重/人/天。與全身給藥到血流中相比，特別是當(dāng)給藥部位是解剖學(xué)隔絕部位時(shí)，如肺間隙，可使用較低劑量。大體上較高劑量可用于局部給藥。制備胃腸外給藥配方的實(shí)際方法將被本技術(shù)領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員所知，并更詳盡地描述于某些出版物中，如Remington’s，見上。也見于Nieman，在“Receptor Mediated Antisteroid Action(受體介導(dǎo)了抗類固醇作用)”，Agarwal等人，(1987)編著，De Gruyter，紐約。
不需要進(jìn)一步的詳細(xì)闡明，相信本技術(shù)領(lǐng)域中的熟練人員可以根據(jù)以前的描述，最大可能地利用本發(fā)明。以下的實(shí)施例是用來作例證的，因此不以任何方式限制此處公開的其余方面。
實(shí)施例1化學(xué)合成anandamide和其它脂肪酸乙醇胺可通過以下標(biāo)準(zhǔn)的步驟合成(Giuffrida A，等人(1998)FEBS Lett，422，373-376)。2-花生四烯酰甘油和其它單酰甘油酯的合成可按照B.Serdarevich(1967)Journal of theOil Chemist Society，44，381-393。
藥品溶于二甲基亞砜(DMSO)，以含10％DMSO的生理鹽水給藥。
實(shí)施例2生物分析支氣管痙攣Dunkin-Hartley豚鼠(Charles-River，體重200-400克)或Wistar大鼠(Charles-River，體重200-300克)用戊巴比妥(40mg/kg，腹膜內(nèi))和芬太尼(25mg/kg，肌肉內(nèi))進(jìn)行麻醉。氣管和頸動(dòng)脈插入導(dǎo)管以測量氣管梗阻和全身血壓。頸靜脈插入導(dǎo)管用來給藥。給予溴化潘庫銨(4mg/kg，靜脈內(nèi))以預(yù)防自發(fā)的呼吸。動(dòng)物用一個(gè)嚙齒動(dòng)物呼吸器以空氣進(jìn)行通氣(U.Basile，Comerio，意大利)，60次/分鐘；一次的容積是3-7ml。用一個(gè)分壓傳感器(U.Basile)測量氣管阻力，該分壓傳導(dǎo)器通過側(cè)臂氣管導(dǎo)管連接到支氣管痙攣傳感器上。支氣管痙攣表示為最大反應(yīng)的百分率，可通過每次實(shí)驗(yàn)之前和之后夾住氣管導(dǎo)管來測定。藥品溶于含10％二甲基亞砜的鹽水中，通過頸靜脈注射。在其峰值時(shí)對(duì)應(yīng)答進(jìn)行檢測。用一個(gè)壓力傳感器連接到一個(gè)記錄儀(U.Basile)上對(duì)動(dòng)脈血壓進(jìn)行連續(xù)測量。為避免迷走神經(jīng)影響支氣管肌肉組織，在一些實(shí)驗(yàn)中切斷了雙側(cè)的迷走神經(jīng)，并注射硫酸阿托品(2mg/kg，靜脈注射)。
咳嗽將清醒的豚鼠分別放置4分鐘以氣霧劑方式給予辣椒素(0.3mM)，同時(shí)使用如Bolser等人(1995)(Eur.J.Pharmacol.，276，R1-R3)描述的放置在暴露腔室的微型麥克風(fēng)記錄咳嗽。每只動(dòng)物僅用辣椒素處理一次。氣霧劑用Air Lister Basic裝置(Hatù，意大利)制備，調(diào)節(jié)成每分鐘6升的出氣流速率。
分離肺標(biāo)本條主要按Samhoun M.N.等人(1984)Prostaglandins，27，711-724描述的方法制備豚鼠肺實(shí)質(zhì)(parenchimal)標(biāo)本條。將標(biāo)本條置于10ml含有Krebs(以nM為單位NaCl，118；KCL，4；K2HPO4，1.2；MgSO4，1.2；CaCL2，2.5；NaHCO3，25.0；葡萄糖，11.2；加入7mM硫酸阿托品和15mM消炎痛)緩沖液的器官槽中，溫度為37℃，給予氧氣/二氧化碳混合物(95/5％)通氣。用等長拉力換能器(U.Basile)記錄肌肉收縮，以每毫克新鮮組織的達(dá)因數(shù)表示。
實(shí)施例3電子顯微鏡分離3只大鼠的肺，用含4％低聚甲醛、0.2％苦味酸和0.05％的戊二醛的磷酸緩沖(PB，0.1M)的固定劑完全覆蓋，然后再固定24小時(shí)。用如Katona，I等人(1999)J.Neurosci.，19，4544-4558描述的方法進(jìn)行免疫組化分析。分別使用1∶5000和1∶20,000稀釋的兔C-末端抗-CB1和抗-NPY抗體。NPY抗體的特異性見先前Csiffary，A等人(1990)BrainRes.506，215-222的報(bào)告。
實(shí)施例4膜的制備和脂質(zhì)的提取肺微粒組分的制備見Desarnaud，F(xiàn)等人(1995)J.Biol.Chem.，270，6030-6035的描述。37℃在含CaCl2(3mM)或EGTA(1mM)和2mg/ml的膜蛋白的Tris緩沖液(50mM，pH7.4)中孵育1小時(shí)。通過加入冷的甲醇終止反應(yīng)，用氯仿提取脂質(zhì)。通過如Cadas，H等人(1997)J.Neurosci.，17，1226-1242描述的硅膠柱層析法對(duì)anandamide和NAPE分部分離，然后進(jìn)行HPLC/MS分析。
實(shí)施例5高效液相色譜法/質(zhì)譜測量法(HPLC/MS)鑒定anandamide，并通過反相HPLC與正離子電噴霧MS聯(lián)合對(duì)其定量，使用方法是由Giuffrida，A，Rodriguez de Fonseca，F(xiàn)，等人(2000)Anal.Biochem.，280，87-93描述的同位素稀釋方法。通過在C18Bondapak柱(300×3.9 mm I.D.，5mm)(Waters)上的反相HPLC純化NAPE種類，保持在20℃并用Agilent H-P 1100模型質(zhì)譜儀進(jìn)行分界。HPLC的條件由水中的線性梯度甲醇(30分鐘內(nèi)從75％至100％)，流速為1ml/min。在這樣的條件下，不同的NAPE種類從柱中洗脫，一組保留時(shí)間的峰值包括27至29分鐘。用設(shè)置在負(fù)離子模式的電噴霧離子源進(jìn)行MS分析，Vcap設(shè)置在5kV，碎片器電壓設(shè)置為200V。使用氮?dú)庾鳛楦稍餁怏w，流速為121/min。干燥氣體的溫度設(shè)置在350℃，霧化器壓力為30PSI。為了定量的目的，將鑒定離子(脫質(zhì)子化分子離子，(M-H)-)從全部掃描數(shù)據(jù)中提取出來，通過與外標(biāo)準(zhǔn)(1-十六烷基-2-油基-sn-甘油基-磷酸乙醇胺-N-花生四烯酰，Avanti Polar Lipids)比較而定量。
實(shí)施例6數(shù)據(jù)分析結(jié)果以平均值±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。使用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各組之間的差異顯著性，或者通過隨后的Dunnett’s檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析。
這里引用的所有出版物、基因庫參考、專利、專利申請(qǐng)?jiān)诖嗣鞔_地引入以供各種目的的參考。本發(fā)明描述了多個(gè)實(shí)施例。但是，可以理解的是，只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍，可以進(jìn)行多種修飾。因此，其他實(shí)施例在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者上呼吸道局部給予分子式I的大麻素化合物 其中X是N-R1或O；R是一個(gè)飽和或不飽和的、手性或非手性、有環(huán)或無環(huán)的、取代的或未取代的含11-29個(gè)碳原子的烴基；R1、R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或具有2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中烷基含1-4個(gè)碳原子，而且n選自2-4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的R含有1至6個(gè)氧或硫原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的R2是OH，X是N-H時(shí)，其其中它們通過羰基結(jié)合成雜環(huán)結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的雜環(huán)結(jié)構(gòu)選自噁唑烷酮和環(huán)嗎啉環(huán)。
5.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者上呼吸道局部給予分子式II的大麻素化合物 其中R是一個(gè)飽和或不飽和的、取代的或未取代的含15-29個(gè)碳原子的烴基；R3和R4獨(dú)立選自氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或具有2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中所述烷基含1-4個(gè)碳原子，而且n選自2-4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的R含有1至3個(gè)氧原子或硫原子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的R2是OH，X是N-H，且其中它們結(jié)合形成雜環(huán)結(jié)構(gòu)。
8.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者上呼吸道局部給予分子式III的大麻素化合物 R是一個(gè)飽和或不飽和的、取代的或未取代的含15-29個(gè)碳原子的烴基；R3和R4獨(dú)立選自的氫、烷基(C1-4)、鏈烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、環(huán)烷基(C3-6)或具有2到4個(gè)碳原子的羥烷基；R2是OH或O-CO-烷基，其中所述烷基含1-4個(gè)碳原子，而且n選自2-4。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的R含有1至3個(gè)氧原子。
10.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者上呼吸道局部或全身應(yīng)用分子式IV的內(nèi)源性大麻素失活的抑制劑 其中R是多不飽和的、取代的或未取代的含18-22個(gè)碳原子的羥基；R2獨(dú)立選自取代的或未取代的環(huán)烷基(C3-6)和取代的或未取代的苯基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的苯基選自對(duì)-羥基苯基和對(duì)-羥基-O-甲基-苯基。
12.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者上呼吸道局部或全身應(yīng)用分子式V的內(nèi)源性大麻素失活的抑制劑R1-X-R2其中的R1是飽和或多不飽和的、取代的或未取代的含6-22個(gè)碳原子的羥基；X是-C＝O或SO2-；以及R2是鹵素或鹵素取代的甲基。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的咳嗽原因可以是氣道刺激和/或感染導(dǎo)致的持續(xù)的干性咳嗽，血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑誘導(dǎo)的咳嗽和癌癥誘導(dǎo)的咳嗽。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的方法進(jìn)一步包括使用分子式I、II、III的大麻素化合物或其任意組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的方法進(jìn)一步包括使用分子式I、II、III的大麻素化合物或其任意組合。
16.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療和氣道反應(yīng)的迷走神經(jīng)控制是功能性的患者上呼吸道局部應(yīng)用分子式I、II、III的大麻素化合物或其任意組合。
17.一種選擇性激活上呼吸道CB1大麻素受體的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者局部應(yīng)用分子式I、II、III的大麻素化合物或其任意組合。
18.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的患者上呼吸道局部應(yīng)用，其中所述的大麻素化合物對(duì)由轉(zhuǎn)運(yùn)或水解引起的代謝失活是敏感的，引起臨床上不明顯的全身性副作用。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分子式I的大麻素選自花生四烯酰乙醇胺(anandamide)、(R)-(+)花生四烯酰-11-羥基-21-丙胺、順式-7，10，13，16-二十二碳四烯酰乙醇胺、同型-δ-linoleyethanolamide，和N-丙基-花生四烯酰乙醇胺。
20.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的分子式IV的大麻素失活抑制劑是4-(羥苯基)-花生四烯酰胺。
21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的分子式V的大麻素失活抑制劑是十六烷基磺酰氟化物或花生四烯酰三氟代甲基酮。
22.一種緩解咳嗽的方法，該方法包括給需要這種治療的受試者上呼吸道局部應(yīng)用含有分子式I、II、III的大麻素化合物或其任意組合的藥物組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的方法進(jìn)一步包括局部或全身應(yīng)用含有分子式IV、V的大麻素失活抑制劑或其任意組合的藥物組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的藥物組合物包括分子式I、II、III、IV、V的化合物或其任意組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的藥物組合物的配方用于局部釋放。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的用于局部釋放的配方是通過氣霧劑釋放的。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的藥物組合物的配方用于局部釋放。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的用于局部釋放的配方是通過氣霧劑釋放的。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的藥物組合物的配方用于全身釋放。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的用于全身釋放的配方是通過口服應(yīng)用或靜脈應(yīng)用。
31.一種藥物組合物，它含有局部起作用的分子式I、II、III的大麻素或其任意組合，其中所述的大麻素緩解了咳嗽，并且最多產(chǎn)生臨床上可以忽略的副作用。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物組合物，它進(jìn)一步包括藥學(xué)上可以接受的賦形劑。
33.一種藥物組合物，它含有分子式IV、V的大麻素失活抑制劑或其任意組合，其中所述的大麻素失活抑制劑緩解了咳嗽，并且最多產(chǎn)生臨床上可以忽略的副作用。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物，它進(jìn)一步包括藥學(xué)上可以接受的賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了氣道中存在大麻素的受體，該類受體有抑制咳嗽的功能。給受試者氣道給予局部起作用的大麻素可緩解咳嗽，而不引起全身給予大麻素時(shí)特有的影響精神的作用。另外，局部或全身給予大麻素失活抑制劑也可用于緩解咳嗽。本發(fā)明也詳細(xì)說明了給予大麻素制劑后能產(chǎn)生無支氣管狹窄的鎮(zhèn)咳作用的條件。
文檔編號(hào)A61P11/14GK1438900SQ01811452
公開日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2001年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月23日
發(fā)明者D·皮奧梅利 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)