專利名稱：含有烷基和芳基丙氨酸p2部分的丙型肝炎病毒的大環(huán)ns3－絲氨酸蛋白酶抑制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的丙型肝炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制劑，包含一種或多種這樣的抑制劑的藥用組合物、制備這樣的抑制劑的方法和使用這樣的抑制劑治療丙型肝炎和相關疾病的方法。本發(fā)明尤其公開了作為HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶抑制劑的新的大環(huán)化合物。本文公開的內容與2000年4月5日提交的待審專利申請順序號＿＿的內容有關。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)為一種(+)-有義單鏈RNA病毒，它作為主要病原體涉及非甲非乙型肝炎(NANBH)，尤其是與血液相關的NANBH(BB-NANBH)(參見國際專利申請公布號WO 89/04669和歐洲專利申請公布號EP 381 216)。NANBH區(qū)別于其它類型的病毒誘發(fā)的肝病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、巨細胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)，也區(qū)別于其它形式的肝病，例如酒精中毒和原發(fā)性膽汁性肝硬變。
最近，多肽加工和病毒復制所必需的HCV蛋白酶已被鑒定，克隆和表達(參見例如美國專利號5,712,145)。這種約3000個氨基酸的多蛋白含有自氨基末端至羧基末端的核殼蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及幾種非結構蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)。NS3為約68kda的蛋白，由HCV基因組的約1893個核苷酸編碼，并且具有2個不同的結構域(a)由約200個N-末端氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶結構域；和(b)在蛋白C-末端的RNA依賴性ATP酶結構域。由于蛋白質序列、整體三維結構和催化機制的相似性，NS3蛋白酶被認為是胰凝乳蛋白酶家族的一個成員。其它類似胰凝乳蛋白酶的酶為彈性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、血纖蛋白溶酶、尿激酶、tPA和PSA。HCVNS3絲氨酸蛋白酶擔負在NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接點的多肽(多蛋白)的蛋白酶解，因此在病毒復制期間負責生成四種病毒蛋白。HCV NS3絲氨酸蛋白酶已被作為抗病毒化學治療學的具有吸引力的靶標。
已經(jīng)測定NS4a蛋白(約6kda的多肽)為NS3的絲氨酸蛋白酶活性的輔因子。經(jīng)NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶進行的NS3/NS4a接點的自動切割在分子內(即順式)發(fā)生，同時其它的切割位點在分子間(即反式)進行。
HCV蛋白酶的天然切割位點的分析揭示在P1存在半胱氨酸，在P1’存在絲氨酸，并且這些殘基在NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接點中嚴格保守。NS3/NS4a接點在P1包含蘇氨酸，在P1’包含絲氨酸。假設NS3/NS4a上的Cys→Thr取代以解釋該接點需要順式而不是反式加工。參見例如Pizzi等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91888-892，F(xiàn)ailla等(1996)Folding & Design 135-42。NS3/NS4a切割位點也比其它的位點更耐受誘變。參見例如Kollykhalov等(1994)J.Virol.687525-7533。也已發(fā)現(xiàn)切割位點的上游區(qū)域的酸性殘基需要有效的切割。參見例如Komoda等(1994)J.Virol.687351-7357。
已報道的HCV蛋白酶抑制劑包括抗氧化劑(參見國際專利申請公布號WO 98/14181)、某些肽類和肽類似物(參見國際專利申請公布號WO 98/17679，Landro等(1997)Biochem.369340-9348，Ingallinella等(1998)Biochem.378906-8914，Llinàs-Brunet等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.81713-1718)、基于70-氨基酸多肽水蛭蛋白酶抑制劑c的抑制劑(Martin等(1998)Biochem.3711459-11468，選自人胰分泌型胰蛋白酶抑制劑(hPSTI-C3)和小體所有組成成分(minibody repertoires)(MBip)的抑制劑親和性(Dimasi等(1997)J.Virol，717461-7469)，cVHE2(“camelized”變體結構域抗體片段)(Martin等(1997)Protein Eng.10607-614)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(Elzouki等)(1997)J.Hepat.2742-28)。設計用來選擇性破壞丙型肝炎病毒RNA的核酶最近已被公開(參見Bio World Today 9(217)4(1998年11月10日))。
也參考1998年4月30日公開的PCT公布號WO 98/17679(VertexPharmaceuyticals Incorporated)、1998年5月28日公開的WO 98/22496(F.Hoffmann-La Roche AG)和1999年2月18日公開的WO 99/07734(Boehringer Ingelheim Canada Ltd)。
HCV已參與肝硬變且參與誘導肝細胞癌。目前患有HCV感染的患者預后是很差的。由于缺乏與HCV感染有關的免疫或者緩解，HCV感染比起其它形式的肝炎更難以治療。目前數(shù)據(jù)表明硬變診斷后四年的生存率小于50％。據(jù)診斷患有定位可切除肝細胞癌的患者具有10-30％的五年生存率，而那些患有定位不可切除肝細胞癌的患者具有小于1％的五年生存率。
參考A.Marchetti等Synlett，S1，1000-1002(1999)，其描述HCVNS3蛋白酶抑制劑的二環(huán)類似物的合成。其中所公開的化合物具有以下結構
也參考WO 00/09558(受讓人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公開)，它公開了下式的肽衍生物 其中各元素在此定義。該系列的示例性化合物為 也參考WO 00/09543(受讓人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公開)，它公開了下式的肽衍生物 其中各元素在此定義。該系列的示例性化合物為 丙型肝炎的目前療法包括干擾素-α(INFα)以及用利巴韋林和干擾素進行的聯(lián)合療法。參見例如，Beremguer等(1998)proc.Assoc.Am.Physicians110(2)98-112。這些療法的持續(xù)應答率低且多發(fā)生副作用。參見例如，Hoofnagle等(1997)N.Engl.J.Med.336347。目前，沒有疫苗可用于HCV感染。
2000年4月5日提交的待審專利申請，順序號＿＿，公開了某些作為HCV蛋白酶的抑制劑的大環(huán)化合物以及含有所述化合物的藥用組合物。
丙型肝炎病毒感染需要新的治療和療法。因此，本發(fā)明一個目的是提供用于治療或者預防或者改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的化合物。
在此另一個目的是提供治療或者預防或者改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法。
本發(fā)明另一個目的是提供使用在此提供的化合物來調節(jié)絲氨酸蛋白酶，特別是HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶活性的方法。
在此另一個目的是提供使用在此提供的化合物來調節(jié)HCV多肽的加工的方法。
發(fā)明概述在本發(fā)明的許多實施方案中，提供一類新的大環(huán)HCV蛋白酶抑制劑，包含一種或多種所述化合物的藥用組合物、制備包含一種或多種這樣的化合物的藥用制劑的方法、以及治療、預防或者改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法。也提供調節(jié)HCV多肽與HCV蛋白酶相互作用的方法。在此提供的化合物中，優(yōu)選抑制HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶活性的化合物。本發(fā)明公開的化合物一般含有大約四個或更多個氨基酸殘基以及少于大約十二個氨基酸殘基。
在本發(fā)明的主要實施方案中，本發(fā)明提供式I的大環(huán)化合物 式I其中E、X和Y可以獨立存在或不存在，如果存在則獨立選自以下部分烷基、芳基、烷基-芳基、雜烷基、雜芳基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、芳基醚、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、芳基砜、烷基-烷基亞砜、烷基-芳基亞砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基-芳基磺酰胺、芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、氨基甲酸芳基酯、烷基酰肼、烷基-芳基酰肼、烷基羥酰胺、烷基-芳基羥酰胺、烷基磺酰基、芳基磺酰基、雜烷基磺?；㈦s芳基磺?；?、烷基羰基、芳基羰基、雜烷基羰基、雜芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基或它們的組合，條件是E、X和Y又可以任選由下述部分取代芳族、烷基、烷基-芳基、雜烷基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基胺、烷基-芳基胺、烷基-芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、鹵素、羥基氨基、肼基甲酸烷基酯、肼基甲酸芳基酯；R1＝COR5或B(OR)2，其中R5＝H、OH、OR8、NR9N10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6、COR7，其中R7＝H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10獨立選自H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’獨立選自H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基和雜芳烷基；Z選自O、N或CH；W可以存在或不存在，并且如果W存在，則W選自C＝O、C＝S、SO2或C＝NR；Q是(NR)P、O、S、CH2、CHR、CRR’或朝向V的雙鍵；A是O、CH2、(CHR)P、(CHR-CHR’)P、(CRR’)P、NR、S、SO2、C＝O或鍵；G是(CH2)P、(CHR)P、(CRR’)P、NR、O、S、SO2、S(O)2NH、C＝O或朝向E或V的雙鍵；V是CH、CR或N；p是數(shù)字0-6；和R、R’、R2、R3和R4獨立選自H；C1-C10烷基；C2-C10鏈烯基；C3-C8環(huán)烷基；C3-C8雜環(huán)烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；雜芳基；烷基-芳基；烷基雜芳基；(環(huán)烷基)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基，其中所述環(huán)烷基由3-8個碳原子、0-6個氧原子、氮原子、硫原子或磷原子組成，所述烷基由1-6個碳原子組成；所述烷基、雜烷基、鏈烯基、雜鏈烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基部分可以任選被取代，所述術語“被取代”指由一個或多個選自下述的部分任選和合適取代烷基、鏈烯基、炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、鹵素、羥基、硫代、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、磺酰胺、亞砜、砜、磺酰脲、酰肼和異羥肟酸酯和硫脲。
除了另有定義外，本文所使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員通常所理解的相同的意義。因此，例如術語烷基(包括烷氧基的烷基部分)指通過從具有1-8個、優(yōu)選1-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴中除去一個原子而衍生的一價基團；芳基—代表具有6-14個碳原子并且具有至少一個苯型環(huán)的碳環(huán)基團，所述碳環(huán)基團的所有可取代的芳族碳原子都作為可能的附著點。優(yōu)選的芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚滿基，特別是苯基和取代的苯基；芳烷基—代表含有通過低級烷基連接的芳基的部分；烷基芳基—代表含有通過芳基連接的低級烷基的部分；環(huán)烷基—代表具有3-8個、優(yōu)選5或6個碳原子、任選取代的飽和碳環(huán)；雜環(huán)—除了以下定義的雜芳基外，代表具有至少一個中斷碳環(huán)結構的O、S和/或N原子的飽和與不飽和環(huán)狀有機基團，所述碳環(huán)結構由一個或多個環(huán)組成，其中每一個環(huán)是5、6或7元環(huán)并且可具有或不具有缺乏離域π電子的雙鍵，所述環(huán)結構具有2-8個、優(yōu)選3-6個碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-嗎啉基、或2-或3-硫代嗎啉基；鹵素—代表氟、氯、溴和碘；雜芳基—代表環(huán)狀有機基團，其具有至少一個中斷碳環(huán)結構的O、S和/或N原子并且具有足夠數(shù)目的離域π電子以提供芳香性，所述芳族雜環(huán)基團具有2-14、優(yōu)選4或5個碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基、或3-或4-噠嗪基等。優(yōu)選的雜芳基是2-、3-和4-吡啶基；這些雜芳基也可以被任選取代。
本發(fā)明也包括式I化合物的互變異構體、旋轉異構體、對映異構體和其它光學異構體以及其藥學上可接受的鹽和溶劑合物。
本發(fā)明的另一特點是含有作為活性成分的式I化合物(或它的鹽、溶劑合物或異構體)與藥學上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物。
本發(fā)明也提供制備式I化合物的方法以及治療疾病如HCV和相關疾病的方法。所述治療方法包括給予患有所述一種或多種疾病的患者治療有效量的式I化合物或含有式I化合物的藥用組合物。
也公開了式I化合物在制備用于治療HCV和相關疾病的藥物中的用途。
優(yōu)選實施方案詳述在一個實施方案中，本發(fā)明公開了作為HCV蛋白酶、特別是HCVNS3/NS4a絲氨酸蛋白酶抑制劑的式I化合物 其中各部分如上所定義。一些優(yōu)選的實施方案包括、但不限于上述通式I中各官能度的下述定義；對于相同和附加官能度的其它所需定義可以在結構和本申請的權利要求中發(fā)現(xiàn)，其也在本發(fā)明的預期之中。在優(yōu)選的實施方案中，式I中的R2可以選自以下部分 E可以是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜芳基或取代或未取代的環(huán)烷基，E的優(yōu)選代表是 R3的優(yōu)選實施方案包括以下部分 其中R30＝H、CH3或其它烷基；R31＝OH、O-烷基、NH2、N-烷基；和R32和R33可以相同或不同，并且獨立選自H、F、Cl、Br和CH3。X-Y部分的優(yōu)選實施方案是以下結構 在本申請的權利要求部分注釋了式I所示化合物的上述各種定義的幾種附加和進一步的改進。它們也由在說明書和權利要求中列出的多種化合物代表。認為這些改進、定義和限定代表了本申請的全部發(fā)明。
下面列出了顯示出良好HCV蛋白酶抑制活性的本發(fā)明的代表化合物
表1中列出了一些化合物的活性(以納摩爾(nM)表示Ki值的范圍)。表1中的實施例號指在本申請后面部分的實施例部分中的各結構式的編號。
表1HCV蛋白酶連續(xù)測試結果
HCV連續(xù)測試Ki*范圍類別A＝0.001-1.0μM，類別B＝1.1-100μM在本部分的較后部分敘述了一些合成本發(fā)明的各類化合物的方法，并且也用示意圖描述，之后描述說明性的例子。
根據(jù)結構，本發(fā)明的化合物可以與有機或無機酸、或有機或無機堿形成藥學上可接受的鹽。用于形成這些鹽的合適的酸的實例有鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、草酸、丙二酸、水楊酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、抗壞血酸、馬來酸、甲磺酸和其它本領域技術人員已知的無機酸和羧酸。對于與堿的鹽的形成來說，合適的堿有例如NaOH、KOH、NH4OH、氫氧化四烷基銨等。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供含上述發(fā)明的大環(huán)化合物作為活性成分的藥用組合物。通常所述藥用組合物還含有藥學上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體(本文中將它們共同稱為載體材料)。由于它們的HCV抑制活性，這些藥用組合物在治療丙型肝炎和相關疾病時有效。
在還一個實施方案中，本發(fā)明公開了制備合本發(fā)明大環(huán)化合物作為活性成分的藥用組合物的方法。在本發(fā)明的藥用組合物和方法中，活性成分一般與適合的根據(jù)計劃的給藥形式而選擇的載體材料混合給予，包括例如口服片劑、膠囊劑(固體填充、半固體填充或液體填充)、用于構成的散劑、口服凝膠劑、酏劑、可分散顆粒劑、糖漿劑、混懸劑等，并符合常規(guī)制藥實踐。例如，對于片劑或膠囊形式的口服制劑來說，所述活性藥物成分可以與任何口服無毒性藥學上可接受的惰性載體如乳糖、淀粉、蔗糖、纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、滑石、甘露醇、乙醇(液體形式)等結合。而且，當要求或需要時，在所述混合物中也可以摻入合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。散劑和片劑可以包含大約5-95％的本發(fā)明組合物。合適的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖類、玉米增甜劑、天然和合成樹膠如阿拉伯膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇和蠟。在潤滑劑中可被提及用于這些劑型的有硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、瓜耳膠等。
當合適時也可以包括甜味劑、矯味劑和防腐劑。以下將更詳細地敘述在以上所提及的一些術語，即崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、粘合劑等。
另外，可以以持續(xù)釋放形式制備本發(fā)明的組合物，以便提供任何一種或多種組分或活性成分的速率控制釋放，從而得到最佳治療效果，即HCV抑制活性等。用于持續(xù)釋放的合適的劑型包括多層片或膠囊，所述多層片含有不同崩解速率的層或控釋聚合物基質(浸漬有活性組分并以片劑形式成型)，所述膠囊含有這種浸透或包囊的多孔聚合物基質。
液體形式制劑包括溶液、懸浮液和乳劑?？杀惶峒暗睦佑杏糜谀c胃外注射的水或水-丙二醇溶液或向口服溶液、懸浮液和乳劑中添加增甜劑和遮光劑(pacifiers)。液體形式的制劑也可以包括用于鼻內給藥的溶液。
適合用于吸入的氣霧劑制劑可以包括溶液和粉末形式的固體，它們可以與藥學上可接受的載體如惰性壓縮氣體如氮氣混合。
為了制備栓劑，首先熔融低熔點的蠟例如脂肪酸甘油酯如可可脂的混合物，通過攪拌或類似的混合使活性成分均勻地分散到其中。然后將熔融均一的混合物倒入大小合適的模具中，冷卻并從而固化。
也可包括臨用前轉變?yōu)橛糜诳诜蚰c胃外給藥的液體形式制劑的固體形式的制劑。這樣的液體形式包括溶液、懸浮液和乳液。
本發(fā)明的化合物也可以經(jīng)皮傳遞。經(jīng)皮化合物可以制備成乳膏、洗劑、氣溶膠和/或乳劑并可以包括在經(jīng)皮貼劑的基質中或者包含在如對該目的的領域是便利的貯庫型中。
優(yōu)選所述化合物通過口服給藥。
藥物制劑優(yōu)選以單位劑量形式存在。在這樣的形式中，制劑可分為包含適量活性成分的合適大小的單位劑量，例如達到所需目的的有效量。
按照具體的應用，本發(fā)明活性組合物在制劑的單位劑量中的量通常可以在約1.0毫克-1,000毫克，優(yōu)選約1.0-950毫克，更優(yōu)選約1.0-500毫克之間變化或者調整，一般為約1-250毫克。所使用的實際劑量可依患者的年齡、性別、體重和待治療疾病的嚴重性而變化。這樣的技術是本領域技術人員熟知的。
通常，包含活性成分的人口服劑型可每天給藥1或2次。給藥量和次數(shù)應根據(jù)主治醫(yī)師的判斷調節(jié)。口服給藥的一般推薦每天劑量方案可以以單次或分開的劑量，在每天約1.0毫克-1,000毫克的范圍內變化。
以下描述一些有用的術語膠囊劑—指由甲基纖維素、聚乙烯醇或變性明膠或淀粉制成以貯藏或容納包含活性成分的組合物的特殊容器或者包封物。硬殼膠囊一般由相對高的明膠強度骨架和豬皮膚明膠的摻合物制成。膠囊本身可包含小量的染料、不透明劑、增塑劑和防腐劑。
片劑—指包含與合適的稀釋劑一起的活性成分的壓制或模壓固體劑型。通過壓制混合物或經(jīng)濕法制粒、干法制粒或者緊壓法得到的顆粒，可制備片劑。
口服凝膠劑—指分散或溶于親水性半固體基質中的活性成分。
用于構成的粉末指包含活性成分和能夠懸浮在水或汁劑中的適宜稀釋劑的粉末摻合物。
稀釋劑—指通常構成組合物或者劑型的主要部分的物質。合適的稀釋劑包括糖類，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；衍生于小麥、玉米、大米和馬鈴薯的淀粉；以及纖維素例如微晶纖維素。組合物中稀釋劑的量可在總組合物的約10-90％重量，優(yōu)選約25-75％重量，更優(yōu)選約30-60％重量，甚至更優(yōu)選在約12-60％重量的范圍內。
崩解劑—指加入到組合物中以幫助其分裂(崩解)并釋放出藥物的物質。合適的崩解劑包括淀粉；“冷水可溶的”變性淀粉例如羧甲基淀粉鈉；天然和合成膠類如槐樹豆膠(locust bean)、梧桐膠、瓜爾膠、西黃蓍膠和瓊脂；纖維素衍生物如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；微晶纖維素和交聯(lián)微晶纖維素如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；藻酸鹽如藻酸和藻酸鈉；粘土如膨潤土；以及泡騰混合物。組合物中崩解劑的量可在組合物的約2-15％重量，更優(yōu)選約4-10％重量的范圍內。
粘合劑—指使粉末粘合或者“膠著”在一起并通過使它們形成顆粒粘聚，因此在制劑中用作“粘合劑”的物質。粘合劑可增加已在稀釋劑或者增量劑中可以得到的粘聚的強度。合適的粘合劑包括糖類如蔗糖；衍生于小麥、玉米、大米和馬鈴薯的淀粉；天然膠類如阿拉伯膠、明膠和西黃蓍膠；海藻衍生物如藻酸、藻酸鈉和藻酸鈣銨；纖維素材料如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉和羥丙基甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；以及無機物例如硅酸鋁鎂。組合物中粘合劑的量可在組合物的約2-20％重量，更優(yōu)選約3-10％重量，甚至更優(yōu)選約3-6％重量的范圍內。
潤滑劑—指加入到劑型中以便在其被壓制后通過減少摩擦或磨損確保片劑、顆粒劑等自模具或者沖模中脫出的物質。合適的潤滑劑包括金屬硬脂酸鹽如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鉀；硬脂酸；高熔點蠟；以及水溶性潤滑劑如氯化鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、油酸鈉、聚乙二醇和d’l-亮氨酸。壓制前通常在很后的步驟中加入潤滑劑，因為它們必須存在于顆粒的表面并介于它們與壓片機的各部分之間。組合物中潤滑劑的量可在組合物的約0.2-5％重量，優(yōu)選約0.5-2％，更優(yōu)選在約0.3-1.5％重量的范圍內。
助流劑—防止結塊并改善顆粒的流動性質以使流動平滑和均勻的物質。合適的助流劑包括二氧化硅和滑石粉。組合物中助流劑的量可在總組合物的約0.1％-5％重量，優(yōu)選約0.5-2％重量的范圍內。
著色劑—向組合物或者劑型提供著色的賦形劑。這樣的賦形劑可包括食品級染料和吸附到合適的吸附劑例如粘土或氧化鋁上的食品級染料。著色劑的量可在組合物的約0.1-5％重量，優(yōu)選約0.1-1％重量之間變化。
生物利用度—指與標準物或者對照物比較，活性藥物成分或者治療部分自給藥劑型吸收進入到全身循環(huán)中的速率和程度。
制備片劑的常規(guī)方法是已知的。這樣的方法包括干法例如直接壓制和經(jīng)過緊壓法產(chǎn)生的顆粒的壓制，或者濕法或其它的特殊方法。制備其它給藥形式例如膠囊劑、栓劑等的常規(guī)方法也是人們熟知的。
本發(fā)明的另一個實施方案公開以上公開的藥用組合物用于治療疾病例如丙型肝炎等的用途。方法包括給予患有這樣一種或多種疾病和需要這樣治療的患者治療有效量的本發(fā)明藥用組合物。
如早先說明的那樣，本發(fā)明也包括所述化合物的互變異構體、對映體和其它的立體異構體。因此，如本領域技術人員已知的那樣，一些本發(fā)明化合物可以異構體形式存在。這樣的變體包括在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明另一個實施方案公開制備在此公開的大環(huán)化合物的方法。通過本領域已知的幾種技術可制備所述化合物。在以下反應方案中概述代表性的示例方法。應當理解雖然以下示例的方案敘述主要衍生自在P2位上的間-酪氨酸或賴氨酸的大環(huán)化合物的制備，但任何天然和非天然氨基酸的合適的取代將導致形成所需的基于這些取代的大環(huán)化合物。
以下是在敘述方案、制備和實施例中所使用的縮寫THF四氫呋喃DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOAc 酸乙酯AcOH 乙酸HOOBt 3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮EDCl 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽NMMN-甲基嗎啉ADDP 1，1’-(偶氮二羰基)二哌啶DEAD 偶氮二羧酸二乙基酯MeOH 甲醇EtOH 醇Et2O 乙醚Bn 芐基Boc叔丁氧羰基Cbz芐氧羰基Cp 環(huán)戊基二烯基Ts 對甲苯磺?；鵐e 甲基HATU 六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓(uronium)Chg環(huán)己基甘氨酸
Tyr酪氨酸G 甘油TG 硫甘油alloc 烯丙氧羰基FMOC 9-芴基甲氧羰基DdeN-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己-1-基)乙基tBu叔丁基equiv 當量rel.int相對強度aq 含水的rt 室溫satd 飽和的Hex己烷NBA硝基苯甲酸PyBrOP 六氟磷酸三(吡咯烷基)溴代鏻DMSO 二甲亞砜TFA三氟乙酸HOBt 羥基苯并三唑Hünigs base 二異丙基乙胺BOP六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻LDA二異丙基氨基化鋰Ph3P 三苯膦LAH氫化鋁鋰DMAP 4-二甲基氨基吡啶DCC二環(huán)己基碳二亞胺MCPBA 間氯過苯甲酸BINAP 2，2’-雙(二苯基膦基)-1，1’-聯(lián)萘酚MeCN 乙腈
Pr 丙基Ac 乙?；鵓h 苯基合成本發(fā)明化合物的一般方案在以下方案中n是數(shù)字1-6。
方案1 由使用NMM、HOBt和EDCl將1a與二肽1b偶合得到中間體1c開始合成1e型化合物，其中R1、R2、R3、R’如上所定義，R4是酰胺、氨基甲酸酯或氫，R是烷基、芳基或芳基烷基。經(jīng)Cs2CO3在DMF中處理該中間體1c，隨后光解得到化合物1d。將大環(huán)酯1d水解并與合適的胺中間體偶合生成1e型化合物。
方案2 在方案2中概括式2e化合物的制備，其中R1、R2、R3和n如上所定義，R’是烷基、雜烷基(OR”、SR、NR”R，其中R”和R是烷基)、在氧原子的鄰、間或對位的鹵素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，n是0-5。在HOOBt、EDCl·HCl和NMM存在下，將間-酪氨酸-二肽2a偶合成鏈烯基羧酸。將得到的產(chǎn)物硼氫化得到化合物2c。在Mitsunobu條件下通過使用三苯膦和ADDP完成大環(huán)化(Mitsunobu反應由D.L.Hughes在Org.Reactions，42(1992)335，JohnWiley & Sons，New York，L.Paquette，ed.中闡述)。用氫氧化鋰將所述酯水解為酸后，將其偶合成胺中間體而得到2e。
方案3 在方案3中概括式3e化合物的制備，其中R’、R1、R2、R3、R和n如在方案1中所定義并且PG是Cbz、Boc或alloc。用DCC將化合物3a與取代的組氨酸衍生物偶合。將化合物3b脫保護并再用ω-溴代酸處理得到3c型化合物。在沸騰的甲基乙烯基酮中用NaI和Na2CO3完成3c的環(huán)化得到3d。通過酯的水解以及隨后與合適的胺中間體偶合將化合物3d轉變?yōu)?e型化合物。
方案4 從4a型化合物開始制備4f型化合物，其中R’、R1、R2、R3、R、n和PG如在方案1中所定義。通過用光氣處理將4a的醇轉變?yōu)?b。通過與alloc保護的1b和Et3N偶合，將4b轉變?yōu)?c。用Pd(PPh3)4將4c的alloc基團脫保護得到4d，將其在Mitsunobu條件下進行環(huán)化得到4e。水解4e的酯并再用EDCl、HOOBt與胺偶合得到4f型化合物。
方案5 由已知的化合物5a開始制備5h型化合物，其中R1、R2、R3、R’、PG和n如在方案1-3中所定義并且PG1是Cbz或Boc，PG2是alloc。通過與ROH和TsOH一起回流，將酸5a轉變?yōu)轷?。通過用alloc-氯化物和三乙胺處理，使5b的酚氧轉變?yōu)閍lloc基團而得到5c。通過使用DCC和HOBt與保護的環(huán)己基甘氨酸偶合，將5c的仲醇轉變?yōu)?d型化合物。使用Pd(Ph3P)4和雙甲酮，使5d化合物的alloc基團脫保護。將5e脫保護并用EDCl、HOOBt和合適的活化釕絡合物處理，得到式5f的化合物。通過使用Cs2CO3并接著光解除去釕，將5f型化合物轉變?yōu)槭?g的環(huán)狀化合物。水解5g的酯基并與胺中間體偶合得到5h型化合物。
方案6 在方案6中概括式6f化合物的制備，其中R1、R2、R3如上所定義，R’是烷基、雜烷基(OR”、SR、NR”R，其中R”和R是烷基)、在鄰、間或對位的鹵素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，PG是Cbz或Boc，n是0-5。在常規(guī)酯化條件(ROH、HCl)下，將間碘代苯基甘氨酸6a轉變?yōu)樗孽?。然后在HOOBt、EDCl·HCl和NMM存在下將所述產(chǎn)物偶合成N-保護的氨基酸。脫保護后，再將得到的胺偶合成末端鏈烯基羧酸而得到產(chǎn)物6d。使用鈀催化劑的分子內Heck反應提供了所需的大環(huán)化合物6e(R.F.Heck，Org.React.，27(1989)345-390詳細說明了Heck反應)。用氫氧化鋰將所述酯水解為酸后，將其偶合成胺中間體而得到6f。
方案7 在方案7中概括式7b化合物的制備，其中R1、R2、R3如上所定義，R’是烷基、雜烷基(OR”、SR、NR”R，其中R”和R是烷基)、在鄰、間或對位的鹵素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，n是0-5。氫化6e的雙鍵得到大環(huán)7a。將該酯水解為酸并接著與胺中間體偶合得到7b。
方案8 在方案8中概括式8f化合物的制備，其中R1、R2、R3如上所定義，R’是烷基、雜烷基(OR”、SR、NR”R，其中R”和R是烷基)、在氧原子的鄰、間或對位的鹵素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，PG是Boc，n是0-5。在Mitsunobu條件(三苯膦和ADDP)下，將間-酪氨酸-二肽8a偶合成末端N-保護的氨基醇8b。除去保護基團得到二胺鹽酸鹽8d。通過使用光氣或羰基二咪唑形成脲鍵完成大環(huán)化。然后用氫氧化鋰將得到的酯水解成酸并接著偶合成胺中間體，得到所需的產(chǎn)物8f。
方案9 通過在二噁烷中用HCl將9a脫保護并用EDCl、HOOBt與ω-羥基酸偶合開始合成9d型化合物，其中取代基R1、R2、R3、R’、R和PG如在方案1中所定義，得到9b型化合物。用Ph3p、ADDP將9b型化合物進一步環(huán)化生成9c型化合物。將環(huán)狀化合物9c脫保護并與合適的胺中間體偶合生成9d型化合物。
方案10 合成10i型化合物，其中R2’、R1’、R1、R3如在方案1中所定義，PG1和PG2定義為保護基團，即Fmoc和Dde。P定義為固定所述化合物的聚合物載體，n是數(shù)字1-6。用于10i型分子合成的工藝是使用Fmoc保護基團的標準固相肽合成法。首先通過哌啶處理將Fmoc保護的Sasarin樹脂10a脫保護，隨后用HATU與Fmoc保護的氨基酸偶合，得到10b型化合物。除去10b的保護基團并用HATU與氨基酸偶合得到10c。經(jīng)哌啶處理將附載于聚合物的10c脫保護并與羥基酸偶合得到10d型的羥基酰胺。使10d的保護基團開裂并用HATU與保護的賴氨酸衍生物偶合，得到10e型化合物。再一次將10e的保護基脫保護并與Fmoc保護的氨基酸偶合，得到10f型化合物。除去保護基團PG1和PG2并用二酸和HATU環(huán)化得到大環(huán)10g。用Dess-Martin試劑將10g化合物氧化，最后用TFA從樹脂中開裂得到10i化合物。
方案11 從保護的酸11a開始合成11e型化合物，其中R1、R2、R3、R4和n如在方案1中所定義，PG2是Cbz，PG1是Bn，PG是Boc。通過用EDCl、HOOBt工藝與賴氨酸衍生物偶合將11a轉變?yōu)?1b型化合物。用LiOH.H2O水解11b的酯基團，隨后與合適的胺中間體偶合得到11c化合物。再在二噁烷中用HCl處理并用EDCl、HOOBt與賴氨酸中間體偶合，形成11d型化合物。將11d化合物脫保護并用EDCl、HOOBt環(huán)化形成11e型化合物。
中間體的制備中間體A步驟1 在0℃-5℃下，用2小時向攪拌的1-硝基丁烷(16.5g，0.16mol)和二羥乙酸在H2O(28.1g，0.305mol)和MeOH(122mL)中的溶液中滴加入三乙胺(93mL，0.667mol)。將該溶液加溫至室溫，攪拌過夜并濃縮至干燥得到油狀物。然后將該油狀物溶于H2O中并用10％HCl酸化至pH＝1，隨后用EtOAc萃取。用鹽水洗滌合并的有機溶液，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干燥，得到產(chǎn)物ii(28.1g，產(chǎn)率99％)。
步驟2 向攪拌的原料ii(240g，1.35mol)的乙酸(1.25L)溶液中加入10％Pd/C(37g)。將得到的溶液在59psi下氫化3小時，然后在60psi下氫化過夜。然后將乙酸蒸發(fā)并與甲苯共沸3次，之后用MeOH和乙醚研磨。將該溶液過濾并與甲苯共沸兩次，得到為灰白色固體的iii(131g，0.891mol，66％)。
步驟3 在0℃下，向攪拌的氨基酸iii(2.0g，013.6mmol)在二噁烷(10mL)和H2O(5mL)中的溶液中加入1N NaOH溶液(4.3mL，14.0mmol)。將得到的溶液攪拌10分鐘，隨后加入二碳酸二叔丁酯(0.110g，14.0mmol)并在0℃下攪拌15分鐘。然后將該溶液加溫至室溫，攪拌45分鐘并保存在冰箱中過夜，濃縮至干燥得到粗制物。向該粗制物在EtOAc(100mL)和冰中的溶液中加入KHSO4(3.36g)和H2O(32mL)并攪拌4-6分鐘。然后分離有機層并將含水層用EtOAc萃取兩次，用水、鹽水洗滌合并的有機層，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干燥，得到為澄清的樹膠狀物的產(chǎn)物iv(3.0g，產(chǎn)率89％)。
步驟4 在-20℃下，向攪拌的iv(3.00g，12.0mmol)在DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)中的溶液中加入HOOBt(1.97g，12.0mmol)、N-甲基嗎啉(4.0mL，36.0mmol)和EDCl(2.79g，14.5mmol)并攪拌10分鐘，隨后加入HCl·H2N-Gly-OBn(2.56g，13.0mmol)。將得到的溶液在-20℃下攪拌2小時然后保存在冰箱中過夜并濃縮至干燥，隨后用EtOAc(150mL)稀釋。然后將所述EtOAc溶液用飽和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、鹽水洗滌兩次，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干燥，得到產(chǎn)物v(4.5g，94％)。LRMS m/z MH+＝395.1。
步驟5 將原料v(7.00g，17.8mmol)的無水乙醇(300mL)溶液在室溫、氫氣氛、Pd-C(300mg，10％)的存在下攪拌。該反應過程經(jīng)tlc監(jiān)測。2小時后，將該混合物通過硅藻土墊過濾并將得到的溶液在真空中濃縮，得到產(chǎn)物vi(5.40g，定量)。LRMS m/z MH+＝305.1。
步驟6 在-20℃下，向二甲基胺鹽酸鹽(1.61g，19.7mmol)、N-Boc-苯基甘氨酸(4.50g，17.9mmol)、HOOBt(3.07g，18.8mmol)和EDCl(4.12g，21.5mmol)在無水DMF(200mL)和CH2Cl2(150mL)中的溶液中加入NMM(5.90mL，53.7mmol)。在此溫度下攪拌30分鐘后，將該反應混合物保存在冰箱中過夜(18小時)。然后將其加溫至室溫并加入EtOAc(450mL)、鹽水(100mL)和5％H3PO4(100mL)。分離各層后將該有機溶液用5％H3PO4(100mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×150mL)、水(150mL)和鹽水(150mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并在真空中濃縮得到粗制產(chǎn)物viii(4.86g)，為白色固體，其沒有進一步純化而使用。
步驟7 將N-Boc-苯基甘氨酸二甲基酰胺viii(4.70g，粗產(chǎn)物)溶于4NHCl(60mL，240mmol)中并將得到的溶液在室溫下攪拌。該反應過程經(jīng)TLC監(jiān)測。4小時后，將該溶液在真空中濃縮，得到為白色固體的ix，其沒有進一步純化而用在以下反應中。LRMS m/z MH+＝179.0。
步驟8 根據(jù)在步驟4中所述的偶合步驟制備所需的化合物x。LRMS m/zMH+＝465.1。
步驟9 根據(jù)在步驟7中所述的步驟，從三肽x制備所需的中間體A。LRMS m/z MH+＝365.1。
中間體B步驟1 使用可買到的xi作為偶合配偶體通過中間體A、步驟8所述的步驟得到所需產(chǎn)物xii。將該粗制物充分純化以便進一步研究。用97/3二氯甲烷/MeOH經(jīng)快速層析將部分產(chǎn)品純化。HRMS(FAB)對于C25H40N3O7的計算值494.2866(M+H)+。實測值494.2863。
步驟2 通過中間體A步驟7所述的步驟得到所需產(chǎn)物B。該粗制物沒有進一步純化而使用。
中間體C步驟1 根據(jù)在中間體A步驟6中所述的偶合步驟制備所需化合物xiii。
步驟2 根據(jù)在中間體A步驟7中所述的步驟制備所需化合物xiv。
步驟3 根據(jù)在中間體A步驟6中所述的偶合步驟制備所需化合物xv。LRMS m/z MH+＝451.1。
步驟4 根據(jù)在中間體A步驟7中所述的步驟制備所需中間體C。LRMSm/z MH+＝351.1。其沒有進一步純化而使用。
中間體D 根據(jù)在中間體A步驟7中所述的步驟，由化合物v制備所需的中間體D。其沒有進一步純化而使用。
中間體E步驟1 用可買到的xvii作為偶合配偶體，通過中間體A步驟8所述的步驟得到所需的產(chǎn)物xviii。將該粗制物充分純化以便進一步研究。
步驟2 通過中間體A步驟7所述的步驟得到所需的產(chǎn)物E。該粗制物沒有進一步純化而使用。
中間體F步驟1 用可買到的xix作為偶合配偶體，通過中間體A步驟4所述的步驟得到所需的產(chǎn)物xx。將該粗制物充分純化以便進一步研究。
步驟2 通過中間體D中所述的步驟得到所需的產(chǎn)物F。
中間體G步驟1 用烯丙基甘氨酸作為偶合配偶體，通過中間體A步驟4所述的步驟得到所需的產(chǎn)物G。將該粗制物充分純化。將該粗制產(chǎn)物用4N HCl/二噁烷處理并在室溫下攪拌50分鐘。將該反應混合物濃縮至干燥，得到中間體G，其沒有進一步純化而使用。
實施例實施例1式1化合物的制備 步驟A 將1a的4-氯代丙酸(2.0g，10.8mmol)在二氯乙烷(200mL)中的溶液用CpRu(CH3CN)3PF6(4.7g，10.8mmol，1.0當量)處理并在回流下加熱2小時。當產(chǎn)物1c的無色晶體沉淀析出時將該反應混合物冷卻至室溫。濾出所述晶體并用1∶1 Et2O/CH2Cl2的混合物洗滌，在真空中干燥。該無色晶體(3.3g)為分析純。1H NMR (CD3C(O)CD3，400MHz，ppm，δ，J)6.77(d，2H，J＝7.0Hz)，6.53(d，2H，J＝7Hz)，5.64(s，5H)，2.87(t，2H，J＝7.0Hz)，2.74(t，2H，J＝7.0Hz)；MS(電噴霧，m/z相對強度)350.9(C14H14ClRu+，M+，100)；對于C14H14ClF6O2PRu的CHN計算值C＝33.92％，H＝2.85％，Cl＝7.15％，P＝6.25％ 實測值C＝34.04％，H＝3.04％，Cl＝7.09％，P＝5.71％。
步驟B 將Boc-環(huán)己基甘氨酸一水合物1d(6.17g，24.00mmol)在無水CH2Cl2(50.0mL)中的溶液用4-甲基嗎啉(2.64g，26.0mmol，1.1當量)處理并冷卻至-10℃。向該混合物中加入氯甲酸異丁基酯(3.62g，3.5mL，1.1當量)并將該白色懸浮液攪拌直至浴溫為-5℃。在一個單獨的燒杯中將間-酪氨酸甲基酯鹽酸鹽(6.5g，26.5mmol，1.1當量)溶于DMF(30mL)中并用4-甲基嗎啉(2.64g，26.0mmol，1.1當量)處理，在室溫下攪拌15分鐘。將該混合物加入到所述反應物中，同時伴有CO2放出。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時并用1M HCl水溶液(100mL)稀釋。用乙酸乙酯(3×200mL)萃取含水層并用1M HCl(1×100mL)、NaOH水溶液(1×100mL)、鹽水(1×100mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，在真空中濃縮并經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷3/7)純化，得到5.3g(53％)偶合化合物1f，為無色泡沫。
步驟C 將1f(10g，23.04mmol)的溶液溶于HCl(在二噁烷中的4M溶液，100mL)中并在室溫下攪拌2-4小時。將反應混合物在真空中濃縮并將固體重懸浮在乙醚中。將其過濾并將固體用乙醚洗滌，干燥得到無色固體1g(8.2g，96％)1H NMR(d4-CD3OD，400MHz，δ，ppm)7.09(t，1H，J＝8.0Hz)，6.71-6.36(m，3H)，4.69(dd，1H，J＝6.0Hz，3.2Hz)，3.69(s，3H)，3.66(d，1H，J＝5.2Hz)，3.15-3.10(dd，1H，J＝5.6Hz，4.0Hz)，1.87-1.69(m，6H)，1.32-1.10(m，5H)。
步驟D 將六氟·磷酸(η-茂)·[η6-(4-氯代苯基)]合釕基丙酸(cyclopentadiene-η6-4-chlorophenylpropionic acid-ruthenium hexanesafluorophosphate)1c(2.0g，4.0mmol)的DMF(20mL)溶液用HOBt(810mg，6.0mmol，1.5當量)和Hünigs base(2.6g，16.0mmol，4.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl·HCl(888mg，5.0mmol，1.25當量)處理。將該反應混合物在0℃下攪拌30分鐘并將胺鹽1g(1.48g，4.0mmol)加入到該混合物中，在室溫下攪拌12小時。將所述反應混合物在真空中濃縮并用H2O(200mL)稀釋殘余物，萃取進CH2Cl2(3×100mL)中。將合并的有機層用HCl水溶液(1×100mL)、NaHCO3(1×100mL)、鹽水(1×100mL)萃取并干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，并且棕色固體1h沒有進行任何進一步純化而用于環(huán)化作用。
步驟E 將(η-茂)·[η6-(4-氯代苯基)]合釕基丙酸(cyclopentadiene-η6-ruthenium-4-chlorophenylpropionic acid)-環(huán)己基甘氨酸-間酪氨酸-OCH31h(1.47g，粗制)在無水DMF(150mL)中的溶液用Cs2CO3(2.40g，7.37mmol，5.0當量)處理并通過將干N2通入所述反應混合物中鼓泡進行脫氣。將該反應混合物在室溫下攪拌16小時并蒸餾除去過量的DMF。將殘余物溶于H2O(200mL)并用CH2Cl2(3×100mL)萃取。用鹽水(100mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，所述殘余物沒有進一步純化而用于釕的光解解絡。
將粗制釕絡合物溶于乙腈(35mL)中，脫氣并在Raynot(λ＝350nM)中光解48小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷7∶3)純化，得到360mg(52％)無色固體1i。
步驟F 將二苯基醚1i(300mg，0.65mmol)在CH3OH(10mL)、CH2Cl2(20mL)和H2O(5mL)中的溶液用LiOH·H2O(90mg，2.2mmol，3.4當量)處理并在室溫下攪拌2小時。將該反應混合物用HCl水溶液(6M)酸化并萃取到CH2Cl2(3×30mL)中。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾并在真空中濃縮得到無色酸1j(200mg，66％)。
步驟G 將酸1j(100mg，0.22mmol)在無水DMF(2.5mL)中的溶液用HOOBt(45mg，0.33mmol)和Hünigs base(141mg，1.1mmol，5.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(63mg，0.33mmol，1.5當量)處理，攪拌20分鐘。將反應混合物用胺B(118mg，0.27mmol，1.22當量)處理并在室溫下攪拌12小時。在真空中濃縮該反應混合物并用H2O(30mL)稀釋。用CH2Cl2(3×50mL)和EtOAc(3×50mL)萃取含水層。用HCl水溶液(2M)、NaOH水溶液(2M)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮得到無色固體1k(79mg)，其用于氧化。MS(電噴霧，m/z相對強度)826[(M+1)+，100]，494(20)，94(30)。
步驟H將羥基酰胺1k(130mg，0.16mmol)的DMF(2.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(130mg，0.32mmol，2.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌2小時并將該混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶49)純化，得到氧化的產(chǎn)物1(55mg，42％)，為無色固體。MS(電噴霧，m/z相對強度)858[(M+CH3OH+1)+，100]，824[(M+1)+，63]。
實施例2式2化合物的制備 步驟A 將叔丁基酯1(50.0mg，60.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，4mL)處理并在室溫下攪拌2小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)。脫保護完成后將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用庚烷(4.0mL)反復處理并濃縮，得到白色固體2(49mg，100％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)768[(M+1)+，100]。
實施例3式3化合物的制備 步驟A 將酸1j(100mg，0.22mmol)在無水DMF(2.5mL)中的溶液用HOOBt(45mg，0.33mmol)和Hünigs base(141mg，1.1mmol，5.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(63mg，0.33mmol，1.5當量)處理，攪拌20分鐘。將反應混合物用胺E(79mg，0.27mmol，1.22當量)處理并在室溫下攪拌12小時。將該反應混合物在真空中濃縮并用H2O(30mL)稀釋。用CH2Cl2(3×50mL)萃取含水層。用HCl水溶液(1M，30mL)、NaOH水溶液(1M，30mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，得到無色固體3a(58mg)，其用于氧化。MS(電噴霧，m/z相對強度)693[(M+1)+，100]，637(41)，494(55)，394(51)，338(13)。
步驟B 將醇3a(95mg，0.14mmol)的CH2Cl2(2.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(116mg，0.28mmol，2.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌2小時并將該混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶32)純化，得到氧化的產(chǎn)物3(47mg，42％)，為無色固體。MS(電噴霧，m/z相對強度)691(M+1)+。
實施例4式4化合物的制備
步驟A 將叔丁基酯3(47.0mg，68.0μmol)的溶液用HCl(4M二噁烷，5mL)處理并在室溫下攪拌25小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)。脫保護完成后將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用庚烷(5.0mL)反復處理并濃縮，得到白色固體4(43mg，100％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)635[(M+1)+，100]，465(62)，336(62)。
實施例5式5化合物的制備
步驟A 將4-氯代丁酸5a(3.0g，15.10mmol)的二氯乙烷(200mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(6.6g，15.10mmol，1.0當量)處理并在回流下加熱2.5小時。將該反應混合物冷卻至0℃并過濾。在真空中濃縮濾液并溶于CH3CN(10mL)中，用大量過量的Et2O處理。經(jīng)潷析乙醚將分離出的樹膠狀物分離并將殘余物溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶1，100mL)中，在真空中濃縮得到5b，為可以固化的棕色樹膠狀物(3.5g，46％)。
步驟B 將羧酸5b(3.12g，5.95mmol)在無水DMF(20mL)中的溶液用Hünigs base(3.07g，24.0mmol，4.0當量，4.4mL)和HOBt(1.2g，8.93mmol，1.5當量)處理。將反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(1.35g，7.43mmol，1.25當量)處理，攪拌1小時。向所述反應混合物中加入胺鹽酸鹽1g(2.65g，7.14mmol，1.2當量)并將反應混合物在室溫下攪拌12小時。蒸餾出DMF并將殘余物用水稀釋，用CH2Cl2萃取含水層。用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、鹽水萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，將沒有進一步純化的粗制產(chǎn)物5c(4.3g)用于環(huán)化作用。1H NMR(d4-CD3OD，400MHz，δ，ppm)7.35(t，1H)，6.72-6.60(m，5H)，6.33-6.20(dd，2H)，5.51(s，5H)，4.19(d，1H)，3.68(s，3H)，3.19-2.83(m，2H)，2.51-2.40(m，2H)，2.40-2.25(m，2H)，1.99-1.59(m，8H)，1.35-0.98(m，5H)；MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)695.3([M-PF6]+，100)，232(20)，171(30)；HRMS對于C34H42N2O5ClRu+(M-PF6)+的計算值695.1832；實測值695.1845。
步驟C 將氯代化合物5c(3.0g，3.6mmol)在無水DMF(300mL)中的溶液用干燥N2和Cs2CO3(5.2g，16mmol，4.0當量)脫氣并在室溫下攪拌16小時。餾出溶劑DMF并將殘余物用水稀釋，用CH2Cl2(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾，在真空中濃縮并在真空下干燥過夜。它沒有進一步純化而用于光解除去Ru。MS FAB(NBA-G/TG-DMSO 695)([M-PF6]+，100)。
將來自上述步驟的環(huán)化化合物溶于CH3CN(35mL)中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶1)純化，得到褐色固體5d(600mg，34％)。1H NMR(CDCl3，400MHz，δ，ppm)7.58(d，1H，J＝7.6Hz)，7.14(t，1H，J＝8.0Hz)，6.94(d，2H，J＝8.4Hz)，6.87(dd，1H，J＝2.4，5.6Hz)，6.73(d，1H，J＝7.2Hz)，6.59(s，1H)，6.57(s，2H)，6.39(d，1H，J＝8.0Hz)，4.51(dt，1H，J＝2.8，8.0Hz)，3.80-3.62(m，1H)，3.62(s，3H)，3.05-3.00(dd，1H，J＝2.8，11.6Hz)，2.85(dd，1H，J＝8.4，6.0Hz)，2.76-2.72(m，1H)，2.36-2.19(m，3H)，2.02(dd，1H，J＝6.4，9.2Hz)，1.8-1.73(m，1H)，1.61-1.34(m，7H)，1.41-0.71(m，7H)。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)493[(M+1)+，100]，465(20)，232(30)，171(40)；HRMS對于C29H37N2O5(M+1)+的計算值493.2702；實測值493.2699。
步驟D 將醚5d(200mg，0.42mmol)在CH3OH(5mL)、CH2Cl2(10mL)和H2O(0.5mL)中的溶液用LiOH·H2O(18mg，0.44mmol，1.1當量)處理并在室溫下攪拌12小時。將該反應混合物用HCl水溶液(12N，1mL)酸化并在真空中濃縮，得到酸5e，其沒有進一步純化直接用于偶合作用。
步驟E 將酸5e的無水DMF(5.0mL)溶液用HOOBt(103mg，0.63mmol，1.5當量)、Hünigs base(216mg，1.68mmol，4.0當量)和胺B(270mg，0.63mmol，1.47當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(101mg，0.52mmol，1.25當量)處理，在室溫下攪拌12小時。將該反應混合物在真空中濃縮并用H2O(30mL)稀釋。將含水層用CH2C12(3×50mL)和EtOAc(3×50mL)萃取。用HCl水溶液(2M)、NaOH水溶液(2M)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮得到無色固體5f(177mg)，其用于氧化作用。MS(電噴霧，m/z相對強度)840[(M+1)+，100]，394(100)。
步驟F 將醇5f(177mg，0.21mmol)的CH2Cl2(10.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(178mg，0.42mmol，2.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌3小時并將該混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶49)純化，得到氧化的產(chǎn)物5(23mg，13％)，為無色固體。MS(電噴霧，m/z相對強度)870[(M+CH3OH+1)+，50]，838[(M+1)+，100]。
實施例6式6化合物的制備
步驟A 將叔丁基酯5(50.0mg，60.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，4mL)處理并在室溫下攪拌7小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CHCl21∶24)。完成脫保護后將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用庚烷(4.0mL)反復處理并濃縮，得到白色固體6(14mg，100％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)782[(M+1)+，100]。
實施例7式7化合物的制備
步驟A 將醇7a(9.2g，54.1mmol)的無水CH2Cl2(200mL)溶液用DMSO(35mL)和Et3N(16.4g，16.3mmol，23.4mL)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用溶于DMSO(30mL)中的Py·SO3(12.9g，81.2mmol，1.50當量)處理。將該反應混合物在0℃下攪拌0.5小時并在室溫下攪拌6小時。將該反應混合物在真空中濃縮并用Et2O(100mL)和H2O(200mL)稀釋。分離各層并用Et2O(3×100mL)萃取含水層。用HCl(2M，3×100mL)、鹽水(1×100mL)萃取合并的有機層，在真空中濃縮并經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶7)純化，得到醛7b，其放置后固化為蠟狀固體(7.1g，77％)。對于C9H9ClO的CHN計算值C＝64.11％，H＝5.38％；實測值C＝64.08％，H＝5.30％。
步驟B 在0℃下，將thiethylphosponoacetate(6.72g，30mmol，1.2當量)的無水THF(100mL)溶液用NaH(60％分散體，1.5g，35mmol，1.4當量)處理。將該反應混合物在25℃下攪拌1小時直至不再放出H2。加入醛7b(4.2g，25.0mmol)的無水THF(5.0mL)溶液并將該反應混合物攪拌36小時。將反應混合物用H2O(100mL)稀釋并用Et2O(3×70mL)萃取。干燥(MgSO4)合并的有機層，過濾，在真空中濃縮并層析，得到α，β-不飽和酯7c(4.2g，71％)，其用于還原作用。
步驟C 將α，β-不飽和酯7c(4.2g，8.0mmol)的EtOAc(50mL)溶液用Pd/C(10％w/w，500mg)處理并在50psi下氫化12小時。將該反應混合物通過硅藻土塞子過濾并在真空中濃縮濾液，得到還原的化合物7d(3.9g，93％)。
步驟D 將所述酯7d(3.9g，16.2mmol)的CH3OH/THF/H2O(1∶1∶0.1，110mL)溶液用LiOH·H2O(1.2g，30mmol，2.0當量)處理并在室溫下攪拌5小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用H2O(100mL)稀釋，萃取進Et2O(3×50mL)中。將含水層酸化至pH～1(13M HCl)并用Et2O(3×100mL)萃取混濁的含水層。干燥(MgSO4)合并的有機層，過濾并在真空中濃縮，得到無色固體7e(3.1g，96％)。對于C11H13ClO2的CHN計算值C＝62.12％，H＝6.16％；實測值C＝62.27％，H＝6.23％。
步驟E 將4-氯代苯基戊酸7e(3.0g，14.15mmol)的二氯乙烷(150mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(6.75g，15.10mmol，1.0當量)處理并在回流下加熱2.5小時。將該反應混合物冷卻至0℃并過濾。在真空中濃縮濾液并溶于CH3CN(20mL)中，用大量過量的Et2O處理。經(jīng)潷析乙醚將分離出的樹膠狀物分離并將殘余物溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶1，100mL)中，在真空中濃縮得到7f，為棕色樹膠狀物，其可以固化(4.36g，58％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)379[(M-PF6)+，100]。
步驟F 將羧酸7f(3.12g，5.95mmol)的無水DMF(20mL)溶液用Hünigsbase(3.07g，24.0mmol，4.0當量，4.4mL)和HOBt(1.2g，8.93mmol，1.5當量)處理。將反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(1.35g，7.43mmol，1.25當量)處理并攪拌1小時。向所述反應混合物中加入胺鹽酸鹽1g(2.65g，7.14mmol，1.2當量)并將反應混合物在室溫下攪拌12小時。蒸餾出DMF并將殘余物用水稀釋，用CH2Cl2萃取含水層。用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、鹽水萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，所述粗制產(chǎn)物7g(4.3g)沒有純化用于進一步的環(huán)化作用。1H NMR(d4-CD3OD，400MHz，δ，ppm)7.35(t，1H)，6.72-6.60(m，5H)，6.33-6.20(dd，2H)，5.51(s，5H)，4.19(d，1H)，3.68(s，3H)，3.19-2.83(m，2H)，2.51-2.40(m，2H)，2.40-2.25(m，2H)，1.99-1.59(m，8H)，1.35-0.98(m，5H)；MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)695.3([M-PF6]+，100)，232(20)，171(30)；HRMS對于C34H42N2O5ClRu+(M-PF6)的計算值695.1832；實測值695.1845。
步驟G 用干燥N2和Cs2CO3(5.2g，16mmol，4.0當量)將氯代化合物7g(3.0g，3.6mmol)的無水DMF(300mL)溶液脫氣并在室溫下攪拌16小時。餾出溶劑DMF并將殘余物用水稀釋，用CH2Cl2(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾，在真空中濃縮并在真空中干燥過夜。它沒有進一步純化而用于光解除去Ru。MS FAB(NBA-G/TG-DMSO)695[(M-PF6)+，100]。
將來自上述步驟的環(huán)化化合物溶于CH3CN(35mL)中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶1)純化，得到褐色固體7h(600mg，34％)。1H NMR(CDCl3，400MHz，δ，ppm)7.58(d，1H，J＝7.6Hz)，7.14(t，1H，J＝8.0Hz)，6.94(d，2H，J＝8.4Hz)，6.87(dd，1H，J＝2.4，5.6Hz)，6.73(d，1H，J＝7.2Hz)，6.59(s，1H)，6.57(s，2H)，6.39(d，1H，J＝8.0Hz)，4.51(dt，1H，J＝2.8，8.0Hz)，3.80-3.62(m，1H)，3.62(s，3H)，3.05-3.00(dd，1H，J＝2.8，11.6Hz)，2.85(dd，1H，J＝8.4，6.0Hz)，2.76-2.72(m，1H)，2.36-2.19(m，3H)，2.02(dd，1H，J＝6.4，9.2Hz)，1.8-1.73(m，1H)，1.61-1.34(m，7H)，1.41-0.71(m，7H)。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)493[(M+1)+，100]，465(20)，232(30)，171(40)；HRMS對于C29H37N2O5(M+1)+的計算值493.2702；實測值493.2699。
步驟H 將醚7h(220mg，0.46mmol)在CH3OH(3.0mL)、CH2Cl2(10mL)和H2O(0.5mL)中的溶液用LiOH·H2O(18mg，0.44mmol，1.1當量)處理并在室溫下攪拌12小時。將該反應混合物用HCl水溶液(13M，1mL)酸化并在真空中濃縮，得到酸7i，其沒有進一步純化直接用于偶合作用。
步驟I 將酸7i的無水DMF(3.0mL)溶液用HOOBt(94mg，0.75mmol，1.6當量)、Hunigs base(237mg，1.84mmol，4.0當量)和胺B(246mg，0.58mmol，1.47當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(110mg，0.58mmol，1.25當量)處理，在0℃下攪拌25分鐘、12小時。將該反應混合物在真空中濃縮并用H2O(30mL)稀釋。用CH2Cl2(3×30mL)萃取合并的含水層。用HCl水溶液(1M，60mL)、NaOH水溶液(60mL)萃取有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮得到無色固體7j(230mg)，其用于氧化作用。MS(電噴霧，m/z相對強度)854[(M+1)+，100]，479(70)，327(50)，271.1(100)。
步驟J 將醇7j(220mg，0.26mmol)的CH2Cl2(3.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(218mg，0.51mmol，2.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌并將該混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶24)純化，得到氧化產(chǎn)物7(23mg，13％)，為無色固體。MS(FAB，m/z相對強度)852[(M+1)+，43]，796(100)，768(20)，461(20)，433(50)，405(50)，336(30)，294(50)。
實施例8式8化合物的制備
步驟A 將叔丁基酯7(32.0mg，37.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，5.0mL)處理并在室溫下攪拌4小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)。完成脫保護后將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用庚烷/CH3OH(4.0mL)反復處理并濃縮，得到褐色固體8(29.0mg，100％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)796[(M+1)+，100]。
實施例9式9化合物的制備
步驟A 將Boc-甘氨酸9a(1.75g，10.0mmol)的無水DMF(50mL)溶液用HOOBt(2.65g，15mmol，1.5當量)和EDCl(2.86g，15.0mmol，1.5當量)處理。將該反應混合物用Hünigs base(5.16g，40mmol，4.0當量，7.3mL)處理。將該反應混合物攪拌1小時并加入間酪氨酸-OCH3·HCl 1e(2.5g，11.5mmol，1.1當量)，在25℃下攪拌12小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用NaHCO3水溶液稀釋，萃取到CH2Cl2中。濃縮合并的有機層并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶1)純化，得到無色固體9b(3.4g，90％)。
步驟B 將9b(4.6g，13.06mmol)的HCl(在二噁烷中的4M溶液，50mL)溶液在室溫下攪拌3小時。將反應混合物在真空中濃縮并將殘余物在高真空中干燥，得到為細粉末的9c，其用于下一步驟中。1H NMR(CD3OD，400MHz，δ，ppm)8.67(d，1H，J＝7.9Hz)，7.10-7.07(m，1H)，6.68-6.64(m，2H)，4.75-4.70(m，1H)，3.75-3.61(m，2H)，3.66(s，3H)，3.10(dd，1H，J＝5.2，8.5Hz)，2.90(dd，1H，J＝8.8Hz，5.0Hz)。
步驟C 將[CpRu(η6-4-氯代苯基丙酸)]PF61c(3.0g，46.01mmol)的無水DMF(60mL)溶液用HOBt(1.3g，9.16mmol，1.5當量)和Hünigs base(3.22g，4.60mL，25.0mmol，4.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(1.75g，9.16mmol，1.5當量)處理。將該反應混合物在0℃下攪拌30分鐘并加入甘氨酸銨鹽9c(1.75g，6.06mmol，1.0當量)。將該反應混合物在室溫下攪拌12并在真空中蒸餾出DMF。將殘余物用HCl水溶液(1M，100mL)稀釋并萃取入CH2Cl2(3×100mL)。將合并的有機層用NaHCO3水溶液(1×100mL)、鹽水(50mL)萃取，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，得到棕色固體9d(1.5g，34％)，其用于環(huán)化作用。MS(電噴霧，m/z相對強度)585[(M-PF6)+，100]，459(30)，373(30)，198(20)。
步驟D 在室溫下用干燥N2將釕絡合物9d(1.5g，2.05mmol)的無水DMF(100mL)溶液脫氣并加入Cs2CO3(5.0g，15mmol，7.5當量)，在室溫下攪拌12小時。蒸餾除去溶劑DMF并將殘余物用水(100mL)稀釋，用CH2Cl2(3×100mL)萃取。用鹽水(100mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮并在真空中干燥過夜。它沒有進一步純化而用于光解除去Ru。
將來自上述步驟的環(huán)化化合物溶于CH3CN(30mL)中并過濾到石英管中。將該溶液脫氣并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc)純化，得到褐色固體9e(230mg，30％)。1H NMR(CDCl3，400MHz，δ，ppm)7.23-7.18(m，2H)，7.09-7.01(m，3H)，6.76(dd，1H，J＝2.4，8.8Hz)，6.66(d，1H，J＝7.6Hz)，6.47(d，1H，J＝5.6Hz)，6.17(s，1H)，5.64(s，1H)，4.69(q，1H，J＝4.4Hz)，3.77(s，3H)，3.68-3.51(m，2H)，3.35(dd，1H，J＝4.0，10.8Hz)，3.05(dd，1H，J＝5.2，9.2Hz)，2.96-2.92(m，2H)，2.61-2.56(m，1H)，2.30-2.29(m，1H)；13C NMR(CDCl3，100MHz，δppm)172.3，171.4，168.1，159.9，155.4，137.6，136.4，131.0，130.0，129.5，123.3，122.4，121.0，117.7，117.1，53.6，53.0，43.6，39.9，36.1，32.3。MS(電噴霧，m/z相對強度)383[(M+1)+，100]，279(20)。
步驟E 在室溫下將環(huán)狀化合物9e(150mg，0.4mmol)在THF(4.0mL)、H2O(4.0mL)中的溶液與LiOH·H2O(41.0mg，1.0mmol，2.5當量)一起攪拌3小時。將該反應混合物用濃HCl(2.0mL)酸化并在真空中濃縮。在真空中干燥固體9f并且沒有進一步純化而將其用于進一步的偶合作用。
步驟F 將水解的酸9f在無水DMF(4.0mL)和CH2Cl2(4.0mL)中的溶液用HOOBt(103mg，0.58mmol，1.5當量)處理并冷卻至0℃，加入Hünigsbase(206mg，1.60mmol，4.0當量，295μL)。向該混合物中加入EDCl(112mg，0.58mmol，1.5當量)并將該反應混合物在0℃下攪拌0.5小時，用胺鹽酸鹽B(206mg，0.48mmol，1.2當量)處理。將該反應混合物貯存在冰箱中48小時并在真空中濃縮除去DMF和CH2Cl2。將殘余物用HCl水溶液(2M)稀釋并用CH2Cl3(3×50mL)萃取。將合并的有機層用HCl水溶液(1M，3×50mL)、NaOH水溶液(2M)、鹽水(100mL)萃取，干燥(Na2SO4)并在真空中濃縮。不經(jīng)進一步純化而將殘余物9g(200mg)氧化。
步驟G 將醇9g(200mg，0.27mmol)的CH2Cl2(3.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(342mg，0.81mmol，3.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌3小時并用NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液稀釋。將該反應混合物在室溫下攪拌20分鐘并將該反應混合物用CH2Cl2(3×30mL)萃取。用鹽水(50mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮，將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH(2M NH3)/CH2Cl21∶19)純化，得到酮酰胺9(100mg，50％)，為無色固體。MS(電噴霧，m/z相對強度)742([M+1]+，100)，686(80)。
實施例10式I0化合物的制備 步驟A 將叔丁基酯9(100mg，0.13mmol)的無水CH2Cl2(4.0mL)溶液用TFA(4.0mL)處理并在室溫下攪拌5小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復溶解于甲苯/CH2Cl2中并在真空中濃縮數(shù)次，得到細的無色固體10。MS(FAB，NBA/DMSO，m/z相對強度)686[(M+1)+，40]，460(20)，307(100)，289(60)；HRMS對于C36H40N5O9(M+1)+的計算值686.2825；實測值686.2840。
實施例11式11化合物的制備 步驟A 在-20℃下，向胺鹽酸鹽1g(1.20g，3.23mmol)、6-庚烯酸(0.610g，4.68mmol)、HOOBt(0.765g，4.69mmol)和EDCl(1.07g，5.58mmol)在無水DMF(50mL)和CH2Cl2(50mL)中的溶液中加入NMM(1.55mL，14.1mmol)。在此溫度下攪拌30分鐘后，將該反應混合物保存在冰箱中18小時。然后將其溫熱至室溫。加入EtOAc(150mL)、鹽水(50mL)和5％H3PO4(50mL)。分層后，將該有機溶液用5％H3PO4(80mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×80mL)、水(80mL)和鹽水(80mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾并在真空中濃縮?？焖賹游?2-5％MeOH-CH2Cl2)，得到11a(1.46g，3.28mmol，定量)，為白色固體。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.25(s，1H)，8.31(d，J＝7.2Hz，1H)，7.70(d，J＝9.2Hz，1H)，7.05-7.01(m，1H)，6.62-6.58(m，3H)，5.82-5.72(m，1H)，5.02-4.91(m，1H)，4.43-4.38(m，1H)，4.23-4.19(m，1H)，3.55(s，3H)，2.93-2.80(m，2H)，2.51-1.97(m，2H)，1.66-0.86(m，15H)；13C NMR(d6-DMSO，125MHz)，δ171.9，171.8，171.1，157.2，138.6，138.4，129.1，119.5，115.8，114.6，113.5，56.5，53.5，51.6，36.5，34.8，32.8，29.0，28.0，27.8，25.8，25.5，24.8；HRMS，m/z 445.2683(對于C25H36N2O5的計算值445.2702，誤差4ppm)。
步驟B 在氮氣氛、0℃下，小心地向11a(1.46g，3.28mmol)的無水THF(60mL)溶液中加入硼烷-THF溶液(12mL，1.0M，12mmol)。將得到的溶液在0℃、氮氣氛下攪拌1小時40分鐘。然后加入乙醇(4mL)和pH7緩沖液(8mL)，隨后加入30％H2O2水溶液(7.5mL)。在0℃下攪拌20分鐘后，將其加溫至室溫并攪拌2小時。加入EtOAc(200mL)和鹽水(100mL)并分離各層。用EtOAc(2×150mL)萃取含水溶液。用硫酸鎂干燥合并的有機溶液，過濾并在真空中濃縮?？焖賹游?2-5％MeOH-CH2Cl2)，得到11b(1.05g，2.18mmol，68％)，為白色固體。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.25(s，1H)，8.30(d，J＝7.2Hz，1H)，7.68(d，J＝9.2Hz，1H)，7.05-7.01(m，1H)，6.62-6.58(m，3H)，4.43-4.18(m，3H)，3.55(s，3H)，3.37-3.33(m，2H)，2.93-2.80(m，2H)，2.20-2.03(m，2H)，1.66-0.87(m，19H)；13C NMR(d6-DMSO，125MHz)，d 172.1，171.8，171.2，157.2，138.4，129.1，119.5，115.8，113.5，60.7，56.5，53.5，51.7，36.5，35.1，32.6，32.4，29.0，28.5，28.0，25.8，25.6，25.4，25.2；HRMS，m/z463.2813(對于C25H36N2O5的計算值463.2808，誤差1ppm)。
步驟C 在0℃向酚醇11b(1.00g，2.16mmol)和三正丁基膦(1.10mL，4.28mmol)在無水CH2Cl2(100mL)和THF(40mL)中的溶液中加入ADDP(1.08g，4.28mmol)。在0℃下攪拌1小時后，將該溶液加溫至室溫并在氮氣氛下攪拌3小時。TLC指示原料完全消耗。在真空中除去溶劑后，將殘余物經(jīng)快速層析(0-3％MeOH的CH2Cl2溶液)部分純化，得到大環(huán)化合物11c(650mg，1.46mmol，68％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.58(d，J＝8.3Hz，1H)，7.76(d，J＝9.2Hz，1H)，7.18-7.14(m，1H)，6.76-6.65(m，3H)，4.77-4.71(m，1H)，4.32(t，J＝8.5Hz，1H)，3.97-3.93(m，1H)，3.82-3.78(m，1H)，3.67(s，3H)，3.18-3.14(m，1H)，2.98-2.92(m，2H)，2.32-2.25(m，1H)，2.02-2.01(m，1H)，1.99-0.87(m，19H)；13C NMR(d6-DMSO，125 MHz)，δ172.1，171.6，171.4，160.1，158.8，139.0，129.1，121.1，113.0，111.9，66.4，56.1，52.0，50.1，40.6，34.9，34.2，28.7，28.3，26.8，26.3，25.9，25.5，25.2，24.2；HRMS，m/z 445.2685(對于C25H36N2O5的計算值445.2702，誤差4ppm)。
步驟D 在室溫下，將氫氧化鋰水溶液(70mg，15mL H2O，2.92mmol)加入到甲基酯11c(330mg，0.742mmol)在THF(20mL)和乙醇(10mL)中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌3小時。由TLC監(jiān)測該反應過程。將該溶液在真空中濃縮后，加入EtOAc(100mL)、6N HCl溶液(10mL)和水(50mL)并分離各層。用EtOAc(2×80mL)萃取含水溶液。合并有機溶液、經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并在真空中濃縮，得到11d(260mg，0.604mmol，81％)，為白色固體。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.43(d，J＝8.3Hz，1H)，7.73(d，J＝9.3Hz，1H)，7.17-7.13(m，1H)，6.77-6.66(m，3H)，4.67-4.62(m，1H)，4.32-4.28(m，1H)，3.98-3.93(m，1H)，3.81-3.75(m，1H)，3.17-3.13(m，1H)，2.97-2.90(m，1H)，2.32-2.26(m，1H)，2.01-1.97(m，1H)，1.67-0.85(m，19H)；13C NMR(d6-DMSO，125MHz)，δ173.2，171.6，171.3，158.8，139.3，129.0，121.1，113.1，111.9，66.4，56.1，50.8，35.1，34.3，28.8，28.3，26.9，26.3，25.9，25.6，25.5，25.2，24.2；HRMS，m/z 431.2564(對于C25H36N2O5的計算值431.2546，誤差4ppm)。
步驟E 在-20℃下，向酸11d(0.140g，0.325mmol)、胺B(0.140g，0.325mmol)、HOOBt(56mg，0.343mmol)和EDCl(75mg，0.391mmol)在無水DMF(40mL)和CH2Cl2(20mL)中的溶液中加入NMM(0.107mL，0.973mmol)。在此溫度下攪拌30分鐘后，將該反應混合物保存在冰箱中18小時。然后加入EtOAc、鹽水和5％H3PO4。用5％H3PO4、飽和碳酸氫鈉水溶液、水和鹽水順序洗滌分離的有機溶液，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并在真空中濃縮?？焖賹游?2-5％MeOH-CH2Cl2)得到11e，為非對映異構體的混合物(0.170g，0.211mmol，65％)，為白色固體，其沒有進一步純化而用于下一步反應中。
步驟F 在室溫下，向羥基酰胺11e(0.29g，0.36mmol)和Dess-Martin試劑(0.45g，1.06mmol)的混合物中加入無水CH2Cl2(60mL)、DMF(3mL)和DMSO(3mL)。將得到的溶液在室溫下劇烈攪拌2.5小時。加入多量的Dess-Martin試劑(300mg，0.71mmol)并將該反應混合物再攪拌1小時。加入飽和碳酸氫鈉水溶液和亞硫酸氫鈉溶液(各40mL)并將該混合物劇烈攪拌10分鐘，然后加入EtOAc(200mL)和水(30mL)并分離各層。用5％H3PO4溶液(2×100mL)和飽和NaHCO3溶液(100mL)洗滌有機溶液，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并在真空中濃縮。快速層析(1-5％MeOH-CH2Cl2)得到11(100mg，0.124mmol，35％)，為白色固體。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.79-8.69(m，2H)，8.36-8.16(m，2H)，7.72-7.68(m，1H)，7.42-7.33(m，5H)，7.17-7.13(m，1H)，6.77-6.63(m，3H)，5.30-5.27(m，1H)，5.09-5.04(m，1H)，4.85-4.76(m，1H)，4.29-4.25(m，1H)，3.98-3.74(m，1H)，3.02-2.85(m，2H)，2.32-2.27(m，1H)，2.04-1.96(m，1H)，1.72-0.81(m，35H)；13C NMR(d6-DMSO，125MHz)，δ196.5，196.2，171.65，171.61，171.5，171.14，171.07，169.4，167.6，160.7，158.84，158.79，139.5，139.3，136.6，136.5，128.92，128.90，128.7，128.6，128.1，127.7，127.4，124.9，121.34，121.28，113.1，112.9，112.0，111.9，81.3，66.34，66.30，56.92，56.87，56.3，56.2，53.4，53.3，51.5，50.9，41.5，41.4，40.8，40.7，36.6，36.1，34.4，34.3，31.8，31.6，30.4，29.1，28.9，28.4，28.3，27.5，26.8，26.21，26.17，25.9，25.59，25.55，25.0，24.2，18.74，18.66，13.5，13.4；HRMS，m/z 804.4542(對于C25H36N2O5的計算值804.4548，誤差1ppm)。
實施例12式12化合物的制備
步驟A 將叔丁基酯11(56.8mg，0.0706mmol)在三氟乙酸(15mL)和CH2Cl2(15mL)中的溶液在室溫下攪拌4小時。在真空中除去揮發(fā)性物后，將殘余物溶于50％MeOH-CH2Cl2(3mL)中并在真空中濃縮至干燥，得到灰白色固體12(50mg，0.0669mmol，95％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.75-8.71(m，2H)，8.36-8.16(m，2H)，7.72-7.69(m，1H)，7.39-7.31(m，5H)，7.17-7.13(m，1H)，6.76-6.63(m，3H)，5.37-5.35(m，1H)，5.07-5.04(m，1H)，4.85-4.76(m，1H)，4.29-4.25(m，1H)，3.97-3.74(m，4H)，3.02-2.86(m，2H)，2.32-2.26(m，1H)，2.01-1.97(m，1H)，1.70-0.82(m，26H)；13C NMR(d6-DMSO，125MHz)，δ196.5，196.2，171.63，171.59，171.52，171.48，171.1，171.06，167.4，160.6，158.82，158.78，153.4，139.4，137.1，137.0，128.91，128.88，128.7，128.65，128.61，128.5，128.43，128.39，128.33，128.32，128.14，128.12，128.0，127.7，128.7，127.63，127.59，127.5，127.4，126.8，121.3，115.9，113.1，112.9，112.8，112.0，111.9，111.88，66.33，66.29，56.3，56.2，56.17，53.34，53.31，53.27，51.1，50.9，41.5，40.84，40.77，40.7，40.6，40.56，40.53，40.5，38.7，38.6，38.56，38.53，36.6，36.1，34.4，34.3，31.8，31.6，29.4，29.1，29.0，e28.9，28.4，28.3，28.2，26.9，26.8，26.79，26.20，26.16，25.88，25.86，25.79，25.75，25.71，25.66，25.57，25.54，25.4，25.0，24.2，18.7，18.6，13.5，13.4；HRMS，m/z 748.3947(對于C25H36N2O5的計算值748.3922，誤差3ppm)。
實施例13式13化合物的制備 步驟A 除了用6-羥基己酸代替6-庚烯酸(39％)外，根據(jù)實施例11、步驟A的方法制備所需的化合物13a。
步驟B 根據(jù)實施例11、步驟C的方法由13a制備所需的化合物13b，產(chǎn)率74％。
步驟C 根據(jù)實施例11、步驟D的方法，由相應的甲基酯13b制備所需的大環(huán)酸13c，產(chǎn)率88％，為白色固體。
步驟D 根據(jù)實施例11、步驟E的方法，由13c和B制備所需的化合物13d，產(chǎn)率48％。
步驟E 根據(jù)實施例11、步驟F的方法，由13d制備所需的化合物13，產(chǎn)率70％。
實施例14式14化合物的制備
步驟A 根據(jù)實施例12、步驟A的方法，以定量的產(chǎn)率由13制備所需的化合物14。
實施例15式15化合物的制備
步驟A 將3-碘代-苯基丙氨酸(analine)15a(2.50g，8.59mmol)和濃鹽酸(2mL，24mmol)的甲醇溶液加熱至回流18小時。在真空中除去溶劑，得到白色固體15b，其沒有進一步純化而用于步驟B中。
步驟B 根據(jù)實施例11、步驟A的方法，由15b制備所需的化合物15c，產(chǎn)率84％。其沒有進一步純化而用于下一反應中。
步驟C 根據(jù)實施例11、步驟A的方法，由15c制備所需的化合物15d(定量)。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟D 根據(jù)實施例11、步驟A的方法，由15d制備所需的化合物15e，產(chǎn)率68％。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟E 將裝在厚壁管中的15e(1.16g，2.04mmol)、三乙胺(2.90mL，20.6mmol)在無水乙腈(25mL)和DMF(20mL)中的溶液經(jīng)氬氣起泡5分鐘。在室溫下向該溶液中快速加入四(三苯膦)鈀(0)(235mg，0.203mmol)。將該管用Teflon螺旋蓋密封并在油浴中加熱至85-90℃。攪拌3小時后，將其冷卻至室溫，小心打開并倒在EtOAc(100mL)上。將該溶液用5％H3PO4(4×50mL)和水(50mL)洗滌。經(jīng)硫酸鎂干燥有機層，過濾并在真空中濃縮。快速層析(1-4％MeOH-CH2Cl2)，得到大環(huán)化合物15f(330mg，0.749mmol，37％)。
步驟F 根據(jù)實施例11、步驟D的方法，由15f定量制備所需的化合物15g。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟G 根據(jù)實施例11、步驟F的方法，由15g制備所需的化合物15h，產(chǎn)率為77％。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟H 根據(jù)實施例1、步驟H的方法，由15h制備所需的化合物15，產(chǎn)率為55％。
實施例16式16化合物的制備
步驟A 根據(jù)實施例12、步驟A的方法，由15定量制備所需的化合物16。
實施例17式17化合物的制備
步驟A 向15f(150mg，0.340mmol)在EtOH(10mL)和EtOAc(5mL)中的溶液中加入10％披鈀碳(20mg)。將該懸浮液在氫氣下攪拌8小時，在此期間用TLC監(jiān)測反應過程。通過硅藻土墊過濾后，在真空中除去溶劑，得到產(chǎn)物，為白色固體17a(150mg，0.339mmol，定量)。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟B 根據(jù)實施例11、步驟D的方法，由17a制備所需的化合物17b。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟C 根據(jù)實施例11、步驟E的方法，由17b制備所需的化合物17c，產(chǎn)率為73％(步驟B和C)。其沒有進一步純化用于下一反應中。
步驟D 根據(jù)實施例11、步驟F的方法，由17c制備所需的化合物17，產(chǎn)率為46％。
實施例18式18化合物的制備
步驟A 根據(jù)實施例12、步驟A的方法，由17定量制備所需的化合物18。
實施例19式19化合物的制備
步驟A 根據(jù)實施例11、步驟C的方法，由1g和19a制備所需的化合物19b，產(chǎn)率為64％。
步驟B 根據(jù)實施例1、步驟C的方法，由19b制備所需的化合物19c。其沒有進一步純化而用于下一反應中。
步驟C 在室溫下，向二胺鹽19c(75mg，1.52mmol)和羰基二咪唑(260mg，1.60mmol)在乙腈(400mL)中的懸浮液中加入三乙胺(0.26mL，1.85mmol)。將該混合物攪拌3天。在真空中除去溶劑。將殘余物溶于EtOAc/THF(100/50mL)中并將該溶液用5％H3PO4洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并在真空中濃縮?？焖賹游?2-10％MeOH-CH2Cl2)，得到19d(290mg，0.651mmol，43％)，為白色固體。
步驟D 根據(jù)實施例11、步驟D的方法，由19d制備所需的化合物19e，產(chǎn)率為97％。其沒有進一步純化而用于下一反應中。
步驟E 根據(jù)實施例11、步驟E的方法，由19e和B制備所需的化合物19f，產(chǎn)率為66％。
步驟F 根據(jù)實施例11、步驟F的方法，由19f制備所需的化合物19，產(chǎn)率為66％。將兩種產(chǎn)物經(jīng)快速層析(0-5％MeOH-CH2Cl2)部分分離。
實施例20式20化合物的制備
步驟A 根據(jù)實施例12、步驟A的方法，由19制備所需的化合物20。
實施例21式21化合物的制備 步驟A
將5-己烯-1-醇21a(10g，50mmol)的乙醚(100mL)溶液用三乙胺(10.1g，100mmol，2.0當量)處理并冷卻至0℃。滴加入光氣的苯溶液(20％，100mL，20g，200mmol，4.0當量)并將該反應混合物在室溫下攪拌12小時。過濾分離出的三乙胺鹽酸鹽并在真空中濃縮濾液。殘余物21b沒有純化直接用于進一步的研究。
步驟B 將1f(8.0g，18.43mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液用三乙胺(2.43g，24.0mmol，1.3當量)處理。將該反應混合物冷卻至-78℃并滴加入氯甲酸烯丙基酯(2.9g，24mmol，1.3當量)。將該反應混合物在室溫下攪拌12小時并將該反應混合物用H2O(100mL)和HCl水溶液(2M，200mL)稀釋。用EtOAc(3×200mL)萃取含水層。用鹽水萃取合并的EtOAc層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮，殘余物21c直接用于Boc脫保護。1H NMR(CHCl3，300MHz，δ，ppm)7.29(t，1H，J＝6.0Hz)，7.06-6.98(m，3H)，6.41(d，1H，J＝5.4Hz)，6.05-5.95(m，1H)，5.42(dd，1H，J＝1.2，13.2)，5.31(dd，1H，J＝1.2，13.2)，5.10(d，1H，J＝6.6Hz)，4.91-4.87(q，1H)，4.74(d，1H，J＝4.5Hz)，3.95-3.92(m，1H)，3.70(s，3H)，3.12(d，1H，J＝4.2Hz)，1.81-1.51(m，6H)，1.43(s，9H)，1.21-0.91(m，6H)。
步驟C 將21c(1.5g)的HCl(4M，在二噁烷中，100mL)溶液在室溫下攪拌3小時。原料消失后進行TLC，并且一旦原料消失則將該反應混合物在真空中濃縮，將殘余物21d在泵中干燥。其沒有進一步純化而用于偶合作用。
步驟D 將胺鹽酸鹽21d(4.0g，8.9mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液用三乙胺(2.73g，27mmol，3.0當量，3.8mL)處理并冷卻至-78℃。滴加入氯甲酸酯21b(2.3g，13.3mmol，1.5當量)的CH2Cl2(30mL)溶液。將該反應混合物在室溫下攪拌過夜并用HCl水溶液(1M，150mL)稀釋。用EtOAc(3×100mL)萃取含水層。將合并的乙酸乙酯層用H2O(100mL)、鹽水(100mL)萃取，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮，將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷3∶7)純化，得到21e，為無色固體(5g，80％)。
步驟E 在0℃下，將alloc-保護的化合物21e(4.0g，7.2mmol)的無水THF(60.0mL)溶液用雙甲酮(dimedione)(2.01g，14.4mmol，2.0當量)、Pd(PPh3)4(830mg，0.71mmol，10mol％)處理并在室溫下攪拌1小時。將該反應混合物在真空中濃縮，將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷，3∶7)純化，得到脫保護的醇21f，為無色固體(2.7g，79％)。1H NMR(CDCl3，300MHz，δppm)7.44(bs，1H)，7.09(s，1H，J＝6.0Hz)，6.75-6.72(m，2H)，6.58-6.48(m，2H)，5.81-5.71(m，1H)，5.55(d，1H，J＝7.2Hz)，4.98(ddd，1H，J＝1.5，1.2，9Hz)，4.92(dd，1H，J＝4.5，0.9Hz)，4.88-4.83(m，1H)，4.12-3.97(m，1H)，3.71(s，3H)，3.09-2.98(m，2H)，2.08-2.03(m，2H)，1.722-1.40(m，10H)，1.24-0.94(m，5H)；13C NMR(100MHz，δ)171.6，157.3，156.6，138.3，136.6，129.8，123.5，120.6，117.0，114.9，114.6，65.7，60.1，53.2，52.5，40.4，37.1，33.3，29.6，28.6，28.3，26.0，25.9，25.1；對于C25H36N2O6的CHN計算值C＝65.20％，H＝7.88％，N＝6.08％；實測值C＝64.90％，H＝7.98％，N＝6.01％。
步驟F 將烯21f(650mg，1.4mmol)的無水THF(5.2mL)溶液冷卻至0℃并用BH3·THF(在THF中的1M溶液，4.2mL，4.2mmol，3.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌2小時并小心加入EtOH(2.0mL)，同時有氫氣放出。在氫氣完全放出后，將該反應混合物用pH7緩沖液處理并在0℃下用H2O2水溶液(30％，5.0mL)處理。除去冰浴并將該混合物在室溫下攪拌3-4小時。將該反應混合物用EtOAc(3×100mL)萃取。用H2O、鹽水萃取合并的有機層，干燥(MgSO4)，過濾，在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷，3∶7)純化，得到硼氫化的產(chǎn)物，為無色固體21g(400mg，60％)[α]D86.4(c0.3 CHCl3，25℃)；1HNMR(CDCl3，400MHz，δ)7.26(s，1H)，7.08(t，1H，J＝5.7Hz)，6.83(d，1H，J＝6.0Hz)，6.71(dd，1H，J＝1.2，4.5Hz)，6.57(bs，1H)，6.54(d，1H，J＝5.7Hz)，5.68(d，1H，J＝6.9Hz)，4.85(dq，1H，J＝4.2，1.8Hz)，4.05-3.97(m，3H)，3.69(s，3H)，3.60(t，2H，J＝4.8Hz)，3.08-2.97(m，2H)，1.77-1.53(m，10H)，1.42，1.25(m，4H)，1.24-0.92(m，5H)；13C NMR(CDCl3，100MHz，δ)171.8，171.8，157.6，156.9，136.9，130.0，120.8，117.0，114.8，65.7，62.7，60.3，53.3，52.7，40.5，37.4，32.5，29.7，29.0，28.8，26.2，26.0，25.6，25.4，MS(FAB，NBA/DMSO，m/z，相對強度)479([M+1]+，100)，296(40)，196(25)，156(25)，136(25)，112(20)。HRMS對于C25H39N2O7(M+1)+的計算值479.2760；實測值479.2757。
步驟G 將PPh3(385mg，1.47mmol，1.75當量)的CH2Cl2(10mL)溶液用化合物21g(400mg，0.84mmol)處理并冷卻至0℃。滴加入DEAD(220mg，1.26mmol，1.5當量)的CH2Cl2(10mL)溶液并在室溫下攪拌3小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶9)純化，得到環(huán)狀產(chǎn)物21h，為無色固體(110mg，25％)。
步驟H 將環(huán)狀氨基甲酸酯21h(200mg，0.44mmol)在二噁烷(30mL)、CH3OH(20mL)和CH2Cl2(20mL)中的溶液用LiOH·H2O(80mg，2.0mmol，4.5當量)處理并在室溫下攪拌4小時。將該反應物在真空中濃縮并用HCl(在二噁烷中的4M溶液，10mL)稀釋。經(jīng)冷凍干燥機除去水，得到直接用于偶合作用的晶體酸21i。
步驟I 將水解的酸21i(210mg，0.47mmol)在無水DMF(5.0mL)和CH2Cl2(5.0mL)中的溶液用HOOBt(125mg，0.70mmol，1.5當量)處理并冷卻至0℃，加入Hünigs base(258mg，2.0mmol，4.0當量，369μL)。向該混合物中加入EDCl(134mg，0.70mmol，1.5當量)并將該反應混合物在0℃下攪拌0.5小時，用胺鹽酸鹽B(253mg，0.58mmol，1.25當量)處理。將該反應混合物貯存在冰箱中24小時并在真空中濃縮以除去DMF和CH2Cl2。將殘余物用HCl水溶液(2M，30mL)稀釋并用CH2Cl2(3×50mL)萃取。用HCl水溶液(2M，30mL )、NaOH水溶液(1M)、鹽水(2×50mL)萃取合并的有機層，干燥(MgSO4)并在真空中濃縮。將沒有進一步純化的殘余物21j(220mg)氧化。
步驟J 將醇21j(220mg，0.26mmol)的CH2Cl2(5.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(200mg，0.47mmol，1.8當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時并用NaHCO3水溶液(15mL)和Na2S2O3水溶液(15mL)稀釋。將該反應混合物在室溫下攪拌20分鐘并用CH2Cl2(3×30mL)萃取反應混合物。用Na2CO3水溶液萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH(2MNH3)/CH2Cl21∶20)純化，得到酮酰胺21(60mg，27％)，為無色固體。
實施例22式22化合物的制備
步驟A 將叔丁基酯21(50mg，0.059mmol)的無水CH2Cl2(2.0mL)溶液用TFA(2.0mL)處理并在室溫下攪拌4小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復溶于庚烷/CH2Cl2中，在真空中濃縮數(shù)次，得到細的褐色固體22(47mg)，將其在真空中干燥。
實施例23式23化合物的制備
步驟A 將酸1d(255mg，1.0mmol)的DMF(2.0mL)溶液用HOBt(202mg，1.5當量)和Hünigs base(517mg，4.0mmol，4.0當量，738μL)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用DCC(258mg，1.25mmol，1.25當量)處理。將該混合物攪拌1小時后，加入組氨酸-OCH3·2HCl 23a(242.0mg，1.0mmol)并在室溫下攪拌過夜。將該反應混合物在真空中濃縮并萃取入EtOAc(3×50mL)和NaHCO3水溶液(50mL )。在真空中濃縮合并的有機層并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶19)純化，得到二肽23b，為無色固體(380mg，93％)。1H NMR(d6-DMSO，400MHz，δ，ppm)8.17(d，1H，J＝7.2Hz)，7.48(s，1H)，6.77(s，1H)，6.57(bs，1H)，5.54(d，1H，J＝7.6Hz)，4.47(q，1H，J＝7.2Hz)，3.79(t，1H，J＝8.4Hz)，3.55(s，3H)，3.36-3.20(m，2H)，2.94-2.82(m，2H)，1.70-1.47(bm，6H)，1.35(s，9H)，1.46-0.85(m，5H)；13C NMR(d6-DMSO，100MHz，δppm)172.5，171.9，157.3，155.9，135.4，78.6，59.5，52.9，52.3，34.1，29.6，28.9，28.6，26.5，26.3，26.0，25.2；FAB MS(NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)409[(M+1)+，100]，353(10)，170(20)；HRMS對于C20H33N4O6的計算值409.2451；實測值409.2466；對于C20H32N4O5的CHN計算值C＝58.81％，H＝7.90％，N＝13.72％；實測值C＝58.70％，H＝7.78％，N＝13.43％。
步驟B 將ω-溴代庚烯酸(223mg，1.0mmol)的DMF(3.0mL)溶液用脫保護的胺鹽酸鹽23b(380mg，1.0mmol，1.0當量)處理并加入Hunigs base(387mg，3.0mmol，3.0當量)。將該反應混合物用PyBroP(465mg，1.0mmol)處理并在室溫下攪拌3小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl2，1∶19)純化，得到無色固體(220mg，50％)。MS(FAB)515.2[(M+1)+，100]，513.2[(M+1)+，95]，469(60)，433(20)，170(40)。HRMS對于C23H38BrN4O4的計算值513.2076，實測值513.2073。
步驟C 將溴代化合物23c(100mg，0.23mmol)的2-丁酮(4.0mL)溶液用Na2CO3(31.0mg，0.29mmol，1.25當量)和LiI(50mg，0.37mmol，1.3當量)處理并在回流下加熱24小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物用水稀釋。將殘余物用CH2Cl2(3×30mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機層并經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶19)純化，得到環(huán)化的化合物23d(25mg，31％)；Rf0.68(2M NH3，在CH3OH/CH2Cl21∶19中)；1H NMR(CDCl3，400MHz，δ，ppm)8.17(d，1H，J＝8.8Hz)，7.33(s，1H)，6.48(d，1H，J＝8.4Hz)，4.90-4.85(m，1H)，4.26(t，1H，J＝8.0Hz)，3.82-3.74(m，2H)，3.69(s，3H)，3.16-3.11(m，2H)，2.91-2.84(m，1H)，2.30-2.01(m，2H)，1.65-1.59(m，11H)，1.18-0.96(m，11H)；13C NMR(CDCl3，100MHz，δppm)172.8，172.4，171.9，138.2，136.8，57.6，52.5，51.7，46.6，41.6，36.0，30.9，29.5，28.8，27.3，26.7，26.4，26.3，26.2，25.2，24.8；MS(電噴霧，m/z相對強度)433.1[(M+1)+，100]；HRMS對于C23H37N4O4的計算值433.2815；實測值433.2822。
步驟D 將甲基酯23d(200mg，0.46mmol)在CH3OH(5.0mL)和H2O(0.5mL)中的溶液用LiOH·H2O(30mg，0.75mmol，1.6當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌15小時并在真空中濃縮，在泵中干燥得到水解的化合物23e，其直接用于偶合作用。
步驟E 將酸23e在CH2Cl2(3.0mL)和DMF(5.0mL)中的溶液用HOOBt(115mg，0.70mmol，1.50當量)和EDCl(113mg，0.60mmol，1.25當量)處理。然后將該反應混合物用Et3N(190mg，1.88mmol，271μL，4.0當量)和胺鹽酸鹽B(201mg，0.5mmol，1.1當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌13小時并用H2O稀釋。用CH2Cl2(3×50mL)萃取含水層并將合并的有機層用NaOH水溶液(1M，50mL)萃取，干燥(Na2SO4)。過濾干燥的有機層并在真空中濃縮，得到無色殘余物23f(442mg)，將其在真空中干燥并直接用于進一步的氧化作用。MS(電噴霧，m/z相對強度)794[(M+1)+，100]。
步驟F 將羥基酰胺23f(50mg，0.064mmol)的CH2Cl2(3.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(53mg，0.13mmol，2.0當量)處理并在室溫下攪拌3小時。將該反應混合物用飽和Na2S2O3水溶液(20mL)稀釋并在室溫下攪拌15分鐘。用CH2Cl2(3×30mL)萃取含水層。干燥(Na2SO4)有機層，過濾，在真空中濃縮并經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl2，1∶15)純化，得到酮酰胺23(20mg，40％)；MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)824[(M+CH3OH)+，100]，792[(M+1)+，60]，447(20)；HRMS對于C42H62N7O8(M+1)+的計算值792.4660；實測值792.4659。
實施例24式24化合物的制備 步驟A 將叔丁基酯23(17mg，21.5μmol)的無水CH2Cl2(2.0mL)溶液用TFA(2.0mL)處理并在室溫下攪拌8小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶19)。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復溶于CH3OH/庚烷/CH2Cl2中，在真空中濃縮數(shù)次得到24，為細的無色固體(7mg)。MS(電噴霧，m/z相對強度)768[(M+CH3OH)+，100]，736[(M+1)+，60]， 46(10)。
實施例25式25化合物的制備 步驟A 將Boc-4-氯代苯基丙氨酸25a(523mg，1.75mmol)的二氯乙烷(37mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(760mg，1.75mmol，1.0當量)處理并在回流下加熱2小時。將該反應混合物冷卻至0℃并過濾。在真空中濃縮濾液并溶于最少量的CH3CN中，用大量過量的Et2O處理。將分離出的固體分離并溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶1，50mL)中，在真空中濃縮得到25b，為棕色泡沫(640mg，69％)。
步驟B 將羧酸25b(2.4g，3.80mmol)的無水DMF(15mL)溶液用Hünigsbase(1.64g，12.64mmol，4.0當量，2.9mL)和HOBt(661mg，4.38mmol，1.5當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(699mg，3.95mmol，1.25當量)處理，攪拌15分鐘。向該反應混合物中加入胺鹽酸鹽1g(1.50g，4.00mmol，1.2當量)并將反應混合物在室溫下攪拌12小時。蒸餾出DMF并將殘余物用水(30mL)稀釋，用CH2Cl2(3×50mL)萃取含水層。用NaHCO3水溶液(30mL)、HCl水溶液(30mL)、鹽水萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮，將粗制產(chǎn)物25c(2.5g，69％)不經(jīng)純化用于進一步的環(huán)化作用。
步驟C 用干燥的N2將化合物25c(100mg，0.11mmol)的無水DMF(10mL)溶液脫氣并用Cs2CO3(170mg，0.5mmol，5.0當量)處理，在室溫下攪拌12小時。蒸餾出溶劑DMF并將殘余物用水(35mL)稀釋，用CH2Cl2(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾，在真空中濃縮并在真空中干燥過夜。其沒有進一步純化而用于光解除去Ru。
將得自以上步驟的環(huán)化化合物溶于CH3CN中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷2∶1)純化，得到25d，為褐色固體(29mg，46％)；MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)580[(M+1)+，80]，524(100)，418(40)，462(30)，452(20)，313(60)，253(20)。
步驟D 將酯25d(150mg，0.26mmol)在THF(3mL)、CH3OH(3.0mL)和H2O(3.0mL)中的溶液用LiOH·H2O(18mg，0.43mmol，1.65當量)處理并在室溫下攪拌35分鐘。將該反應混合物用濃HCl(13M，1mL)酸化并萃取進CH2Cl2(3×50mL)中。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾并在真空中濃縮得到酸25e，其沒有進一步純化直接用于偶合作用。
步驟E 將酸25e(150mg，0.27mmol)的無水CH2Cl2(2.0mL)溶液用HOBt(62mg，0.40mmol)和Hünigs base(139mg，1.1mmol，4.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(53mg，0.34mmol，1.25當量)處理，攪拌30分鐘。將該反應混合物用胺F(88mg，0.29mmol，1.22當量)處理并貯存在冰箱中12小時。將該反應混合物在真空中濃縮并用H2O(50mL)稀釋。用CH2Cl2(3×50mL)萃取含水層。用HCl水溶液(1M，3×20mL)、NaOH水溶液(1M，3×20mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮得到無色固體25f(138mg)，將其用于氧化作用。
步驟F 將醇25f(140mg，0.143mmol)的CH2Cl2∶THF(1∶1，5.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(121mg，0.42mmol，3.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌2小時并將該混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶32)純化，得到氧化產(chǎn)物25(57mg，41％)，為無色固體。
實施例26式26化合物的制備
步驟A 將芐基酯25(30mg，38.0μmol)的CH3OH/THF(1∶1，4.0mL)溶液用Pd/C(20mg，10％)處理并將氫氣通入其起泡。加入一滴乙酸以加速還原作用。將該反應混合物通過硅藻土塞過濾并在真空中濃縮濾液。沒有進一步純化而對殘余物26進行分析。
實施例27式27化合物的制備
步驟A 將酸25e(100mg，0.17mmol)的無水CH2Cl2溶液用HOOBt(41mg，0.26mmol)和Hünigs base(91mg，0.70mmol，4.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(35mg，0.22mmol，1.25當量)處理，攪拌30分鐘。將該反應混合物用胺D(71mg，0.22mmol，1.22當量)處理并貯存在冰箱中12小時。將反應混合物在真空中濃縮并用H2O(30mL)稀釋。用CH2Cl2(3×30mL)萃取含水層。用HCl水溶液(1M，30mL)、Na2CO3水溶液(1M，30mL)萃取有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮得到27a無色固體(119mg)，其用于氧化作用。MS(FAB)，842[(M+1)，100]，765(20)，735(10)，657(20)，575(10)，492(10)，464(20)，446(30)。HRMS對于C46H60N5O10(M+1)+的計算值842.4339；實測值842.4336。
步驟B 將醇27a(120mg，0.143mmol)的CH2Cl2∶THF(1∶1，3.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(180mg，0.42mmol，3.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌2小時并將混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶32)純化，得到氧化產(chǎn)物27，為無色固體。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)，840[(M+1)+，50]。HRMS對于C46H58N5O10(M+1)+的計算值840.4184；實測值840.4199。
實施例28式28化合物的制備
步驟A 將芐基酯27(40mg，47.0μmol)的CH3OH/THF(1∶1，6.0mL)溶液用Pd/C(30mg，10％)處理并將氫氣通入其起泡。加入一滴乙酸以加速還原作用。將該反應混合物通過硅藻土塞過濾并在真空中濃縮濾液得到28。
實施例29式29化合物的制備
步驟A 將4-氯代苯基丙氨酸29a(1.5g，7.5mmol)在THF(20mL)和H2O(20mL)中的溶液用NaOH(900mg，22.5mmol，3.0當量)處理并冷卻至0℃。滴加入乙酰氯(707mg，9.00mmol，1.25mmol)的THF(10mL)溶液并將反應混合物在室溫下攪拌過夜。將該反應混合物用HCl水溶液(1M，10mL)酸化并用CH2Cl2(3×30mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾并在真空中濃縮得到29b，其沒有純化用于下一步驟中。
步驟B 將N-乙?；?4-氯代苯基丙氨酸29b(1.39g，5.75mmol)的二氯乙烷(118mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(2.5g，5.8mmol，1.0當量)處理并在回流下加熱2小時。將該反應混合物冷卻至0℃并過濾。在真空中濃縮濾液并溶于CH3CN(15mL)中，用Et2O(150mL)處理。經(jīng)潷析所述醚將分離出的樹膠狀物分離并將殘余物溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶1，50mL)中，在真空中濃縮得到29c，為棕色泡沫(2.2g，69％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)408[(M-PF6)+，100]。
步驟C 將羧酸29c(2.0g，4.00mmol)的無水DMF(20mL)溶液用Hünigsbase(2.06g，16.0mmol，4.0當量，2.9mL)和HOBt(810mg，6.0mmol，1.5當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃然后用EDCl(888mg，5.0mmol，1.25當量)處理并攪拌0.5小時。向該反應混合物中加入胺鹽酸鹽1g(1.48g，7.14mmol，1.2當量)并將該反應混合物在室溫下攪拌12小時。蒸餾出DMF并將殘余物用水稀釋，將含水層用CH2Cl2(3×100mL)萃取。用NaHCO3水溶液(200mL)、HCl水溶液(100mL)、鹽水萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮，將粗制產(chǎn)物29d(1.2g，38％)不經(jīng)進一步純化用于環(huán)化作用。
步驟D 用干燥N2將氯代化合物29d(1.2g，1.5mmol)的無水DMF(120mL)溶液脫氣并用Cs2CO3(2.4g，7.4mmol，5.0當量)處理，在室溫下攪拌23小時。蒸餾出溶劑DMF并將殘余物用水(300ml)稀釋，用丙腈(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾并在真空中濃縮，在真空中干燥過夜。其沒有進一步純化用于光解除去Ru。
將來自以上步驟的環(huán)化化合物溶于CH3CN(40mL)中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷4∶1)純化，得到褐色固體29e(240mg，38％)。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相對強度)，522[(M+1)+，100]。
步驟E 將酯29e(200mg，0.42mmol)在CH3OH(5mL)、CH2Cl2(13mL)和H2O(2.0mL)中的溶液用LiOH·H2O(41mg，1.0mmol，2.4當量)處理并在室溫下攪拌3小時。將該反應混合物用HCl水溶液(13M，1mL)酸化并萃取進CH2Cl2(3×50mL)和EtOAc(3×50mL)中。干燥(Na2SO4)合并的有機層，過濾并在真空中濃縮得到酸29f(178mg)，其沒有進一步純化直接用于偶合作用。
步驟F 將酸29f(90mg，0.18mmol)的無水DMF(1.0mL)溶液用HOBt(45mg，0.33mmol，1.6當量)、Hünigs base(142mg，1.1mmol，5.0當量)和胺B(118mg，0.28mmol，1.47當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(63mg，0.33mmol，1.6當量)處理并在0℃下攪拌20分鐘、12小時。將該反應混合物在真空中濃縮并用H2O(30mL)稀釋。用CH2Cl2(3×30mL)和EtOAc(3×30mL)萃取合并的含水層。用NaOH水溶液(2M，30mL)萃取有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮，得到無色固體29g(50mg，32％)，將其用于氧化作用。MS(電噴霧，m/z相對強度)883[(M+1)+，100]，522(30)，394(60)。
步驟G 將醇29g(50mg，60.0μmol)的CH2Cl2(2.0mL)懸浮液用Dess-Martin試劑(40mg，0.94mmol，2.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌3小時并將混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶32)純化，得到氧化產(chǎn)物29(41mg，80％)，為無色固體。MS(FAB，m/z，相對強度)881[(M+1)+，100]，825(170)，248(100)。
實施例30式30化合物的制備 將叔丁基酯29(23.0mg，26.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，2.0mL)處理并在室溫下攪拌4小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)。完成脫保護后，將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復用庚烷/CH2Cl2(4.0mL)處理，濃縮得到褐色固體30(13.0mg，100％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)825[(M+1)+，100]。
實施例31式31化合物的制備
步驟A 將酸29f(150mg，0.29mmol)在無水DMF(4.0mL)、CH2Cl2(3.0mL)中的溶液用HOBt(58mg，0.44mmol)和Hunigs base(149mg，1.1mmol，4.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(82mg，0.44mmol，1.5當量)處理，攪拌30分鐘。將該反應混合物用胺E(88mg，0.29mmol，1.22當量)處理并在室溫下攪拌12小時。將反應混合物在真空中濃縮并用H2O(30mL)稀釋。用CH2Cl2(3×30mL)萃取含水層。用HCl水溶液(1M，3×20mL)、NaOH水溶液(1M，3×20mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮，得到無色固體31a(56mg)，其用于氧化作用。MS(電噴霧，m/z相對強度)750[(M+1)+，20]，663(10)，522(10)，416(20)，247(30)。
步驟B 將醇31a(56mg，75μmol)的CH2Cl2(5.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(93mg，0.22mmol，3.0當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌4小時并將混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(SiO2，CH3OH/CH2Cl21∶19)純化，得到氧化產(chǎn)物31(34mg，60％)，為無色固體。MS(電噴霧，m/z相對強度)748[(M+1)+，35]，692(5)，279(100)。
實施例32式32化合物的制備
步驟A 將叔丁基酯31的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，4.0mL)處理并在室溫下攪拌4小時。使所述酯相對于基線消失，之后進行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)。完成脫保護后，將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復用庚烷/CH2Cl2(4.0mL)處理，濃縮得到32，為褐色固體。
實施例33式33化合物的制備
步驟A 將酸33a(4.5g，25.0mmol)在二噁烷(30mL)和苯(80mL)中的溶液用BnOH(8.0g，74mmol，3.0當量)和TsOH·H2O(713mg，3.75mmol，10mol％)處理。當用迪安-斯達克裝置分離水時，將該反應混合物在回流下加熱5小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷3∶7)純化，得到芐基酯33b，為無色油狀物(4.2g，62％)；Rf0.22(EtOAc/己烷3∶7)；13C NMR(CH3OD，75MHz，δ)175.1，158.2，139.7，130.3，129.5，129.3，121.7，117.4，114.6，73.1，67.6，41.6；MS(FAB，G/TG-DMSO，m/z，相對強度)351([M+DMSO]+，70)，273([M+1]+，100)，255(20)，227(30)，181(40)；HRMS對于C16H17O4(M+1)+的計算值272.1049；實測值272.1054。
步驟B 將芐基酯33b(3.8g，12.9mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液用Et3N(1.55g，15.4mmol，2.2mL，1.1當量)處理，冷卻至-78℃(2-PrOH，干冰)并滴加入氯甲酸烯丙基酯(1.84g，15.36mmol，1.1當量)的CH2Cl2(10mL)溶液。將該反應混合物加溫至室溫并用HCl水溶液(1M，100mL)稀釋。用EtOAc(3×100mL)萃取反應混合物。用HCl水溶液(100ml，1M)、鹽水(100mL)洗滌合并的有機層，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮得到33c，其沒有進一步純化用于下一步驟中。Rf0.43(EtOAc/Hex7∶13)；13C NMR(CH3OD，75MHz，δ)174.8，162.5，155.0，152.5，140.3，137.1，132.8，130.3，129.6，129.5，129.4，123.2，120.3，119.4，72.7，70.1，67.7，41.2，29.9。
步驟C 將Boc-環(huán)己基甘氨酸一水合物1d(6.02g，23.4mmol，2.0當量)的溶液溶于CH2Cl2中并干燥(MgSO4)。將該混合物過濾并再將殘余物與甲苯一起共沸干燥。將殘余物溶于CH2Cl2中并用HOBt(4.73g，35.1mmol，2.9當量)、EDCl(6.7g，35.1mmol，2.9當量)和Hünigs base(8.31g，64.3mmol，11mL)處理。將其在室溫下攪拌30分鐘，加入alloc保護的醇33c(4.3g，12.04mmol)。將該反應混合物在室溫下攪拌36小時并用HCl水溶液(1M，100mL)稀釋，用EtOAc(3×100mL)萃取。用NaOH水溶液(1M，100mL)、鹽水(100mL)萃取合并的有機層，干燥，在真空中濃縮并經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/Hex 1∶4)純化，得到縮肽(depsipeptide)33d(7.1g，100％)。Rf0.18(EtOAc/Hex 1∶4)；HRMS對于C28H34O7(M-Boc)+的計算值496.2335；實測值496.2333。
步驟D 將alloc-保護的縮肽33d(7.8g，13.0mmol)的無水THF(200mL)溶液在氮氣氛下用雙甲酮(3.27g，23.4mmol，2.0當量)和Pd(Ph3P)4(780mg，0.67mmol，5mol％)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時并在反應物消失后進行TLC(EtOAc/Hex 1∶4)。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶4)純化，得到酚33e(5.2g，78％)，為無色泡沫狀物。Rf0.52(EtOAc/己烷3∶7)；1H NMR(d4-CD3OD，300MHz，δ)7.4-7.19(m，5H)，7.15-6.99(m，1H)，6.68-6.55(m，4H)，5.43-5.01(m，3H)，4.6(bs，2H)，4.11-4.00(m，1H)，3.18-2.91(m，2H)，1.80-1.55(bs，6H)，1.39(s，9H)，1.21-0.89(m，6H)；13C NMR(CH3OD，75MHz，δ，非對映異構體的混合物)171.6，169.4，169.3，161.1，157.1，157.0，137.2，136.9，135.4，135.3，129.2，129.1，128.2，128.2，128.0，120.3，120.1，116.0，115.9，113.6，94.8，79.3，73.6，73.5，66.7，66.6，58.6，58.5，40.0，39.9，36.8，29.1，27.7，27.3，25.5。MS(電噴霧，m/z，相對強度)1023([2M+1]+，20)；512([M+1]+，20)，412([M-Boc]+，100)，202(40)HRMS對于C24H30NO5(M-Boc)+的計算值412.2123；實測值412.2119。
步驟E 將Boc-保護的胺33e(5.2g，10.7mmol)的溶液與HCl(4M，二噁烷，200mL，800mmol，80當量)一起攪拌直至經(jīng)TLC(EtOAc/Hex 3∶7)指示原料相對于基線消失。將該反應混合物在真空中濃縮并在高真空中干燥，殘余物33f直接用于下一步驟中。1H NMR(d4-CD3OD，300MHz，δ)7.40-3.23(m，5H)，7.07(q，1H，J＝13Hz)，6.77-6.6(m，3H)，5.33-5.41(m，1H)，5.3-5.05(2AB，2H)，3.99-3.85(m，1H)，3.35-22(m，2H)，2.00-1.5(m，5H)，1.50-0.80(m，6H)；MS(FAB，G/TG-DMSO，m/z，相對強度)412([M+1]+，100)；HRMS對于C24H30NO5M+的計算值412.2123；實測值412.2139。
步驟F
將[CpRu(η6-4-氯代苯基丙酸)]PF61c(2.0g，4.03mmol)的無水DMF(20mL)溶液用HOBt(835mg，6.0mmol，1.5當量)和Hünigs base(2.06g，2.95mL，16mmol，4.0當量)處理。將該反應混合物冷卻至0℃并用EDCl(1.15g，6.0mmol，1.5當量)處理。將該反應混合物在0℃下攪拌30分鐘。將胺鹽酸鹽加入到在無水DMF(10mL)中的33f(1.8g，4.03mmol，1.0當量)中。將該反應混合物在室溫下攪拌12小時并真空蒸餾出DMF。將殘余物用HCl水溶液(1M，100mL)稀釋并萃取到CH2Cl2(3×100mL)中。用NaHCO3水溶液(3×50mL)、鹽水(100mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮得到棕色固體33g(3.5g)，其用于環(huán)化作用。MS(電噴霧，m/z，相對強度)743[(M-PF6)+，100]，304(60)；HRMS對于C38H41NO6Cl102Ru(M-PF6)+的計算值744.1666；實測值744.1694。
步驟G 將η6-釕絡合物33g(3.5g，3.93mmol)的無水DMF(300mL)溶液用干燥的氮氣脫氣并用Cs2CO3(6.5g，19.95mmol，5.0當量)處理，在室溫下攪拌16小時。將該反應混合物在真空中濃縮以除去DMF，用H2O(100mL)稀釋殘余物。將該反應混合物用CH2Cl2(3×100mL)萃取。用鹽水萃取合并的CH2Cl2層，干燥(Na2SO4)，過濾并在真空中濃縮得到33h，其直接用于光解作用。MS(電噴霧，m/z，相對強度)708[(M-PF6)+，100]；HRMS對于C38H40NO61O2Ru(M-PF6)+的計算值708.1892；實測值708.1918。
步驟H 將環(huán)化的釕絡合物33h(3.5g，3.9mmol)的CH3CN(60mL)溶液脫氣并在石英管中在λ＝350nm下、分兩批光解，各進行48小時。將所述反應混合物集中在一起并經(jīng)層析(SiO2，CH2Cl2/Et2O 9/1)純化，得到環(huán)狀縮肽，為非對映異構體的混合物(700mg，34％)。將這些非對映異構體經(jīng)層析(己烷/CH2Cl2/Et2O 6∶3∶1)分離，得到兩種非對映異構體33i(370mg，18％)和33j(216mg，11％)，為無色固體。Rf0.28(己烷EtOAc3∶2)；[α]D＝25(c0.15，CHCl3，20℃)IR(純的，cm-1)3329(w)，2960(m)，2926(s)，2854(s)，1745(s)，1680(m)，1589(m)，1506(m)，1446(m)，1365(w)，1259(s)，1099(m)，1030(s)，800(s)，752(m)，698(w)，619(w)；1H NMR(CDCl3，300MHz，δ)7.36-7.23(m，5H)，7.18-6.99(m，4H)，6.81(d，1H，J＝7.5Hz)，6.74(dd，1H，J＝2.7，5.7Hz)，6.30(S，1H)，5.75(d，1H，J＝7.2Hz)，5.61(dd，1H，J＝2.4Hz，5.4Hz)，5.18，5.14(AB，2H，J＝12.3Hz)，4.23(dd，1H，J＝4.2Hz，3.3Hz)，3.26-3.01(m，2H)，2.98-2.85(m，2H)，2.68-2.64(m，1H)，2.38-2.34(m，1H)，1.96-1.51(m，6H)，1.51-0.96(m，5H)；13C NMR(CDCl3，75MHz，δ，ppm)177.3，171.1，168.7，159.8，155.3，138.6，135.4，134.9，131.2，129.7，129.2，128.7，126.6，126.1，123.3，120.8，120.8，117.5，114.2，71.8，57.5，56.9，41.5，39.0，35.7，32.6，31.3，29.0，27.6，26.0，25.9。FAB(NBA/DMSO，m/e，相對強度)542[(M+1)+，100]，514(15)，450(5)，307(8)，232(5)，154.1(17)，136(14)；HRMS對于C33H36NO6(M+1)+的計算值542.2543；實測值542.2541；對于C33H35NO6·0.5H2O的CHV計算值C 71.98％，H6.59％，N 2.54％；實測值C 72.56％，H 7.05％，N 2.63％。
步驟I 將芐基酯33i(360mg，0.66mmol)的CH3OH/EtOAc(1∶1，50mL)溶液用Pd(OH)2處理并氫化(50psi)12小時。將該反應混合物通過硅藻土塞過濾并將濾餅用CH3OH/CH2Cl2(1∶1，50mL)沖洗。在真空中濃縮濾液，將殘余物33k(330mg)不經(jīng)純化用于偶合作用。Rf0.58(CH3OH/CH2Cl21∶19)；MS(電噴霧，m/z，相對強度)827.2[(M+1)+，100]，694(20)，539(40)，466(10)，174(70)；HRMS對于C46H58N4O10(M+1)+的計算值827.4231；實測值827.4215。
步驟J 將酸33k(165mg，0.31mmol)在無水DMF(5.0mL)和CH2Cl2(5.0mL)中的溶液用HOBt(83mg，0.46mmol，1.5當量)處理并冷卻至0℃，加入Hünigs base(159mg，1.23mmol，4.0當量，229μL)。向該混合物中加入EDCl(89mg，0.47mmol，1.5當量)并將該反應混合物在0℃下攪拌1小時，用胺鹽酸鹽B(159mg，0.372mmol，1.2當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌48小時并在真空中濃縮以除去DMF和CH2Cl2。將殘余物用水稀釋并用CH2Cl2(3×50mL)萃取。用HCl水溶液(1M，3×50mL)、NaOH水溶液(1M，3×50mL)和鹽水(100mL)萃取合并的有機層并在真空中濃縮。不經(jīng)進一步純化而將殘余物33l氧化。
步驟K 將醇33l(330mg，0.4mmol)的CH2Cl2(5.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(424mg，1.00mmol，2.5當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時并用NaHCO3水溶液(50mL)和Na2S2O3水溶液(50mL)稀釋。將該反應混合物在室溫下攪拌20分鐘并用CH2Cl2(3×50mL)萃取反應混合物。用鹽水(50mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶1)純化，得到酮酰胺33(180mg，55％)，為無色固體。Rf0.63(CH3OH/CH2Cl21∶19)；MS(電噴霧，m/z，相對強度)857.2([M+CH3OH]+，40)，825.2([M+1]+，100)。
實施例34式34化合物的制備 步驟A 將氧化的縮肽33(160mg，0.2mmol)的無水CH2Cl2(5.0mL)溶液用TFA(5.0mL)處理并在室溫下攪拌7小時。將該反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復溶于CH3OH/CH2Cl2/己烷(1∶1∶1)中并在真空中濃縮數(shù)次，得到褐色固體34(133mg，86％)，將其在真空中干燥。MS(電噴霧，m/z，相對強度)769.2[(M+1)+，100]，481(5)，269(25)，191(90)。
實施例35式35化合物的制備 步驟A 將酸33k(165mg，0.31mmol)在無水DMF(5.0mL)和CH2Cl2(5.0mL)中的溶液用HOBt(83mg，0.46mmol，1.5當量)處理并冷卻至0℃，加入Hünigs base(159mg，1.23mmol，4.0當量，229μL)。向所述混合物中加入EDCl(89mg，0.47mmol，1.5當量)并將該反應混合物在0℃下攪拌1小時，用胺鹽酸鹽A(159mg，0.372mmol，1.2當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌48小時并在真空中濃縮以除去DMF和CH2Cl2。將殘余物用水稀釋并用CH2Cl2(3×50mL)萃取。用HCl水溶液(1M，3×50mL)、NaOH水溶液(1M，3×50mL)、鹽水(100mL)萃取合并的有機層并在真空中濃縮。不經(jīng)進一步純化將殘余物35a氧化。MS(電噴霧，m/z，相對強度)798.2[(M+1)+，30]，479(10)，391(20)，180(100)。
步驟B 將醇35a(190mg，0.24mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液用Dess-Martin試劑(423mg，1.0mmol，4.0當量)處理并在室溫下攪拌1小時。將該反應混合物用NaHCO3水溶液(50mL)稀釋并萃取到CH2Cl2(3×50mL)中。用飽和Na2S2O3水溶液、鹽水(3×50mL)萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮并經(jīng)層析(SiO2，丙酮/己烷3∶7-＞1∶1)純化，得到氧化的產(chǎn)物35(163mg，86％)，為無色固體。MS(電噴霧，m/z，相對強度)796[(M+1)+，100]，508(20)，269(20)。
實施例36式36化合物的制備 步驟A 在0℃下，將BH3·THF(1M，在THF中，100mmol，100mL，3.0當量)的溶液滴加入到烯(5.0g，35mmol)的THF(100mL)溶液中并攪拌1小時。將該反應混合物用乙醇(20mL)處理。當不再放出氫氣后，將反應混合物用pH7緩沖液(100mL)和H2O2(30體積，100mL)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌4小時并用HCl水溶液(100mL)猝滅。用Et2O(3×100mL)萃取含水層。將合并的醚層用NaOH水溶液(1M，100mL)、鹽水(100mL)萃取，干燥(MgSO4)，過濾，在真空中濃縮并經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷2/3)純化，得到為無色液體的醇(2.9g，52％)。
將羥基化酯的THF/H2O/CH3OH(100mL，1∶1∶1)溶液用LiOH·H2O(2.1g，51.2mmol，3.0當量)處理并在室溫下攪拌3天。將該反應混合物在真空中濃縮并將含水層用乙醚(2×40mL)萃取。將含水層酸化至pH～1并萃取到EtOAc(3×50mL)中。用鹽水(100mL)萃取合并的有機層，干燥(MgSO4)，過濾，在真空中濃縮并將殘余物36b用于步驟B中的偶合作用。1HNMR(300MHz，CD3OD，δ)3.53(t，2H，J＝6.6Hz)，2.72(t，2H，J＝7.2Hz)，1.59(t，2H，J＝7.5Hz)，1.5(t，2H，J＝7.5Hz)，1.38-1.33(m，6H)。
步驟B 將ω-羥基庚酸36b(1.01g，6.93mmol)的CH2Cl2(40mL)溶液用Hünigs base(1.97g，15.24mmol，2.2當量，2.81mL)和胺鹽酸鹽33f(3.1g，6.93mmol，1.0當量)處理。將所述反應混合物冷卻至0℃并用PyBrOP(3.22g，6.93mmol，1.0當量)處理。將反應混合物在室溫下攪拌過夜并將反應混合物在真空中濃縮。將殘余物經(jīng)層析(EtOAc/己烷1∶1)純化，得到縮肽36c(2.5g，66％)，為無色粘性油狀物。1H NMR(CD3OD，400MHz，δ，ppm)8.07(t，1H)，7.33-7.21(m，4H)，7.09-7.02(m，1H)，6.67-6.63(m，3H)，5.25-5.06(m，1H)，5.08(q，2H，J＝7.5Hz)，4.36-4.33(m，1H)，3.51(dd，2H，J＝5.4Hz，0.9Hz)，3.11-2.96(m，2H)，2.22-2.17(m，1H)，1.99-0.90(m，14H)。13C NMR(CD3OD，75MHz，δ，ppm，非對映異構體的混合物)172.1，172.0，171.8，171.1，170.9，169.5，169.3，157.1，157.0，137.3，137.0，135.3，135.2，129.2，129.1，128.2，128.0，127.9，120.3，120.0，116.0，115.9，113.6，94.8，73.6，73.4，66.8，66.7，60.2，57.3，39.6，36.7，28.9，28.0，25.6，20.9，19.5，13；MS(FAB，NBA DMSO，m/z，相對強度)562[(M+Na)+，20]，540[(M+1)+，100]，412(15)，240(50)，112(80)。
步驟C 在氮氣氛下，將醇36c(2.5g，4.63mmol)的無水CH2Cl2(50mL)溶液用三苯膦(2.67g，10.2mmol，2.2當量)處理并冷卻至0℃。將該反應混合物用DEAD(1.61g，9.26mmol，2.0當量)在CH2Cl2(30mL)中處理。將反應混合物加溫至室溫并攪拌2小時。將其在真空中濃縮并經(jīng)層析(Et2O/Hex 1∶3)純化得到環(huán)狀產(chǎn)物36d(530mg，21％)，為無色固體。MS(FAB，NBA，DMSO，m/z，相對強度)522[(M+1)+，100]，494(60)，268(20)，222(20)；HRMS對于C31H40NO6(M+1)+的計算值522.2856；實測值522.2864。
步驟D 將芐基酯(242mg，0.47mmol)的甲醇(30mL)溶液用Pd/C(10％重量)處理并在Parr上、40psi下氫化14小時。將該反應混合物通過硅藻土墊過濾并在真空中濃縮濾液，得到無色固體36e(181mg，93％)，其用于偶合作用。
步驟E 將水解的酸36e(167mg，0.39mmol)的CH2Cl2(4.0mL)溶液用HOOBt(95mg，0.58mmol，1.5當量)處理并冷卻至0℃，加入Hünigsbase(202mg，1.56mmol，4.0當量，288μL)。向該混合物中加入EDCl(111mg，0.58mmol，1.5當量)，將反應混合物在0℃下攪拌0.5小時，并用胺鹽酸鹽(186mg，0.47mmol，1.20當量)處理。將該反應混合物在冰箱中貯存24小時并在真空中濃縮以除去DMF和CH2Cl2。將殘余物用HCl水溶液(2M，30mL)稀釋并用CH2Cl2(3×50mL)萃取。用HCl水溶液(2M，30mL)、NaOH水溶液(1M)、鹽水(2×50mL)萃取合并的有機層，干燥(MgSO4)并在真空中濃縮。不經(jīng)進一步純化而將殘余物36f(100mg)氧化。HRMS對于C42H60N5O9(M+1)+的計算值778.4391；實測值778.4399。
步驟F 將醇36f(100mg，0.13mmol)的CH2Cl2(5.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(100mg，0.0.23mmol，1.8當量)處理。將反應混合物在室溫下攪拌2小時并用NaHCO3水溶液(15mL)和Na2S2O3水溶液(15mL)稀釋。將反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，丙酮/己烷3∶7)純化，得到酮酰胺36(61mg，61％)，為無色固體。MS(FAB，NBA/DMSO，m/z相對強度)776[(M+1)+，100]，731(10)，598(25)，570(15)，485(20)，358(20)，247(50)。
實施例37式37化合物的制備 步驟A 將芐基酯33j(230mg，0.42mmol)的CH3OH/EtOAc(1∶1，50mL)溶液用Pd(OH)2處理并氫化(50psi)12小時。將該反應混合物通過硅藻土塞過濾并將濾餅用CH3OH/CH2Cl2(1∶1，50mL)沖洗。將該反應混合物在真空中濃縮，不經(jīng)純化而將殘余物37a(177mg，93％)用于偶合作用。
步驟B 將酸37a(177mg，0.33mmol)在無水DMF(5.0mL)和CH2Cl2(5.0mL)中的溶液用HOBt(88mg，0.49mmol，1.5當量)處理并冷卻至0℃，加入Hünigs base(175mg，1.35mmol，4.0當量，251μL)。向該混合物中加入EDCl(95mg，0.49mmol，1.5當量)并將反應混合物在0℃下攪拌1小時，用胺鹽酸鹽B(170mg，0.39mmol，1.2當量)處理。將該反應混合物在室溫下攪拌48小時并在真空中濃縮以除去DMF和CH2Cl2。將殘余物用水稀釋并用CH2Cl2(3×50mL)萃取。用NaOH水溶液(1M，2×50mL)、鹽水(100mL)萃取合并的有機層并在真空中濃縮。不經(jīng)進一步純化而將殘余物37b(315mg)氧化。
步驟C 將醇37b(315mg，0.4mmol)的CH2Cl2(5.0mL)溶液用Dess-Martin試劑(424mg，1.00mmol，2.5當量)處理。將反應混合物在室溫下攪拌1小時并用NaHCO3水溶液(50mL)和Na2S2O3水溶液(50mL)稀釋。將該反應混合物在室溫下攪拌20分鐘并將反應混合物用CH2Cl2(3×50mL)萃取。用鹽水萃取合并的有機層，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷1∶1)純化，得到酮酰胺37(210mg，66％)，為無色固體。Rf0.63(CH3OH/CH2Cl21∶19)；MS(電噴霧，m/z相對強度)857([M+CH3OH]+，33)，825([M+1]+，40)，191(100)。
實施例38式38化合物的制備 步驟A 將氧化的縮肽37(200mg，0.24mmol)的無水CH2Cl2(5.0mL)溶液用TFA(5.0mL)處理并在室溫下攪拌7小時。將反應混合物在真空中濃縮并將殘余物反復溶于CH3OH/CH2Cl2/己烷(1∶1∶1)中，在真空中濃縮數(shù)次，得到褐色固體38(130mg，87％)，將其在真空中干燥。MS(電噴霧，m/z相對強度)769([M+1]+，45)，294(45)，191(100)。
實施例39式39化合物的制備 步驟A 將酸22(40mg，0.06mmol)在CH2Cl2(0.5mL)和DMF(0.5mL)中的溶液冷卻至0℃并用Me2NH·HCl(15mg，0.18mmol，3.0當量)和Hünigs base(31mg，0.24mmol，44μL，4.0當量)處理。然后將反應混合物用PyBrOP(55mg，0.12mmol，2.0當量)處理并貯存在冰箱中12小時。將該黃色反應混合物在真空中濃縮并將殘余物經(jīng)層析(SiO2，EtOAc/己烷梯度3∶2→1∶0)純化，得到不純的產(chǎn)物，將其用(丙酮/己烷1∶6)再純化一次得到二甲基酰胺39，為無色固體(14mg，35％)。MS(電噴霧，m/z相對強度)791[(M+1)+，50]，391(40)，276(50)，176(100)。
實施例40式40化合物的制備 用于固相偶合反應的一般步驟在由底部安裝有聚丙烯玻璃料的聚丙烯注射器筒構成的反應容器中進行合成。在標準固相技術下將Fmoc-保護的氨基酸偶合。在每一個反應容器中裝載100mg起始Fmoc-Sieber樹脂(大約0.035mmol)。將所述樹脂用2mL份的DMF洗滌(2次)。通過用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘除去Fmoc保護基團。用2mL份的DMF洗滌所述樹脂(4次)。用0.12mmol Fmoc-氨基酸、0.12mmolHATU和0.24mmol DIPEA在DMF(2mL)中進行偶合。振蕩2小時后，對所述反應容器進行排液并將樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)。用下面的Fmoc-氨基酸或封端基團重復偶合循環(huán)。
方案10
將Fmoc-Sieber樹脂40a(0.035mmol)用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘，隨后用2mL份的DMF洗滌(4次)。將DMF(2mL)加入到該樹脂中，隨后加入Fmoc-苯基甘氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室溫下振蕩2小時后，將所述樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)，得到結合樹脂的化合物40b。將結合樹脂的化合物40b用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘。隨后用2mL份的DMF洗滌(4次)。將DMF(2mL)加入到該樹脂中，隨后加入Fmoc-甘氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室溫下振蕩2小時后，將所述樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)得到結合樹脂的化合物40c。將結合樹脂的化合物40c用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘，隨后用2mL份的DMF洗滌(4次)。將DMF(2mL)加入到該樹脂中，隨后加入N-Fmoc-丙基異絲氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室溫下振蕩2小時后，將所述樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)得到結合樹脂的化合物40d。將結合樹脂的化合物40d用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘，隨后用2mL份的DMF洗滌(4次)。將DMF(2mL)加入到該樹脂中，隨后加入Fmoc-賴氨酸(Dde)(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室溫下振蕩2小時后，將所述樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)得到結合樹脂的化合物40e。將結合樹脂的化合物40e用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘，隨后用2mL份的DMF洗滌(4次)。將DMF(2mL)加入到該樹脂中，隨后加入Fmoc-環(huán)己基甘氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室溫下振蕩2小時后，將所述樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)得到結合樹脂的化合物40f。將結合樹脂的化合物40f用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)處理20分鐘。用2mL份的DMF洗滌所述樹脂(4次)得到結合樹脂的化合物40g。將結合樹脂的化合物40g用2mL份肼的DMF溶液(2％v/v)處理5分鐘(3次)。將該樹脂用2mL份的DMF洗滌(4次)得到結合樹脂的化合物40h。在室溫下將結合樹脂的化合物40h用在2mL DMF中的0.035mmol戊二酸、0.07mmolHATU和0.14mmol DIPEA處理16小時。將該樹脂用2mL份的DMF(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗滌得到結合樹脂的化合物40i。在室溫下將結合樹脂的化合物40i用0.14mmol Dess-Martin periodinane和0.14mmol t-BuOH在2mL DCM中的溶液處理4小時。將該樹脂用2mL份iPrOH在DCM中的溶液(20％v/v)、THF、THF的水溶液(50％v/v)(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗滌得到結合樹脂的化合物40j。將結合樹脂的化合物40j用4mL TFA的DCM溶液(2％v/v)處理5分鐘。將濾液加入到1mL的AcOH中并將該溶液經(jīng)真空離心濃縮，得到化合物40(0.0117g，產(chǎn)率48％)。MS(LCMS-電噴霧)698.2MH+。
實施例41-53式41-53化合物的制備 使用與實施例40的合成所示相似的固相法，合成化合物41-53。
實施例54式54化合物的制備 步驟A 向攪拌的Boc-環(huán)己基甘氨酸-OH(2.33g，9.07mmol)在DMF(20mL)和CH2Cl2(20mL)中的溶液中加入HOBT(1.48g，9.07mmol)、EDCl(1.91g，9.97mmol)和NMM(2.99mL，27.2mmol)。將該溶液在-20℃下攪拌10分鐘，隨后加入H-Lys(Z)-OMe·HCl并在-20℃下攪拌半小時，保存在冰箱中過夜。然后將該溶液濃縮至干燥，之后用EtOAc、飽和NaHCO3萃取。用H2O、鹽水洗滌合并的有機層，經(jīng)Na2SO4干燥并濃縮至干燥，得到白色固體(4.83g，MH+＝534.1)。
步驟B 向攪拌的54b(4.86g，8.76mmol)在MeOH(10mL)和H2O(7mL)中的溶液中加入LiOH(70mg，11.4mmol)。形成白色沉淀并將該溶液在室溫下攪拌過夜，然后濃縮至干燥。然后將該粗制物分配在CH2Cl2和水之間。分離有機層并用鹽水洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干燥，得到54c(4.55g，MH+＝520.1)。
步驟C 在-20℃下，向攪拌的54c(4.3g，8.27mmol)在DMF(40mL)和CH2Cl2(40mL)中的冷溶液中加入HOBT(1.35g，8.27mmol)、EDCl(1.74g，9.1mmol)和MM(2.73mL，8.27mmol)。將得到的溶液在-20℃下攪拌10分鐘，隨后加入胺G(2.32g，8.27mmol)并在-20℃下攪拌半小時，保存在冰箱中過夜。按照步驟A的后處理步驟得到54d(6.21g，MH+＝746.2)。
步驟D 將54d(6.16g，8.26mmol)的4N HCl/二噁烷(40mL)溶液在室溫下攪拌1小時并濃縮至干燥，得到粗制產(chǎn)物54e(5.70g，產(chǎn)率100％，MH+＝646.3)。
步驟E 在-20℃下，向攪拌的Boc-Glu(OBn)-OH在DMF(25mL)和CH2Cl2(25mL)中的冷溶液中加入HOBT(1.29g，7.92mmol)、EDCl(1.66g，8.71mmol)和NMM(2.61mL，23.7mmol)。將得到的溶液在-20℃下攪拌10分鐘，隨后加入54e(5.4g，7.916mmol)并在-20℃下攪拌半小時，保存在冰箱中過夜。按照步驟A的后處理步驟得到粗制產(chǎn)物(7.14g，產(chǎn)率93.5％)。
步驟F 向攪拌的54f(6.9g，7.15mmol)的無水EtOH(350mL)溶液中加入在50％H2O(w/w)中的10％Pd/C(2.8g)。將得到的溶液用H2凈化并在H2氛下攪拌過夜。然后將該溶液通過硅藻土過濾并用EtOH/CH2Cl2洗滌濾液，然后濃縮至干燥，得到白色固體(1.44g)。將該固體用25％H2O/MeOH洗滌并過濾通過燒結的漏斗，然后冷凍并凍干得到54g(4.12g，產(chǎn)率77.5％，MH+＝743.2)。
步驟G 在-20℃下，向攪拌的54g(0.5g，6.7mmol)在DMF(50mL)和CH2Cl2(50mL)中的冷溶液中加入HOBT(0.219g，1.34mmol)、EDCl(0.271g，1.41mmol)和NMM(0.296mL，2.69mmol)。將得到的溶液在-20℃下攪拌25分鐘，然后保存在冰箱中過夜。將該溶液濃縮至干燥，隨后用EtOAc、飽和NaHCO3萃取。然后將合并的有機層濃縮至干燥，得到54h(254mg，MH+＝725.2)。
步驟H
向攪拌的54h(0.2g，0.27mmol)的無水CH2Cl2(20mL)溶液中加入Dess-Martin periodinane(0.234g，0.55mmol)。將得到的溶液在室溫下攪拌1小時。用半小時向該溶液中滴加入H2O(0.010mL)的CH2Cl2(20mL)溶液并再劇烈攪拌2小時。然后將該溶液與50％Na2S2O3/50％飽和NaHCO3一起攪拌半小時。分離有機層并用水、鹽水洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干燥并在硅膠上經(jīng)柱層析純化，用10％MeOH/CH2Cl2洗脫，得到54(17mg，62％，MH+＝723.2)。HCV蛋白酶抑制活性試驗分光光度試驗按照由R.Zhang等，Analytical Biochemistry，270(1999)268-275描述的方法(其公開通過引用結合到本文中)，對本發(fā)明化合物進行HCV絲氨酸蛋白酶的分光光度試驗?；陲@色酯底物的蛋白酶解試驗適用于HCV NS3蛋白酶活性的連續(xù)監(jiān)測。底物衍生于NS5A-NS5B接合序列(Ac-DTEDVVX(Nva)，其中X＝A或者P)的P側，其C-末端羧基用4種不同的顯色醇(3-或4-硝基苯酚、7-羥基-4-甲基香豆素或4-苯基偶氮苯酚)中的一種酯化。下面提出這些新的分光光度酯底物的合成、表征以及應用于高通量篩選和HCV NS3蛋白酶抑制劑的詳細的動力學評價。材料與方法材料用于與試驗有關的緩沖液的化學試劑得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。用于肽合成的試劑得自AldrichChemicals，Novabiochem(San Diego，California)、Applied Biosystems(Foster City，California)和Perseptive Biosystems(Framingham，Massachusetts)。肽由人工合成或者在型號431A的自動ABI合成儀(得自Applied Biosystems)上合成。型號LAMBDA 12的UV/VIS分光計得自Perkin Elmer(Norwalk，Connecticut)和96孔UV板得自Corning(Corning，New York)。預溫熱封閉劑得自USA Scientific(Ocala，F(xiàn)lorida)和96孔板旋渦儀得自Labline Instruments(Melrose Park，lllinois)。具有單色光源的Spectramax Plus微量滴定板讀數(shù)器得自Molecular Devices(Sunnyvale，California)。酶制備通過采用先前公開的方法(D.L.Sali等，Biochemistry，37(1998)3392-3401)制備重組異源二聚體(heterodimeric)的HCV NS3/NS4A蛋白酶(株1a)。使用先前經(jīng)氨基酸分析定量的重組HCV蛋白酶標準物，通過Biorad染色法測定蛋白濃度。試驗開始前，采用Biorad Bio-SpinP-6預裝柱，將酶儲備緩沖液(50mM磷酸鈉pH8.0，300mM NaCl，10％甘油，0.05％十二烷基麥芽糖苷和10mM DTT)交換為試驗緩沖液(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％十二烷基麥芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)。底物合成和純化如由R.Zhang等(出處同上)報道的那樣進行底物的合成并且使用標準方法(K.Barlos等，Int.J.Pept.Protein Res.，37(1991)，513-520)，通過將Fmoc-Nva-OH固定到2-氯三苯甲基氯樹脂上啟動。隨后，或者人工或者在型號431的自動ABI肽合成儀上，采用Fmoc化學裝配肽?；蛘咄ㄟ^在二氯甲烷(DCM)中的10％乙酸(HOAc)和10％三氟乙醇(TFE)30分鐘，或者通過在DCM中的2％三氟乙酸(TFA)10分鐘，自樹脂裂解N-乙?；统浞直Ｗo的肽片段。共沸蒸發(fā)(或者經(jīng)Na2CO3水溶液反復提取)合并的濾液和DCM洗液，除去在裂解中所用的酸。經(jīng)Na2SO4干燥DCM相并且蒸發(fā)。
采用標準酸-醇偶合方法(K.Holmber等，Acta Chem.Scand.，B33(1979)，410-412)裝配酯底物。將肽片段溶于無水吡啶(30-60mg/ml)中，向其中加入10摩爾等價物的發(fā)色團和催化量(0.1eq.)的對甲苯磺酸(pTSA)。加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，3eq.)以啟動偶合反應。經(jīng)HPLC監(jiān)測產(chǎn)物形成并發(fā)現(xiàn)反應在室溫下12-72小時后完成。真空蒸發(fā)吡啶溶劑并經(jīng)用甲苯共沸蒸發(fā)進一步除去。用95％在DCM中的TFA將肽酯脫保護2小時并用無水乙醚提取3次以除去過量的發(fā)色團。經(jīng)反相HPLC在C3或C8柱上純化脫保護的底物，用30％-60％乙腈(使用6個柱體積)梯度洗脫。HPLC純化后總收率為約20-30％。經(jīng)電噴霧離子質譜證實分子量。在干燥下，以干燥粉末形式貯存底物。底物和產(chǎn)物的波譜在pH6.5的試驗緩沖液中得到底物和相應顯色團產(chǎn)物的波譜。采用多倍稀釋，在最佳脫峰波長下，1-cm比色杯(340nm對3-Np和HMC，370nm對PAP和400nm對4-Np)中測定消光系數(shù)。最佳脫峰波長定義為在底物與產(chǎn)物之間產(chǎn)生吸收度最大相對差異的波長(產(chǎn)物OD-底物OD/底物OD)。蛋白酶試驗在96孔微量滴定板中，采用200μl反應混合物在30℃下進行HCV蛋白酶試驗。使試驗緩沖液條件(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％十二烷基麥芽糖苷、5μM EDTA和5μM DTT)對NS3/NS4A異源二聚體最佳化(D.L. Sali等，出處同上)。通常，將150μl緩沖液、底物和抑制劑的混合物加入到各孔(DMSO最終濃度，4％v/v)中并且在30℃下預孵育約3分鐘。然后將50μl在試驗緩沖液中預溫熱的蛋白酶(12nM，30℃)用于啟動所述反應(最終體積200μl)。采用配有單色光源的Spectromax Plus微量滴定板讀數(shù)器(通過利用截斷濾膜的板讀數(shù)器可得到可以接受的結果)，在試驗全程(60分鐘)監(jiān)測板在合適的波長(對于3-Np和HMC為340nm，對于PAP為370nm，對于4-Np為400nm)下吸光度的變化。在合適的波長下監(jiān)測Nva與發(fā)色團之間的酯鍵的蛋白酶剪切，相對于作為非酶促水解的對照的無酶空白。于30倍底物濃度范圍(～6-200μM)內進行底物動力學參數(shù)的評價。采用線性回歸測定最初速度，并且采用非線性回歸分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)，通過將數(shù)據(jù)擬合到Michaelis-Menten方程式中獲得動力學常數(shù)。假設酶完全活化，以計算轉化數(shù)(Kcat)。抑制劑和滅活劑的評價按照競爭抑制作用動力學的重排Michaelis-Menten方程式vo/vi＝1+[l]o/(Ki(1+[S]o/Km))(其中vo為未抑制的初始速度，vi為在任何給出的抑制劑濃度([l]o)下，在抑制劑存在下的初始速度，且[S]o為所使用的底物濃度)，通過vo/vi對抑制劑濃度([l]o)作圖，在固定的酶和底物的濃度下，可實驗測定競爭性抑制劑Ac-D-(D-Gla)-L-1-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH的抑制常數(shù)(Ki)。采用線性回歸擬合所得數(shù)據(jù)，并將所得到的斜率1/(Ki(1+[S]o/Km)用于計算Ki值。
在以上提及的表1中給出了所得到的本發(fā)明各大環(huán)化合物的Ki值，其中按Ki值的范圍的順序排列化合物。從這些試驗結果，技術人員應該意識到本發(fā)明化合物作為NS3-絲氨酸蛋白酶抑制劑具有優(yōu)良的用途。細胞生物測定方法按照由S.Agrawal等，“Development andCharacterization of Hepatitis C Virus Serine Protease Cell-based Trans-Cleavage Assay”(丙型肝炎病毒絲氨酸蛋白酶細胞-基反式切割測定法的開發(fā)和鑒定)，Hepatology Supplement to Volume 30(No.4，第2部分，1999年10月)，Abstract No.615(Proceedings of AASLD 50thAnnualMeeting，Dallas，Texas，1999年11月5-9日)(其公開通過引用結合到本文中)描述的方法，對本發(fā)明化合物進行HCV絲氨酸蛋白酶的細胞生物測定。在用質粒(表達包含NS5A/5B切割識別序列的報道蛋白底物)和1BNS4A21-32GS-GSNS3-81117K表達載體以及作為控制細胞毒性的內標蛋白的YFPn1共轉染的Hela/Huh7細胞中進行所述測定。通過全細胞溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE隨后通過采用針對報道底物的單克隆抗體的蛋白質印跡檢測，測量蛋白酶活性。通過在磷光成像儀上掃描免疫印跡進行底物切割的定量。材料質粒DNAspBFP-5A/5B-GFP表達所述底物的報道基因編碼融合蛋白，后者包括被衍生于NS5A/5B切割識別序列的25個氨基酸分開的N’末端藍色熒光蛋白(BFP)結構域和C’末端綠色熒光蛋白(GFP)結構域。當經(jīng)合適波長的UV光激發(fā)時，GFP和BFP均為分別發(fā)射綠光或藍光的基本上均勻的自動熒光蛋白。在GFP的發(fā)色團中的四個氨基酸取代改變發(fā)射波長并把蛋白轉變?yōu)锽FP。
采用識別兩種蛋白的單克隆抗體，通過免疫學方法在細胞溶胞產(chǎn)物中可檢測底物和得到的GFP和BFP產(chǎn)物。
BFP-5A/5B-GFP報道基因包含BFP和GFP自動熒光蛋白編碼序列(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal，Canada)，所述序列被NS5A/5B切割識別序列分開，在pQB125克隆載體(QuantumBiotechnologies，Inc.)的NheI和BamHI限制性內切核酸酶位點之間被克隆。融合蛋白的表達處于CMVIE啟動子-增強子的控制下。載體的牛生長激素p(A)序列向mRNA提供多腺苷酸化信號。NS5A/5B切割序列為SSGADTEDVVCCSMSYTWTGALVTP。用DNA測序來證實克隆。P1B0021bNS4A21-32GS-GS NS3-81l17K將亞型1b蛋白酶克隆為在載體pClneo中的CMV啟動子后的Xba1/Not1片段。YFPn1YFPn1購自CLONTECH(Palo Alto，California)。將第三種質粒加入到轉染提供控制細胞毒性的內標蛋白且不影響蛋白酶切割的百分率。
在合適的抗生物素選擇下，于LB培養(yǎng)基中，在DH5α細胞(得自Life Technologies)中維持和繁殖質粒DNAs，并且采用QIAfilter PlasmidKits(Qiagen，Valencia，California)純化。細胞培養(yǎng)在補充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和100u/ml青霉素-鏈霉素(BioWhitaker)、2％NaHCO3的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基(EMEM；BioWhittaker，Walkersville，Maryland)中維持和繁殖Hela細胞。在補充有10％胎牛血清(FCS)、100u/ml青霉素-鏈霉素(BioWhitaker)和5ml NEAA(100x；BioWhittaker)/L的Dulbecco改進的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM；BioWhittaker)中維持和繁殖Huh7細胞。SOP方法轉染前一天以6×104細胞/孔的密度將Hela細胞接種在24孔板(Falcon 3047板)中并于37℃下在5％CO2孵育器中生長過夜。轉染當天將質粒DNAs在不含有核酸酶的水中稀釋至最終濃度0.05μg/μl(Promega，Madison，Wisconsin，分類號P119C)。合并0.75μgBFP-5A/5B-GFP并與0.175μg P1B002(0.23X)和0.02μg的YFPn1混合。用不含有FBS、谷氨酰胺和抗生素的EMEM使DNAs的最終體積達到60μl。按5μl體積/μg總DNA的比例加入SuperFectReagent(Qiagen，目錄號301305)，并在室溫下將混合物渦旋約10秒鐘且孵育10分鐘以形成復合物。
當形成復合物時，吸出細胞培養(yǎng)板中的生長培養(yǎng)基，并用1ml不含有Ca2+、Mg2+的PBS(BioWhitaker)洗滌細胞1次。將350μlEMEM(補充有合適的補充物-完全培養(yǎng)基)加入到包含轉染復合物的試管中并將混合物上下吸打2-3次。將全部體積轉移至24孔培養(yǎng)板的一個孔中。在37℃下和5％CO2中，將Hela細胞與轉染復合物孵育約3小時。通過吸出從細胞中除去包含轉染復合物的培養(yǎng)基。
在約1ml PBS中洗滌細胞一次，將PBS吸出，加入495μl完全EMEM隨后加入5μl化合物/孔。在37℃下和5％CO2中，將細胞孵育22-24hr。細胞溶胞產(chǎn)物的制備自每孔吸出培養(yǎng)基并用DPBS洗滌1次。將細胞收獲在100μl的1x Tris-SDS-BME樣品緩沖液(OWL分離系統(tǒng)，Portsmouth，NewHampshire，編號ER33)中，并且轉移至微量離心管中。然后，將其煮沸3-5分鐘以裂解細胞。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上以10μl/孔進行加樣。在10cm×10cm 12.5％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Owl Scientific，編號OG-0125B)上，在tris-甘氨酸-SDS緩沖液(Owl Scientific)中，于30mamp下經(jīng)電泳將溶胞產(chǎn)物分離。使用前，將PVDF膜(Immobilon-P；.45μm孔徑；Millipore，Bedford，Massachusetts)在100％甲醇中浸泡10秒鐘，然后將印跡置于蒸餾水中。采用半-干燥電印跡儀在每塊凝膠108mamp下90分鐘將蛋白轉移至PVDF濾膜(0.45μm，Millipore)。經(jīng)ECF蛋白質印跡的蛋白的檢測(Amersham Pharmacia Biotech，LittleChalfont，England)，目錄號RPN5780)。在冰箱中，于2-4℃下，通過在～10ml的包含0.05％吐溫20、pH7.4的PBS(Sigma Chemicals，St.Louis，Missouri，目錄號3563)中的5％封閉劑(得自試劑盒)，將PVDF濾膜封閉過夜。次日，用包含0.05％吐溫20的TPBS洗滌緩沖液短暫沖洗膜兩次，然后在包含0.05％吐溫20、pH7.4的PBS中洗滌三次，每次5分鐘。在包含0.05％吐溫20、pH7.4的PBS中，將膜在12ml抗-GFP單克隆抗體的1∶3000稀釋液中孵育30分鐘(Clontech，Palo Alto，California)，而在同時加入1％BSA(牛白蛋白，得自Sigma的目錄號A-2153)以減少背景。用TPBS短暫洗滌膜兩次，然后在TPBS洗滌緩沖液中洗滌三次，每次5分鐘。將膜在12ml在TPBS中的1∶600稀釋抗熒光素-連接的抗小鼠Ig中孵育30分鐘。用TPBS短暫洗滌膜兩次，然后在TPBS洗滌緩沖液洗滌三次，5分鐘。為用ECF底物放大信號，將膜在10ml的1∶2500抗熒光素堿性磷酸酶綴合物中孵育30分鐘。用TPBS短暫沖洗膜兩次，然后在TPBS洗滌緩沖液中沖洗三次，5分鐘。按照制造商的說明書(等分試樣和冷凍)，制備ECF底物溶液，將膜孵育2-3分鐘，排出過量的試劑，然后用濾紙吸干，風干9-10分鐘，然后掃描。掃描膜將印跡放在Storm 860磷光成像儀的玻璃上。設立藍色化學發(fā)光，200像素大小，700PMT電壓。在ImageQuant中打開文件并通過產(chǎn)生圍繞代表底物(S)、產(chǎn)物(P)和內部對照物(IC)的條帶的正方形定量化。底物的切割百分率可作為P/(S+P)×100測量。與包括在每個印跡上的藥物對照品的重復試驗相比，測量由藥物引起的切割的抑制作用。在Excel中建立報告。一些化合物的結果如下實施例36的化合物EC50＝9μm實施例35的化合物EC50＝20μm根據(jù)這些試驗結果，本領域技術人員應該意識到本發(fā)明化合物作為NS3-絲氨酸蛋白酶抑制劑具有優(yōu)良的用途。
權利要求
1.一種大環(huán)化合物，包括所述化合物的對映異構體、立體異構體、旋轉異構體和互變異構體以及具有式I所示通用結構的所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物 式I其中E、X和Y可以獨立存在或不存在，如果存在則獨立選自以下部分烷基、芳基、烷基-芳基、雜烷基、雜芳基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、芳基醚、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、芳基砜、烷基-烷基亞砜、烷基-芳基亞砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基-芳基磺酰胺、芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、氨基甲酸芳基酯、烷基酰肼、烷基-芳基酰肼、烷基羥酰胺、烷基-芳基羥酰胺、烷基磺酰基、芳基磺?；㈦s烷基磺?；㈦s芳基磺?；?、烷基羰基、芳基羰基、雜烷基羰基、雜芳基羰基、烷氧羰基、芳氧羰基、雜芳氧羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基或它們的組合，條件是E、X和Y還可以任選由下述部分取代芳族、烷基、烷基-芳基、雜烷基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基胺、烷基-芳基胺、烷基-芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、鹵素、羥基氨基、肼基甲酸烷基酯、肼基甲酸芳基酯；R1＝COR5或B(OR)2，其中R5＝H、OH、OR8、NR9N10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6、COR7，其中R7＝H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10獨立選自H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’獨立選自H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基和雜芳烷基；Z選自O、N或CH；W可以存在或不存在，并且如果W存在，則W選自C＝O、C＝S、SO2或C＝NR；Q是(NR)P、O、S、CH2、CHR、CRR’或朝向V的雙鍵；A是O、CH2、(CHR)P、(CHR-CHR’)P、(CRR’)P、NR、S、SO2、C＝O或鍵；G是(CH2)P、(CHR)P、(CRR’)P、NR、O、S、SO2、S(O)2NH、C＝O或朝向E或V的雙鍵；V是CH、CR或N；p是數(shù)字0-6；和R、R’、R2、R3和R4獨立選自H；C1-C10烷基；C2-C10鏈烯基；C3-C8環(huán)烷基；C3-C8雜環(huán)烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；雜芳基；烷基-芳基；烷基雜芳基；(環(huán)烷基)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基，其中所述環(huán)烷基由3-8個碳原子、0-6個氧原子、氮原子、硫原子或磷原子組成，所述烷基由1-6個碳原子組成；所述烷基、雜烷基、鏈烯基、雜鏈烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基部分可以任選被取代，所述術語“被取代”指由一個或多個選自下述的部分任選和合適取代烷基、鏈烯基、炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、鹵素、羥基、硫代、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、磺酰胺、亞砜、砜、磺酰脲、酰肼、異羥肟酸酯和硫脲。
2.權利要求1的化合物，其中R1＝COR5并且R5是H、OH、COOR8或者CONR9R10。
3.權利要求2的化合物，其中R1＝COCONR9R10并且R9是H，R10是H、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)。
4.權利要求3的化合物，其中R10＝CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’是H或烷基，R2’選自苯基、取代的苯基、雜原子取代的苯基、苯硫基、環(huán)己基、環(huán)戊基、環(huán)丙基、哌啶基、吡啶基和2-茚滿基。
5.權利要求4的化合物，其中R1’是H。
6.權利要求5的化合物，其中R2’＝苯基、苯硫基、環(huán)己基、2-茚滿基、環(huán)戊基、吡啶基、苯基(4-HNSO2NH2)，R11是H或叔丁基，R12和R13是甲基，R’是羥基甲基或叔丁氧基甲基。
7.權利要求1的化合物，其中R2選自以下部分
8.權利要求7的化合物，其中R1＝COR5，R5是H、OH、COOR8或CONR9R10。
9.權利要求8的化合物，其中V是CH。
10.權利要求9的化合物，其中Q是NR或O。
11.權利要求10的化合物，其中G是CH2。
12.權利要求11的化合物，其中A是O、NR、CH＝CH或CH2。
13.權利要求12的化合物，其中E是烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷基、芳基或環(huán)烷基。
14.權利要求13的化合物，其中E選自以下部分
15.權利要求14的化合物，其中R3選自以下部分 其中R30＝H、CH3或其它烷基；R31＝OH、O-烷基、NH2、N-烷基；和R32和R33可以相同或不同，并獨立選自H、F、Cl、Br和CH3。
16.權利要求15的化合物，其中Z＝N，R4＝H。
17.權利要求16的化合物，其中W是C＝O。
18.權利要求17的化合物，其中X-Y部分選自C1-C10烷基、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、芳基烷基、芳基、雜芳基和烷基芳基。
19.權利要求18的化合物，其中 其中Rb直接連接到A并且Rc直接連接到W；所述部分U1、U2、U3、U4、U5和U6形成六元碳環(huán)或者帶有一個或多個雜原子的五元或六元環(huán)；Ra＝H、烷基、烷氧基、羥基、烷硫基、鹵素、硝基、氰基、羧酸、酯、酰胺、氨基、腈或CF3；Rb是鍵、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C2-C6炔基、O、S、SO2、NH、O(烷基)、S(烷基)、SO2(烷基)或N(烷基)；和Rc是鍵、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C2-C6炔基、O、S、SO2、NH、O(烷基)、S(烷基)、SO2(烷基)、N(烷基)或者CH2連接到芳環(huán)的CH2-N(烷基)。
20.權利要求18的化合物，其中所述X-Y部分選自以下結構
21.一種包括作為活性成分的權利要求1化合物的藥用組合物。
22.權利要求21的藥用組合物在治療與丙型肝炎病毒有關的疾病中的用途。
23.權利要求21的藥用組合物，它還包括藥學上可接受的載體。
24.一種治療與HCV蛋白酶有關的疾病的方法，所述方法包括給予需要此治療的患者一種藥用組合物，該組合物包括治療有效量的權利要求1的化合物。
25.權利要求1的化合物在生產(chǎn)治療與HCV蛋白酶有關疾病的藥物中的用途。
26.一種制備用于治療與HCV蛋白酶有關疾病的藥用組合物的方法，所述方法包括使權利要求1的化合物和藥學上可接受的載體密切接觸。
27.一種表現(xiàn)出HCV蛋白酶抑制活性的化合物，包括所述化合物的對映異構體、立體異構體、旋轉異構體和互變異構體，以及所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物，所述化合物選自具有下示結構的化合物
28.一種用于治療與HCV蛋白酶有關疾病的藥用組合物，所述組合物包括治療有效量的一種或多種權利要求27的化合物和藥學上可接受的載體。
29.權利要求28的藥用組合物，它還含有抗病毒劑。
30.權利要求28或29的藥用組合物，還另外含有干擾素。
31.權利要求30的藥用組合物，其中所述抗病毒劑是利巴韋林，所述干擾素是α-干擾素。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的具有HCV蛋白酶抑制活性的大環(huán)化合物以及制備這些化合物的方法。在另一實施方案中，本發(fā)明公開了包括所述大環(huán)化合物的藥用組合物以及使用它們治療與HCV蛋白酶有關疾病的方法。
文檔編號A61P31/14GK1432022SQ01810566
公開日2003年7月23日 申請日期2001年4月17日 優(yōu)先權日2000年4月19日
發(fā)明者S·文卡特拉曼, K·X·陳, A·阿拉薩潘, F·G·恩約羅格, V·M·基里亞瓦拉布漢, 覃天佑, B·A·麥克基特里克, A·J·普倫蓋, V·S·馬迪森 申請人:先靈公司