專利名稱：采用抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域并針對治療或預(yù)防癌癥尤其是前列腺癌和胰腺癌的方法。本發(fā)明還涉及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白領(lǐng)域，以及抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑如抗體在治療或預(yù)防癌癥和/或疼痛中的應(yīng)用。
人們普遍認為NT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)細胞的生長、分化和生存中起關(guān)鍵作用。但是近來有證據(jù)表明NT也對神經(jīng)系統(tǒng)外的腫瘤生物發(fā)揮作用。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白及其受體亞型與多種癌癥有關(guān)，包括前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺瘤、結(jié)腸癌和肺癌以及惡性黑色素瘤、胰腺類癌和成膠質(zhì)細胞瘤。具體而言，胰管腺瘤(PDAC)中已發(fā)現(xiàn)trk受體A、B和C的異常表達，并且NT可影響該腫瘤類型的侵入(Miknyoczki等，Int.J.Cancer，1999，81，417)。此外，NGF已與圍神經(jīng)的侵入和與PDAC相關(guān)的疼痛相關(guān)(Zhu等，J.Clin.Oncol.，1999，17，2419)。TrkA也已知在前列腺上皮組織中表達，對應(yīng)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白NGF參與到刺激前列腺癌生長。對NGF的免疫反應(yīng)性已顯示在人前列腺癌中(De Schryver-Kecskemeti等，Arch.Pathol.，1987，111，833)以及腫瘤衍生的細胞系中(MacGrogan等，J.Neurochem.，1992，59，1381)，這提示NGF在此類癌細胞中可能具有促有絲分裂或存活作用。另外，前列腺癌細胞在體外對NGF的應(yīng)答中已顯示具有趨化性(Diakiew等，Cancer Res.，1993，53，1416)和侵入性(Geldof等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1997，123，107)。
Trk已顯示既在前列腺癌中發(fā)揮作用(Delsite等，J.Androl.，1996，17，481，Pflug等，Endocrinology，1995，136，262，Pflug等，Cancer Res.，1992，52，5403，Djakiew等，Cancer Res.，1991，51，3304，Passaniti等，Int.J.Cancer，1992，51，318，MacGrogan等，J.Neurochem.，1992，59，1381，Geldof等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1997，123，107，Pflug等，Mol.Carcin.，1998，12，106以及George等，The Prostrate，1998，36，172)，又在胰腺癌中發(fā)揮作用(Oikawa等，Int.J.Pancreat.，1995，18，15，Ohta等，J.Pathol.，1997，181，405，Miralles等，J.Endocrinology，1998，156，431以及Miknyoczki等，Crit.Rev.Oncogenesis，1996，7，89)。
由于trk活性在某些癌癥發(fā)生和發(fā)展中的可能作用，對NT-trk軸的選擇性破壞已經(jīng)成為靶子，作為可能的治療手段。具體而言，小分子已開發(fā)出來，并經(jīng)測試具有抑制trk受體的能力(Ruggeri等，CurrentMedicinal Chemistry，1999，6，845)。已知糖基化的吲哚咔唑生物堿K-252a和K-252b可抑制NGF和其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的生物作用。有報道，K-252a在nM濃度下特異性地抑制trkA、trkB和trkC以及其他相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的自磷酸化(Hashimoto，Cell Biol.，1988，107，1531；Berg等，J.Biol.Chem.，1992，267，13；Tarpley等，Oncogene，1992，7，371；Ohmichi等，Biochemistry，1992，31，4034；Muroya等，Biochim.Biophys.Acta.，1992，1135，353以及Nye等，Mol.Biol.Cell，1992，3，677)，通過對K-252a糖部分的修飾已開發(fā)出另兩個強的trk抑制劑。具體而言，已發(fā)現(xiàn)K-252a的羥甲基衍生物CEP-751是trkA(ELISA分析中IC50為3nM)、trkB和trkC的強抑制劑。還合成了二肽衍生物CEP-2563，其顯示相似的活性和改進的水溶解性。同樣發(fā)現(xiàn)另一個相關(guān)化合物CEP-701具有良好的trkA抑制活性，其IC50為4nM。在臨床前模型中CEP-751和CEP-701已顯示可顯著抑制人和大鼠前列腺癌(Dionne等，Clin.Cancer Res.，1998，4，1887以及George等，CancerResearch，1999，59，2395)。CEP-751在成神經(jīng)細胞瘤和成髓細胞瘤異種移植模型(Evans等，Clin.Cancer Research，1999，5，3594)以及在卵巢癌和黑素瘤模型中也表現(xiàn)出抗腫瘤活性。進一步，CEP-701在人胰管腺瘤的臨床前異種移植模型中已顯示顯著的抗腫瘤活性(Miknyoczki等，Clin.Cancer Res.，1999，5，2205)。CEP-701現(xiàn)正進行人的臨床試驗。
盡管這些小分子trk抑制劑能用作前列腺癌、胰腺癌和其他癌癥的治療工具，但是對特定靶分子開發(fā)具有特異性的小分子則是困難的。一般而言，對小分子的一種主要擔憂是對靶受體或靶通道的非特異性，導(dǎo)致對其他受體非需要的活化或失活以及可能的毒性。例如，K-252a已顯示具有多種生化特性，包括與trk組合的趨向神經(jīng)活性和蛋白激酶C抑制活性(Kaneko等，J.Med.Chem.，1997，40，1863)。因此，涉及trk受體活性的對生物靶具有高特異性的治療劑，是用于治療前列腺癌、胰腺癌和其他癌癥的理想的潛在藥物候選物。為此目的，針對特定trk受體的抗體已顯示比小分子更不理想(LeSauteur等，NatureBiotech.，1996，14，1120)。本發(fā)明通過給哺乳動物施用至少一種中和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體，提供了trk受體-介導(dǎo)的癌癥如胰腺癌或前列腺癌的治療方法。該抗體治療提供了許多小分子的確不能給予的所需的特異性。
在優(yōu)選的實施方案中，治療或預(yù)防癌癥的方法包括將治療有效量的至少一種中和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體傳遞給前列腺瘤或胰腺瘤，所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白如NGF、BDNF、NT-3和NT-4/5。
本發(fā)明的另一方面是針對減少前列腺瘤或胰腺瘤體積的方法，其包括將所述腫瘤與至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑接觸。
本發(fā)明的進一步方面是針對降低前列腺瘤或胰腺瘤生長速率的方法，其包括將所述腫瘤與至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑接觸。
本發(fā)明的另一方面是針對減少疼痛的方法，其包括給哺乳動物施用至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑。
本發(fā)明全文進行了各種定義。大多數(shù)詞屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員共知的意思。本發(fā)明下文或其他地方具體定義的詞具有本發(fā)明作為一個整體上下文所提供的意思，以及本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員通常所理解的意思。
如本發(fā)明所用，短語“抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑”意思是指防止神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的合成或減少其合成量的任何分子，或者抑制或減少神經(jīng)營養(yǎng)蛋白生物活性的任何分子?？股窠?jīng)營養(yǎng)蛋白劑的優(yōu)選例子包括但不限于抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體、針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子、結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子或者結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的trk受體的顯性失活突變。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“癌”意思是指生物體中任何組織中的無休止生長的贅生物。所述癌一般認為是惡性的或可能變成惡性的，具有潛在的侵入性或可能轉(zhuǎn)移到新的位點的特征。本發(fā)明優(yōu)選適用于為那些與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白表達相關(guān)的癌癥，包括但不限于前列腺癌和胰腺癌。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“腫瘤”意思是指從現(xiàn)成組織中出現(xiàn)的生長，與其正常組織比較，生長速率異常，而且沒有正常的生理功能。該生長可能是惡性的，也可能是良性的，但經(jīng)常與癌癥或癌變前的狀態(tài)相關(guān)或是其指征。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“哺乳動物”指人及非人類的正承受、以前承受或有癥狀顯示即將承受癌癥折磨的生命體。
如本發(fā)明所用，短語“治療有效量”意思是指抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑，如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的量，該量適用于本發(fā)明的實施方案，依據(jù)所需的治療方案施用后能發(fā)揮所需的治療、預(yù)防效果或達到所需的反應(yīng)。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“抗體”意思是指完全完整的抗體及其F(ab)片段和F(ab)2片段。完全完整的抗體包括單克隆抗體，如鼠單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體以及所有上述抗體的衍生物。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白”或“NT”意思是指任何天然或非天然神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，包括但不限于NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6和NT-7，以及它們的功能性衍生物或等價物，不管是從天然資源純化的、重組DNA技術(shù)方法制備的、或是化學(xué)合成的，還是這些或其他方法的任意組合。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“中和”一般表示使失去作用，并且當用于描述抗體時，進一步表示使與其結(jié)合的分子失去作用的抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，“中和”抗體與特定配體結(jié)合并防止或干擾配體與其受體的結(jié)合。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“接觸”表示一種分子或多種分子與另一種分子直接或間接放在一起，由此有助于分子間的相互作用。接觸可發(fā)生在體外或體內(nèi)。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體”意思是指結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白配體的受體。在優(yōu)選的實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體是受體酪氨酸激酶家族的一員，一般稱為“trk”受體或“trks”受體，其在細胞表面上表達。trk家族包括但不限于trkA、trkB和trkC。在其他實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體是p75NTR稱為p75或低親和性神經(jīng)生長因子受體。這些受體可來自任意動物種類(如人、鼠、兔、豬和馬等)，而且包括全長受體、它們的截短和變體形式，如通過剪切和/或插入替換出現(xiàn)的那些形式，和自然發(fā)生的等位基因變體，以及這些受體的功能性衍生物。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明針對治療或預(yù)防前列腺癌或胰腺癌的方法。其他瘤性疾病狀態(tài)，特征可能在于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體如trk受體的表達，依據(jù)本發(fā)明的方法是可被治療或預(yù)防的。表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的癌包括但不限于與乳房、甲狀腺、結(jié)腸、肺、卵巢、皮膚、肌肉、腎、生殖器官、血液、免疫系統(tǒng)組織(如脾、甲狀腺和骨髓)腦以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織相關(guān)的癌癥。
在其他優(yōu)選實施方案中，非惡性腫瘤、癌變前損傷、癌變前腫瘤或其他與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體相關(guān)或與上述瘤性疾病狀態(tài)相關(guān)的癌變前狀態(tài)，依據(jù)本發(fā)明方法也可治療或預(yù)防。這種治療可幫助具有接近癌癥臨床癥狀或有癌癥傾向的患者防止癌癥的發(fā)生。
本發(fā)明優(yōu)選的哺乳動物是易患或臨床已診斷為前列腺癌或胰腺癌的病人。受到前列腺癌或胰腺癌折磨的非人類哺乳動物自然也落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。此外，除了前列腺癌和胰腺癌以外，受到上述所列瘤折磨的人和非人都包括在本發(fā)明中。哺乳動物還包括有傾向即將受到癌癥折磨的人或非人。例子包括接觸了已知致癌劑的人或上了年紀的男性，他們有發(fā)生前列腺癌的風(fēng)險。還包括有癌癥家族史的患者或者有遺傳傾向發(fā)生某類癌癥的人。
在本發(fā)明的一些實施方案中，抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑是針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的核苷酸序列如下NGF(Borsani等，Nuc.Acids Res.，1990，18，4020；保藏號NM 002506)，BDNF(Maisonpierre等，Genomics，1991，10，558；保藏號M 61181)，NT-3(Jones等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，8060；保藏號M37763；和Maisonpierre等，Genomics，1991，10，558；保藏號M 61180)，NT-4(Ip等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，3060；保藏號M 86528)以及NT-5(Ip等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，3060；以及Berkemeier等，Somat.Cell Mol.Genet.，1992，18，233；保藏號NM006179)，各篇文獻以其全文在此引作參考。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員可制備反義寡核苷酸分子，這些反義寡核苷酸分子將特異性地結(jié)合到特定神經(jīng)營養(yǎng)蛋白上，而不與其他聚核苷酸交叉反應(yīng)。優(yōu)選靶位點包括但不限于起始密碼子、5’調(diào)節(jié)區(qū)、編碼區(qū)以及3’非翻譯區(qū)。寡核苷酸優(yōu)選長度為10-100個核苷酸、更優(yōu)選長度為15-50個核苷酸以及更優(yōu)選18-25個核苷酸。寡核苷酸可包括主鏈修飾如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的硫代磷酸酯連接和2’-O糖修飾。寡核苷酸可在腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、口腔內(nèi)、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚上施用。
在本發(fā)明的其他實施方案中，抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑是針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能制備特異性地結(jié)合特定神經(jīng)營養(yǎng)蛋白而不結(jié)合其他多肽的有機小分子。優(yōu)選的靶位點包括但不限于與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合的部分神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和那些靠近受體結(jié)合區(qū)域的部分神經(jīng)營養(yǎng)蛋白分子，它們部分負責(zé)受體結(jié)合部分正確的三維形狀。有機小分子優(yōu)選分子量為100-20,000道爾頓，更優(yōu)選500-15,000道爾頓和更優(yōu)選1000-10,000道爾頓。有機小分子的文庫可商購。這些有機小分子可在腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、口腔內(nèi)、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚上施用。
在本發(fā)明的其他實施方案中，抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑是trk受體的顯性失活突變體。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能制備特定trk受體的顯性失活突變體，以便該受體可結(jié)合自然發(fā)生的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，由此充當“陷井”捕獲神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。但是顯性失活突變體在與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合后將不具有trk受體正常的生物活性。優(yōu)選的顯性失活突變體包括但不限于下列文獻中所描述的突變體Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，10884；Eide等，J.Neurosci.，1996，16，3123；Liu等，J.Neurosci.，1997，17，8749；Klein等，Cell，1990，61，647；Valenzuela等，Neuron，1993，10，963；Tsoulfas等，Neuron，1993，10，975以及Lamballe等，EMBO J.，1993，12，3083，各篇文獻以其全文引作參考。顯性失活突變體可以蛋白形式施用，或以表達載體形式施用，以便該突變trk受體在體內(nèi)表達。該蛋白或表達載體可在腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、口腔內(nèi)、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚上施用。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟悉施用表達載體以獲得外源蛋白體內(nèi)表達。
在本發(fā)明的一些實施方案中，抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑包括至少一種中和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的抗體。優(yōu)選抗體含有全部目前已知的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體，包括但不限于抗NGF(目錄號500-P85，Pepro Tech Inc.；目錄號AF-256-NA，R&D Systems，Inc.)，抗BDNF(目錄號500-P85，PeproTech Inc.；目錄號MAB248，R&D Systems，Inc.)，抗NT-3(目錄號500-P82，Pepro Tech Inc.；目錄號AF-268-NA，R&D Systems，Inc.)，抗NT-4(目錄號500-P83，Pepro Tech Inc.；目錄號AF-256-NA，R&DSystems，Inc.)，抗NT-4/5，抗NT-6和抗NT-7以及它們的功能等價物。這些抗體優(yōu)選采用親和純化的形式。兩種或多種不同中和抗體的混合物也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。例如，癌癥如胰管腺瘤表達一種以上的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體，采用針對一種以上受體的抗體混合物治療更有效。
本發(fā)明抗體可從供應(yīng)商如Pepro Tech，Inc.(Rocky Hill，NJ)，R&DSystems，Inc.(Minneapolis，MN)處獲得，或依據(jù)標準程序產(chǎn)生。可商購的中和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體包括抗人b-NGF、抗人BDNF、抗人NT-4以及來自兔抗血清的抗人NT-3。
抗體的生成和純化可根據(jù)下列文獻中所描述的標準操作過程在實驗室中進行Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，4thEdition，Greene和Wiley-Interscience，NY以及Current Protocols inMolecular Biology，1999，John Wiley & Sons，NY，各篇文獻以其全文在此引作參考。
本發(fā)明還包括對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白或其部分特異的抗體(如單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能/雙特異抗體、人源化抗體、人抗體以及互補決定區(qū)(CDR)-嫁接抗體，包括含有可特異性識別本發(fā)明多肽的CDR序列的化合物)。本發(fā)明所提供的抗體片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv。測定本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性的篩選分析在本領(lǐng)域是熟知的和常規(guī)操作。對此分析綜述，參見Harlow等(編輯)，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1988)，第6章，在此以其全文引作參考。識別并結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白片段的抗體也是預(yù)料之中的。采用本領(lǐng)域熟知的和常規(guī)操作方法可生產(chǎn)本發(fā)明抗體。
例如，重組或自然發(fā)生的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白或其片段能用于免疫小鼠或其他合適動物，以生成單克隆抗體(或免疫較大的哺乳動物如兔以生成多克隆抗體)。為了增加抗原性，按照廠商說明，可將肽與匙孔血藍蛋白結(jié)合。對于初次注射，可將抗原用弗氏完全佐劑乳化后皮下注射。間隔2-3周，采用弗氏不完全佐劑可乳化另一等份的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗原后皮下注射。在終了強化注射之前，從免疫小鼠中采集血清樣品，并用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析確認可與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白交叉反應(yīng)的抗體存在。免疫動物血清可用作多克隆抗血清或用作分離可識別神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的多克隆抗體?；蛘?，可將小鼠處死并取出它們的脾用于生成單克隆抗體。
為了生成單克隆抗體，將脾放置在10ml無血清RPMI1640中，通過研磨無血清RPMI1640中的脾形成單細胞懸浮液，并補入2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco，Canada)。將細胞懸浮液過濾，離心洗滌并重懸浮在無血清RPMI。以相似方式制備從原初三個Balb/c小鼠中采集的胸腺淋巴細胞，并用作飼養(yǎng)層。融合前將NS-1骨髓瘤細胞在含有10％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中維持對數(shù)期3天，離心并洗滌。
為了生成雜交瘤融合，將從免疫小鼠中采集的脾細胞與NS-1細胞結(jié)合，離心，然后抽出上清液。輕敲離心管移出細胞沉淀，并用2ml37℃的PEG1500(75mM HEPES，pH8.0中50％濃度)(Boehringer-Mannheim)攪動沉淀，隨后加入無血清RPMI。其后，細胞離心，重懸浮于含有15％FBS、10μM次黃嘌呤鈉、0.4μM氨基喋呤、16μM胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT)(Gibco)、25單位/mlIL-6(Boehringer-Mannheim)和1.5×106胸腺淋巴細胞/ml的RPMI中，并涂抹在10個康寧(Corning)平底96孔組織培養(yǎng)板(Corning，Corning New York)中。
在融合后的第2、4和6天，從融合板中移出100μl培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基替換。第8天，采用ELISA方法篩選融合，測試可與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合的小鼠IgG的存在。通過稀釋進一步克隆篩選的融合孔，直至獲得產(chǎn)生抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的單克隆培養(yǎng)物。
采用本領(lǐng)域已知任何方法可將非人抗體人源化。在一種方法中，將非人CDR插入到人抗體或共有抗體構(gòu)架序列中。進一步變化可導(dǎo)入抗體構(gòu)架中從而調(diào)節(jié)親和性或免疫原性。下列方案改進了抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白單克隆抗體用于人類治療的效用通過使單克隆抗體人源化以提高血清半壽期和使之對人宿主呈顯較小的免疫原性(即防止人抗體對非人抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的反應(yīng))。
人源化原理已在文獻中描述，并借助于抗體蛋白的模塊排列。為了使結(jié)合補體的可能性降到最小，優(yōu)選IgG4同型的人源化抗體。
例如，人源化水平的獲得是通過生成嵌合抗體，所述抗體包括目的蛋白的非人抗體可變區(qū)和人抗體分子的恒定區(qū)。(參見，如Morrison等，Adv.Immunol.，1989，44，65-92，以其全文在此引作參考)。將中和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的可變區(qū)從B細胞雜交瘤的基因組DNA中或從由目的雜交瘤分離的mRNA生成的cDNA中克隆出來。把V區(qū)基因片段連接到編碼人抗體恒定區(qū)的外顯子，并將得到的構(gòu)建體在適當?shù)牟溉閯游锼拗骷毎斜磉_(如骨髓瘤細胞或CHO細胞)。
為了獲得更高水平的人源化，只將部分的可變區(qū)基因片段克隆到人抗體序列中，該部分可變區(qū)基因片段編碼非人單克隆抗體基因的抗原結(jié)合互補決定區(qū)(“CDR”)。(參見如Jones等，Nature，1986，321，522-525，Riechmann等，Nature，1988，332，323-327，Verhoeyen等，Science，1988，239，1534-36，以及Tempest等，Bio/Technology，1991，9，266-71，各篇文獻以其全文引作參考)。如果需要，CDR3區(qū)周圍的人抗體的β-折疊構(gòu)架也被修飾，以便更可靠地反映出原始單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)。(參見Kettleborough等，Protein Engin.，1991，4，773-783以及Foote等，J.Mol.Biol.，1992，224，487-499，各篇以其全文在此引作參考)。
在另一可替換的方法中，目的非人單克隆抗體表面的人源化可通過改變非人抗體的選擇的表面殘基，如通過定點誘變，而同時保持了非人抗體的全部內(nèi)在殘基和接觸殘基實現(xiàn)。參見Padlan，MolecularImmunol.，1991，28，489-98，以其全文在此引作參考。
本發(fā)明的抗體可制成制劑用于以各種方式施用給哺乳動物。在一些實施方案中，抗體是無菌的水溶液或如血清的生物流體。水溶液可以是緩沖溶液或非緩沖溶液，并含有附加的活性或非活性組分。附加的組分包括用于調(diào)節(jié)離子強度的鹽，防腐劑包括但不限于殺菌劑、抗氧化劑、螯合劑等，營養(yǎng)物包括葡萄糖、右旋糖、維生素和礦物質(zhì)?；蛘撸贵w可制成固體形式施用?？贵w可與許多惰性載體或賦形劑組合，包括但不限于粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；分散劑如藻酸、原生膠(primogel)或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂；glidant如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如胡椒薄荷或水楊酸甲酯。
抗體或其制劑可通過任何給疾病組織投遞抗體的有效途徑給哺乳動物施用。這些途徑包括但不限于腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、口腔內(nèi)、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚。具體而言，抗體或抗體制劑可通過腸胃外注射液體制劑施用或通過消化固態(tài)制劑如藥丸、片劑、膠囊或液體制劑如乳劑和溶液。其他給藥系統(tǒng)包括水凝膠、羥甲基纖維素、微膠囊、脂質(zhì)體、微乳、小球體等。將抗體局部直接注射到病組織如腫瘤內(nèi)，是施用本發(fā)明抗體的優(yōu)選方法。磷酸緩沖液(PBS)是可注射制劑的優(yōu)選載體。
獲得治療有效量的藥劑的抗體劑量依賴于各種因素。例如年齡、敏感性、耐受性和患者的其他特性都將影響劑量。贅生物或腫瘤種類、發(fā)病階段和腫瘤體積也將影響劑量。此外，血漿水平、所用抗體的半壽期、對識別位點的親和性以及其他管床醫(yī)師通常考慮的相似因素都是影響有效劑量的因素。對于全身施用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體，可用劑量范圍從約0.05mg/kg患者/天至約500mg/kg患者/天，盡管僅僅由于施用方便和經(jīng)濟有效優(yōu)選在范圍較低端的劑量。劑量可調(diào)節(jié)到例如提供特定抗體的血漿水平，如在范圍約5-30mg/ml，更優(yōu)選范圍約10-15mg/ml，以及維持此水平如一段時間或直至獲得臨床結(jié)果。嵌合和人源化抗體的清除預(yù)期更緩慢，可要求較低的劑量以維持有效的血漿水平。同樣，對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白具有高親和性的抗體比具有較低親和性的抗體優(yōu)選以較少頻率或較低劑量施用?？贵w治療有效量的測定可表現(xiàn)為治療過程中腫瘤體積的減少、腫瘤生長速率的降低或更理想的是癌癥病態(tài)的完全消失。測定或評價前列腺癌或胰腺癌的發(fā)展階段的有效途徑是測定血液中前列腺特異抗原(PSA)、測定胰腺癌的生存時間、測定前列腺癌和胰腺癌轉(zhuǎn)移擴散的延遲或抑制、測定胰腺癌的組織學(xué)的等級(grading)以及對胰腺癌進行CT檢查。這些程序?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
本發(fā)明通過使腫瘤與至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑接觸還預(yù)期減少前列腺瘤或胰腺瘤體積的方法。本發(fā)明同樣地也包括防止腫瘤進一步生長或降低腫瘤生長速率的方法。給腫瘤位點投遞藥劑優(yōu)選通過給在腫瘤位點或靠近腫瘤位點的組織局部直接注射來完成。然而以上述討論的途徑全身性施用藥劑也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。在腫瘤位點上局部注射可以是在瘤內(nèi)或瘤體周圍或兩者的組合。
對于在腫瘤位點直接注射，藥劑劑量取決于數(shù)個因素，包括其他可變量中的腫瘤類型、腫瘤的發(fā)展階段以及腫瘤體積。依據(jù)腫瘤體積，通常每次注射，藥劑的治療劑量范圍可從約0.01mg/mm3至約10mg/mm3，注射的施用頻率視需要而確定。例如，當腫瘤或病態(tài)存在時，注射每天一次可能是合適的，但根據(jù)癌癥種類、病程和患者的不同可發(fā)生變化。治療有效的表征為治療過程中腫瘤體積的減少或腫瘤生長速率的抑制。對腫瘤外圍的體積測定對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。腫瘤體積計算采用下列公式V(mm3)＝0.5236×長度(mm)×寬度(mm)[長度(mm)+寬度(mm)/2]。
評估特定治療有效性的另一方法是通過本領(lǐng)域熟知的方法評估神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的抑制。例如，采用以ELISA為基礎(chǔ)的酶檢測法可測試trkA的活性，該法如所下列文獻所闡述Angeles等，Anal.Biochem.，1996，236，49，以其全文在此引作參考。另一評估方法是在大鼠前腦基部測定ChAT活性。
在本發(fā)明的其他實施方案中，給哺乳動物施用抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑以防止或減少疼痛。藥劑、用量及其施用如上所述。
本領(lǐng)域中的那些專業(yè)技術(shù)人員將理解可對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案作出許多改變和修飾，而且這些改變和修飾能在不背離本發(fā)明實質(zhì)的情況下作出。因此，權(quán)利要求書目的涵蓋了所有這樣的等價物變化，如同落在了本發(fā)明的實質(zhì)和保護范圍內(nèi)。
下列實施例都是真實的，并且其意不在限制本發(fā)明的范圍。
抗NGF抗體在NIH3T3-trkA細胞中降低了配體刺激的trk自磷酸化作用。將NGF(10ng/ml)和不同濃度的抗體在6ml組織培養(yǎng)基中預(yù)溫育。把NGF/抗體混合物加入NIH3T3-trkA細胞中。采用pan-Trk抗體CEP-21從裂解液中免疫沉淀出Trk蛋白，并且將樣品用抗磷酸酪氨酸抗體4G10在免疫印跡上標記探針。光密度掃描值(整數(shù)OD單位)如下(如NGF(10ng/ml)/抗NGF(μg/ml)顯示)-/-道，0.3；+/-道，6.5；0.001mg/ml，5.0；0.01mg/ml，4.5；0.1mg/ml，2.5；1.0mg/ml，3.1；10.0mg/ml，2.1；100mg/ml，1.1。因此，在用10ng/ml NGF處理5分鐘的細胞中，100μg/ml濃度的抗NGF(Pepro Tech，Inc.，500-P85)相對于無抗NGF處理降低trk磷酸化大約80％。實施例2通過抗NT-3中和trk受體抗NT-3抗體在NIH3T3-trkC細胞中降低配體刺激trk的自磷酸化。NT-3(10ng/ml)和不同濃度的抗體在6ml組織培養(yǎng)基中預(yù)溫育。把NT-3/抗體混合物加入NIH3T3-trkC細胞中。采用pan-Trk抗體CEP-21從裂解液中免疫沉淀出Trk蛋白，并且將樣品用抗磷酸酪氨酸抗體4G10在免疫印跡上標記探針。光密度掃描值(整數(shù)OD單位)如下(如NT-3(10ng/ml)/抗NT-3(μg/ml)顯示)-/-道，0.1；+/-道，4.0；IgG，7.5；0.001mg/ml，6.2；0.01mg/ml，4.0；0.1mg/ml，3.6；1.0mg/ml，7.8；10.0mg/ml，1.2。因此，在用10ng/ml NT-3處理5分鐘的細胞中，10μg/ml濃度的抗NT-3(Pepro Tech 500-P82)相對于無抗NGF處理降低trk磷酸化大約70％。
下列例子顯示對本發(fā)明抗體的抗腫瘤活性的實驗結(jié)果。這些實驗所用的腫瘤模型為裸鼠中的前列腺癌和胰腺癌異種移植，所述裸鼠作為優(yōu)選的臨床前動物模型對本領(lǐng)域那些專業(yè)技術(shù)人員是熟知的，這些模型與體內(nèi)臨床結(jié)果相關(guān)。新近的參考文獻顯示這些異種移植模型與對應(yīng)的人疾病的特定相關(guān)性，所述文獻包括Plonowski等，CancerRes.，1999，59，1947，Joseph等，Cancer Res.，1997，57，1054，Pinski等，Int.J.Cancer，1993，55，963，Gao等，Cancer Res.，1998，58，1391，以及Tan等，Tumour Biology，1985，6，89。實施例3通過神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抑制PC-3前列腺癌異種移植生長采用下列神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抗NGF(Pepro Tech 500-P85)，抗BDNF(Pepro Tech 500-P84)，抗NT-3(Pepro Tech 500-P82)，抗NT-4/5(Pepro Tech 500-P83)。在培養(yǎng)的細胞經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白處理后，抗NGF和抗NT3抗體阻斷trkA和trkC自磷酸化。各個抗體在生物檢定中已顯示阻斷其關(guān)連神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的活性，其中ChAT活性在大鼠前腦基部細胞培養(yǎng)物中測定。
將PC-3人前列腺腫瘤細胞(5×106細胞/小鼠)皮下注射到8-10周齡雌性無胸腺裸鼠(nu/nu；Charles River，Raleigh，NC)脅腹上。在種植腫瘤的那天，小鼠稱重22-25g。在異種移植瘤長到100-500mm3后，把小鼠隨機分成實驗組。一些實驗組施用無菌1×PBS(總體積100μl)緩沖的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒(抗NGF、BDNF、NT-3和NT4/5各4×25μg或4×100μg)或正常兔IgG(100μg或400μg；Pepro Tech 500-P00)。在5個注射位點腫瘤內(nèi)(50μl)以及在5個注射位點腫瘤周圍、皮下(50μl)施用所有抗體。在實驗#1，第1、3、5、8、10、12和15天每天一次讓小鼠接受抗體注射。第1 5天后不施用抗體。在實驗#2，第1、3、6、10、13天每天一次讓小鼠接受抗體注射。第13天有一只接受了4×100μg的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的小鼠死亡，死因不明。每2-3天測定腫瘤長度和寬度。作為對照，給一個實驗組單獨施用CEP-751，以證實腫瘤對CEP-751的反應(yīng)，如同以前對生長在不同機構(gòu)中的PC-3異種移植所顯示的。小鼠接受媒介物(40％聚乙二醇、10％聚烯吡酮C30和2％芐基醇；100μl)或媒介物(100μl)中CEP-751(10mg/kg皮下注射每天二次)每周7天連續(xù)22天。每2-3天(第1、3、5、8、10、12、15、17、19和22)測定腫瘤長度和寬度。
按公式長度×寬度(長度+寬度)/2)×0.526計算腫瘤體積(Isaacs，Canc.Res.，1989，49，6290-6294，以其全文在此引作參考)。計算平均腫瘤體積和標準誤差(SigmaStat，Jandel Scientific，San Rafel，CA)。將其分析最后一天的腫瘤體積偏離分析最后一天的平均腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。相對腫瘤體積以(平均Vt/平均V0)計算，其中Vt是指確定天的腫瘤體積，V0是在初始劑量時相同腫瘤的體積(第1天)。將其分析最后一天的相對腫瘤體積偏離分析最后一天的平均相對腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。概率值按照Mann-Whitney RankSum Test(SigmaStat)計算。
實驗#1相對于用IgG對照處理的腫瘤，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的施用抑制PC-3腫瘤的生長。采用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤相對體積至第3天比IgG對照組顯著較小(P≤0.05)，并且直至第22天實驗終止時維持較小(P≤0.05，第5天，P≤0.01，第8天，P≤0.001，第10-22天)。第10天(35％；P≤0.001)和第12天(25％；P≤0.05)觀察到腫瘤的顯著退化。在中和抗體處理撤出后(第15天)，至第22天觀察到腫瘤重新生長(0.95相對腫瘤體積，第22天，對0.77相對腫瘤體積，第15天)。與IgG對照組比較，用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的絕對體積至第15天顯著較小(P≤0.05)，直至實驗終止維持較小(P≤0.05，第17天；P≤0.01，第19和22天)，并且在第17天達到最小T/C0.33。
相對于媒介物對照，CEP-751施用抑制了PC-3腫瘤的生長。用CEP-751處理的腫瘤的相對體積在第12天(P≤0.05)，第17天(P≤0.01)，第19天(P≤0.05)和第22天(P≤0.01)比媒介物對照組顯著較小。用CEP-751處理的腫瘤的絕對體積比媒介物對照組在第17天(P≤0.01)和第22天(P≤0.05)顯著較小，并且至第19天達到最小T/C0.44。
實驗#2相于用IgG對照處理的腫瘤，抗體施用(抗NGF、BDNF、NT-3和NT4/5各4×25μg或4×100μg)抑制了PC-3腫瘤生長。用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的相對體積至第3天比IgG對照組顯著較小(P≤0.05；100mg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對100μg正常IgG；400μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對400μg正常IgG)，并且直至實驗終止維持較小。在第10天(31％；P≤0.05)和第13天(19％；P≤0.05)觀察到顯著的腫瘤退化(400μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對400μg正常IgG)。與IgG對照組比較，用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的絕對體積至第8天(100μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對100μg正常IgG)和第6天(400μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對400μg正常IgG)顯著較小(P≤0.05)，并且直至實驗終止維持較小(P≤0.005，第10、13和15天100μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對100μg正常IgG和400μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對400μg正常IgG)，并且在第15天(100μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對100μg正常IgG)達到最小T/C0.26或者在第13天(400μg神經(jīng)營養(yǎng)蛋白雞尾酒對400μg正常IgG)達到最小T/C0.17。實施例4通過神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抑制TSU-Pr1前列腺癌異種移植的生長實驗#1采用下列神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抗NGF(Pepro Tech 500-P85)，抗BDNF(Pepro Tech 500-P84)，抗NT-3(Pepro Tech 500-P82)，抗NT-4/5(Pepro Tech 500-P83)。
將TSU-Pr1人前列腺腫瘤細胞皮下注射到雌性無胸腺裸鼠(nu/nu；5×106細胞/小鼠)脅腹中。在異種移植瘤長到100-500mm3后，把小鼠隨機分成4個實驗組。一個實驗組施用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體(抗NGF、BDNF、NT-3和NT4/5)雞尾酒。各劑量的抗體雞尾酒(100μl)含有100μg各神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體。第二實驗組施用正常兔IgG(400μg/100μl；Pepro Tech 500-P00)作為對照。在5個注射位點腫瘤內(nèi)(50μl)以及在5個注射位點腫瘤周圍(50μl)施用所有抗體。每周三天，在第1、3、5、8、10和12天每天一次讓小鼠接受抗體注射。每2-3天(第1、3、5、8、10、12和15天)測定腫瘤長度和寬度。
第三實驗組接受含有CEP-701的媒介物(40％聚乙二醇、10％聚烯吡酮C30和2％芐基醇)，10mg/kg皮下注射每天二次，每周5天連續(xù)14天。第四實驗組只根據(jù)第三實驗組的劑量方案接受媒介物(100μl)。每2-3天(第1、3、5、8、10、12和15天)測定腫瘤長度和寬度。
腫瘤體積的計算同上描述。平均腫瘤體積和標準誤差的計算如上描述。將其腫瘤體積偏離平均腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。對于相對腫瘤體積，將確定小鼠的各數(shù)據(jù)點正態(tài)化到該小鼠初始劑量(第1天)的腫瘤體積。概率值的計算如上描述。任何實驗組中沒有觀察到死亡或發(fā)病，這顯示CEP-701和中和抗體在這些動物中耐受性良好。
相對于IgG對照組中的腫瘤體積，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的施用導(dǎo)致較低相對腫瘤體積。采用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤相對腫瘤體積至第5天比IgG處理的對照組中的相對腫瘤體積顯著較小(P≤0.0001)，并且在實驗全部余下的天中維持較小(P≤0.01第8和10天；P≤0.0001第12和15天)。與IgG對照組比較，用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的絕對體積至第10天顯著較小(P≤0.05)，直至實驗終止維持較小(P≤0.001，第12天；P≤0.01，第15天)，并且在第15天達到最小T/C0.41。
相對于媒介物對照組中的腫瘤體積，CEP-701的施用導(dǎo)致較低的相對腫瘤體積。用CEP-701處理的腫瘤的相對腫瘤體積至第3天比媒介物處理的對照組顯著較小(P≤0.05)，并且直至實驗終止維持較小(P≤0.01，第5天；P≤0.05，第8天；P≤0.01第10和12天；P≤0.001第15天)。用CEP-701處理的腫瘤的絕對體積與媒介物對照組比較，在第8天(P≤0.05)顯著較小，直至實驗終止維持較小(P≤0.05，第10天；P≤0.001第12和15天)，并且在第12和15天達到最小T/C0.29。
用正常IgG處理的腫瘤似乎比那些用CEP-701的媒介物處理的腫瘤生長更緩慢；但是這兩組間在腫瘤體積或相對腫瘤體積上，實驗過程中任何時間沒有顯著(P≤0.05)差異。
該實驗顯示神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體具有TSU-Pr1異種移植生長。用中和抗體處理的腫瘤的相對腫瘤體積比正常IgG處理的對照組在第5天(P≤0.0001)，第8和10天(P≤0.01)以及第12和15天(P≤0.0001)顯著較小。相對于正常IgG，由于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體表現(xiàn)出抑制腫瘤生長，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的作用可能是由于阻斷了通過trk神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號，這與把IgG注射到腫瘤中的一般的效果相反。
實驗#2采用下列神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抗NGF(Pepro Tech 500-P85)，抗BDNF(Pepro Tech 500-P84)，抗NT-3(Pepro Tech 500-P82)，抗NT-4/5(Pepro Tech 500-P83)。
將TSU-Pr1人前列腺腫瘤細胞皮下注射到雌性無胸腺裸鼠(nu/nu；5×106細胞/小鼠)脅腹中。在異種移植瘤長到100-500mm3后，把小鼠隨機分成6個實驗組。第一組每劑量施用抗NGF(100μg)+正常兔IgG(300μg)。第二組每劑量施用抗NT-3(100μg)+正常兔IgG(300μg)。第三組每劑量施用抗NT4/5(100μg)+正常兔IgG(300μg)。第四組每劑量施用抗BDNF(100μg)+正常兔IgG(300μg)。第五組每劑量施用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒(抗NGF、BDNF、NT-3和NT4/5(每劑量各抗體100μg))。第六組作為對照施用正常兔IgG(每劑量400μg；Pepro Tech 500-P00)。在5個注射位點腫瘤內(nèi)(50μl)以及在5個注射位點腫瘤周圍(50μl)施用各個劑量(每100μl PBS中總共400μg蛋白)，每周三天，在第1、3、6、8、10和13天，每天一次。每2-3天(第1、3、6、8、10、13和15天)測定腫瘤長度和寬度。
腫瘤體積的計算同上描述。平均腫瘤體積和標準誤差的計算如上描述。將其腫瘤體積偏離平均腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。對于相對腫瘤體積，將給定小鼠的各數(shù)據(jù)點正態(tài)化到該小鼠初始劑量(第1天)的腫瘤體積。概率值的計算如上描述。任何實驗組中沒有觀察到死亡或發(fā)病，這顯示該中和抗體在這些動物中耐受性良好。
相對于正常兔IgG，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒(抗NGF、抗NT-3、抗BDNF和抗NT-4/5)、抗NGF或抗NT-3抑制了腫瘤生長。相對于正常兔IgG，抗BDNF和抗NT-4/5對抑腫瘤生長都沒有顯著效果。接受了神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒組的相對腫瘤體積至第3天(P≤0.01)和第8天(P≤0.05)比IgG對照組的相對腫瘤體積顯著較小，然后在實驗全部余下的時間內(nèi)維持較小(P≤0.01第10、13和15天)。用抗NGF處理腫瘤的相對腫瘤體積至第3天比IgG處理的對照組中相對腫瘤體積顯著較小(P≤0.001)，并且在實驗全部余下的時間內(nèi)維持較小(P≤0.001第6天；P≤0.01第8天；P≤0.001第10天；P≤0.01第13天；P≤0.001第15天)。用抗NT-3處理腫瘤的相對腫瘤體積至第6天比IgG對照組中相對腫瘤體積顯著較小(P≤0.05)，并且在實驗全部余下的時間內(nèi)維持較小(P≤0.01第8天；P≤0.001第10天；P≤0.01第13天；P≤0.001第15天)。
與IgG處理的對照組比較，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒組的絕對腫瘤體積顯著較小(P≤0.05，第8天；P≤0.01，第10、13和15天)，并且在第13天達到最小T/C0.52。與IgG處理的對照組比較，接受了抗NGF組的絕對腫瘤體積顯著較小(P≤0.05，第3天；P≤0.001，第6、8、10和13；以及和P≤0.01，第15天)，并且至第13天達到最小T/C0.34?？筃GF組在第3天(20％，P≤0.001)、第6天(31％，P≤0.01)、第8天(35％，P≤0.001)、第10天(35％，P≤0.01)和第13天(37％，P≤0.01)觀察到腫瘤退化。與IgG處理的對照組比較，接受了抗NT-3組的絕對腫瘤體積顯著較小(P≤0.05，第6天；P≤0.01，第8、10、13和15天)，并且至第13天達到最小T/C0.38?？筃T-3組在第8天(16％，P≤0.001)、第10天(33％，P≤0.001)和第13天(29％，P≤0.01)觀察到腫瘤退化。
抗NGF或抗NT-3與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒的效果比較表明各個這些單個神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體比神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒短暫抑制腫瘤生長更有效?？筃GF組的相對和絕對腫瘤體積在第8天(P≤0.01)和第10天(P≤0.05)比神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒組顯著較小?？筃GF相對于正常兔IgG在第8和10天分別抑制腫瘤生長57％和64％，而神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒相對于正常兔IgG在第8和10天分別抑制腫瘤生長32％和43％。抗NT-3組的相對腫瘤體積比神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒組在第10天(P≤0.05)顯著較小。抗NT-3相對于正常兔IgG在第10天抑制腫瘤生長60％，而神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒相對于正常兔IgG在第10天抑制腫瘤生長43％。該實驗結(jié)果表明抗NGF或抗NT-3抑制TSU-Pr1異種移植的生長，以及短暫抑制比神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體雞尾酒(抗NGF、抗NT-3、抗BDNF和抗NT-4/5)效果更好。
盡管不同的NT-4/5或BDNF中和抗體或不同濃度的這些抗體可能導(dǎo)致對腫瘤生長的顯著效果，但是在劑量為100μg時，抗NT-4/5和抗BDNF對裸鼠中TSU-Pr1腫瘤的生長都沒有顯著效果。以前trkB在TSU-Pr1細胞中表達的分析數(shù)據(jù)顯示trkB在該細胞系中不表達(Dionne等，1998)。由于BDNF和NT-4/5的信號通道主要是通過trkB(Barbacid，1995；Ibanez，1995)，我們實驗中未觀察到其抑瘤效果與缺少trkB受體相一致。實施例5通過神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抑制AsPC-1胰腺癌異種移植的生長采用下列神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抗NGF(Pepro Tech 500-P85)，抗BDNF(Pepro Tech 500-P84)，抗NT-3(Pepro Tech 500-P82)，抗NT-4/5(Pepro Tech 500-P83)。
將AsPC-1人胰腺腫瘤細胞皮下注射到雌性無胸腺裸鼠(nu/nu；5×106細胞/小鼠)脅腹上。在異種移植瘤長到100-500mm3后，把小鼠隨機分成4個實驗組。一組施用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體(抗NGF、BDNF、NT-3和NT4/5)雞尾酒。每劑量抗體雞尾酒(100μl)含有100μg各神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體。第二實驗組作為對照施用正常兔IgG(400μg/100μl；Pepro Tech 500-P00)。在5個注射位點腫瘤內(nèi)(50μl)以及在5個注射位點腫瘤周圍(50μl)施用所有抗體。每周三天，在第1、3、5、8、10和12天，每天一次，讓小鼠接受抗體注射。每2-3天(第1、3、5、8、10、12和15天)測定腫瘤長度和寬度。第三實驗組接受含有CEP-701的媒介物(40％聚乙二醇、10％聚烯吡酮C30和2％芐基醇)，10mg/kg皮下注射每天二次，每周5天連續(xù)14天。第四實驗組根據(jù)第三實驗組的劑量方案只接受媒介物。每2-3天(第1、3、5、8、10、12和15天)測定腫瘤長度和寬度。
腫瘤體積的計算如上所述。平均腫瘤體積和標準誤差的計算也如上所述。將其腫瘤體積偏離平均腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。對于相對腫瘤體積，將給定小鼠的各數(shù)據(jù)點正態(tài)化到該小鼠初始劑量(第1天)的腫瘤體積。概率值的計算如上所述。任何實驗組中沒有觀察到死亡或發(fā)病，這顯示CEP-701和該中和抗體在這些動物中耐受性良好。
與IgG對照組中腫瘤體積比較，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的施用導(dǎo)致較低的相對腫瘤體積。用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的相對腫瘤體積比IgG處理的對照組在第5、10、12和15天顯著較小(P≤0.05)。與IgG對照組比較，用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的絕對體積至第5天顯著較小(P≤0.01)，直至實驗終止維持較小(P≤0.01，第8、10、12和15天)，并在第15天達到最小T/C0.43。
與媒介物對照組中腫瘤體積比較，CEP-701的施用導(dǎo)致較低相對腫瘤體積。用CEP-701處理的腫瘤的相對腫瘤體積比媒介物處理的對照組至第3天顯著較小(P≤0.01)，并直至實驗終止維持較小(P≤0.001，第5天；P≤0.01，第8天；P≤0.001，第10天；P≤0.01，第12天以及P≤0.001，第15天)。與媒介物對照組比較，用CEP-701處理的腫瘤的絕對體積在第5天顯著較小(P≤0.05)，直至實驗終止維持較小(P≤0.05，第8、10、12和15天)，并在第15天達到最小T/C0.27。
該實驗結(jié)果表明神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抑制AsPC-1異種移植的生長。由于相對于正常IgG，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抑制腫瘤生長，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體的作用可能是由于阻斷了通過trk神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號，這與把IgG注射到腫瘤中的一般效果相反。用正常IgG處理的腫瘤似乎比那些用CEP-701的媒介物處理的腫瘤生長更緩慢；但是，在這兩個組間實驗過程中任何時間腫瘤體積或相對腫瘤體積沒有顯著差異(P≤0.05)。實施例6對CFPAC胰腺腫瘤異種移植采用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體治療后的結(jié)果比較采用下列神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體抗NGF(Pepro Tech 500-P85)，抗BDNF(Pepro Tech 500-P84)，抗NT-3(Pepro Tech 500-P82)，抗NT-4/5(Pepro Tech 500-P83)。
把人胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-1和CFPAC分別生長在含有10％胎牛血清(Atlanta Biological，Norcoss，GA)的RPMI或DMEM培養(yǎng)基中(Cellgro/Mediatech，Washington，D.C.)，在37℃帶有95％空氣/5％CO2大氣的潮濕溫育箱中培養(yǎng)。細胞經(jīng)測定無支原體和嚙齒類動物病毒(MAP測試)。采用胰蛋白酶/EDTA(GibcoBRL，Rockville，MD)收集指數(shù)生長細胞，并采用臺盼藍(Fisher Scientific，Malvern，PA)計數(shù)。將該細胞重懸浮于1∶1適當?shù)纳L培養(yǎng)基和Matrigel(Fisher Scientific)中。
將雌性無胸腺nu/nu小鼠(8-10周齡；Charles River，Raleigh，NC)飼養(yǎng)在微量分離器單位中，每籠5只。隨意給動物商品食物和水，房間內(nèi)濕度48±2％和溫度22±2℃，以及明暗循環(huán)間隔設(shè)定為12小時。在實驗操作前把小鼠隔離檢疫至少一周。接種腫瘤細胞當天小鼠稱重22-25g。把如上所述培養(yǎng)的指數(shù)生長細胞收集并注射(5×106細胞/小鼠)到裸鼠的右側(cè)脅腹中。接種后10天將攜帶100-400mm3(AsPC-1)或100-900mm3(CFPAC)腫瘤的動物隨機分配到適當組中。初始處理采用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體(抗NGF、抗BDNF、抗NT-3和抗NT-4/5；總體積100μl中含有各抗體100μg，50μl腫瘤內(nèi)和50μl腫瘤周圍)雞尾酒或正常兔IgG(400μg/100μl，50μl腫瘤內(nèi)和50μl腫瘤周圍)。每周三天，在第1、3、5、8、10和12天每天一次讓小鼠接受抗體或正常兔IgG注射。
每2-4天采用游標卡尺測定腫瘤。腫瘤體積的計算如上所述。平均腫瘤體積和標準誤差的計算也如上所述。將其分析終了一天的腫瘤體積偏離分析終了一天的平均腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。統(tǒng)計分析計算如上所述，以P≤0.05認定顯著。
與IgG對照組中腫瘤體積比較，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體(抗NGF、抗BDNF、抗NT-3和抗NT4/5)的施用導(dǎo)致較低的相對腫瘤體積。用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的相對腫瘤體積比IgG處理的對照組在第5天顯著較小(P≤0.05)，并從第10天直至實驗終止維持較小。與IgG對照動物比較，用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體處理的腫瘤的絕對體積至第5天顯著較小(P≤0.01)，直至實驗終止維持較小，并在第15天達到最大腫瘤生長抑制55％。
相對于用IgG對照處理的腫瘤，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體的施用不抑制CFPAC腫瘤的生長。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體抑制缺乏暗示這些異種移植生長不依賴于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。CFPAC的不反應(yīng)與先前出版的資料一致，所述資料中CFPAC腫瘤生長對用pan-trk抑制劑CEP-701處理并不敏感，而AsPC-1腫瘤的生長受到CEP-701的抑制。
在實驗組中沒有明顯跡象表明中和抗體與發(fā)病或死亡有關(guān)、并且在用中和抗體處理的和用正常兔IgG處理的動物間的體重是可比的(表2 & 4)。這些資料顯示動物對中和抗體在觀察到顯著抗腫瘤功效的劑量時耐受性良好。
表1神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體對裸鼠中ASPC1胰腺異種移植的抗腫瘤作用相對腫瘤體積(絕對腫瘤體積)
采用中和抗體(各抗體100μg/100μl，在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)或無菌PBS中的正常兔IgG(100μg/100μl在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)處理攜帶ASPC1腫瘤的裸鼠。每2-3天測定腫瘤體積。腫瘤體積的值為相對腫瘤體積的平均值±SE。括號內(nèi)值為表示實際腫瘤體積(mm3)的平均值±SE。*P≤0.05，**P≤0.01根據(jù)Mann-Whitney Rank SumTest計算。
表2神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體對攜帶AsPC-1異種移植的裸鼠的體重的影響
采用中和抗體(各抗體100μg/100μl，在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)或無菌PBS中的正常兔IgG(100μg/100μl在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)處理攜帶ASPC1腫瘤的裸鼠。數(shù)值為體重的平均值±SE。
表3神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體對裸鼠CFPAC胰腺異種移植的影響相對腫瘤體積(絕對腫瘤體積)
采用中和抗體(各抗體100μg/100μl，在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)或無菌PBS中的正常兔IgG(400μg/100μl在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)處理攜帶CFPAC腫瘤的裸鼠。每3-4天測定腫瘤體積。腫瘤體積的值為相對腫瘤體積的平均值±SE。括號內(nèi)值為實際腫瘤體積(mm3)的平均值±SE。
表4神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中和抗體對攜帶CFPAC異種移植的裸鼠的體重的影響
采用中和抗體(各抗體100μg/100μl，在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)或無菌PBS中的正常兔IgG(100μg/100μl在第1、3、5、8、10和12天腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍每天一次)處理攜帶CFPAC腫瘤的裸鼠。每3-4天測定體重。體重值(g)為平均值±SE。實施例7個體計算的腫瘤體積和體重把如上所述培養(yǎng)的指數(shù)生長細胞收集并注射(5×106細胞/小鼠)到裸鼠右側(cè)脅腹中。將攜帶100-500mm3大小腫瘤的動物隨機分成適當?shù)膶嶒灲M，劑量采用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(抗NGF、抗BDNF、抗NT-3和抗NT-4/5)中和抗體(總體積100μl中含有各抗體100μg，50μl腫瘤內(nèi)和50μl腫瘤周圍)或正常兔IgG(400μg/100μl，50μl腫瘤內(nèi)(it)和50μl腫瘤周圍(pt))。每周三天，在第1、3、5、8、10和12天，每天一次讓小鼠接受抗體注射。
每2-3天采用游標卡尺測定腫瘤。腫瘤體積、平均腫瘤體積和標準誤差的計算也如上所述。每個數(shù)據(jù)點采用下列公式測定相對腫瘤體積平均Vt/平均V0，其中Vt是指確定天的腫瘤體積以及V0是在初始劑量時的腫瘤體積(第1天)。將其分析終了一天的腫瘤體積偏離分析終了一天的平均腫瘤體積大于2個標準偏差的任何小鼠從每個數(shù)據(jù)點的分析中去除。統(tǒng)計分析計算如上所述，以P≤0.05認定顯著。
權(quán)利要求
1.治療或防止癌癥的方法，其包括給哺乳動物施用治療有效量的至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑選自抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體、針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子、結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子以及結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的trk受體的顯性失活突變。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是前列腺癌或胰腺癌。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6或NT-7。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體是人源化抗體、嵌合抗體、F(ab)片段或F(ab)2片段。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
8.治療前列腺或胰腺腫瘤的方法，其包括將所述腫瘤與治療有效量的至少一種中和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體接觸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白選自NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6和NT-7。
9.減少前列腺或胰腺腫瘤體積的方法，其包括將所述腫瘤與至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑接觸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑選自抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體、針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子、結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子以及結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的trk受體的顯性失活突變。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6或NT-7。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是人源化抗體、嵌合抗體、F(ab)片段或F(ab)2片段。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
14.降低前列腺或胰腺腫瘤生長速率的方法，其包括將所述腫瘤與至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑接觸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑選自抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體、針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子、結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子以及結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的trk受體的顯性失活突變。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6或NT-7。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體是人源化抗體、嵌合抗體、F(ab)片段或F(ab)2片段。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
19.治療疼痛的方法，其包括給哺乳動物施用治療有效量的至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑選自抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體、針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子、結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子以及結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的trk受體的顯性失活突變。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6或NT-7。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是人源化抗體、嵌合抗體、F(ab)片段或F(ab)2片段。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過給哺乳動物施用治療有效量的至少一種抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑治療或防止癌癥的方法。所述抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白劑優(yōu)選抗神經(jīng)營養(yǎng)蛋白抗體、針對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的反義分子、結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的有機小分子或結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的trk受體的顯性失活突變。該法特別優(yōu)選用于治療前列腺癌或胰腺癌?？股窠?jīng)營養(yǎng)蛋白劑中和NGF、BDNF、NT－3、NT－4/5、NT－6或NT－7，以及包括人源化抗體及其片段。
文檔編號A61K45/00GK1420785SQ01805810
公開日2003年5月28日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月29日
發(fā)明者卡倫·J·布奇科維奇, 克雷格·A·迪翁, 希拉·J·米克尼奧茨基, 布魯斯·A·魯杰里 申請人:賽福倫公司