專利名稱：增強了鋅結合力的胰島素衍生物的制作方法
皮下施藥胰島素的藥物動力學依賴于其締合性質。胰島素在中性水溶液中形成六聚體。如果胰島素從組織進入血流而到達作用部位，它必先經(jīng)過毛細血管壁。據(jù)推測只有單分子的或二聚的胰島素才有可能、而六聚的胰島素或較高分子量的相關物則不可能或可能性很小(Brange et al.，Diabetes Care13(1990)，pp 923-954；Kanget al.，Diabetes Care14(1991)，pp 942-948)。因此六聚體的解離是從皮下組織迅速經(jīng)過進入血流的先決條件。
胰島素的締合性質和聚集特性受Zn++的影響，它會導致六聚體的穩(wěn)定化并在中性點附近的pH值時導致生成較高分子量的聚集體直至出現(xiàn)沉淀。Zn++作為添加劑被加入未緩沖的人胰島素溶液(pH4)卻只是稍微影響作用的形式。盡管這種溶液在注射時在皮下組織中被迅速中和并形成胰島素-鋅復合體，但是人胰島素自然的鋅結合力不足以穩(wěn)定六聚體和更高的聚集體。通過添加Zn++，胰島素的釋放不被顯著延遲而且不會達到強的儲存效果。已知胰島素六聚體的含鋅量是每mol的胰島素六聚體含大約2mol Zn++(Blun-dell et al.，Adv.Protein Chem.26(1972)，pp 323-328)。每個胰島素六聚體的2個Zn++離子與胰島素六聚體牢固結合并且不能被通常的透析除去。所謂的4-鋅胰島素晶體已被公認地描述，但這些晶體平均每mol的胰島素六聚體只含有少于3mol的Zn++(G.D.Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，pp 7093-7097)。
本發(fā)明的目的是找出這種胰島素衍生物它與人胰島素相比，具有增強了的鋅結合力，形成含胰島素六聚體和Zn++的穩(wěn)定的復合體，并在皮下注射時出現(xiàn)延遲的作用形式。
式I的胰島素 和/或式I的胰島素的生理上耐受的鹽業(yè)已被發(fā)現(xiàn)，它們基本符合上述條件并且其中R1表示苯丙氨酸殘基或氫原子，R3表示基因可編碼的氨基酸殘基，Y表示基因可編碼的氨基酸殘基，Z表示a)氨基酸殘基His或b)具有2～35個基因可編碼的氨基酸殘基的肽，它含1～5個組氨酸殘基，而殘基A2～A20相應于人胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物的A鏈的氨基酸序列，并且殘基B2～B29相應于人胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物的B鏈的氨基酸序列。
這樣的式I胰島素是特別優(yōu)選的，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示選自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸殘基，Y表示選自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸殘基，Z表示a)氨基酸殘基His或b)具有4～7個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
這樣的式I胰島素是更優(yōu)選的，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示選自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸殘基，Y表示選自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸殘基，Z表示a)氨基酸殘基His或b)具有2～7個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
這樣的式I胰島素是特別優(yōu)選的，其中Z表示具有1～5個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
這樣的式I胰島素是特別優(yōu)選的，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示選自Asn和Gly的氨基酸殘基，Y表示選自Thr和His的氨基酸殘基，而Z表示具有1～5個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
這樣的式I胰島素是更優(yōu)選的，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示甘氨酸殘基，Y表示蘇氨酸殘基而Z表示具有1～5個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
這樣的式I胰島素是尤為優(yōu)選的，其中Z表示具有序列His His、His His Arg、Ala His His、Ala His His Arg、Ala Ala His His Arg或Ala Ala His His的肽。
肽和蛋白質的氨基酸序列從氨基酸鏈的N端算起。式I中括號內(nèi)的說明例如A1、A6、A7、A11、A20、B1、B7、B19或B30，對應于胰島素的A鏈或B鏈中氨基酸殘基的位置。
“基因可編碼的氨基酸殘基”這個用詞表示氨基酸Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Lys、His、Tyr、Phe、Trp、Pro和硒代半胱氨酸的殘基。
動物胰島素的“殘基A2～A20”和“殘基B2～B29”這些用詞應理解為例如，得自牛、豬或雞的胰島素的氨基酸序列的意思。
胰島素衍生物的“殘基A2～A20”和“B2～B29”表示相應的人胰島素的氨基酸序列，這些序列是通過由其它基因可編碼的氨基酸置換其中的氨基酸而形成的。
人胰島素的A鏈具有下述序列(序列1)
Gly，Ile，Val，Glu，Gln，Cys，Cys，Thr，Ser，Ile，Cys，Ser，Leu，Tyr，Gln，Leu，Glu，Asn，Tyr，Cys，Asn人胰島素的B鏈具有下述序列(序列2)Phe，Val，Asn，Gln，His，Leu，Cys，Gly，Ser，His，Leu，Val，Glu，Ala，Leu，Tyr，Leu，Val，Cys，Gly，Glu，Arg，Gly，Phe，Phe，Tyr，Thr，Pro，Lys，Thr.
式I的胰島素衍生物可借助于基因工程構建物的多重性在微生物中形成(EP 0489780，EP0347781，EP0368187，EP0453969)。基因工程構建物在發(fā)酵期間在諸如大腸桿菌(Escherichia coli)或鏈霉菌(Streptomycetes)的微生物中得以表達。形成的蛋白質被貯存于微生物內(nèi)(EP 0489780)或分泌入發(fā)酵液。
式I的胰島素實例有Gly(A21)-人胰島素-His(B31)-His(B32)-OHGly(A21)-人胰島素-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OHGly(A21)-人胰島素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OHGly(A21)-人胰島素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OHGly(A21)-人胰島素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OHGly(A21)-人胰島素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH式I的胰島素衍生物主要是按標準方法通過基因工程采用定點誘變制備的。為此，編碼期望的式I的胰島素衍生物的基因結構被構建并表達于宿主細胞-優(yōu)選是如大腸桿菌的細菌內(nèi)或酵母、尤其是釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)內(nèi)-而且-如果基因結構編碼融合蛋白-式I的胰島素衍生物就從融合蛋白中釋放；類似的方法被描述于例如EP-A-0211299、EP-A-0227938、EP-A-0229998、EP-A-0286956和DE專利申請P3821159中。
細胞破裂后，融合蛋白部分可以通過化學法利用鹵化氰-參見EP-A-0180920-或者通過酶促法利用溶葡萄球菌素或胰蛋白酶-參見DE-A-3739347而得以裂解。
然后胰島素前體用已述方法例如按R.C.Marshall and A.S.In-glis在“Practical Protein Chemistry-A Handbook”(Editor A.Darbre)1986，pp 49-53中描述的進行氧化亞硫酸解；接著，例如按G.H.Dixon and A.C.Wardlow在Nature(1960)，pp 721-724中描述的方法在硫醇存在下形成恰當?shù)亩蜴I而被復性。但胰島素前體還可被直接折疊(EP-A-0600372；EP-A-0668292)。
通過胰蛋白酶解-例如按Kemmler et al.，J.B.C.(1971)，pp6786-6791的方法除去C肽以及存在的話除去前序列(式II的R2)，并利用已知技術例如色譜法-如EP-A-0305760和結晶作用將式I的胰島素衍生物純化。
本發(fā)明還涉及含胰島素六聚體和每mol胰島素六聚體大約5～9mol Zn++、優(yōu)選是每mol胰島素六聚體5～7mol Zn++的復合體，該胰島素六聚體由六個式I的胰島素分子構成。
鋅與胰島素六聚體結合得如此牢固，以至每mol胰島素六聚體的5～9mol Zn++不能用例如pH7.4的10mM Tris/Hcl緩沖水溶液進行40小時的常規(guī)透析而除去。
皮下施藥后，存在于基本上不含鋅的制劑(pH4)中的式I的胰島素，與人胰島素相比顯示很小的作用延遲。加入大約20μg Zn++/ml制劑后，皮下施藥之后，觀察到更遲的作用開始。最好是在40μgZn++/ml時觀察作用的延遲，更高的鋅濃度可增強該效果。
本發(fā)明還涉及式II的前胰島素原R2-R1-B2-B29-Y-Z1-Gly-A2-A2O-R3(II)其中R3和Y同權利要求1～6的一或多項中提出的式I中的定義，和R1表示苯丙氨酸殘基或共價鍵，和R2表示a)基因可編碼的氨基酸殘基或
b)具有2～45個氨基酸殘基的肽，且殘基A2～A20和B2～B29相應于人胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物的A和B鏈的氨基酸序列，而且Z1表示具有2-40個基因可編碼的氨基酸殘基的肽，它具有1-5個組氨酸殘基。
式II的胰島素原適于用作制備式I的胰島素的中間體。
優(yōu)選的式II的胰島素原是那些其中R2表示具有2～25個氨基酸殘基的肽。
特別優(yōu)選的式II的胰島素原是那些其中R2表示具有2～15個氨基酸殘基的肽，其中一個選自Met、Lys和Arg的氨基酸殘基在羧基端。
本發(fā)明的式I的胰島素衍生物和/或含胰島素六聚體和5～9mol Zn++/mol六聚體的復合體和/或其生理上耐受的鹽(例如其堿金屬鹽或銨鹽)，主要是用作治療多尿癥、尤其是糖尿病用的藥物制劑的活性化合物。
該藥物制劑最好是注射用的溶液或懸浮液；它包括至少一種本發(fā)明的式I的胰島素衍生物和/或復合體和/或至少一種其生理上耐受的鹽，該鹽為溶解的、無定形的和/或晶態(tài)-最好是溶解的形式。
該制劑的pH優(yōu)選是約為2.5～8.5，特別是約為4.0～8.5，它含合適的等滲劑、合適的防腐劑且適當時還含合適的緩沖劑，而且最好還具有一定的鋅離子濃度；當然，所有這些溶液均為無菌的水溶液。除活性化合物之外的全部制劑組分構成藥物載體溶液。
含式I的胰島素溶液的制劑pH為2.5～4.5，特別是3.5～4.5，優(yōu)選是4.0。
含式I的胰島素懸浮液的制劑pH為6.5～8.5，特別是7.0～8.0，優(yōu)選是7.4。
合適的等滲劑例如有甘油、葡萄糖、甘露糖醇、NaCl、鈣化合物或鎂化合物如CaCl2或MgCl2。
由于等滲劑和/或防腐劑的選用，在弱酸性的pH值下胰島素衍生物或其生理上耐受的鹽的溶解性會受影響。
合適的防腐劑例如有苯酚、間甲酚、苯甲醇和/或對-羥基苯甲酸酯。
可用的緩沖劑物質、特別是用于調節(jié)大約為4.0～8.5間的pH的緩沖劑物質例如有乙酸鈉、檸檬酸鈉或磷酸鈉。此外，生理上可接受的稀酸(以HCl為典型)或堿(以NaOH為典型)也適于調節(jié)pH。
如果制劑中存在含Zn++量，一個含量為1μg～2mg的Zn++/ml，尤以5μg～200μg的Zn++/ml為優(yōu)選的。
為改變本發(fā)明的制劑的作用形式，還可摻合未修飾的胰島素，優(yōu)選是牛的、豬的或人的胰島素，最好是人胰島素；或者摻合修飾的胰島素例如單一的胰島素、快速作用(rapid-acting)胰島素或Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰島素。
優(yōu)選的活性化合物濃度是大約1～1500，更優(yōu)選大約為5～1000且最優(yōu)選大約為40～400國際單位/ml。
實施例1Gly(A21)-人胰島素-His(B31)-His(B32)-OH的制備該表達系統(tǒng)的制備基本按US5,358,857中描述的進行。其中還描述了載體pINT 90d和pINT 91d(參見實施例17)和PCR引物TIR和Insu11。將這4種組分特別用作下述載體構建物的起始原料。
首先，將Gly(A21)的密碼子插入編碼小胰島素原(miniproin-sulin)的序列中。為此，以pINT 91d為模板并用引物TIR和Insu31進行PCR反應。
Insu31(序列10)5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3′PCR循環(huán)的進行如下第1分鐘94℃，第2分鐘55℃，第3分鐘72℃。該循環(huán)被重復25次然后將該混合物在72℃下培養(yǎng)7分鐘，接著在4℃下過夜。
使所得PCR片段在乙醇中沉淀以純化它，干燥，然后按制造商的說明利用限制酶Nc01和Sal1在限制緩沖液中消化，接著用凝膠電泳將反應混合物分離而Nc01-前胰島素原-Sal1片段被分離出。同樣利用Nc01和Sal1使質粒pINT90d的DNA裂解，且猴胰島素原(the monkey proinsulin)片段以這種方式從pINT殘余質粒中被釋放出來。兩種片段通過凝膠電泳被分離，而殘余質粒DNA被分離出。該DNA在連接酶反應中與Nc01-Sal1 PCR片段反應，由此得到質粒pINT 150d，它被大腸桿菌轉化后被復制然后再次分離出來。
將質粒pINT 150d的DNA用作質粒pINT302的起始原料，利用后者可制備所需的胰島素變體。
為了構建該質粒，可采用US5,358,857(參見實施例6)中描述的路線。為此進行彼此獨立的兩個PCR反應，質粒pINT 150d的DNA被用作模板。其中一個反應的進行用到引物對TIR和pINTB5(序列11)5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′而另一個反應用到引物對Insu11和pINTB6(序列12)5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′所得PCR片段是部分互補的，所以在第3個PCR反應中它們導致生成一個片段，它編碼被位置B31和B32增長的Gly(A21)小胰島素原。用Nc01和Sal1使該片段裂解，然后在連接酶反應中使之與所述pINT 90d殘余質粒的DNA反應而得質粒pINT302。
將用該質粒轉化過的大腸桿菌K12 W3110發(fā)酵，再按US5,227,293的實施例4中的方法操作。作為中間體(在胰蛋白酶裂解前)而得到的前胰島素原衍生物具有下述氨基酸序列前胰島素原1(序列3)Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
His His ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly前胰島素原1符合式II，此時R2表示具有11個氨基酸殘基的肽，R1表示Phe(B1)，Y表示Thr(B30)，Z表示His His Arg(B31～B33)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素的B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
按US5,227,293中的實施例4用胰蛋白酶將前胰島素原裂解，然后按實施例11將所得產(chǎn)物與羧肽酶B反應而得胰島素1。胰島素1符合式I，此時R1表示Phe(B1)，Y表示Thr(B30)，Z表示His His(B31～B32)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素的B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
胰島素1具有下述氨基酸序列胰島素1(序列4)B鏈 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrHis HisA鏈 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫鍵。實施例2Gly(A21)-人胰島素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH的制備按實施例1構建表達載體。
將質粒pINT150d作為模板用于兩個彼此獨立的PCR反應，利用引物對TIR和pINT B7(序列13)5′GAT GCC GCGGTGGTGCGCGGT CTT GGG TGT GTAG 3′或Insu11和pINTB8(序列14)5′ACCC AAG ACCGCGCACCACCGC GGC ATC GTG GAG 3′兩個反應中生成的PCR片段是部分互補的，且在第3個PCR反應中產(chǎn)生完整的序列，它編碼所需的胰島素變體。用酶Nc01和Sal1處理該反應的片段，然后將其連接到pINT90d DNA的Nc01/Sal1-開放式殘余質粒(opened residual plasmid)中。生成的質粒pINT303用大腸桿菌K12 W3110轉化后被用作表達所需的前小胰島素原(pre-miniproinsulin)的基礎。按實施例1進行發(fā)酵和操作，省去羧肽酶B反應。
所得前胰島素原衍生物具有下述氨基酸序列前胰島素原2(序列5)Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrAla His His ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly前胰島素原2符合式II，此時R1表示Phe(B1)，R2表示具有11個氨基酸殘基的肽，
Y表示Thr(B30)，Z1表示Ala His His Arg(B31～B34)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
然后將前胰島素原2與胰蛋白酶反應而得胰島素2。胰島素2符合式II，此時R1表示Phe(B1)，Y表示Thr(B30)，Z表示Ala His His Arg(B31～B34)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
胰島素2具有下述氨基酸序列胰島素2(序列6)B鏈 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrAla His His ArgA鏈Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫健。實施例3Gly(A21)-人胰島素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH的制備按實施例1構建表達載體。
將質粒pINT150d作為模板用于兩個彼此獨立的PCR反應，利用引物對TIR和pINT 316a(序列15)5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3′或Insu11和pINT316b(序列16)5′A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3′兩個反應中生成的PCR片段是部分互補的，且在第3個PCR反應中產(chǎn)生完整的序列，它編碼所需的胰島素變體。用酶Nc01和Sal1處理該反應的片段，然后將其連接到pINT90d DNA的Nc01/Sal1-開放式殘余質粒中。生成的質粒pINT316用大腸桿菌K12W3110轉化后被用作表達所需的前小胰島素原的基礎。按實施例1進行發(fā)酵和操作，省去羧肽酶B反應。
所得前胰島素原3具有下述氨基酸序列前胰島素原3(序列7)Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrAla Ala His His ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly前胰島素原3符合式II，此時R1表示Phe(B1)，R2表示具有11個氨基酸殘基的肽，Y表示Thr(B30)，Z表示Ala Ala His His Arg(B31～B35)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
然后將前胰島素原3與胰蛋白酶和實施例11的羧肽酶B反應而得胰島素3。胰島素3符合式I，此時
R1表示Phe(B1)，Y表示Thr(B30)，Z表示Ala Ala His His(B31～B34)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
胰島素3具有下述氨基酸序列胰島素3(序列8)B鏈 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrAla Ala His HisA鏈 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫鍵。
胰島素4符合式I，此時R1表示Phe(B1)，Y表示Thr(B30)，Z表示Ala His His(B31～B33)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰島素的A鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～20)，而B2～B29表示人胰島素的B鏈的氨基酸序列(氨基酸殘基2～29)。
胰島素4具有下述氨基酸序列胰島素4(序列9)B鏈 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrAla His HisA鏈
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys SerLeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫鍵。實施例5胰島素衍生物的鋅結合在15℃下將胰島素的制劑(0.243mM人胰島素，0.13M NaCl，0.1％苯酚，80μg/ml(1.22mM)的Zn++，10mMTris/Hcl，pH.7.4)用10mM Tris/HCl pH7.4透析共40小時(16小時和24小時后更換緩沖液)。然后酸化透析液，用HPLC測定胰島素的濃度并用原子吸收光譜測定鋅。用不含胰島素的對照組的鋅含量校正鋅值，表1給出了結果表1
按本發(fā)明的式I的胰島素
實施例6人胰島素對狗的作用形式的鋅依賴性施藥法皮下劑量0.3IU/kg，制劑的pH為4.0每組實驗的狗數(shù)目(n)為6只表2顯示以起始值的％表示的血液萄萄糖表2
實施例7Gly(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)，Arg(B34)人胰島素對狗的作用形式(胰島素2)按實施例2制備的胰島素2被用于下述配方甘油20mg/ml；間甲酚2.7mg/ml，胰島素2 40IU/mlIU表示國際單位且相當于大約6nmol的胰島素，例如人胰島素或式I的胰島素。用NaOH或HCl調節(jié)pH。
施藥法皮下；劑量0.3IU/kg；受試驗的狗數(shù)為6，制劑的pH為4.0表3顯示以起始值的％表示的血液葡萄糖表3
實施例8Gly(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)人胰島素對狗的作用形式(胰島素4)將按實施例4制備的胰島素4如實施例7中那樣配方和應用。
施藥法皮下；劑量0.3IU/kg；n＝6；制劑的pH為4.0表4顯示以起始值的％表示的血液葡萄糖表4
實施例9Gly(A21)His(B31)，His(B32)人胰島素對狗的作用形式
(胰島素1)將按實施例1制備的胰島素1如實施例7那樣配方和應用。施藥法皮下；劑量0.3IU/kg；n＝6；制劑的pH為4.0表5顯示了以起始值的％表示的血液葡萄糖表5
實施例10Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34)人胰島素對狗的作用形式(胰島素3)將按實施例3制備的胰島素3如實施例7那樣配方和應用。
施藥法皮下；劑量0.3IU/kg；n＝6；制劑的pH為4.0表6顯示以起始值的％表示的血液萄萄糖表6
實施例11由前胰島素原1制備胰島素將200mg按實施例1制備的、其中一個Arg在B鏈的羧基端的胰島素溶于95ml 10mM HCl中。加入5ml pH為8的1M Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)/HCl后，用HCl或NaOH調節(jié)pH至8。
加入0.1mg羧肽酶B，90分鐘后，精氨酸裂解基本。加入HCl調節(jié)混合物的pH至3.5，泵入反相柱(PLRP-SRP300 10μ，2.5×30cm，Polymer Laboratories Amherst，MA，USA)。流動相A為含0.1％三氟乙酸的水，相B由含0.09％三氟乙酸的乙腈構成。在5ml/min的流速下操作柱子。加樣后，用150ml A洗柱子，用22.5～40％B的線性梯度在400分鐘內(nèi)進行分級洗脫，采用分析用反相HPLC分析各級分，合并足夠純的含Des-Arg-胰島素的級分。用NaOH將pH調至3.5，通過旋轉式蒸發(fā)器除去乙腈。然后將pH定到6.5使Des-Arg-胰島素沉淀。離心出沉淀物，用50ml水洗滌二次，最后凍干。胰島素1的產(chǎn)率為60～80％。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Hoechst Aktiengesellschaft(B)街—(C)城市Frankfurt am Main(D)州—(E)縣Bundesrepublik Deutschland(F)郵政編碼65926(G)電話069-305-6047(H)傳真069-35-7175(I)電報041234-700 hod(ii)發(fā)明名稱增強了鋅結合力的胰島素衍生物(iii)序列數(shù)16(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)(2)序列1的信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..21(xi)序列1描述Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln1 5 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Asn20(2)序列2的信息(i)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..30(xi)序列2描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)序列3的信息(i)序列特征(A)長度65個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..65(xi)序列3描述Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu35 40 45Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys50 55 60Gly65(2)序列4的信息(i)序列特征(A)長度53個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..53(xi)序列4描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His20 25 30Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu35 40 45Glu Asn Tyr Cys Gly50(2)序列5的信息(i)序列特征(A)長度66個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..66(xi)序列5描述Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val35 40 45Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr50 55 60Cys Gly65(2)序列6的信息(i)序列特征(A)長度55個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..55(xi)序列6描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His20 25 30His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr35 40 45Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly50 55(2)序列7的信息(i)序列特征(A)長度67個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..67(xi)序列7描述Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile35 40 45Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn50 55 60Tyr Cys Gly65(2)序列8的信息(i)序列特征(A)長度55個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..55(xi)序列8描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala20 25 30His His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr35 40 45Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly50 55(2)序列9的信息(i)序列特征(A)長度54個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物大腸桿菌(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..54(xi)序列9描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His20 25 30His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln35 40 45Leu Glu Asn Tyr Cys Gly50(2)序列10的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..39(xi)序列10描述TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG 39(2)序列11的信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..31(xi)序列11描述GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G 31(2)序列12的信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..31(xi)序列12描述ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G 31(2)序列13的信息(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征
(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..34(xi)序列13描述GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GTAG 34(2)序列14的信息(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..34(xi)序列14描述ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG 34(2)序列15的信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..37
(xi)序列15描述GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG 37(2)序列16的信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..37(xi)序列16描述ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG3權利要求
1.式I的胰島素 或式I的胰島素的生理上耐受的鹽，其中R1表示苯丙氨酸殘基或氫原子，R3表示基因可編碼的氨基酸殘基，Y表示基因可編碼的氨基酸殘基，Z表示a)氨基酸殘基His或b)具有2～35個基因可編碼的氨基酸殘基的肽，它含1～5個組氨酸殘基，而殘基A2～A20相應于人胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物的A鏈的氨基酸序列，并且殘基B2～B29相應于人胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物的B鏈的氨基酸序列。
2.權利要求1中要求的式I的胰島素，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示選自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸殘基，Y表示選自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸殘基，Z表示a)氨基酸殘基His或b)具有4～7個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
3.權利要求1中要求的式I的胰島素，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示選自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸殘基，Y表示選自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸殘基，Z表示a)氨基酸殘基His或b)具有2～7個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
4.權利要求3中要求的式I的胰島素，其中Z表示具有1～5個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
5.權利要求1～4的一項或多項中要求的式I的胰島素，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示選自Asn和Gly的氨基酸殘基，Y表示選自Thr和His的氨基酸殘基，而Z表示具有1～5個氨基酸殘基的肽，它含1或2個組氨酸殘基。
6.權利要求1中要求的式I的胰島素，其中R1表示苯丙氨酸殘基，R3表示甘氨酸殘基，Y表示蘇氨酸殘基而Z表示具有1～5個氨基酸殘基的肽。
7.權利要求6中要求的式I的胰島素，其中Z表示具有序列HisHis、His His Arg、Ala His His、Ala His His Arg、Ala Ala His His Arg或Ala Ala His His的肽。
8.含胰島素六聚體和每mol胰島素六聚體5～9mol Zn++、特別是每mol胰島素六聚體5～7mol Zn++的復合體，該胰島素六聚體由6個權利要求1～7中一項或多項要求的式I的胰島素分子構成。
9.一種藥物制劑，它含有效量的至少一種式I的胰島素和/或至少一種生理上耐受的、權利要求1～7的一項或多項中要求的式I的胰島素的鹽，該鹽以溶解的、無定形的和/或晶體形式存在。
10.權利要求9中要求的藥物制劑，其中添加1μg～2mg、優(yōu)選是5μg～200μg鋅/ml的含鋅量。
11.權利要求9或10中所要求的藥物制劑，其pH為2.5～8.5。
12.權利要求9～11的一項或多項中要求的藥物制劑，其pH為2.5～4.5。
13.權利要求9～12的一項或多項中要求的藥物制劑，它具有附加含量的未修飾胰島素、優(yōu)選是未修飾人胰島素，或修飾胰島素、優(yōu)選是Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰島素。
14.式II的胰島素原R2-R1-B2-B29-Y-Z1-Gly-A2-A20-R3(II)其中R3和Y同權利要求1～7的一項或多項中提出的式I中的定義，和R1表示苯丙氨酸殘基或共價鍵，和R2表示a)基因可編碼的氨基酸殘基或b)具有2～45個氨基酸殘基的肽，且殘基A2～A20和B2～B29相應于人胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物的A和B鏈的氨基酸序列。Z1表示具有2～40個基因可編碼的氨基酸殘基的肽，它具有1～5個組氨酸殘基。
15.權利要求14中要求的式II的胰島素原，其中R2表示具有2～25個氨基酸殘基的肽。
16.權利要求14或15中要求的式II的胰島素原，其中R2表示具有2～15個氨基酸殘基的肽，其中一個選自Met、Lys和Arg的氨基酸殘基在羧基端。
全文摘要
增強了鋅結合力的胰島素衍生物適合于制備用于治療多尿癥的藥物制劑I,其中Z表示組氨酸殘基或具有2～35個基因可編碼的氨基酸殘基的肽,后者含1～5個組氨酸殘基。式I的胰島素與鋅形成復合體,它含胰島素六聚體和大約5～9mol鋅/mol六聚體。
文檔編號A61P5/50GK1362417SQ0114366
公開日2002年8月7日 申請日期2001年12月17日 優(yōu)先權日1996年7月26日
發(fā)明者J·厄特, P·哈伯曼, K·蓋森, G·塞普克 申請人:赫徹斯特股份公司