專利名稱：一種眼藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種眼藥，特別是一種與預防和治療眼部新血管生成相關疾病的藥物。
新血管形成與許多眼部疾病有關，是致盲的主要原因之一。病理狀態(tài)下在眼部的不同成熟組織都可出現新血管生成，合并出血、滲出、增生等一系列的病變導致眼部結構和功能的破壞，嚴重損毀視力。角膜創(chuàng)傷、手術、感染，佩帶角膜接觸鏡，堿及化學物質燒傷等引起角膜新血管生成最易導致失明。虹膜新血管生成相關眼部疾病包括，新生血管性青光眼，視網膜脫離，糖尿病及腫瘤引起虹膜新血管生成。視網膜新生血管相關疾病包括糖尿病、年齡相關的黃斑變性，視網膜中央靜脈栓塞，視網膜分支靜脈栓塞，紅斑狼瘡，腫瘤，視網膜脫離等。脈絡膜新血管生成相關疾病包括年齡相關黃斑變性，炎癥或感染引起的眼科疾病等。
內皮抑素(endostatin)最初發(fā)現于小鼠血管內皮瘤細胞EOMA的培養(yǎng)上清中，具有強大的抑制新血管生成和抑制腫瘤形成、轉移的功能。自發(fā)現之初，就以其強大的抑瘤活性引起廣泛關注。作為腫瘤治療輔助藥物，內皮抑素在美國已經開始一期臨床實驗觀察，但其作用機理還未闡明。
本發(fā)明的目的是提供一種眼藥，它可以預防和治療與新血管生成相關的眼部疾病。
本發(fā)明的眼藥，其活性成分是內皮抑素。
它的輔劑可以是蒸餾水、生理鹽水等可以被人體接受，又可以溶解內皮抑素的物質。
它的劑型可以是水劑或膏劑，也可以是粉劑，用的時候先行溶解。
眼部新血管生成的過程包括血管基底膜的酶解，內皮細胞的趨化遷移，內皮細胞的增殖，血管管腔的形成，基底膜的重建。新血管生成中，對血管內皮基底膜的降解起作用的主要是基質外金屬蛋白酶MMP2、MMP9，這兩種酶可降解基底膜的主要基質蛋白膠原IV、V以及膠原I、II、III和糖蛋白等，是降解細胞外基質，引發(fā)新血管生成的主要蛋白酶。他們的含量在視網膜新血管生成過程中顯著升高，抑制MMP的活性可減少眼部新血管生成，治療由此引發(fā)的疾病。在新血管生成過程中血管內皮細胞起了關鍵的作用，抑制血管內皮細胞的激活、增殖也可抑制新血管生成。
內皮抑素是一種內源性新血管生成抑制因子，我們的實驗證據表明其抑制活性在多水平起作用，首先可通過誘導凋亡來抑制激活的血管內皮細胞增殖，其次還可抑制基質外金屬蛋白酶MMP2酶原的激活和MT1-MMP、MMP2、MMP9的活性。整合素αvβ3在新血管生成過程中起到重要作用，它的拮抗劑可以抑制新血管的生成，已有用αvβ3拮抗劑用做治療眼部新血管生成相關疾病，內皮抑素可與此整合素相互作用，并抑制新血管的生成，所以本發(fā)明將內皮抑素作為一種金屬蛋白酶抑制劑和整合素αvβ3的拮抗劑抑制眼部新血管生成，并將其用于與新血管生成相關的眼科疾病的預防、治療、輔助治療。
正常角膜基質形成一層抗血管穿透的屏障，并且存在抗新血管生成的因子，所以保持無血管狀態(tài)，而發(fā)炎、感染、外傷、同種異體角膜移植術后的排斥反應等會誘導打破保持角膜無血管的平衡因素，發(fā)生新生血管化(CNV)。新血管生成抑制劑有著良好的臨床應用前景。將內皮抑素制成滴眼液可預防角膜移植術后及外傷、感染引起的眼部新血管生成。
下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為內皮細胞增殖抑制實驗的直方2為本發(fā)明基質外金屬蛋白酶的酶譜檢測電泳結果圖3為雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗實施例1內皮細胞增殖抑制實驗(MTT法)96孔細胞培養(yǎng)板中按每孔100μl約104個細胞接種，人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)用20％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，人臍靜脈血管內皮細胞系(ECV304)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，作參照的人結腸癌細胞系(HT29)細胞用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃，5％CO2孵箱中24小時后換含2％血清的培養(yǎng)基，12小時后分別加10ng/ml人堿性成纖維細胞因子(bFGF)，10ng/mlbFGF+endostatin從10μg/孔起倍比稀釋，以PBS為對照每樣品重復3孔，加樣后培養(yǎng)32小時，每孔加入20μL噻唑蘭(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲亞砜(DMSO)放置15分鐘，充分溶解后用BioRad酶聯(lián)免疫比色儀在波長490下比色。
結果如圖1所示，通過以加入緩沖液PBS為對照的加入不同濃度的人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)與內皮抑素(分別為bFGF10ng；bFGF10ng+內皮抑素50ng；bFGF10ng+內皮抑素500ng；bFGF10ng+內皮抑素1ug)所進行的實驗證實，在加入相同劑量的bFGF的情況下，隨著加入內皮抑素劑量的增加，人臍靜脈血管內皮細胞的增長受到抑制，實施例2基質外金屬蛋白酶的酶譜檢測取內皮抑素處理組和對照組的人臍靜脈血管內皮細胞培養(yǎng)上清，1000轉/分離心10分鐘，再取上清11000轉/分離心50分鐘，取上清20μl加入2×上樣緩沖液(50mmol/L Tris-HCL，2％SDS，0.1％溴芬蘭，10％甘油，pH 6.8)，制備含有1mg/ml明膠的10％(wt/vol)聚丙烯酰胺凝膠，140V恒壓電泳。電泳完畢后將凝膠浸泡于2.5％(vol/vol)Triton X-100中溫和振蕩1小時，以便除去膠里的SDS。用ddH2O漂洗兩遍，再浸泡于復性液中(50mmol/L Tris-HCL，0.2mol/L NaCl，5mmol/L CaCl2，0.02％(wt/vol)，Brij-35，adjusted to pH7.6)，37℃溫育18個小時。在考馬斯亮藍G-250(30％甲醇，10％冰醋酸，0.5％考馬斯亮藍G-250)中染色3個小時，用脫色液(30％甲醇，10％冰醋酸)脫色。
結果如圖2所示，其中第1道為正常內皮細胞培養(yǎng)上清，第2道為內皮抑素刺激的內皮細胞培養(yǎng)上清，帶Pro-MMP2為酶原形式的金屬蛋白酶，在第1道中可以看到明顯的條帶，第2道中條帶明顯變淺，說明酶原形式的金屬蛋白酶量明顯減少。帶MMP2為切去前導序列后的金屬蛋白酶，在第1道中可以看到明顯的條帶，第2道中沒有條帶，說明經內皮抑素處理后，金屬蛋白酶基因沒有表達。
實施例3雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗9日齡的雞胚在氣室下方開0.5cm2的小洞露出尿囊膜，分別把沾有2μgbFGF，2μg bFGF和endostatin20μg，的無菌濾紙小塊(4mm2)放于尿囊膜上，用無菌透明膠封口，于37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時，打開雞胚觀察。
結果如圖3所示，A為用2μgbFGF處理的雞胚絨毛尿囊膜，B為用2μg bFGF和endostatin20μg處理的雞胚絨毛尿囊膜，從圖中可明顯看出，A中有明顯的血管網生成，B中沒有血管生成，說明內皮抑素抑制了血管的生成。
實施例4兔角膜新血管形成抑制試驗2.5-3.5kg新西蘭大白兔隨機分為兩組(不分雌雄)各6只。角膜囊袋的制作無菌條件下，3％戊巴比妥鈉兔耳緣靜脈注射麻醉25mg/kg，1％地卡因局部點眼麻醉，角膜中央作1.5mm、1/2角膜厚度切口，向6點位潛行分離1/2厚角膜囊袋，至距角膜緣2.0mm處，用玻璃套管植入制備好的緩釋藥丸，角膜囊袋復位。緩釋藥丸的制作，1ug人堿性成纖維細胞因子與聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯(Hydron)和硫糖鋁混合制成。實驗組植入緩釋藥丸后滴加含有內皮抑素的滴眼液，對照組滴加不含內皮抑素的滴眼液。觀察新血管形成的情況。
結果含有內皮抑素的滴眼液可顯著抑制兔角膜新血管的形成。對照組從術后第三天出現明顯的新血管生成，兩周的試驗期結束時，形成完整的毛細血管網，而內皮抑素治療組始終沒有明顯的新血管生成，只有少量不完整的小血管分支出現。
權利要求
1.一種眼藥，它的活性成分是內皮抑素。
2.根據權利要求1所述的一種眼藥，其特征在于它的輔劑是蒸餾水。
3.根據權利要求1所述的一種眼藥，其特征在于它的輔劑是生理鹽水。
4.根據權利要求1所述的一種眼藥，其特征在于它的劑型是水劑或膏劑。
5.根據權利要求1所述的一種眼藥，其特征在于它的劑型是粉劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼藥,它的活性成分是內皮抑素,它的輔劑可以是蒸餾水、生理鹽水等可以被人體接受,又可以溶解內皮抑素的物質,它的劑型可以是水劑或膏劑,也可以是粉劑,用的時候先行溶解。將內皮抑素制成滴眼液可預防角膜移植術后及外傷、感染引起的眼部新血管生成。
文檔編號A61K38/17GK1383892SQ0111570
公開日2002年12月11日 申請日期2001年4月29日 優(yōu)先權日2001年4月29日
發(fā)明者馮怡, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所