專利名稱：干擾素γ偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有干擾素γ樣活性的偶聯(lián)物，其制備方法，含有該分子的藥用組合物及其在疾病治療中的用途。
背景技術(shù)：
干擾素-γ(IFNG)是由T-淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子且以兩個非共價結(jié)合的多肽亞基的同型二聚體存在。各二聚體的成熟形式含有143個氨基酸殘基(SEQ ID NO2所示)，其前體形式包括166個氨基酸殘基的信號序列(SEQ ID NO1所示)。
各亞基具有兩個潛在的N-糖基化位點(Aggarwal等，人類細(xì)胞因子，Blackwell科學(xué)出版社，1992)在位置25和97。根據(jù)糖基化的程度，二聚體形式的IFNG分子量是34-50kDa(Farrar等，免疫學(xué)年鑒，1993，11571-611)。
Gray等(自然，298859-863，1982)，Taya等(EMBO J.1953-958，1982)，Devos等(核酸研究，102487-2501，1982)和Rinderknecht等(生物學(xué)化學(xué)雜志，2596790-6797，1984)及在EP77670，EP89676和EP110044中已報導(dǎo)了野生型人IFNG(huIFNG)的一級序列。Ealick等(科學(xué)，252698-702，1991)報導(dǎo)了huIFNG的三維結(jié)構(gòu)。
已報導(dǎo)了IFNG亞基多肽的各種天然存在的或突變的形式，包括一種包含Cys-Tyr-Cys N-末端氨基酸序列(相對于SEQ ID NO2的位置(-3)-(-1))的形式，一種包含N-末端甲硫氨酸(相對于SEQ ID NO2的位置-1)的形式，和含有127-134氨基酸殘基的各種C-末端截短形式。已知可從C-末端缺失1-15個氨基酸殘基而不破壞該分子的IFNG活性。而且，Pan等(歐洲生物化學(xué)雜志，166145-149，1987)已描述了huIFNG C-末端的異質(zhì)性。
Slodowski等(歐洲生物學(xué)化學(xué)雜志，2021133-1140，1991)，Luk等(生物學(xué)化學(xué)雜志，26513314-13319，1990)，Seelig等，(生物化學(xué)，271981-1987，1988)，Trousdale等(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，261244-1251，1985)，和在EP 146354中報導(dǎo)了HuIFNG突變體。Nishi等(生物化學(xué)雜志，97153-159，1985)報導(dǎo)了天然huIFNG變異體。
US6,046,034公開了插入4對半胱氨酸殘基使得二硫鍵形成且因此以同型二聚體的形式穩(wěn)定IFNG變異體的耐熱重組huIFNG(rhuIFNG)變異體。
WO 92/08737公開了在野生型人IFNG的全長(殘基1-143)或部分(殘基1-132)氨基酸序列的N末端含有添加的甲硫氨酸的IFNG變異體。EP219 781公開了含有氨基酸殘基3-124(SEQ ID NO2中)的部分huIFNG序列。US4,832,959公開了含有氨基酸序列的殘基l-127，5-146和5-127的部分huIFNG序列，該序列與SEQ ID NO2相比具有3個添加的N-末端氨基酸殘基(CYC)。US5,004,689公開了編碼無3個N-末端氨基酸殘基CYC的huIFNG的DNA序列及其在大腸桿菌中的表達(dá)。EP446582公開了大腸桿菌產(chǎn)生的不含N-末端甲硫氨酸的rhuIFNG。US6,120,762公開了含有其殘基95-134(相對于SEQ ID NO2)的huIFNG肽片斷。
Wang等(Sci.Sin.B241076-1084，1994)報導(dǎo)了rhuIFNG的高水平表達(dá)。
Curling等(生物化學(xué)雜志，272333-337，1990)和Hooker等，(干擾素和細(xì)胞因子研究雜志，1998，18287-295)報導(dǎo)了rhuIFNG中的糖基化變異體。
Kita等(Drug Des.Deliv.，6157-167，1990)，和在EP236987和US5109120中報導(dǎo)了rhuIFNG的聚合物修飾。
WO 92/22310報導(dǎo)了干擾素，特別是huIFNG的脫唾液酸糖蛋白偶聯(lián)物的衍生物。
IFNG融合蛋白已有描述。例如，EP237019公開了具有表現(xiàn)出干擾素β活性的區(qū)域和一個表現(xiàn)出IFNG活性的區(qū)域的單鏈多肽。
EP158,198公開了具有表現(xiàn)出IFNG活性的區(qū)域和表現(xiàn)出IL-2活性的區(qū)域的單鏈多肽。一些文獻(xiàn)描述了單鏈二聚體IFNG蛋白質(zhì)，例如Landar等(分子生物學(xué)雜志，2000，299169-179)。
WO 99/02710公開了單鏈多肽，其中的一個例子是IFNG。WO 99/03887公開了屬于生長激素超家族的多肽的PEG連接的變異體，其中，位于多肽特定區(qū)域的一個非必需氨基酸殘基被一個半胱氨酸殘基取代。IFNG作為生長激素超家族成員的一個例子被提及，但沒有詳細(xì)討論其修飾。
已有建議將IFNG用于治療間質(zhì)性肺疾病(也稱為間質(zhì)性肺纖維癥(IPF))(Ziesche等(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3411264-1269，1999和胸科，110增刊25S，1996)和EP795332)，為此可將IFNG與脫氫皮質(zhì)甾醇結(jié)合使用。除了IPF外，肉芽腫性疾病(Bolinger等，臨床藥物學(xué)，1992，11834-850)，某些分支桿菌感染(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3301348-1355，1994)，腎癌(泌尿?qū)W雜志，152841-845，1994)，石骨癥(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3321594-1599，1995)，硬皮病(風(fēng)濕病學(xué)雜志，23654-658，1996)，乙型肝炎(肝胃腸學(xué)，452282-2294，1998)，丙型肝炎(國際肝學(xué)通信，6264-273，1997)，膿毒性休克(自然醫(yī)學(xué)，3678-681，1997)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也可用IFNG治療。
作為藥用化合物，rhuIFNG被用于，例如抵抗某些病毒感染和腫瘤取得了一定的成功。rhuIFNG通常經(jīng)過腸胃外使用，優(yōu)選通過皮下，注射使用。7小時后發(fā)現(xiàn)最大血清濃度，血漿半壽期是在靜脈注射給藥后30分鐘。因此用rhuIFNG進(jìn)行有效治療需要經(jīng)常注射。主要的有害作用包括發(fā)燒，寒戰(zhàn)，出汗，頭痛，肌痛和嗜睡。這些效應(yīng)與注射rhuIFNG相聯(lián)系且在注射后第一個小時內(nèi)觀察到。罕見的副作用是局部疼痛和紅斑，肝臟酶升高，可逆的粒細(xì)胞和血小板減少癥及心臟毒性。
需要提供具有IFNG-活性的新分子，它在藥物動力學(xué)，均一性，免疫原性和其它有害副作用方面與huIFNG或rhuIFNG相比具有改進(jìn)的特性。
發(fā)明簡述本申請公開了提供一種或多種上述所需優(yōu)點的改進(jìn)的IFNG-樣分子。在第一個方面，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出IFNG活性且包含至少一個共價連接到IFNG多肽上的第一非多肽組分的偶聯(lián)物，該多肽含有的氨基酸序列與親本IFNG多肽區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個和/或去掉了至少一個含有非多肽組分的一個連接基團(tuán)的氨基酸殘基。該偶聯(lián)物與huIFNG和rhuIFNG相比體內(nèi)半壽期延長且任選與rhuIFNG相比引起的免疫反應(yīng)降低。任選的是，這類分子在均一性分子的產(chǎn)生能力，對蛋白裂解的穩(wěn)定性增強(qiáng)和/或生物有效性的提高方面也具有進(jìn)一步改進(jìn)的特性。
因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物提供了超過目前可獲得的IFNG化合物的許多優(yōu)點，包括注射或其它形式的給藥之間的間隔期間更長，副作用更少，和/或由于抗體減少而增強(qiáng)了效力。另外，經(jīng)過使用本發(fā)明的偶聯(lián)物可獲得更高劑量的活性蛋白且因此可獲得更有效的治療反應(yīng)。
在另一方面，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出IFNG活性且含有至少一個N-末端PEG連接的IFNG多肽的偶聯(lián)物。IFNG多肽可以是huIFNG或本文所述的任意IFNG多肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的偶聯(lián)物的工具(means)和方法，包括核苷酸序列和表達(dá)載體以及制備多肽或偶聯(lián)物的方法。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明的偶聯(lián)物的治療組合物，涉及用于治療的本發(fā)明的偶聯(lián)物或組合物，涉及偶聯(lián)物或組合物在治療或用于生產(chǎn)治療疾病的藥物中的用途。
最后，本發(fā)明涉及特定IFNG偶聯(lián)物在生產(chǎn)藥物中的用途，用于治療間質(zhì)性肺疾病，癌癥，感染性和/或炎癥性疾病的藥用組合物或試劑盒的一部分(kit-of-parts)，且在間質(zhì)性肺疾病的情況下，任選還與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用。
發(fā)明詳述定義在本申請和發(fā)明的說明書中使用了下列定義術(shù)語“偶聯(lián)物”(或可互換的“偶聯(lián)的多肽”)意指由一個或多個多肽共價連接到一個或多個非多肽組分上形成的雜合的(指復(fù)合或嵌合的意義)分子。術(shù)語共價連接的意思是多肽和非多肽組分直接共價連接到另一組分上，或者通過諸如橋，間隔，或連接組分等一個或多個間插組分間接共價連接到另一組分上。優(yōu)選的是，偶聯(lián)物在有關(guān)濃度和條件下是可溶的，即在諸如血液等生理學(xué)液體中是可溶的。本發(fā)明的偶聯(lián)多肽的例子包括糖基化和/或PEG連接的多肽。對于偶聯(lián)物的多肽部分可使用術(shù)語“未偶聯(lián)的多肽”。
術(shù)語“非多肽組分”意指能偶聯(lián)到IFNG多肽的連接基團(tuán)上的分子。該分子的優(yōu)選例子包括聚合物分子，親脂性化合物，糖組分或有機(jī)衍生物。當(dāng)在本發(fā)明的偶聯(lián)物環(huán)境中使用時應(yīng)理解非多肽組分通過多肽的連接基團(tuán)連接到偶聯(lián)物的多肽部分上。
術(shù)語“聚合物分子”定義為由兩個或多個單體共價連接形成的分子，其中沒有一個單體是氨基酸殘基，除非該聚合物是人白蛋白或另一高豐度血漿蛋白。術(shù)語“聚合物”可與術(shù)語“聚合物分子”互換使用。術(shù)語“糖組分”意指通過體內(nèi)或體外糖基化，例如N-或O-糖基化連接的碳水化合物分子。除非在偶聯(lián)物中的諸如聚合物分子的非多肽組分的數(shù)目在每次提及時特別指出是在偶聯(lián)物中所含的或者在本發(fā)明中使用的“一個非多肽組分”，否則應(yīng)當(dāng)是指偶聯(lián)物中的一個或多個非多肽組分。
術(shù)語“連接基團(tuán)”意指能偶聯(lián)到諸如聚合物分子或糖組分的有關(guān)非多肽組分上的氨基酸殘基基團(tuán)。有用的連接基團(tuán)及其匹配的非多肽組分從下表中是顯而易見的。
對于體內(nèi)N-糖基化，術(shù)語“連接基團(tuán)”以非傳統(tǒng)的方式使用，指組成N-糖基化位點的氨基酸殘基(具有序列N-X′-S/T/C-X″，其中X′是除脯氨酸外的任意氨基酸殘基，X″是可以與X′相同或不同且優(yōu)選不同于脯氨酸的任意氨基酸殘基，N是天冬酰胺且S/T/C是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，且最優(yōu)選蘇氨酸)。盡管N-糖基化位點的天冬酰胺殘基是糖基化期間連接糖組分的殘基，但除非存在N-糖基化位點的其它氨基酸殘基，否則將不能實現(xiàn)該連接。因此，當(dāng)非多肽組分是糖組分且經(jīng)過N-糖基化實現(xiàn)偶聯(lián)時，與親本多肽氨基酸序列改變相聯(lián)使用的術(shù)語“含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基”應(yīng)理解為組成N-糖基化位點的一個，兩個或所有氨基酸殘基以這樣的方式改變，即將功能性N-糖基化位點導(dǎo)入氨基酸序列或從所述序列中去掉該位點。
在本申請中，氨基酸名稱和原子名稱(例如CA，CB，CD，CG，SG，NZ，N，O，C，等)按蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)(www.pdb.org)的定義使用，該數(shù)據(jù)庫以IUPAC命名法(氨基酸和肽的IUPAC命名法和代號(殘基名稱，原子名稱等)，歐洲生物化學(xué)雜志，138，9-37(1984))及其在歐洲生物化學(xué)雜志，152，1(1985)中的修正為基礎(chǔ)。CA有時稱為Cα，CB稱為Cβ。術(shù)語“氨基酸殘基”意指包含在由丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，組氨酸(His或H)，異亮氨酸(Ile或I)，賴氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，甲硫氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，絲氨酸(Ser或S)，蘇氨酸(Thr或T)，纈氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)，和酪氨酸(Tyr或Y)殘基組成的組中的一個氨基酸殘基。在本文件中氨基酸殘基的編號從無信號肽的huIFNG的N-末端開始(即SEQ ID NO2)。鑒定氨基酸位置/取代所用的術(shù)語如下所述N25(表示SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中位置#25是天冬酰胺)。N25C(表示位置25的Asp殘基被Cys取代)。多個取代用“+”表示，例如，Q1N+P3T/S指在位置1用Asn取代Gln殘基且在位置3用Thr或Ser，優(yōu)選用Thr取代Pro殘基的氨基酸序列。
術(shù)語“核苷酸序列”意指兩個或多個核苷酸分子的連續(xù)鏈。核苷酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成來源，或其任意組合的核苷酸序列。
術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”一般指體外擴(kuò)增所需核苷酸序列的方法，例如，如US4,683,195所述。一般來說，PCR方法涉及使用能與模板核酸優(yōu)先雜交的寡核苷酸引物進(jìn)行引物延伸合成的重復(fù)循環(huán)。
“細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞”，“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”在本文中可互換使用且所有這些術(shù)語應(yīng)理解為包括細(xì)胞生長或培養(yǎng)產(chǎn)生的后代。“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可互換使用，指將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程。
“可操作地連接”指通過酶連接或者互相之間的構(gòu)型使得可行使序列的正常功能的方式將兩個或多個核苷酸序列共價連接。例如，如果編碼前序列或分泌先導(dǎo)序列的核苷酸序列作為參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)則它與多肽的核苷酸序列可操作地連接；如果啟動子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄則它與編碼序列可操作地連接；如果核糖體結(jié)合位點的位置有助于翻譯，則它與編碼序列可操作地連接。一般來說，“可操作地連接”意味著連接的核苷酸序列是連續(xù)的，且對于分泌的先導(dǎo)序列而言是連續(xù)的且在閱讀相(reading phase)中。經(jīng)過在方便的限制性位點連接來實現(xiàn)該連接。如果不存在該位點，那么可結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法使用合成寡核苷酸連接物或接頭。
術(shù)語“導(dǎo)入”首先是指現(xiàn)有氨基酸殘基的取代，但也可指插入其它的氨基酸殘基。術(shù)語“去掉”首先是指被去掉的氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代，但也指缺失(沒有取代)去掉的氨基酸殘基。
術(shù)語“含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基”是指氨基酸殘基是非多肽組分結(jié)合的(對于導(dǎo)入的氨基酸殘基)或結(jié)合過的(對于去掉的氨基酸殘基)氨基酸殘基。
對本文所述的IFNG多肽的氨基酸序列使用的術(shù)語“一個區(qū)別”或“多個區(qū)別”是指允許存在其它的區(qū)別。因此，除了特定的氨基酸區(qū)別外，可突變不是這些特定氨基酸殘基的其它氨基酸殘基。
術(shù)語“功能性體內(nèi)半壽期”以其正常含義使用，即50％的偶聯(lián)物分子在被清除前在血漿或血流中循環(huán)的時間(也稱為“血清半壽期”)，或保留50％的偶聯(lián)物給定功能的時間。多肽或偶聯(lián)物在正常情況下被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)，腎臟，脾臟或肝臟的一種或多種作用，或者被特異性或非特異性蛋白裂解清除。正常情況下，清除依賴于大小(相對于腎小球過濾的截留值)，電荷，連接的糖鏈，和蛋白質(zhì)細(xì)胞受體的存在。保留的功能正常情況下選自抗病毒，抗增生，免疫調(diào)節(jié)或IFNG受體結(jié)合活性。功能性體內(nèi)半壽期可用在下文方法部分進(jìn)一步討論的本領(lǐng)域已知的任何合適的方法測定。
術(shù)語“功能性體內(nèi)半壽期增加”用于指偶聯(lián)物的功能性體內(nèi)半壽期相對于在相當(dāng)條件下測定的對照分子，例如huIFNG，任選以糖基化形式，例如，未偶聯(lián)的huIFNG或rhuIFNG在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。
與給定物質(zhì)結(jié)合使用的術(shù)語“免疫原性”是指物質(zhì)誘導(dǎo)來自人免疫系統(tǒng)的反應(yīng)的能力。免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞或抗體介導(dǎo)的反應(yīng)(參見，例如，Roitt基礎(chǔ)免疫學(xué)(第8版，Blackwell)，可得到免疫原性的進(jìn)一步定義)。
術(shù)語“降低的免疫原性”是指本發(fā)明的偶聯(lián)物比在相當(dāng)條件下測定的對照分子，例如huIFNG或rhuIFNG產(chǎn)生可測定的更低的免疫反應(yīng)。
術(shù)語“表現(xiàn)出IFNG活性”是指多肽具有天然IFNG，特別是huIFNG或rhuIFNG的一種或多種功能，包括體外或體內(nèi)測定的結(jié)合IFNG受體的能力和引起huIFNG結(jié)合其受體時轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力(即體外或體內(nèi)生物活性)。Aguet等(細(xì)胞，55273-280，1988)和Calderon等(美國國家科學(xué)院院報，854837-4841，1988)已描述了IFNG受體?！癐FNG多肽”是表現(xiàn)出IFNG活性的多肽，本文按需要用于表示單體或二聚體形式的多肽。例如，當(dāng)表示特定取代時，正常情況下它們表示IFNG多肽單體的取代。當(dāng)作為本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG部分的對照時，一般是二聚體形式(且因此，例如，包含兩個按所述修飾的IFNG多肽單體)。通過正常締合兩個單體或者以單鏈二聚體IFNG多肽的形式可提供IFNG多肽的二聚體形式。
本文所述的IFNG多肽可與huIFNG或rhuIFNG具有相同大小的體內(nèi)或體外生物活性，或者更低或更高的活性，例如在相同條件下測量時具有1-100％的huIFNG或rhuIFNG的體內(nèi)或體外生物活性，例如，具有1-25％或1-50％或25-100％或50-100％的huIFNG或rhuIFNG的活性。
術(shù)語“親本IFNG”是指將要按照本發(fā)明進(jìn)行修飾的分子。一般來說，親本IFNG由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列可按本發(fā)明進(jìn)行修飾使其編碼本發(fā)明的偶聯(lián)物的多肽部分。親本IFNG一般是huIFNG或rhuIFNG或變異體或其片斷?！白儺愺w”是一種多肽，它與其親本多肽具有一個或多個氨基酸殘基的區(qū)別，一般是有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個氨基酸殘基的區(qū)別。片斷是表現(xiàn)出IFNG活性的全長huIFNG序列的一部分，例如，其C-末端或N-末端截短的形式。
術(shù)語“功能性位點”是指IFNG的功能或功效所必需的或者與之相關(guān)的一個或多個氨基酸殘基。該氨基酸殘基“位于”功能性位點。功能性位點可用本領(lǐng)域已知的方法測定且優(yōu)選經(jīng)過分析與諸如IFNG受體的相關(guān)受體復(fù)合的多肽結(jié)構(gòu)來鑒定。
本發(fā)明的偶聯(lián)物如上所述，在第一個方面，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出IFNG活性且含有共價連接到IFNG多肽上的至少一個第一非多肽組分的偶聯(lián)物，該多肽含有的氨基酸序列與親本IFNG多肽區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個和/或去掉了至少一個含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
通過去掉或?qū)牒蟹嵌嚯慕M分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基，可特異性地修改多肽以便制備與選定非多肽組分偶聯(lián)更敏感的分子，優(yōu)化偶聯(lián)方式(例如，保證非多肽組分在IFNG多肽表面的最佳分布)且因此獲得表現(xiàn)出IFNG活性且與目前獲得的基于huIFNG或rhuIFNG的分子相比改進(jìn)了一種或多種特性的新偶聯(lián)物分子。例如，經(jīng)過導(dǎo)入連接基團(tuán)，增強(qiáng)或改變了IFNG多肽與相關(guān)非多肽組分結(jié)合的特異性氨基酸殘基的含量，從而實現(xiàn)更有效，更特異和/或更廣泛的偶聯(lián)。通過去掉一個或多個連接基團(tuán)，可避免在多肽部分與非多肽組分形成不利的偶聯(lián)，例如，偶聯(lián)到位于或靠近多肽功能性位點的氨基酸殘基上(因為在該位點的偶聯(lián)可導(dǎo)致所得的偶聯(lián)物由于損害了受體識別而失活或降低IFNG活性)。另外，去掉緊靠另一連接基團(tuán)的一個連接基團(tuán)以避免與該基團(tuán)的不均一偶聯(lián)也是具有優(yōu)勢的。在優(yōu)選的實施方案中，改變IFNG多肽的一個以上的氨基酸殘基，例如，改變包含去掉和導(dǎo)入含有選定非多肽組分的連接位點的氨基酸殘基。據(jù)認(rèn)為該實施方案的具體益處在于可特異性地設(shè)計IFNG多肽，以便獲得與非多肽組分的最佳偶聯(lián)。
除了去掉和/或?qū)氚被釟埢猓嚯目珊衅渌〈?，該取代不涉及含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基的導(dǎo)入和/或去掉。
盡管按本發(fā)明修飾的親本多肽可以是具有IFNG活性的任意多肽，且因此可以是任何來源，例如，非人哺乳動物來源所衍生的，但優(yōu)選親本多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的huIFNG或其變異體或片斷。hIFNG變異體的例子在上文本發(fā)明的背景中描述，且包括，例如，具有N-末端添加CYC的huIFNG和US6,046,034所述的半胱氨酸修飾的變異體。片斷的具體例子是在上文本發(fā)明的背景部分公開的那些且包括C-末端截短1-15個氨基酸殘基，例如截短1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15個氨基酸殘基，和/或N-末端截短1-3個氨基酸殘基的huIFNG。
應(yīng)理解當(dāng)親本IFNG多肽是huIFNG的變異體或片斷時，從該親本制備的修飾的IFNG多肽包含該親本的突變或截短。
另外，親本IFNG多肽可以是IFNG多肽單體和另一同源性多肽之間的雜合分子，任選含有向該雜合分子導(dǎo)入的一個或多個其它的取代。該雜合體在上文本發(fā)明的背景部分描述。該雜合分子可含有的氨基酸序列與SEQ IDNO2所示的氨基酸序列有15個以上，例如10個以上的氨基酸殘基的區(qū)別。為了在本發(fā)明中有用，雜合分子表現(xiàn)出IFNG活性。
可按類似于本文所述的方法修飾非人類的親本IFNG’s，例如通過修飾與本文所述位置相應(yīng)的非人類的親本IFNG的位置(例如，從所述的IFNG與huIFNG的氨基酸序列的序列對比或三維結(jié)構(gòu)測定)。
應(yīng)理解含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基無論將被去掉或?qū)?，均?yīng)根據(jù)選定的非多肽組分部分的特性來選擇，在大多數(shù)情況下，根據(jù)所用的偶聯(lián)方法來選擇。例如，當(dāng)非多肽組分是聚合物分子，例如聚乙二醇或聚環(huán)氧烷衍生的分子時，能用作連接基團(tuán)的氨基酸殘基可選自半胱氨酸，賴氨酸，天冬氨酸，谷氨酸和精氨酸。當(dāng)非多肽組分是糖組分時，連接基團(tuán)是，例如體內(nèi)糖基化位點，優(yōu)選N-糖基化位點。
每當(dāng)按照本發(fā)明向IFNG多肽導(dǎo)入或去掉非多肽組分的連接基團(tuán)時，需修飾的多肽位置按如下進(jìn)行適當(dāng)選擇該位置優(yōu)選位于IFNG多肽的表面，且更優(yōu)選占據(jù)該位置的氨基酸殘基根據(jù)以其二聚體形式的IFNG三維結(jié)構(gòu)或模型測定其側(cè)鏈至少25％暴露于溶劑，優(yōu)選其側(cè)鏈至少50％暴露于溶劑，該結(jié)構(gòu)或模型任選進(jìn)一步包含一個或兩個IFNG受體分子。該位置(例如，代表在含有或不含受體分子的模型中超過25％或超過50％的表面暴露)在本文的材料和方法部分列出。
另外感興趣的是修飾親本IFNG的任意23個C-末端氨基酸殘基(經(jīng)過導(dǎo)入和/或去掉含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基)，因為據(jù)信該殘基位于IFNG多肽的表面。
另外，在本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分中，優(yōu)選去掉了位于IFNG的受體結(jié)合位點的連接基團(tuán)，優(yōu)選通過取代含有該基團(tuán)的氨基酸殘基來去掉。IFNG受體結(jié)合位點的氨基酸殘基在下文的材料和方法部分鑒定。對于單鏈IFNG多肽，僅在一個單體的受體結(jié)合位點去掉連接基團(tuán)就足夠且因此可獲得具有一個有活性的和一個失活的受體結(jié)合位點的單鏈IFNG多肽偶聯(lián)物。
為了測定連接基團(tuán)的最佳分布，根據(jù)IFNG二聚體多肽的三維結(jié)構(gòu)計算位于IFNG多肽表面的氨基酸殘基之間的距離。更具體的說，測定含有該連接基團(tuán)的氨基酸殘基的CB之間的距離，或者測定一個氨基酸殘基的官能團(tuán)(賴氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)與含有連接基團(tuán)的另一氨基酸殘基的CB之間的距離。對于甘氨酸，使用CA代替CB。在本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分中，任何所述的距離優(yōu)選超過8，特別是超過10以避免或減少不均一性偶聯(lián)。
另外，IFNG多肽的氨基酸序列與親本IFNG多肽的區(qū)別在于去掉了組成表位部分的一個或多個氨基酸殘基，優(yōu)選通過取代含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基，以便破壞或滅活表位。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，也稱為表位定位法，可鑒定huIFNG或rhuIFNG的表位，參見，例如Romagnoli等，生物化學(xué)，1999，380(5)553-9，DeLisser HM，分子生物學(xué)方法，1999，9611-20，Van de Water等，臨床免疫學(xué)和免疫病理學(xué)，1997，85(3)229-35，Saint-Remy JM，毒理學(xué)，1997，119(1)77-81，以及Lane DP和Stephen CW，一般免疫學(xué)觀點，1993，5(2)268-71。一個方法是建立表達(dá)例如9個氨基酸殘基的隨機(jī)寡肽的噬菌體展示文庫。通過免疫沉淀法從抗huIFNG或rhuIFNG的特異性抗血清純化IgGl抗體且通過免疫印跡鑒定反應(yīng)的噬菌體。通過測序純化的反應(yīng)噬菌體的DNA，可測定寡肽的序列，隨后在IFNG的三維結(jié)構(gòu)上定位該序列。由此鑒定的該結(jié)構(gòu)上的區(qū)域構(gòu)成表位，然后可選擇該表位作為導(dǎo)入非多肽組分的連接基團(tuán)的靶區(qū)域。
為了避免過多地破壞親本IFNG分子的結(jié)構(gòu)和功能，按照本發(fā)明改變的氨基酸殘基的總數(shù)(與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相比)一般不超過15個。優(yōu)選的是，IFNG多肽含有的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有1-15個氨基酸殘基的區(qū)別，例如1-8或2-8個氨基酸殘基的區(qū)別，例如與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有l(wèi)-5或2-5個氨基酸殘基的區(qū)別。因此，正常情況下IFNG多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列成熟部分有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個氨基酸殘基的區(qū)別。優(yōu)選的是，上述數(shù)目代表導(dǎo)入的或者去掉的含有相關(guān)非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基的總數(shù)，或者代表導(dǎo)入及去掉的含有該基團(tuán)的氨基酸殘基的總數(shù)。
偶聯(lián)所需的且在二聚體形式的IFNG多肽中存在的連接基團(tuán)的精確數(shù)目依賴于需要通過偶聯(lián)來實現(xiàn)的效果。所得的效果依賴于，例如，偶聯(lián)的特性和程度(例如，非多肽組分的特性，偶聯(lián)到多肽上所需的或可能的非多肽組分的數(shù)目，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行的偶聯(lián)或應(yīng)當(dāng)避免的偶聯(lián)等)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分可以是截短的形式(例如，如上文所述相對于親本IFNG多肽截短1-15個C-末端氨基酸殘基，或截短1-3個N-末端氨基酸殘基)。
功能性體內(nèi)半壽期依賴于，例如，偶聯(lián)物的分子量和提供延長半壽期所需的連接基團(tuán)數(shù)目，因此依賴于所述非多肽組分的分子量。在一個實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物具有至少67kDa的分子量，特別是按Laemmli，U.K.，自然，第227卷(1970)，p680-85所述通過SDS-PAGE測量為至少70kDa。IFNG的分子量范圍是大約34-50kDa，因此需要另外的大約20-40kDa以獲得所需的效果。例如，可通過2-4個10kDa的PEG分子或者按本文所述提供。
在本發(fā)明的偶聯(lián)物中，優(yōu)選至少大約50％的所有可偶聯(lián)的連接基團(tuán)，例如至少80％且優(yōu)選所有這些基團(tuán)被有關(guān)非多肽組分占據(jù)。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物包含，例如，1-10個非多肽組分，如2-8個或3-6個。
如上所述，在生理學(xué)條件下，IFNG作為二聚體多肽存在。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分一般是同型二聚體形式(例如，通過締合按本文所述制備的兩個IFNG多肽分子來制備)。然而，如果需要，本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分可以單鏈形式提供，其中兩個IFNG多肽單體可通過肽鍵或肽接頭連接。以單鏈形式提供IFNG多肽的優(yōu)勢在于兩個組分IFNG多肽可以不同，這種不同有利于，例如，允許多肽的不對稱誘變。例如，從一個單體的受體結(jié)合位點去掉PEG連接位點，但保留另一個單體的位點。因此，在PEG連接后，一個單體具有完整的受體結(jié)合位點，而另一個被充分PEG連接(且因此提供顯著增大的分子量)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的偶聯(lián)物具有一個或多個下列改進(jìn)的特性1)與huIFNG或rhuIFNG相比增強(qiáng)了功能性體內(nèi)半壽期，例如，增加了大約至少5倍，例如至少10倍或更高。2)與huIFNG或rhuIFNG相比降低了免疫原性，例如降低了至少25％，例如至少50％，且更優(yōu)選至少75％。
非多肽組分是糖組分時的本發(fā)明偶聯(lián)物在本發(fā)明偶聯(lián)物的優(yōu)選實施方案中，第一非多肽組分是糖組分，例如O-連接的或N-連接的糖組分，且IFNG多肽包含至少一個去掉的和/或至少一個導(dǎo)入的體內(nèi)糖基化位點。
例如，將體內(nèi)糖基化位點導(dǎo)入相當(dāng)于親本IFNG多肽中被暴露于多肽表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置，優(yōu)先該氨基酸殘基具有超過25％的側(cè)鏈暴露于溶劑中，特別是超過50％暴露于溶劑中(這些位置在本文的方法部分鑒定)。N-糖基化位點以這樣的方式導(dǎo)入，即所述位點的N-殘基位于所述位置。類似的是，導(dǎo)入O-糖基化位點以便組成該位點的S或T殘基位于所述位置。另外，為了保證有效糖基化，優(yōu)選體內(nèi)糖基化位點，特別是N-糖基化位點的N殘基或O-糖基化位點的S或T殘基位于IFNG多肽的118個N-末端氨基酸殘基內(nèi)，更優(yōu)選在93個N-末端氨基酸殘基內(nèi)。另外更優(yōu)選的是，體內(nèi)糖基化位點導(dǎo)入的位置是只需要一個突變就可產(chǎn)生該位點(即，產(chǎn)生功能性糖基化位點所需的任何其它氨基酸殘基已存在于該分子中)。
例如，導(dǎo)致在暴露于IFNG多肽表面且被具有超過25％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點的取代包括Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，S40N+R42S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，D63N，D63N+S65T，Q64N+166S/T，S65N+Q67S/T，Q67N，Q67N+S69T，K68N+V70S/T，E71N+173S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/T，K80N+F82S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，E119N，E119N+S121T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F(xiàn)136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相對于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的huIFNG。S/T表示取代成絲氨酸或蘇氨酸殘基，優(yōu)選蘇氨酸殘基。
導(dǎo)致在暴露于IFNG多肽表面且具有超過50％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點的取代包括P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40S/T，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，D62N+Q64S/T，Q64N+166S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+173S/T，E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F(xiàn)136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相對于具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列的huIFNG。
導(dǎo)入一個N-糖基化位點時僅需要一個氨基酸突變的那些取代包括K12S/T，G18S/T，G18N，K37S/T，E38N，M45N，149N，K61S/T，D63N，Q67N，V70N，K80S/T，F(xiàn)82N，N85S/T，K87S/T，K94N，S99N，Q106S/T，E119N，A124N，K130N和R140N，特別是K12S/T，G18N，G18S/T，K37S/T，E38N，K61S/T，D63N，Q67N，K80S/T，N85S/T，K94N，S99N，Q106S/T，A124N，K130N，和R140N(具有超過25％的側(cè)鏈暴露于表面(在不含受體分子的結(jié)構(gòu)中)的位置)，或更優(yōu)選G18N，E38N，D63N，Q67N，K94N，S99N，A124N，K130N和R140N(在不含受體分子的結(jié)構(gòu)中具有超過50％的側(cè)鏈暴露于表面)。
從上面所列的取代中，優(yōu)選選擇位于118個N-末端氨基酸殘基內(nèi)的取代，特別是位于93個N-末端氨基酸殘基內(nèi)的取代。
如上所述，除了一個或多個導(dǎo)入的糖基化位點，可從IFNG多肽去掉已有的糖基化位點。例如，導(dǎo)入糖基化位點的任意上述取代可與去掉huIFNG的任意兩個天然N-糖基化位點的取代結(jié)合。例如，IFNG多肽可包含N25和/或N97的取代，例如，取代N25K/C/D/E和/或N97K/C/D/E的多肽，如果本發(fā)明的偶聯(lián)物包含一個非多肽，則多肽具有相關(guān)K，C，D，E作為連接基團(tuán)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分每個單體可含有單個體內(nèi)糖基化位點。然而，為了變成足夠大小以增加功能性體內(nèi)半壽期，通常需要該多肽包含一個以上的體內(nèi)糖基化位點，特別是2-7個體內(nèi)糖基化位點，例如2，3，4，5，6或7個體內(nèi)糖基化位點。因此，IFNG多肽的每個單體可包含一個增加的糖基化位點，或者可包含兩個，三，四，五，六，七或更多個導(dǎo)入的體內(nèi)糖基化位點，優(yōu)選通過一個或多個任意上面所列的取代進(jìn)行導(dǎo)入。
去掉和/或?qū)塍w外糖基化位點可按下面部分對于修飾IFNG多肽以導(dǎo)入和/或去掉聚合物連接位點所述實現(xiàn)。
本部分公開的具有導(dǎo)入和/或去掉至少一個糖基化位點的任意糖基化IFNG多肽可進(jìn)一步偶聯(lián)到第二非多肽組分上。例如，第二非多肽組分是聚合物分子，例如PEG，或者可以是任何其它非多肽組分。為達(dá)到該目的，通過使用已存在于IFNG多肽中的連接基團(tuán)可實現(xiàn)該偶聯(lián)，或者連接基團(tuán)已被導(dǎo)入和/或去掉，特別是導(dǎo)致總共1-6個，特別是3-4個或者1，2，3，4，5，或6個連接基團(tuán)可用于偶聯(lián)。優(yōu)選的是，在本發(fā)明的偶聯(lián)物中，如果IFNG多肽含有兩個糖基化位點，可選擇非多肽組分的數(shù)目和分子量以便通過非多肽組分增加的總分子量范圍為20-40kDa，特別是大約20kDa或30kDa。
具體來說，糖基化的IFNG多肽可偶聯(lián)到具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的聚合物上。為達(dá)到該目的，可向IFNG多肽中插入一個或多個半胱氨酸殘基，例如，如標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子”的部分所述。
任選或者此外，糖基化的IFNG多肽可偶聯(lián)到具有賴氨酸作為連接基團(tuán)的聚合物上。為達(dá)到該目的，例如，可通過按標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是具有賴氨酸作為連接基團(tuán)的分子”的部分所述的任意取代去掉親本多肽的一個或多個賴氨酸殘基。任選或者此外，例如通過在所述部分提及的任意取代可導(dǎo)入賴氨酸殘基。
作為通過半胱氨酸或賴氨酸基團(tuán)偶聯(lián)聚合物的另一選擇，可通過按標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分結(jié)合到酸性基團(tuán)上”的部分所述的酸性基團(tuán)，或者通過任何其它合適的基團(tuán)實現(xiàn)偶聯(lián)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中第一非多肽組分是聚合物在另一實施方案中，第一非多肽組分是聚合物，例如，在標(biāo)題為“與聚合物分子的偶聯(lián)”部分所述的任意聚合物，特別是線性的或分支的PEG分子，例如具有半胱氨酸，賴氨酸，天冬氨酸和谷氨酸作為連接基團(tuán)的分子。該聚合物連接基團(tuán)的導(dǎo)入和/或去掉在下面部分說明。根據(jù)該實施方案的偶聯(lián)物的IFNG多肽部分可以是糖基化的多肽，例如，使用huIFNG的一個或兩個天然N-糖基化位點或按相鄰前一部分所述導(dǎo)入的糖基化位點。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子在優(yōu)選的實施方案中，第一非多肽組分是具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的聚合物且將至少一個半胱氨酸殘基導(dǎo)入在野生型人類IFNG中被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的IFNG多肽的位置中。優(yōu)選的是，按照在標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)物”部分提供的導(dǎo)入和/或去掉非多肽組分的連接基團(tuán)的一般考慮因素導(dǎo)入半胱氨酸殘基。例如，IFNG多肽可包括至少一個選自P3C，K6C，N10C，K13C，N16C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，K37C，E38C，E39C，K55C，K58C，N59C，D62C，Q64C，S65C，K68C，E71C，E75C，N83C，S84C，K86C，K87C，K94C，N97C，S99C，T101C，D102C，L103C和N104C(導(dǎo)入半胱氨酸殘基的位置被具有超過50％的側(cè)鏈暴露于具有受體的結(jié)構(gòu)表面的氨基酸殘基占據(jù))的取代。當(dāng)IFNG多肽在諸如大腸桿菌的非糖基化宿主細(xì)胞中表達(dá)時，取代N25C和N97C特別有利，尤其是N25C+N97C，因為N25和N97組成huIFNG的內(nèi)在糖基化位點的一部分。
另外或任選，根據(jù)該實施方案的IFNG多肽可包含在被huIFNG的氨基酸殘基121-143的任意殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入至少一個半胱氨酸殘基。
優(yōu)選的是，根據(jù)該方面的偶聯(lián)物的IFNG多肽每個單體包含總數(shù)為1-8個，例如2-6個Cys殘基，例如1-3個Cys殘基。
多肽和聚合物之間的偶聯(lián)可以任意合適的方式實現(xiàn)，例如，按在標(biāo)題為“與聚合物分子的偶聯(lián)”部分所述，例如，使用在所述部分提及的一步法或逐步方式。當(dāng)偶聯(lián)物包含兩個或多個第一非多肽組分時，正常情況下，這些組分的每個具有5或10kDa的分子量。合適的聚合物是VS-PEG。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽部分是具有賴氨酸作為連接基團(tuán)的分子根據(jù)該實施方案，非多肽是具有賴氨酸作為連接基團(tuán)的聚合物，且對IFNG多肽的修飾是去掉了至少一個賴氨酸殘基，該賴氨酸殘基選自K6，K12，K13，K34，K37，K43，K55，K58，K61，K68，K74，K80，K86，K87，K88，K94，K108，K125，K128和K130，編號相對于SEQ ID NO2作出。更優(yōu)選的是，去掉至少一個選自K12，K34，K37，K108，K128和K130的賴氨酸殘基。從而，可避免該殘基的偶聯(lián)?？捎萌魏纹渌被釟埢〈嚢彼釟埢?，但優(yōu)選用精氨酸或谷氨酰胺取代。
另外，可修飾IFNG多肽以導(dǎo)入一個或多個賴氨酸殘基，特別是在被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的huIFNG的位置。優(yōu)選的是，按照在標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)物”部分提供的導(dǎo)入和/或去掉非多肽組分的連接基團(tuán)的一般考慮因素導(dǎo)入賴氨酸殘基，特別是在被具有至少25％，例如至少50％的側(cè)鏈暴露于表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置(該位置在本文的材料和方法部分鑒定)。另外，經(jīng)過取代SEQ ID NO2的氨基酸殘基121-143的任意殘基可導(dǎo)入至少一個賴氨酸殘基。作為選擇，IFNG多肽可在至少一個下列位置含有賴氨酸，該位置選自SEQ ID NO2的D2，E7，E9，H19，D21，D24，N25，E38，E39，D41，R42，D62，D63，E71，E75，D76，R89，D90，D91，E93，N97，R107，H111，E112，E119，R129，R131，R137，R139和R140(huIFNG中被N，R，D，E或H殘基占據(jù)的位置)。
根據(jù)該實施方案，IFNG多肽的每個單體在一個或多個上述位置含有取代，特別是在1-15，例如1-8或2-8，優(yōu)選在1-5或2-5個位置(賴氨酸殘基的取代和/或?qū)?。例如，IFNG多肽可在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個上述位置含有取代。當(dāng)IFNG多肽在諸如大腸桿菌的非糖基化宿主細(xì)胞中表達(dá)時，取代N25K和N97K特別有利，尤其是N25K+N97K，因為N25和N97組成huIFNG的部分內(nèi)在糖基化位點。
例如，根據(jù)該實施方案的偶聯(lián)物的IFNG多肽可包含至少一個用于導(dǎo)入賴氨酸殘基的上述取代結(jié)合至少一個如上限定的去掉賴氨酸殘基的取代(優(yōu)選取代成R或Q)。例如，IFNG多肽含有下列取代N25K和N97K的至少一個結(jié)合取代K128R，K128Q，K130R和K130Q的至少一個。甚至更具體的說，IFNG多肽包含取代N25K+K128R，N25K+K130R，N25K+K128R+K130R，N97K+K128R，N97K+K130R，N97K+K128R+K130R，N25K+N97K+K128R+K130R，N25K+N97K+K128R和N25K+N97K+K130R。
盡管根據(jù)本發(fā)明該方面的偶聯(lián)物的非多肽組分可以是任意分子，當(dāng)使用給定的偶聯(lián)方法時該分子具有賴氨酸作為連接基團(tuán)(例如，糖組分，親脂性基團(tuán)或有機(jī)物衍生的試劑)，但優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子。聚合物分子可以是在標(biāo)題為“聚合物分子的偶聯(lián)”部分提及的任何分子，但優(yōu)選選自線性或分支聚乙二醇或聚環(huán)氧烷。更優(yōu)選的是，聚合物分子是來自Shearwater聚合物公司的SS-PEG，NPC-PEG，醛-PEG，mPEG-SPA，mPEG-SCM或mPEG-BTC，來自Enzon公司的SC-PEG，US5,880,255中所述的tresylatedmPEG或氧羰基-氧-N-二羧酰亞胺-PEG(US5,122,614)。一般來說，為了與賴氨酸殘基偶聯(lián)，非多肽組分具有大約5或10kDa的分子量。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分與酸性基團(tuán)結(jié)合在另一實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物的非多肽部分是具有酸性基團(tuán)作為連接基團(tuán)的分子，且IFNG多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列區(qū)別在于至少一個表面暴露的氨基酸殘基被天冬氨酸殘基或者谷氨酸殘基取代，優(yōu)選按照在標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)物”部分提供的一般考慮因素進(jìn)行取代。
另外，可將Asp或Glu殘基導(dǎo)入親本IFNG多肽中被K，R，Q或N占據(jù)的位置。例如，可用Asp或Glu殘基取代N25，N97，K125，K128，R129，K130和/或R131，更優(yōu)選N25和/或N97，最優(yōu)選N25+N97。
類似于前面部分所作的描述，可從例如，受體結(jié)合位點去掉一個或多個Asp或Glu殘基，如果非多肽組分是與這些殘基結(jié)合的組分。
盡管具有酸性基團(tuán)作為連接基團(tuán)的根據(jù)本發(fā)明該方面的偶聯(lián)物的非多肽組分可以是具有該特性的任意非多肽組分，但目前優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子或有機(jī)衍生試劑，特別是聚合物分子，且偶聯(lián)物按例如，Sakane和Pardridge，制藥學(xué)研究，第14卷，第8期，1997，第1085-1091頁所述制備。
本發(fā)明偶聯(lián)物的非多肽組分如上文所述，本發(fā)明偶聯(lián)物的非多肽組分優(yōu)選選自聚合物分子，親脂化合物，糖組分(例如通過體內(nèi)糖基化)和有機(jī)衍生試劑。所有這些試劑可賦予偶聯(lián)物的多肽部分所需的特性，特別是增加功能性體內(nèi)半壽期和/或降低免疫原性。偶聯(lián)物的多肽部分一般僅偶聯(lián)到一種類型的非多肽組分上，但也可偶聯(lián)到兩種或多種不同類型的非多肽組分上，例如，偶聯(lián)到聚合物分子和糖組分上，偶聯(lián)到親脂基團(tuán)和糖組分上，偶聯(lián)到有機(jī)衍生試劑和糖組分上，偶聯(lián)到親脂基團(tuán)和聚合物分子上等。偶聯(lián)到兩個或多個不同非多肽組分上可同時或依次進(jìn)行。
制備本發(fā)明的偶聯(lián)物的方法在以下章節(jié)“與親脂化合物的偶聯(lián)”，“與聚合物分子的偶聯(lián)”，“與糖組分的偶聯(lián)”和“與有機(jī)衍生試劑的偶聯(lián)”中，描述與具體類型的非多肽組分的偶聯(lián)。
與親脂化合物的偶聯(lián)多肽和親脂化合物可直接或者通過使用接頭互相偶聯(lián)。親脂化合物可以是天然化合物，例如飽和或不飽和脂肪酸，脂肪酸二酮，萜烯，前列腺素，維生素，類胡蘿卜素或類固醇，或者是合成化合物，例如具有一個或多個烷基，芳香基，鏈烯基或其他多個不飽和化合物的羧酸，醇，胺和磺酸。多肽和親脂化合物之間任選通過接頭的偶聯(lián)可按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如，Bodanszky在肽的合成，John Wiley，紐約，1976和在WO 96/12505中所述。
與聚合物分子的偶聯(lián)與多肽偶聯(lián)的聚合物分子可以是任意合適的聚合物分子，例如天然或合成同型聚合物或雜聚物，一般具有的分子量范圍是300-100,000Da，例如300-20,000Da，更優(yōu)選500-10,000Da，甚至更優(yōu)選500-5000Da。
同型聚合物的例子包括多元醇(即poly-OH)，多胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)。雜聚物是一種聚合物，它包含一個或多個不同的偶聯(lián)基團(tuán)，例如，羥基和胺基。
合適的聚合物分子的例子包括選自下列分子的聚合物分子聚環(huán)氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚亞乙基-共-馬來酸酐，聚苯乙烯-共-馬來酸酐，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，或者適合于降低免疫原性和/或增加功能性體內(nèi)半壽期和/或血清半壽期的任何其他生物聚合物。聚合物分子的另一例子是人白蛋白或另一高豐度血漿蛋白。一般來說，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的，無毒，無抗原性，無免疫原性的，具有不同水溶性特性，且容易從活生物體排泄掉。
PEG是優(yōu)選的待用聚合物分子，因為它與例如，諸如葡聚糖等的多糖相比僅具有較少的能交聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)。具體來說，單功能性PEG，例如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)是令人感興趣的，因為其偶聯(lián)化學(xué)相對簡單(僅一個反應(yīng)基團(tuán)可用于與多肽上的連接基團(tuán)偶聯(lián))。因此，消除了交聯(lián)的風(fēng)險，所得的多肽偶聯(lián)物均一性更好且聚合物分子與多肽的反應(yīng)更易于控制。
為了實現(xiàn)聚合物分子與多肽的共價連接，聚合物分子的羥基末端基團(tuán)必須以活化形式提供，即，具有反應(yīng)性官能團(tuán)(該基團(tuán)的例子包括伯胺基團(tuán)，酰肼(HZ)，巰基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)，羧甲基化琥珀酰亞胺(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，醛，硝基苯碳酸酯(NPC)，和tresylate(TRES))。適當(dāng)活化的聚合物分子是商業(yè)上可獲得的，例如從Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA獲得。另外，聚合物分子可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法活化，例如按WO 90/13540公開的方法。用于本發(fā)明的活化的線性或分支聚合物分子的具體例子在Shearwater Polymer，Inc.1997和2000年產(chǎn)品目錄(用于研究和制藥的功能化生物相容性聚合物，聚乙二醇和衍生物，本文引用以供參考)中描述。活化的PEG聚合物的具體例子包括下列線性PEGsNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分支PEGs，例如PEG2-NHS和在US5,932,462和US5,643,575中公開的那些分子，本文引用這兩篇文獻(xiàn)以供參考。另外，本文作為參考文獻(xiàn)引用的下列文獻(xiàn)公開了有用的聚合物分子和/或PEG連接的化學(xué)性質(zhì)US5,824,778，US5,476,653，WO 97/32607，EP229，108，EP402,378,US4,902,502,US5,281,698，US5,122,614，US5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，W095/13090，WO95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO95/06058，EP439,508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP921，131，US5,736,625，WO 98/05363，EP809 996，US5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP605 963，US5,382,657，EP510 356，EP400 472，EP183 503和EP154 316。
多肽與活化的聚合物分子的偶聯(lián)經(jīng)過使用任何常規(guī)方法進(jìn)行，例如按下列文獻(xiàn)所述的方法(它們也描述了用于聚合物分子活化的合適方法)Harris和Zalipsky，編輯，聚(乙二醇)化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用，AZC，華盛頓；R.F.Taylor，(1991)，“蛋白質(zhì)的固定化，基礎(chǔ)和應(yīng)用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)的化學(xué)”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定化的親和配體技術(shù)”，學(xué)術(shù)出版社，紐約)。技術(shù)人員將明白所用的活化方法和/或偶聯(lián)化學(xué)依賴于IFNG多肽的連接基團(tuán)以及聚合物的官能團(tuán)(例如，是氨基，羥基，羧基，醛或巰基)。PEG化可針對與多肽上所有可獲得的連接基團(tuán)(即暴露于多肽表面的連接基團(tuán))的偶聯(lián)或者可針對特異性連接基團(tuán)，例如N-末端氨基(US5,985,265)。另外，偶聯(lián)可用一步法或者以逐步方式實現(xiàn)(例如按WO 99/55377所述)。
應(yīng)明白可設(shè)計PEG化以產(chǎn)生對于連接的PEG分子數(shù)目，該分子的大小和形式(例如，不論它們是線性的還是分支的)最佳的分子，且其中該分子與該多肽連接。例如，可根據(jù)所要達(dá)到的效果選擇所用的聚合物的分子量。例如，如果偶聯(lián)的首要目的是實現(xiàn)具有高分子量的偶聯(lián)(例如，以便降低腎臟清除率)，通常需要偶聯(lián)盡可能少的高分子量的聚合物分子以獲得所需分子量。當(dāng)需要高度屏蔽表位時，可通過使用足夠多數(shù)量的低分子量聚合物(例如，具有大約5,000Da的分子量)以有效屏蔽該多肽的所有或大多數(shù)表位來獲得。例如，可使用2-8個，例如3-6個該聚合物。
僅與蛋白質(zhì)上的單個連接基團(tuán)偶聯(lián)時(如US5,985,265中所述)，優(yōu)選線性或分支的聚合物分子具有高分子量，例如，大約20kDa。
一般來說，在能使聚合物的所有可利用的連接基團(tuán)與聚合物分子反應(yīng)的條件下進(jìn)行聚合物偶聯(lián)。典型的是，活化型聚合物分子與多肽的摩爾比是1000-1，特別是200-1，優(yōu)選100-1，例如10-1或5-1以便獲得最佳反應(yīng)。然而，也可使用等摩爾比率。
根據(jù)本發(fā)明還包括通過接頭偶聯(lián)聚合物分子與多肽。合適的接頭是技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的例子是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物學(xué)化學(xué)雜志，252，3578-3581；US4,179,337；Shafer等，(1986)，高分子科學(xué)和高分子化學(xué)雜志，編輯，24，375-378)。
偶聯(lián)后，按照本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過向反應(yīng)混合物中加入伯胺封閉殘余的活化型聚合物分子，并通過合適的方法去除所得的失活型聚合物分子。
與糖組分的偶聯(lián)糖組分的偶聯(lián)可在體內(nèi)或者體外發(fā)生。為了實現(xiàn)經(jīng)過修飾以導(dǎo)入一個或多個體內(nèi)糖基化位點(見“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是糖組分”部分)的具有IFNG活性的多肽的體內(nèi)糖基化，將編碼偶聯(lián)物的多肽部分的核苷酸序列插入糖基化的真核表達(dá)宿主中。表達(dá)宿主細(xì)胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)，昆蟲或動物細(xì)胞或者選自轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。另外，當(dāng)在基因治療中使用編碼本發(fā)明的偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明的多肽的核苷酸序列時可在人體內(nèi)實現(xiàn)糖基化。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞，BHK或者HEK細(xì)胞，例如HEK293，或昆蟲細(xì)胞，例如SF9細(xì)胞，或者酵母細(xì)胞，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichiapastoris或者任何其他合適的糖基化宿主，例如，如下所述。任選的是，經(jīng)過體內(nèi)糖基化連接到IFNG多肽上的糖組分可通過使用糖基轉(zhuǎn)移酶，例如，使用Neose，Horsham，PA，USA上市的glycoAdvanceTM技術(shù)進(jìn)一步修飾。從而可以增加，例如表達(dá)后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化和CHO細(xì)胞的體內(nèi)糖基化。
可使用糖苷與IFNG的氨基酸殘基的共價體外偶聯(lián)來修飾或增加糖組分的數(shù)目或特性。根據(jù)使用的偶聯(lián)方式，糖類可連接到a)精氨酸和組氨酸上，b)游離羧基上，c)游離巰基，例如半胱氨酸的游離巰基上，d)游離羥基，例如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸或羥脯氨酸的游離羥基上，e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基上或者f)谷氨酰胺的酰胺基上。這些氨基酸殘基組成糖組分的連接基團(tuán)的例子，可在本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽中導(dǎo)入和/或去掉該殘基。體外偶聯(lián)的合適方法在例如，WO 87/05330和Aplin等，CRC生物化學(xué)的重點回顧，第259-306頁，1981中描述。糖組分或PEG與蛋白質(zhì)和肽結(jié)合的Gln-殘基的體外偶聯(lián)可通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)實現(xiàn)，例如，按Sato等，1996，生物化學(xué)，35，13072-13080或在EP725145中所述。
與有機(jī)衍生試劑的偶聯(lián)經(jīng)過將多肽的連接基團(tuán)與有機(jī)衍生試劑反應(yīng)可進(jìn)行IFNG多肽的共價修飾。合適的衍生試劑和方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，最常見的半胱氨酰殘基與α-鹵代乙酸(和相應(yīng)的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)以產(chǎn)生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰殘基也通過與溴三氟丙酮，α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸，氯乙?；姿狨?，N-烷基馬來酰亞胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，對氯汞基苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑反應(yīng)衍生化。組氨酰殘基經(jīng)過與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反應(yīng)衍生化，因為該試劑對組氨酸側(cè)鏈具有相對特異性。對溴苯甲酰甲基溴化物也是有用的；反應(yīng)優(yōu)選在0.1M卡可酸鈉中在pH6.0下進(jìn)行。賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應(yīng)。與這些試劑的衍生化具有使賴氨酰殘基的電荷逆轉(zhuǎn)的效應(yīng)。衍生含α-氨基的殘基的其他合適試劑包括亞氨酸酯(imidoesters)，例如甲基吡啶亞酰胺(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氫化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。精氨酰殘基通過與苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-環(huán)己二酮和茚三酮的一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)進(jìn)行修飾。精氨酸殘基的衍生化需要在堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)，因為胍官能團(tuán)具有高pKa。另外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應(yīng)。通過與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應(yīng)可選擇性修飾羧基側(cè)基團(tuán)(天冬氨?；蚬劝滨?，其中R和R′是不同的烷基基團(tuán)，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰殘基通過與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)變成天冬酰胺?；凸劝滨０孵；?br> 功能性位點的封閉已報道過多的聚合物偶聯(lián)可導(dǎo)致偶聯(lián)聚合物的多肽活性喪失。通過例如，去掉位于功能性位點的連接基團(tuán)或者通過在偶聯(lián)前封閉功能性位點消除該問題。后一種策略組成本發(fā)明的其他實施方案(第一種策略在上文舉例說明，例如經(jīng)過去掉靠近功能性位點的賴氨酸殘基進(jìn)行)。更具體的說，根據(jù)第二種策略，多肽和非多肽組分之間的偶聯(lián)在能與多肽功能性位點結(jié)合的輔助分子封閉IFNG多肽的功能性位點的條件下進(jìn)行。優(yōu)選的是，輔助分子是特異性識別多肽的功能性位點的分子，例如受體。另外，輔助分子可以是抗體，特別是識別表現(xiàn)出IFNG活性的多肽的單克隆抗體。具體地說，輔助分子可以是中和單克隆抗體。
實現(xiàn)偶聯(lián)前使得多肽與輔助分子相互作用。這樣保證多肽的功能性位點被屏蔽或保護(hù)且隨后不能被諸如聚合物的非多肽組分衍生化。其從輔助分子洗脫后，可回收具有至少部分保護(hù)的功能性位點的非多肽組分和多肽之間的偶聯(lián)物。
隨后，具有已封閉的功能性位點的多肽與聚合物，親脂化合物，糖組分，有機(jī)衍生試劑或任意其他化合物以正常方式偶聯(lián)，例如，按標(biāo)題為“與....偶聯(lián)”的上述部分所述進(jìn)行。
在另一實施方案中，輔助分子首先共價偶聯(lián)到諸如柱填充材料，例如交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖珠的固相上，或者表面上，例如反應(yīng)器表面。隨后，將多肽上樣到攜帶輔助分子的柱材料上且按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行偶聯(lián)，例如，按標(biāo)題為“與....偶聯(lián)”的上述部分所述進(jìn)行。該方法允許通過洗脫從輔助分子分離多肽偶聯(lián)物。在不導(dǎo)致多肽偶聯(lián)物大量降解的物理化學(xué)條件下以常規(guī)技術(shù)洗脫該多肽偶聯(lián)物。含有多肽偶聯(lián)物的液相從輔助分子保持共價連接在其上的固相上分離。分離可用其他方式實現(xiàn)例如，用可被特異性結(jié)合劑(例如鏈霉抗生物素蛋白)識別的第二分子(例如生物素)衍生化輔助分子。特異性結(jié)合劑可連接到固相上，從而允許通過在隨后洗脫時滯留輔助分子-第二分子復(fù)合物而不是多肽偶聯(lián)物的第二輔助分子固相柱中過柱從輔助分子-第二分子復(fù)合物中分離多肽偶聯(lián)物?？捎萌魏魏线m的方式從輔助分子釋放多肽偶聯(lián)物。通過提供輔助分子從其結(jié)合的IFNG功能性位點解離的條件實現(xiàn)去保護(hù)。例如，偶聯(lián)聚合物的抗體與抗獨特型抗體之間的復(fù)合物可通過將pH調(diào)到酸性或堿性pH來解離。
標(biāo)記多肽的偶聯(lián)在另一實施方案中，以具有標(biāo)記，即一般由1-30個，例如1-20個氨基酸殘基組成的一個氨基酸序列或肽鏈的融合蛋白表達(dá)IFNG多肽。除了允許快速和容易地純化外，標(biāo)記是實現(xiàn)標(biāo)記的IFNG多肽與非多肽組分之間的偶聯(lián)的一種常規(guī)工具。具體地說，標(biāo)記可用于在通過標(biāo)記固定化標(biāo)記多肽的微量滴定板或其他載體，例如，順磁珠上實現(xiàn)偶聯(lián)。在例如微量滴定板中偶聯(lián)標(biāo)記的IFNG多肽的優(yōu)勢在于標(biāo)記的多肽可直接分離于培養(yǎng)基在微量滴定板中固定化(原則上不需任何純化)和進(jìn)行偶聯(lián)。因此，減少了加工步驟(從表達(dá)到偶聯(lián))的總數(shù)。另外，標(biāo)記可充當(dāng)間隔分子以保證提高用于偶聯(lián)的固定化多肽的可用性。使用標(biāo)記的多肽可偶聯(lián)到本文公開的任意非多肽組分上，例如，偶聯(lián)到諸如PEG的聚合物分子上。
使用的特異性標(biāo)記的同一性并不重要，只要該標(biāo)記能與多肽一起表達(dá)且能被固定化在合適的表面或載體材料上。許多合適的標(biāo)記是商業(yè)上可獲得的，例如從丹麥，Unizyme實驗室獲得。例如，標(biāo)記可以是任意下列序列His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-HisMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln (都可從丹麥，Unizyme實驗室獲得)或者任意下列序列EQKLI SEEDL(分子細(xì)胞生物學(xué)，53610-16，1985中描述的C-末端標(biāo)記)DYKDDDDK(C-或N-末端標(biāo)記)YPYDVPDYA抗上述標(biāo)記的抗體是商業(yè)上可獲得的，例如，從ADI，Aves Lab andResearch Diagnostics獲得。
標(biāo)記的多肽用于PEG連接的常規(guī)方法在下面材料和方法部分給出。
隨后通過使用商業(yè)上可獲得的酶可實現(xiàn)從多肽裂解標(biāo)記。
本發(fā)明的多肽在另一方面，本發(fā)明一般涉及本文公開的新型IFNG多肽。該新型多肽是制備本發(fā)明的偶聯(lián)物的重要中間化合物。另外，該多肽本身具有令人感興趣的特性。
例如，新型IFNG多肽包含至少一個在本申請前面部分更詳細(xì)描述的對表面暴露的氨基酸殘基K，R，D，E，C，S，T或N的取代。
制備IFNG多肽的方法以本領(lǐng)域已知的任何合適的方法可生產(chǎn)IFNG多肽，任選以糖基化形式生產(chǎn)。該方法包括構(gòu)建編碼該多肽的核苷酸序列并在合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)該序列。然而，盡管效率不高，經(jīng)過化學(xué)合成或化學(xué)合成的組合或者化學(xué)合成與重組DNA技術(shù)的組合也可生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
經(jīng)過分離或合成編碼親本IFNG，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO2的huIFNG的核苷酸序列，然后改變核苷酸序列以實現(xiàn)有關(guān)氨基酸殘基的導(dǎo)入(即插入或取代)或缺失(即去掉或取代)可構(gòu)建編碼IFNG多肽(以單體或單鏈形式)的本發(fā)明的核苷酸序列。
按照熟知的方法，參見例如，Mark等，“人成纖維細(xì)胞干擾素基因的定點誘變”，美國國家科學(xué)院院報，81，第5662-66頁(1984)；和US 4,588,585的方法經(jīng)過定點誘變可常規(guī)修飾核苷酸序列。
或者，經(jīng)過化學(xué)合成可制備核苷酸序列，例如，經(jīng)過使用寡核苷酸合成儀，其中根據(jù)目的多肽的氨基酸序列設(shè)計寡核苷酸，且優(yōu)選選擇那些在生產(chǎn)該重組多肽的宿主細(xì)胞中有利的密碼子。例如，經(jīng)過PCR，連接或者連接鏈反應(yīng)(LCR)可合成和組裝編碼目的多肽之部分的一些小寡核苷酸。單個寡核苷酸一般含有用于互補(bǔ)組裝的5’或3’突出端。
一旦組裝(經(jīng)過合成，定點誘變或另一方法)，編碼多肽的核苷酸序列可插入重組載體且與在所需轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中表達(dá)IFNG所必需的調(diào)控序列可操作地連接。
當(dāng)然應(yīng)明白為了表達(dá)編碼本文所述的IFNG多肽的核苷酸序列，并不是所有的載體和表達(dá)調(diào)控序列都能同樣較好地發(fā)揮功能。也不是所有的宿主用同一表達(dá)系統(tǒng)都能同樣較好地發(fā)揮功能。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在這些載體，表達(dá)調(diào)控序列和宿主中不需過多的實驗就可作出選擇。例如，在選擇載體時，必須考慮到宿主，因為載體必須在宿主中復(fù)制或者能整合進(jìn)染色體中。還應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)，控制該拷貝數(shù)的能力，和由該載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)，例如抗生素標(biāo)記的表達(dá)。在表達(dá)調(diào)控序列的選擇中，也應(yīng)考慮各種因素。這些包括，例如，序列的相對長度，其調(diào)控能力，其與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，特別是要考慮到潛在的二級結(jié)構(gòu)。宿主的選擇應(yīng)考慮到其與選定載體的相容性，該核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的毒性，其分泌特征，其正確折疊多肽的能力，其發(fā)酵或培養(yǎng)要求，和該核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的純化簡便性。
重組載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒。作為選擇，載體是導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組且與其整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的載體。
該載體優(yōu)選是一種表達(dá)載體，其中編碼IFNG多肽的核苷酸序列可操作地連接到該核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所需的其他片斷上。該載體一般從質(zhì)?；虿《綝NA衍生。本文提及的用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的許多合適的表達(dá)載體是商業(yè)上可獲得的或在文獻(xiàn)中描述的。用于真核宿主的有用的表達(dá)載體包括，例如，含有來自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)調(diào)控序列的載體。具體載體是，例如，pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Joia，CA，USA)。用于細(xì)菌宿主的有用表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(兩者都來自Novagen Inc.，WI，USA)，廣譜宿主范圍的質(zhì)粒，例如RP4，噬菌體DNAs，例如，λ噬菌體的眾多衍生物，如NM989，和其他DNA噬菌體，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。酵母細(xì)胞的有用的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒及其衍生物，POT1載體(US4,931,373)，在(Okkels，紐約科學(xué)院年報，782，202-207，1996)中所述的pJSO37載體和pPICZA，B或C(Invitrogen)。用于昆蟲細(xì)胞的有用的載體包括pVL941，pBG311(Cate等，“牛和人Mullerian抑制物質(zhì)基因的分離和在動物細(xì)胞中表達(dá)人基因”，細(xì)胞，45，第685-98頁(1986)，pBluebac4.5和pMelbac(兩者都可從Invitrogen獲得)。
用于本發(fā)明的其他載體包括允許編碼IFNG多肽的核苷酸序列以拷貝數(shù)擴(kuò)增的那些載體。這些可擴(kuò)增的載體是本領(lǐng)域熟知的。它們包括，例如，能經(jīng)過DHFR擴(kuò)增(參見，例如Kaufman，美國專利號4,470,461，Kaufman和Sharp，“模塊二氫葉酸還原酶cDNA基因的構(gòu)建用于有效表達(dá)的信號分析”，分子細(xì)胞生物學(xué)，2，第1304-19頁(1982))和谷氨酰胺合成酶(“GS”)擴(kuò)增(參見，例如，US5,122,464和EP338,841)被擴(kuò)增的載體。
重組載體可進(jìn)一步包含能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。該序列的一個例子(當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞時)是SV40的復(fù)制起點。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞時，能使載體復(fù)制的合適序列是酵母質(zhì)粒2μ復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起點。
載體也可包含一個選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞缺陷的基因，例如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的TPI基因(P.R.Russell，基因，40，1985，第125-130頁所述)，或者，提供對藥物，例如氨芐青霉素，卡那霉素，四環(huán)素，氯霉素，新霉素，潮霉素，或氨甲蝶呤抗性的基因。對于絲狀真菌，選擇標(biāo)記包括amdS，pyrG，arcB，niaD，sC。
本文定義的術(shù)語“調(diào)控序列”包括表達(dá)IFNG多肽必須的或者有利的所有元件。各調(diào)控序列可以是天然的或者相對于編碼該多肽的核酸序列是外源的。該調(diào)控序列包括，但不限于前導(dǎo)序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，啟動子，增強(qiáng)子或上游活化序列，信號肽序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。最少，調(diào)控序列包括啟動子。
本發(fā)明可使用各種各樣的表達(dá)調(diào)控序列。這種有用的表達(dá)調(diào)控序列包括與上述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相聯(lián)系的表達(dá)調(diào)控序列以及已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒基因表達(dá)的任意序列，及其各種組合。
用于指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)控序列的例子包括SV40和腺病毒的早期和晚期啟動子，例如，腺病毒2主要晚期啟動子，MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子，人巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動子(CMV)，人延伸因子1α(EF-1α)啟動子，果蠅屬最小型熱休克蛋白70啟動子，勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子，人遍在蛋白質(zhì)C(UbC)啟動子，人生長激素終止子，SV40或腺病毒Elb區(qū)域多聚腺苷化信號和Kozak共有序列(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，1987年8月20日；196(4)947-50)。
為了提高在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，可將合成的內(nèi)含子插入編碼IFNG多肽的核苷酸序列的5’非翻譯區(qū)。合成內(nèi)含子的例子是來自質(zhì)粒pCI-Neo(可從Promega Corporation，WI，USA獲得)的合成內(nèi)含子。
用于指導(dǎo)在昆蟲細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)控序列的例子包括多角體蛋白啟動子，P10啟動子，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多角體病毒堿性蛋白啟動子，桿狀病毒立即早期基因1啟動子和桿狀病毒39K延遲-早期基因啟動子，和SV40多聚腺苷化序列。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適調(diào)控序列的例子包括酵母α-交配系統(tǒng)的啟動子，酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動子，來自酵母糖酵解基因或乙醇脫氫酶基因的啟動子，ADH2-4c啟動子和誘導(dǎo)型GAL啟動子。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適的調(diào)控序列的例子包括ADH3啟動子和終止子，來自編碼米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶丙糖磷酸異構(gòu)酶或堿性蛋白酶，黑色曲霉(A.niger)α-淀粉酶，黑色曲霉或構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂酶基因的啟動子，TPI1終止子和ADH3終止子。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的合適的調(diào)控序列的例子包括lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)的啟動子，λ噬菌體的主要啟動子區(qū)域。
本發(fā)明的核苷酸序列，不論是以定點誘變，合成還是以其它方法制備，都可以包含或者不合編碼信號肽的核苷酸序列。當(dāng)多肽需要從表達(dá)它的細(xì)胞中分泌時存在信號肽。如果存在的話，該信號肽應(yīng)是可被選擇表達(dá)該多肽的細(xì)胞識別的信號肽。信號肽可以是與該多肽同源的(例如一般與huIFNG相聯(lián))或異源的(即來自不同于huIFNG的另一來源)或者可以與宿主細(xì)胞是同源的或異源的，即從該宿主細(xì)胞正常表達(dá)的信號肽或一般不從該宿主細(xì)胞表達(dá)的信號肽。因此，信號肽可以是原核的，例如來自諸如大腸桿菌的細(xì)菌，或者可以是真核的，例如來自哺乳動物，或昆蟲或酵母細(xì)胞。
信號肽是否存在依賴于，例如用于生產(chǎn)該多肽的表達(dá)宿主細(xì)胞，所要表達(dá)的蛋白質(zhì)(是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外蛋白)和是否需要獲得分泌。為了用于絲狀真菌，信號肽可方便地來自于編碼曲霉屬種類淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼Rhizomucor miehei脂酶或蛋白酶或者Humicola lanuginosa脂酶的基因。信號肽優(yōu)選來自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸穩(wěn)定淀粉酶，或者黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。為了用于昆蟲細(xì)胞，信號肽可方便地來自于昆蟲基因(參見WO 90/05783)，例如鱗翅目昆蟲的煙草天蛾(Manduca sexta)脂動激素前體(參見US5,023,328)，蜜蜂的蜂毒肽(Invitrogen)，蛻皮甾類UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(egt)(Murphy等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，4，349-357(1993))或人胰腺脂酶(hpl)(酶學(xué)方法，284，第262-272頁，1997)。
用于哺乳動物細(xì)胞的優(yōu)選信號肽是huIFNG的信號肽或鼠Igκ輕鏈信號肽(Coloma，M(1992)，免疫學(xué)方法雜志，15289-104)。為了用于酵母細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)合適的信號肽是來自啤酒糖酵母α-因子的信號肽(參見US 4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶的信號肽(參見O.Hagenbuchle等，自然，289，1981，第643-646頁)，修飾的羧肽酶信號肽(參見L.A.Valls等，細(xì)胞，48，1987，第887-897頁)，酵母BAR1信號肽(參見WO 87/02670)，和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等，酵母6，1990，第127-137頁)。
可使用任何合適的宿主來生產(chǎn)IFNG多肽，包括細(xì)菌，真菌(包括酵母)，植物，昆蟲，哺乳動物，或其它合適的動物細(xì)胞或細(xì)胞系，以及轉(zhuǎn)基因動物或植物。細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子包括革蘭氏陽性細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬菌株，例如，短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌，假單胞菌屬或鏈霉菌屬，或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌的菌株。例如，經(jīng)過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(xué)，168111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen，1961，細(xì)菌學(xué)雜志，81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學(xué)雜志，56209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)，6742-751)，或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，細(xì)菌學(xué)雜志，1695771-5278)可實現(xiàn)將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞。
合適的絲狀真菌宿主細(xì)胞的例子包括曲霉屬的菌株，例如米曲霉，黑色曲霉，或構(gòu)巢曲霉，鐮孢屬或木霉屬。經(jīng)過包括原生質(zhì)體形成，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，和細(xì)胞壁再生的方法以本身已知的方式可轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238 023和US5,679,543中描述。轉(zhuǎn)化鐮孢屬種類的合適方法由Malardier等，1989，基因，78147-156和WO 96/00787描述。使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編輯，酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法，第194卷，第182-187頁，紐約學(xué)術(shù)出版公司；Ito等，1983，細(xì)菌學(xué)雜志，153163；和Hinnen等，1978，美國國家科學(xué)院院報，751920所述的方法可轉(zhuǎn)化酵母。
合適的酵母宿主細(xì)胞的例子包括酵母屬菌株，例如，啤酒糖酵母，裂殖糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，畢赤氏酵母屬，例如巴斯德畢赤氏酵母或P.Methanolica，漢遜氏酵母屬，例如多形漢遜氏酵母，或者Yarrowia。用異源性DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并從中生產(chǎn)異源性多肽的方法由Clontech實驗室公司，Palo Alto，CA，USA(在YeastmakerTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)試劑盒的產(chǎn)品說明中)，和由Reeves等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，99，(1992)193-198，Manivasakam和Schiestl，Nucleic Acids Research，1993，Vol.21，No.18，第4414-4415頁和Ganeva等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters121(1994)159-164公開。
合適的昆蟲宿主細(xì)胞的例子包括鱗翅目細(xì)胞系，例如草地貪夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細(xì)胞(High Five)(US5,077,214)。昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和異源性多肽在其中的生產(chǎn)可按Invitrogen所述進(jìn)行。
合適的哺乳動物宿主細(xì)胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)，綠猴細(xì)胞系(COS)(例如COS1(ATCCCRL-1650)，COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細(xì)胞(例如NS/O)，幼小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)，和人細(xì)胞(例如，HEK 293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞。其它合適的細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的且可從公共保藏單位獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland。另外，可修飾諸如CHO細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞以表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如，1，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如，按US5,047,335所述，以便提高IFNG多肽的糖基化。
將外源性DNA導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，病毒載體和生命技術(shù)有限公司，Paisley，UK所述使用Lipofectamin 2000的轉(zhuǎn)染方法。這些方法是本領(lǐng)域熟知的且由例如Ausbel等(編)，1996，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，USA進(jìn)行了描述。哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)按照已建立的方法進(jìn)行，例如在(Animal Cell Biotechnology，Methods andProtocols，Nigel Jenkins編輯，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USAand Harrison MA and Rae IF，General Techniques ot Cell Culture，CambridgeUniversity Press 1997)中公開的方法。
為了產(chǎn)生糖基化多肽，優(yōu)選使用真核宿主細(xì)胞，例如上述類型的真核宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，在適合于生產(chǎn)該多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可通過搖瓶培養(yǎng)，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在合適培養(yǎng)基中和在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，流加，或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在含有碳和氮源和無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得或可根據(jù)公開的成分制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌進(jìn)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可直接從培養(yǎng)基回收該多肽。如果多肽不分泌，可從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收。
可用本領(lǐng)域已知的方法回收所得的多肽。例如，可通過常規(guī)方法，包括但不限于離心，過濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)，或沉淀從營養(yǎng)培養(yǎng)基回收該多肽。
所述多肽可以用本領(lǐng)域已知的各種方法，包括但不限于，色譜法(例如，離子交換，親和，疏水，色譜聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，制備型等電聚焦)，不同溶解性(例如，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE，或提取(參見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來純化。表現(xiàn)出IFNG活性的多肽的具體純化方法在EP110044和未審日本專利申請?zhí)?86995/84中公開。
可用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法測定IFNG多肽的生物學(xué)活性。該測定法包括對抗病毒活性的抗體中和，對蛋白激酶，寡聚腺苷酸2，5-A合成酶或磷酸二酯酶活性的誘導(dǎo)，如EP 41313 B1所述。該測定法還包括免疫調(diào)制測定法(參見，例如，US4，753，795)，生長抑制測定法，和測量與表達(dá)干擾素受體的細(xì)胞的結(jié)合。具體測定法在本文材料和方法部分描述。
另外，本發(fā)明涉及治療特別是間質(zhì)肺疾病，但也包括肉芽腫疾病，癌癥，感染，骨疾病(例如，骨代謝病，如惡性骨硬化病)和自體免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的改進(jìn)方法，主要優(yōu)勢在于用藥次數(shù)和/或侵入性更小，治療更有效，且任選與治療活性化合物的免疫反應(yīng)風(fēng)險更低。
本發(fā)明的偶聯(lián)物優(yōu)選在包含藥用上可接受的載體或賦形劑的組合物中用藥?！八幱蒙峡山邮艿摹笔侵篙d體或賦形劑在施用它的病人中不引起任何不幸效果。該藥用上可接受的載體和賦形劑是本領(lǐng)域熟知的(Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer and L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物可“照現(xiàn)在的樣子”和/或以其鹽形式使用。合適的鹽包括但不限于，具有堿金屬或堿土金屬，例如鈉，鉀，鈣和鎂的鹽以及例如鋅鹽。這些鹽或復(fù)合物可作為結(jié)晶和/或無定形結(jié)構(gòu)存在。
本發(fā)明的偶聯(lián)物以大約相似于在用諸如Actimmune的IFNG的已知商業(yè)制劑的療法中所用的或者按EP 795332中限定的劑量用藥。用藥的精確劑量依賴于具體情況。一般來說，該劑量應(yīng)能夠防止或減輕所要治療的癥狀或適應(yīng)征的嚴(yán)重性或傳播。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是本發(fā)明的偶聯(lián)物或組合物的有效量依賴于，特別是疾病，劑量，用藥計劃，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨還是與其它治療劑結(jié)合用藥，組合物的血清半壽期，和病人的總體健康狀態(tài)。
本發(fā)明還涉及使用a)含有共價連接到IFNG多肽上的至少一個非多肽組分，IFNG多肽選自huIFNG，rhuIFNG或本文所述的IFNG多肽(即偶聯(lián)物是本發(fā)明的偶聯(lián)物)或b)本發(fā)明的藥用組合物生產(chǎn)用于治療間質(zhì)肺疾病，癌癥，感染，骨疾病(例如，骨代謝病，如惡性骨硬化病)和/或炎癥性疾病，特別是間質(zhì)肺疾病，更具體的說是特發(fā)性肺纖維變性的藥物，藥用組合物或分部的試劑盒。也可包括諸如強(qiáng)的松龍的糖皮質(zhì)激素。優(yōu)選的劑量是每千克病人體重每劑量的多肽成分為1-4微克，更優(yōu)選2-3微克。優(yōu)選的劑量是每千克病人體重每劑量100-350微克，更優(yōu)選100-150微克糖皮質(zhì)激素。
還公開了傳遞任選還含有糖皮質(zhì)激素的分子或制劑的改進(jìn)方法。
本發(fā)明還涉及適用于治療間質(zhì)肺疾病的分部的試劑盒，它包含含有上述活性成分a)或b)的第一藥用組合物和含有至少一種糖皮質(zhì)激素的第二藥用組合物，每種組合物任選與藥用上可接受的載體和/或賦形劑一起。
本發(fā)明的偶聯(lián)物可用熟知的方法配制成藥用組合物。合適的配制劑由E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences和US5,183,746描述。
以包括液體，凝膠，凍干品，粉末，壓縮固體，或任何其它合適形式的各種形式可配制藥用組合物。優(yōu)選的形式依賴于所治療的具體適應(yīng)征且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
可通過口服，皮下，靜脈內(nèi)，大腦內(nèi)，鼻內(nèi)，經(jīng)皮膚，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，肺內(nèi)，陰道內(nèi)，直腸，眼內(nèi)或任何其它可接受的方式，例如使用PowderJect或ProLease技術(shù)施用該藥用組合物。盡管使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如泵或植入進(jìn)行大丸藥注射是可接受的，但該配制劑可通過輸注連續(xù)用藥。在某些情況下配制劑可作為溶液或噴霧劑直接應(yīng)用。優(yōu)選的用藥方式依賴于所治療的具體適應(yīng)征且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
可結(jié)合其它治療劑施用本發(fā)明的藥用組合物。這些試劑可作為同一藥用組合物的部分摻入或者可同時或按照任何其它可接受的治療程序與本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物分開用藥。另外，本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或藥用組合物可用作其它療法的附加。特別是考慮與EP 795332所述的糖皮質(zhì)激素組合。
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的實例是設(shè)計成非腸道給藥的溶液劑。盡管在很多情況下，藥物溶液劑可以以適用于立即使用的液體制劑形式提供，但所述非腸道制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強(qiáng)組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩(wěn)定性，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應(yīng)物更穩(wěn)定。所述凍干制劑在使用前通過加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配制。
在非胃腸道給藥的情況下，制成凍干制劑或水溶液備用，如通過將具有所需純度的多肽與一種或多種本領(lǐng)域常用的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(統(tǒng)稱為“賦形劑”)適當(dāng)混合來制備，賦形劑如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
緩沖劑有助于將pH保持在接近生理條件的范圍中。它們通常以大約2mM-50mM的濃度范圍存在。本發(fā)明使用的合適緩沖劑包括有機(jī)和無機(jī)酸及其鹽如檸檬酸鹽緩沖劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)鹽緩沖劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽如Tris。
加入防腐劑來阻滯微生物生長，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發(fā)明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基銨氯化物、苯亞甲基 鹵化物(如苯亞甲基氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。
可以加入等滲劑來確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優(yōu)選三羥或更高級糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以其它組分的相對量計算。
穩(wěn)定劑涉及一大類賦形劑，其功能范圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助于防止變性或與容器壁粘合的添加劑。通常的穩(wěn)定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機(jī)糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個殘基)；蛋白質(zhì)如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖?；诨钚缘鞍踪|(zhì)重量計算，穩(wěn)定劑通常的存在范圍為0.1-10000重量份。
可以存在非離子表面活性劑或清潔劑(也稱作“濕潤劑”)以有助于溶解治療劑以及保護(hù)治療性多肽來避免攪拌誘導(dǎo)的聚集，其也允許配方劑暴露于剪切表面壓力而沒有引起多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫20、吐溫80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)和共溶劑?；钚越M分也可以被包裹在制備的微囊中，例如通過coascervation技術(shù)或通過界面聚合制備的，例如羥甲基纖維素、明膠或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在膠體狀藥物釋放體系(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中或包裹在大乳劑中。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(同上)中公開了這些技術(shù)。
體內(nèi)給藥所使用的非胃腸道制劑必須是滅菌的。該過程容易完成，例如，通過無菌濾膜來過濾。
持續(xù)釋放制劑持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有多肽或偶聯(lián)物的固體疏水聚合物半滲透材料、具有合適形式如膜或微囊的材料。持續(xù)釋放材料的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技術(shù)或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠長時間釋放分子如長達(dá)或超過100天，某些水凝膠在較短時間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。包囊中的多肽長時間保留在體內(nèi)時，它們因在37℃潮濕的環(huán)境中暴露而變性或聚集，導(dǎo)致喪失生物活性并且可能改變免疫原性。合理的穩(wěn)定策略可根據(jù)所涉及的機(jī)理設(shè)計。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理是通過硫代二硫化物相互交換形成分子內(nèi)S-S鍵，那么可通過修飾巰基、凍干酸性溶液、控制含濕量、使用適宜的添加劑和開發(fā)特異性聚合物型組合物來達(dá)到穩(wěn)定。
口服用藥對于口服用藥，藥用組合物可以是固體或液體形式，例如，以膠囊，片劑，懸液，乳劑或溶液的形式。藥用組合物優(yōu)選以含有給定量活性成分的劑量單位的形式制備。用于人或其它哺乳動物的合適的每日劑量可根據(jù)病人的情況和其它因素大幅度變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用常規(guī)方法測定。
口服用藥的固體劑型可包括膠囊，片劑，栓劑，粉末和顆粒。在該固體劑型中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑，例如蔗糖，乳糖或淀粉混合。該劑型也可包括，如正常實踐中的添加物質(zhì)，例如潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于膠囊，片劑和丸劑，劑型也可包括緩沖劑。片劑和丸劑還可用腸衣制備。
偶聯(lián)物可與諸如乳糖，蔗糖，淀粉粉末，鏈烷酸的纖維素酯，硬脂酸，滑石，硬脂酸鎂，氧化鎂，磷酸和硫酸的鈉和鈣鹽，阿拉伯膠，明膠，藻酸鈉，聚乙烯-吡咯烷，和/或聚乙烯醇的佐劑混合，并作成片劑或包成膠囊用于常規(guī)用藥。作為選擇，它們可溶于鹽水，水，聚乙二醇，丙二醇，乙醇，油類(例如玉米油，花生油，棉子油或芝麻油)，黃芪膠，和/或各種緩沖液中。其它佐劑和用藥方式是制藥領(lǐng)域熟知的。載體或稀釋劑可包括時間延遲材料，例如單獨或與蠟一起的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本領(lǐng)域熟知的其它材料。
可對藥用組合物進(jìn)行諸如滅菌的常規(guī)制藥操作和/或藥用組合物可含有常規(guī)佐劑，例如防腐劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑，乳化劑，緩沖液，填充物，等，例如，如在本文別處所述。
口服用藥的液體劑型可包括含有諸如水的本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑的藥用上可接受的乳劑，溶液，懸液，糖漿和酏劑。該組合物也可佐劑，例如潤濕劑，甜味劑，調(diào)味劑和香味劑。
局部用藥適用于局部用藥的配制劑包括適合于穿透皮膚的液態(tài)或半液態(tài)制劑(例如，擦劑，洗劑，軟膏，乳膏，或糊劑)和適合于眼，耳或者鼻給藥的滴劑。
肺部遞送適合于用噴射或者超聲噴霧器使用的配制劑一般包含以，例如每mL溶液大約0.01到25mg偶聯(lián)物，優(yōu)選大約0.1到10mg/mL的濃度溶于水中的多肽或偶聯(lián)物。配制劑也可包括緩沖液和普通糖類(例如，用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定化和滲透壓調(diào)節(jié))，和/或濃度范圍從0.1到10mg/ml的人血清白蛋白?？墒褂玫木彌_液的例子是乙酸鈉，檸檬酸鹽和甘氨酸。優(yōu)選的是，緩沖液具有適合于將溶液調(diào)到pH為3至9范圍的組成成分和摩爾濃度。一般來說，從1mM到50mM的緩沖液摩爾濃度適合于該目的?？墒褂玫奶穷惖睦邮侨樘牵溠刻?，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范圍是配制劑重量的1％到10％。
噴霧配制劑也可含有表面活性劑以降低或防止在形成氣溶膠時由溶液的霧化引起的表面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集。可使用各種常規(guī)表面活性劑，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范圍一般為配制劑重量的0.001％和4％之間。用于本發(fā)明目的的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯山梨聚糖單油酸酯。
具體配制劑和產(chǎn)生合適分散的本發(fā)明的液體顆粒的方法在WO94/20069，US5,915,378，US5,960,792，US5,957,124，US5,934,272，US5,915,378，US5,855,564，US5,826,570和US5,522,385中描述，在此引用以供參考。
與帶有劑量刻度的吸入器裝置一起使用的配制劑一般包含精細(xì)區(qū)分的粉末。該粉末可通過凍干并然后磨制液體偶聯(lián)物配制劑來生產(chǎn)且也可含有穩(wěn)定劑，例如人血清白蛋白(HSA)。一般來說，加入超過0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要可向制劑中加入一種或多種糖或糖醇。其例子包括乳糖，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制劑中的該偶聯(lián)物的量的范圍從大約0.01到200％(w/w)，優(yōu)選從大約1到50％。然后凍干該配制劑并磨制成所需的顆粒大小。
然后將合適大小的顆粒借助于表面活性劑懸浮于推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是用于該目的的任何常規(guī)材料，例如含氯氟烴，hydrochlorofluorocarbon，hydrofluorocarbon，或碳?xì)浠衔铮ㄈ确淄?，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，?，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。然后將該混合物裝入遞送裝置中。適用于本發(fā)明的商業(yè)上可獲得的測定劑量的吸入器例子是由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C生產(chǎn)的Ventolin測定劑量的吸入器。
用于粉末吸入器的配制劑包含含有偶聯(lián)物的精細(xì)區(qū)分的干粉且也可包括膨脹劑，例如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇，其含量可幫助粉末從裝置中散布，例如，占配制劑重量的50％到90％。粉末的顆粒在肺中應(yīng)具有空氣動力學(xué)特性，相應(yīng)于具有大約1g/cm2密度的顆粒，具有小于10微米的平均直徑，優(yōu)選在0.5和5微米之間，最優(yōu)選在1.5和3.5微米之間。根據(jù)本文的教導(dǎo)適用的粉末吸入器的例子是由Fisons Corp.，Bedford，Mass生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器。
以US5,997,848，US5,993,783，US5,985,248，US5,976574,US5,922,354，US5,785,049和US5,654,007公開的方法可產(chǎn)生和/或遞送這些裝置中的粉末。
設(shè)計用于治療產(chǎn)品的肺部遞送的機(jī)械裝置包括但不限于噴霧器，測定劑量的吸入器，和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。適用于本發(fā)明實踐的商業(yè)上可獲得的裝置的具體例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生產(chǎn)的Ultravent噴霧器；由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生產(chǎn)的Acorn II噴霧器；由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，North Carolina生產(chǎn)的Ventolin測定劑量的吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器；Inhale TherapeuticSystems，Inc.，San Carlos，California的“standing cloud”裝置；Alkermes，Cambridge，Massachusetts生產(chǎn)的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，California生產(chǎn)的AERx肺部藥物遞送系統(tǒng)。
本發(fā)明提供了用于治療細(xì)菌和病毒感染，癌癥或腫瘤，間質(zhì)肺疾病，例如特發(fā)性肺纖維變性，肉芽腫疾病，骨病(例如，骨代謝病，例如惡性骨硬化病)和自體免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組合物和方法。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療具有抗huIFNG或rhuIFNG的循環(huán)抗體的哺乳動物的方法，該方法包括施用具有IFNG生物活性且不與所述抗體反應(yīng)的化合物。該化合物優(yōu)選是本文所述的偶聯(lián)物且哺乳動物優(yōu)選是人類。所要治療的哺乳動物可患有IFNG用作治療劑的任何上述疾病。另外，本發(fā)明涉及制備用于治療具有抗huIFNG或rhuIFNG循環(huán)抗體的哺乳動物的藥物產(chǎn)品的方法，其中具有IFNG生物活性且不與其反應(yīng)的化合物配制成可注射的或其它合適的配制劑。術(shù)語“循環(huán)抗體”是指在哺乳動物中相應(yīng)于用任何商業(yè)上可獲得的IFNG制劑進(jìn)行治療而形成的自體抗體。
另外還包含編碼本發(fā)明的IFNG多肽的核苷酸序列在基因治療應(yīng)用中的用途。具體地說，令人感興趣的是使用編碼上文標(biāo)題為“修飾摻入其它糖基化位點的本發(fā)明的糖基化多肽”的部分所述的IFNG多肽的該苷酸序列。因此在基因治療的過程中，即在人體中表達(dá)該核苷酸序列后實現(xiàn)多肽的糖基化。
涉及的基因治療應(yīng)用包括治療預(yù)期該多肽可提供有效治療的那些疾病。
使用基因療法的IFNG的局部遞送可提供針對靶區(qū)域的治療劑而避免與非特異性用藥相聯(lián)系的潛在毒性問題。
體外和體內(nèi)基因治療方法都是所涉及的。
向確定的細(xì)胞群體轉(zhuǎn)移潛在的治療性基因的一些方法是已知的。對于進(jìn)一步的參考文獻(xiàn)，可參見例如，Mulligan，“The Basic Science Of GeneTherapy”，Science，260，第926-31頁(1993)。這些方法包括直接基因轉(zhuǎn)移，例如按Wolff等，“Direct Gene transfer Into MouseMuscle In vivo”，Science247，第1465-68頁(1990)所述；脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，例如按Caplen等，“Liposome-mediated CFTRGene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”，NatureMed.，3，第39-46頁(1995)；Crystal，“The Gene As A Drug”，Nature Med.，1，第15-17(1995)；Gao and Huang，“A Novel Cationic Liposome Reagent ForEfficient Transfection of Mammalian Cells”，Biochem.Biophys Res.Comm.，179，第280-85頁(1991)所述；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，例如按Kay等，“In vivo Gene Therapy ofHemophilia BSustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs”，Science，262，第117-19頁(1993)；Anderson，“Human Gene Therapy”，Science，256，第808-13頁(1992)所述；DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這種DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad-2或Ad-5的載體)，皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)，和細(xì)小病毒屬(優(yōu)選基于“缺陷型”或非自主型細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺伴隨病毒的載體，最優(yōu)選基于AAV-2的載體)。參見例如，Ali等，“The Use OfDNA Viruses as Vectors for Gene Therapy”，Gene Therapy，1，第367-84頁(1994)；US4,797,368，和US5,139,941。
在下面實施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。該實施例不應(yīng)以任何方式理解為對本說明書和權(quán)利要求書范圍的限制。
材料和方法試驗干擾素試驗概述以前已經(jīng)公開了IFNG在HeLa細(xì)胞中與IFNG受體相互作用并激活該受體。隨后，在含有干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)的啟動子處激活轉(zhuǎn)錄。因此通過在HeLa細(xì)胞中使用與螢光素酶受體基因偶聯(lián)的ISRE(ISRE-luc)可篩選干擾素受體的激動劑。
主要試驗用ISRE-Luc和pCDNA3.1/hygro共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，經(jīng)過在含有潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中選擇可建立轉(zhuǎn)化灶(細(xì)胞克隆)。在存在或不存在IFNG的條件下篩選細(xì)胞克隆的螢光素酶活性。顯示出刺激與未刺激的螢光素酶活性比率最高的那些克隆用于進(jìn)一步的試驗。
為了篩選突變蛋白，在96孔培養(yǎng)板中接種15,000個細(xì)胞/孔并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。在第二天以各種濃度向細(xì)胞中加入突變蛋白以及已知的標(biāo)準(zhǔn)品。平板在37℃下在5％ CO2的空氣中培養(yǎng)6小時。隨后向各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen The Netherlands)。密封平板并在TopCount發(fā)光計(Packard)中以SPC(單光子計數(shù))方式測量發(fā)光。每個平板含有用IFNG培養(yǎng)的孔作為刺激對照且其它孔含有正常培養(yǎng)基作為未刺激對照。刺激的和未刺激的螢光素酶活性的比率用作突變蛋白活性和實驗間誤差的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)。
IFNG偶聯(lián)物的功能性體內(nèi)半壽期按文獻(xiàn)中所述的許多方式可實現(xiàn)生物學(xué)半壽期的測量。Rutenfranz等(J.Interferon Res.1990，vol.10，p.337-341)描述了一種方法，他們對8周齡的C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)注射IFNG。通過使用Hep-2細(xì)胞和水皰性口炎病毒(VVS)在鼠血清中測定IFNG滴度的生物學(xué)試驗測量生物學(xué)半壽期。作為選擇，他們也使用ELISA檢測血清中的IFNG水平。
作為選擇，放射性標(biāo)記的IFNG可用于研究IFNG的皮下吸收和局部分布。Croos和Roberts(J.Pharm.，1993，vol 45，p.606-609)在麻醉的雌性Spraque-Dawley大鼠中對125IFNG進(jìn)行了試驗。皮下給藥后，收集血液和組織樣品且通過γ-計數(shù)測定IFNG的量。
IFNG的PEG化按US5,109,120的實施例2所述可制備PEG化的rhuIFNG。同樣，也可PEG化本文所述的修飾的IFNG多肽，例如攜帶突變N25K的多肽。所得的PEG-IFNG-N25K偶聯(lián)物與rhuIFNG的偶聯(lián)物相比另外還連接上一個PEG分子。
藥用組合物的制備按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法以每小瓶容納含50，100，200，300，400或500微克rhuIFNG或IFNG-N25K的偶聯(lián)物的方式將本發(fā)明的有關(guān)純化的偶聯(lián)物配制成可注射的組合物，從而制備，例如用于治療間質(zhì)肺疾病的藥用組合物。
表面暴露的氨基酸殘基的鑒定結(jié)構(gòu)以X-射線晶體學(xué)測定的huIFNG的實驗三維結(jié)構(gòu)已由Ealick等，Science252698-702(1991)報道，它報道了IFNG同型二聚體的C-α軌跡(trace)。Walter等，Nature 376230-235(1995)報道了與兩分子可溶性IFNG受體復(fù)合的IFNG同型二聚體的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的座標(biāo)從未公開過。Thiel等，Structure8927-936(2000)報道了與兩分子可溶性IFNG受體復(fù)合的IFNG同型二聚體的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中第三個受體分子不與IFNG同型二聚體發(fā)生相互作用。
方法可接近的表面區(qū)域(ASA)用計算機(jī)程序Access(B.Lee和F. M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)計算該結(jié)構(gòu)中各原子的可接近的表面區(qū)域(ASA)。該方法一般使用1.4的探針大小且將可接近的表面區(qū)域(ASA)定義為由探針中心形成的區(qū)域。計算前，從坐標(biāo)系(coordinate set)中去掉與該蛋白質(zhì)不直接相關(guān)的所有水分子，氫原子和其它原子。
側(cè)鏈的分部ASA通過用在延伸的ALA-x-ALA三肽中代表該殘基類型側(cè)鏈原子的ASA值除側(cè)鏈中該原子的ASA總和來計算側(cè)鏈原子的分部ASA。參見Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該實施例中，將CA原子視為甘氨酸殘基側(cè)鏈的一部分但不視為其它殘基的一部分。下表用作側(cè)鏈的標(biāo)準(zhǔn)100％ ASAAla 69.23A2Arg 200.35A2Asn 106.25A2Asp 102.06A2Cys 96.69A2Gln 140.58A2Glu 134.61A2Gly 32.28A2
His147.00A2Ile137.91A2Leu140.76A2Lys162.50A2Met156.08A2Phe163.90A2Pro119.65A2Ser78.16A2Thr101.67A2Trp210.89A2Tyr176.61A2Val114.14A2在該結(jié)構(gòu)中未檢測到的殘基定義為100％暴露，因為據(jù)認(rèn)為它們在彈性區(qū)域。
測定原子間的距離使用分子圖形軟件，例如InsightII v.98.0，MSI INC測定原子間的距離。測定受體結(jié)合位點受體結(jié)合位點定義為能通過受體結(jié)合而改變它們的可接近的表面區(qū)域的所有殘基。這通過至少兩個ASA計算來測定一個在配體/受體復(fù)合物的分離配體上，一個在完整的配體/受體復(fù)合物上。
結(jié)果所用的X-射線結(jié)構(gòu)是Thiel等，Structure8927-936(2000)報道的與兩分子可溶性IFNG受體復(fù)合的IFNG同型-二聚體的結(jié)構(gòu)且在該結(jié)構(gòu)中第三個IFNG受體分子不與IFNG同型二聚體發(fā)生相互作用。該結(jié)構(gòu)由IFNG同型二聚體組成，其中兩個分子是標(biāo)記的A和B。為達(dá)到構(gòu)建目的，在標(biāo)記M0的IFNG序列前放置另一個甲硫氨酸且該序列在C-末端截短10個殘基(Q133是所構(gòu)建的分子中的最后一個殘基)。在該實施例的所有計算中從結(jié)構(gòu)中去掉M0。兩個IFNG單體的結(jié)構(gòu)在殘基120之后具有極弱的電子密度且各殘基僅僅是模擬的(modeled)，直到殘基T126。因此，在該實施例中計算前從該結(jié)構(gòu)中去掉殘基S121-T126。C和D標(biāo)記的兩個受體片斷可與IFNG同型二聚體發(fā)生直接相互作用，E標(biāo)記的第三受體分子與IFNG同型二聚體不接觸且不包括在這些計算中。
表面暴露對不含M0和S121-T126的分子A和B的同型二聚體進(jìn)行分部ASA計算，結(jié)果在至少一個單體中下列殘基具有超過25％的其側(cè)鏈暴露于表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K12，K13，Y14，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，H111，Q115，A118和E119。
下面的殘基在至少一個單體中具有超過50％的其側(cè)鏈暴露于表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，Q115，A118，E119。
對不含M0和S121-T126且包括受體分子C和D的分子A和B的同型二聚體進(jìn)行分部ASA計算，結(jié)果在至少一個單體中下列殘基具有超過25％的其側(cè)鏈暴露于表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，Y14，N16，G18，H19，D21，N25，G26，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，E119。下面的殘基在至少一個單體中具有超過50％的其側(cè)鏈暴露于表面P3，K6，N10，K13，N16，D21，N25，G26，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103和N104。
所有上述位置都是按照本發(fā)明進(jìn)行修飾的靶。
比較兩列殘基發(fā)現(xiàn)，在受體結(jié)合時，從所述超過25％側(cè)鏈的ASA列殘基中去掉了K12，S20，A23，D24，T27，H111，Q115和A118，從所述超過50％側(cè)鏈的ASA列殘基中去掉了Q1，D2，E9，G18，H19，S20，A23，D24，T27，Q115，A118和E119。
該結(jié)構(gòu)中未測定的殘基按表面完全暴露處理，即殘基S121，P122，A123，A124，K125，T126，G127，K128，R129，K130，R131，S132，Q133，M134，L135，F(xiàn)136，R137，G138，R139，R140，A141，S142，Q143。這些殘基也組成根據(jù)本發(fā)明導(dǎo)入連接基團(tuán)的不同靶(或者可認(rèn)為屬于表面暴露的氨基酸殘基的基團(tuán)，例如具有超過25％或超過50％暴露的側(cè)鏈)。
受體結(jié)合位點按上述進(jìn)行ASA計算發(fā)現(xiàn)，在復(fù)合物的至少一個單體中IFNG分子的下列殘基與在分離的二聚體上的計算結(jié)果相比具有減少的ASAQ1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119。
實施例實施例1設(shè)計能在酵母和CHO細(xì)胞中表達(dá)IFNG的表達(dá)盒GenBank登錄號為X13274的DNA序列包含編碼無其天然信號肽的成熟huIFNG的全長cDNA，對其進(jìn)行修飾以便幫助在酵母細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)。首先，導(dǎo)入一個MATa信號肽代替IFNG信號肽以便幫助分泌進(jìn)酵母培養(yǎng)基中。其次，通過在密碼子使用中采用偏向常用于酵母的密碼子來修飾huIFNG核苷酸序列的密碼子。隨后在該序列中的某些核苷酸用其它核苷酸取代以便導(dǎo)入DNA限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點。設(shè)計引物以便合成該基因。使用Platinum Pfx-聚合酶試劑盒(Life Technologies)和標(biāo)準(zhǔn)三步PCR循環(huán)參數(shù)通過一步PCR將引物裝配成合成基因。裝配基因通過使用相同條件的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，它具有SEQ ID NO3所示的序列。
將合成基因克隆進(jìn)pJSO37-lip(Okkels，J.S.(1996)Rec.DNA Biotech.III.，vo1782，202-207)5’端的HindIII位點和3’端的XbaI位點之間，產(chǎn)生pIGY-1。
為了制備含有共價連接的單體IFNG多肽的單鏈構(gòu)建體，制備下列三個構(gòu)建體I)含有通過模擬人IgAl鉸鏈區(qū)后的19殘基接頭肽連接的兩個成熟全長huIFNG多肽的構(gòu)建體(Lunn CA等，J.Biol.Chem.，267，17920-17924，1992)。使用下列引物通過PCR做到這點ADJ002 5′-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3′(SEQ ID NO4)ADJ003 5′-GCGGCCCTCTAGATTACT-3′(SEQ ID NO5)ADJ004 5′-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3′(SEQ ID NO6)
ADJ0075′-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGGAGTAGAAGGAACCGCTGTTTTAGCAGCTGGAGACAATT-3′(SEQ ID NO7)將該PCR片斷克隆進(jìn)pIGY-1的5’端ClaI和3’端XbaI之間，在SphI中裝配兩個單體(在連接區(qū)導(dǎo)入)。該構(gòu)建體稱為pIGY-2。
II)含有兩個單體成熟全長huIFNG多肽而無接頭的構(gòu)建體。為此，使用下列引物進(jìn)行PCR。
ADJ002 5′-GGTTTGArATCGATGGCCAA-3′(SEQ ID NO8)ADJ003 5′-GCGGCCCTCTAGATTACT-3′(SEQ ID NO9)ADJ0065′-TTTAGAGGTAGAAGAGCTTCTCAGCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3′(SEQ ID NO 10)ADJ0095′-AGCTTCTTTCACATATGGATCTTGCTGAGAAGCTCTTCTACGTCTAAA-3′(SEQ ID NO 11)通過兩步PCR組裝PCR片斷并克隆進(jìn)pIGY-1的5’端ClaI和3’端XbaI之間，稱為DIGY-3。
III)含有通過上述19殘基肽接頭共價連接的兩個C-末端截短(最后11個氨基酸)的單體IFNG多肽的構(gòu)建體。使用下列引物ADJ001 5′-TGCTCTAGACATCTGAGATCGWTTCTCTTTCC-3′(SEQID NO 12)ADJ002 5′-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3′(SEQ ID NO 13)ADJ004 5′-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3′(SEQ ID NO 14)ADJ005 5′-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGGAGTAGAAGGAACCGGCATCTGAGATCTTTTTCTCC-3′(SEQ ID NO 15)將PCR片斷克隆進(jìn)pIGY-1的5’端ClaI和3’端XbaI之間，在SphI中裝配兩個單體(在連接區(qū)導(dǎo)入)。該構(gòu)建體稱為pIGY-4。
用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)的構(gòu)建體為了在CHO細(xì)胞中表達(dá)IFNG，合成下列寡核苷酸以便將IFNG包括其信號肽克隆進(jìn)pcDNA3.1/hygro(Invitrogen)中。
ADJ0125′-CGCGGAICCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3′(SEQ ID NO 16)為了在該表達(dá)載體中克隆IFNG，以pIGY-1作模板使用ADJ012和ADJ003經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生450bp的片斷，該片斷可克隆進(jìn)pcDNA3.1/hygro的5’端BamHI和3’端XbaI之間，得到pIGY-5。
為了在IFNG中導(dǎo)入糖基化位點，設(shè)計寡核苷酸使得在表達(dá)質(zhì)粒(pIGY-5)中通過傳統(tǒng)的兩步PCR來導(dǎo)入改變，隨后克隆5’端BamHI和3’端XbaI之間的PCR片斷。
因此，設(shè)計兩個載體引物與特異性突變引物一起使用ADJ0135′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3′(SEQ ID NO 17)(反義下游載體引物)ADJ0145′-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3′(SEQ ID NO 18)(有義上游載體引物)針對不同的突變蛋白，設(shè)計下列引物。
K12T.
ADJ0155′-AGCATTAAAATACTTCGTCAAGTTTTCAGC-3′(SEQ IDNO 19)ADJ0165′-GCTGAAAACTTGACGAAGTATTTTAATGCT-3′(SEQ IDNO 20)G18TADJ0175′-CACATCAGAATGAGTAGCATTAAAATA-3′(SEQ ID NO21)ADJ0185′-TATTTTAATGCTACTCATTCTGATGTG-3′(SEQ ID NO 22)E38NADJ0195′-CATAATTTTTCGATCGGATTCGTTTTTCC AATTCTT-3′(SEQ ID NO 23)ADJ0205′-AAGAATTGGAAAAACGAATCCGATCGAAAAATTATG-3′(SEQ ID NO 24)K61TADJ0215′-AATAGACTGATCGTCTGTAAAGTTTTTAAA-3′(SEQ IDNO 25)ADJ0225′-TTTAAAAACTTTACAGACGATCAGTCTATT-3′(SEQ IDNO 26)N85TADJ0235′-TCTTTTCTTTTTAGTACTATTGAAAAACTT-3′(SEQ IDNO 27)ADJ0245′-AAGTTTTTCAATAGTACTAAAAAGAAAAGGA-3′(SEQ IDNO 28)K94NADJ0255′-ATAATTAGTCAAATTTTCGAAGTCATG-3′(SEQ ID NO29)ADJ0265′-GATGACTTCGAAAATTTGACTAATTAT-3′(SEQ ID NO30)S99NADJ0275′-AATCAAGTCAGTAACGTTATAATTAGTCAA-3′(SEQ IDNO 31)ADJ0285′-TTGACTAATTATAACGTTACTGACTTGAAT-3′(SEQ IDNO 32)Q106TADJ0295′-ATGAATAGCTTTACTAGTCACATTCAAGTC-3′(SEQ IDNO 33)ADJ0305′-GACTTGAATGTGACTAGTAAAGCTATTCAT-3′(SEQ IDNO 34)經(jīng)過兩步PCR和用BamHI和XbaI消化后，預(yù)期每對引物產(chǎn)生447bp的片斷，該片斷可在pIGY-5中克隆。
在CHO細(xì)胞中表達(dá)干擾素γ通過使用Lipofectamine 2000(Life Technologies，USA)作為轉(zhuǎn)染劑將上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO K1細(xì)胞系(ATCC#CCL-61)中。24小時后收獲培養(yǎng)基并測定干擾素γ的活性和濃度。
序列表<110>馬克西根公司(Maxygen Aps)<120>干擾素γ偶聯(lián)物<130>7wo<160>34<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>166<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>1Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu1 5 10 15Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu20 25 30Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn35 40 45Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp50 55 60Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe65 70 75 80Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
85 90 95Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg100 105 110Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Agn Val115 120 125Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser130 135 140Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg145 150 155 160Gly Arg Arg Ala Ser Gln165<210>2<211>143<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>2Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln130 135 140<210>3<211>375<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>3tctgatgtgg ctgataatgg aactttgttc ttaggcattt tgaagaattg gaaagaagaa 60tctgatagaa aaattatgca gtctcaaatt gtgtcttttt acttcaaatt gtttaaaaac120tttaaagatg atcagtctat tcaaaagtct gtggaaacta ttaaggaaga tatgaatgtg180aagtttttca attctaacaa aaagaaaaga gatgacttcg aaaagttgac taattattct240gtgactgact tgaatgtgca aagaaaagct attcatgaat tgatccaagt gatggctgaa300ttgtctccag ctgctaaaac aggaaagaga aaaagatctc agatgttgtt tagaggtaga360agagcttctc agtaa375<210>4<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>4ggtttgatat cgatggccaa20<210>5<211>18<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>5gcggccctct agattact18<210>6<211>51<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>6catctccgtc cactccgact ccatagcatg caagatccat atgtgaaaga a51<210>7<211>84<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>7atcttgcatg ctatggagtc ggagtggacg gagatggagt tggcggagta gaaggaaccg 60ctgttttagc agctggagac aatt84<210>8<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>8ggtttgatat cgatggccaa20<210>9<211>18<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>9gcggccctct agattact18<210>10<211>48<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>10tttagaggta gaagagcttc tcagcaagat ccatatgtga aagaagct48<210>11<211>48<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>11agcttctttc acatatggat cttgctgaga agctcttcta cgtctaaa
48<210>12<211>33<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>12tgctctagac atctgagatc gttttctctt tcc33<210>13<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>13ggtttgatat cgatggccaa20<210>14<211>51<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>14catctccgtc cactccgact ccatagcatg caagatccat atgtgaaaga a51<210>15<211>81<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>15atcttgcatg ctatggagtc ggagtggacg gagatggagt tggcggagta gaaggaaccg 60gcatctgaga tctttttctc c81<210>16<21l>102<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>16cgcggatcca tgaaatatac aagttatatc ttggcttttc agctctgcat cgttttgggt 60tctcttggct gttactgcca agatccatat gtgaaagaag ct102<210>17<211>19<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>17gatggctggc aactagaag19<210>18<211>19<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>18tgtacggtgg gaggtctat19<210>19<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>19agcattaaaa tacttcgtca agttttcagc30<210>20<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>20gctgaaaact tgacgaagta ttttaatgct30<210>21<211>27<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>21cacatcagaa tgagtagcat taaaata27<210>22<211>27<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>22tattttaatg ctactcattc tgatgtg27<210>23<211>36<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>23cataattttt cgatcggatt cgtttttcca attctt36<210>24<211>36<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>24aagaattgga aaaacgaatc cgatcgaaaa attatg36<210>25<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>25aatagactga tcgtctgtaa agtttttaaa30<210>26<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>26tttaaaaact ttacagacga tcagtctatt30<210>27<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>27tcttttcttt ttagtactat tgaaaaactt30<210>28<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>28aagtttttca atagtactaa aaagaaaaga30<210>29<21l>27<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>29ataattagtc aaattttcga agtcatg27<210>30<211>27<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>30gatgacttcg aaaatttgac taattat27<210>31<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>31aatcaagtca gtaacgttat aattagtcaa30<210>32<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>32ttgactaatt ataacgttac tgacttgaat30<210>33<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>33atgaatagct ttactagtca cattcaagtc30<210>34<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>34gacttgaatg tgactagtaa agctattcat30
權(quán)利要求
1.表現(xiàn)出IFNG活性且包含共價連接到IFNG多肽上的至少一個第一非多肽組分的偶聯(lián)物，該多肽含有的氨基酸序列與親本IFNG多肽的區(qū)別在于導(dǎo)入和/或去掉了至少一個含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中親本多肽是野生型人IFNG(huIFNG)或其變異體或片斷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的偶聯(lián)物，其中第一非多肽組分選自聚合物分子，親脂化合物，糖組分和有機(jī)衍生試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的偶聯(lián)物，其中從hulFNG中被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入和/或去掉含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中從hulFNG中被具有至少25％的其側(cè)鏈暴露于表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入和/或去掉含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的偶聯(lián)物，其中從hulFNG中被具有至少50％的其側(cè)鏈暴露于表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入和/或去掉含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一項的偶聯(lián)物，其中第一非多肽組分是糖組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的偶聯(lián)物，其中糖組分是N-連接的糖組分且IFNG多肽與親本多肽相比包含至少一個去掉的和/或至少一個導(dǎo)入的N-糖基化位點。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的偶聯(lián)物，其中IFNG多肽含有至少一個選自下列的突變Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T， S40N+R42S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，D63N，D63N+S65T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，Q67N， Q67N+S69T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/T，K80N+F82S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，E119N，E119N+S121T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R13lN+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F(xiàn)136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相對于具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的huIFNG。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的偶聯(lián)物，其中IFNG多肽含有至少一個選自下列的取代P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40S/T，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，D62N+Q64S/T，Q64N+166S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+173S/T，E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F(xiàn)136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相對于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的huIFNG。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項的偶聯(lián)物，其中IFNG多肽含有至少一個選自下列的取代K12S/T，G18S/T，E38N，K61S/T，N85S/T，K94N，S99N，Q106S/T，A124N，K130N，和R140N，更優(yōu)選選自E38N，K94N，S99N，A124N，K130N和R140N。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11任一項的偶聯(lián)物，還包含至少一個第二非多肽組分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中第二非多肽組分是聚合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的偶聯(lián)物，其中該多肽與親本多肽的區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個和/或去掉了至少一個含有第二非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的偶聯(lián)物，其中第一非多肽組分是聚合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項的偶聯(lián)物，其中聚合物是線性的或分支的聚乙二醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16任一項的偶聯(lián)物，其中含有聚合物連接基團(tuán)的氨基酸殘基選自半胱氨酸，賴氨酸，天冬氨酸和谷氨酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項的偶聯(lián)物，其中非多肽是具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的聚合物且其中在huIFNG中被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入至少一個半胱氨酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項的偶聯(lián)物，其中非多肽是具有賴氨酸作為連接基團(tuán)的聚合物且其中去掉了至少一個賴氨酸殘基，該賴氨酸殘基選自K6，K12，K13，K34，K37，K43，K55，K58，K61，K68，K74，K80，K86，K87，K88，K94，K108，K125，K128和K130，編號相對于SEQ ID NO2給出。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的偶聯(lián)物，其中去掉的賴氨酸是K12，K34，K37，K108，K128和/或K130。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項的偶聯(lián)物，其中IFNG多肽在其C-末端截短。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項的偶聯(lián)物，其中IFNG多肽是單鏈IFNG多肽。
23.表現(xiàn)出IFNG活性且包含至少一個N-末端PEG連接的IFNG多肽的偶聯(lián)物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的偶聯(lián)物，其中IFNG多肽是huIFNG或其變異體或片斷。
25.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的偶聯(lián)物，它與huIFNG相比增加了功能性體內(nèi)半壽期。
26.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的偶聯(lián)物的多肽部分的核苷酸序列。
27.含有根據(jù)權(quán)利要求26的核苷酸序列的表達(dá)載體。
28.含有根據(jù)權(quán)利要求26的核苷酸序列或根據(jù)權(quán)利要求27的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的宿主細(xì)胞，它是酵母，大腸桿菌，CHO，BHK，HEK293，或SF9細(xì)胞。
30.增加IFNG多肽功能性體內(nèi)半壽期的方法，該方法包括將組成非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基導(dǎo)入親本IFNG多肽含有表面暴露的氨基酸殘基，且該殘基不合該連接基團(tuán)的位置中和/或去掉組成該連接基團(tuán)的氨基酸殘基，且將該所得的修飾多肽與具有導(dǎo)入和/或去掉的氨基酸殘基作為連接基團(tuán)的非多肽組分偶聯(lián)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中非多肽組分選自聚合物分子，糖組分，親脂基團(tuán)和有機(jī)衍生試劑。
32.制備根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的偶聯(lián)物的方法，其中使得偶聯(lián)物的多肽部分在有益于發(fā)生偶聯(lián)的條件下與偶聯(lián)它的分子反應(yīng)，并回收偶聯(lián)物。
33.含有根據(jù)權(quán)利要求1-25的偶聯(lián)物和b)一種藥用上可接受的稀釋劑，載體或佐劑的藥用組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的偶聯(lián)物或根據(jù)權(quán)利要求33的藥用組合物，它們用于治療疾病，特別是間質(zhì)肺疾病，最具體的是特發(fā)性肺纖維變性。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的偶聯(lián)物或根據(jù)權(quán)利要求34的藥用組合物，它們用于治療疾病，特別是間質(zhì)肺疾病，最具體的是特發(fā)性肺纖維變性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表現(xiàn)出干擾素γ活性且含有與IFG多肽共價連接的至少一個第一非多肽組分的偶聯(lián)物，該多肽含有的氨基酸序列與親本IFNG多肽的區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個和/或去掉了至少一個含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基。該偶聯(lián)物可用于治療各種疾病。
文檔編號A61K47/48GK1433324SQ00818218
公開日2003年7月30日 申請日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日
發(fā)明者安妮·D·詹森, 金·V·安德森, 克里斯琴·K·漢森 申請人:馬克西根控股公司