專利名稱：釋放抗癌劑的生物降解微球在治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤方面的用途的制作方法
本申請涉及釋放抗癌劑的生物降解微球在治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤方面的用途。
成膠質(zhì)細(xì)胞瘤屬于由“國家稀有病癥組織”編輯的稀有疾病類。
惡性神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原始腫瘤，根據(jù)分類，它們占顱內(nèi)腫瘤的13-22％。在組織學(xué)方面，事實上可分成兩類惡性神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤，間變型星形細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，后者是這些腫瘤中最無親和力的形式。
目前對惡性神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤尚無有效的治療方法?；汲赡z質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的存活時間不超過一年，即使化學(xué)療法和放射療法與外科手術(shù)結(jié)合起來也是如此。
惡性神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的治療在原則上受到三種現(xiàn)象的制約。
第一種現(xiàn)象是存在一種使中樞神經(jīng)系統(tǒng)與余下組織彼此隔離的血腦屏障(BHE)。這種BHE只能讓脂溶的小尺寸分子通過。其他分子要達(dá)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)就應(yīng)該服用非常大的劑量，其代價是產(chǎn)生嚴(yán)重的系統(tǒng)副作用。
第二個制約神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤治療效率的因素是這些腫瘤的浸潤特性。大腦是一種高度功能性的器官，從癌學(xué)意義上對其實施大型外科手術(shù)是不可能的。最完全的切除只是宏觀地完全切除，而大量的浸潤腫瘤細(xì)胞留在切除腔壁上。許多作者還證明90％采用放射療法處理和治療的惡性神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤還會在距起始腫瘤位置二厘米處復(fù)發(fā)。
最后一個制約神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤治療效率的因素是低的治療指數(shù)。這些腫瘤細(xì)胞以某種方式隱藏在對例如由放射療法或某些抗癌劑所引起的刺激極其脆弱和敏感的正常組織后面。因此難以在不損害正常神經(jīng)細(xì)胞的條件下破壞腫瘤細(xì)胞。
在治療神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤方面取得的進(jìn)展尚不充分(Kornblith PL，Walker M，“惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化學(xué)治療”《神經(jīng)外科學(xué)雜志》(J.Neurosurg)，681-17，1988；Shapiro WR，Green SB，Burger PC，SelkerRG，VanGilder JC，Robertson JT，Mahaley SM，“對于新診斷的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者借助或不借助靜脈注射5-氟尿嘧啶進(jìn)行動脈與靜脈BCNU隨機比較”，《神經(jīng)外科學(xué)雜志》，76772-781，1992)。
目前，由外科切除手術(shù)引起的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的傳統(tǒng)治療是基于外部放射治療。其存活期不超過一年。放射治療與采用1-(2-氯乙基)-3-環(huán)己基-1-亞硝基-脲(BCNU)進(jìn)行化學(xué)治療相結(jié)合只對間變型星形細(xì)胞瘤有效。它帶來的效果不大，因為它只是將存活百分率提高到18個月，沒有改變存活期。
另外，從未進(jìn)行過免疫治療，基因治療尚需得到驗證。
還曾試驗過幾種目的在于增加抗癌劑局部濃度的技術(shù)如血腦屏障的滲透性破裂、往腦脊液中注射、頸動脈內(nèi)灌注和借助皮下儲器進(jìn)行瘤內(nèi)給藥(Tamargo RJ和Brem H，“往中樞神經(jīng)系統(tǒng)用藥”，《神經(jīng)外科學(xué)季刊》，2259-279，1992)。這些技術(shù)中任何一種均無法增加患者的存活期，某些技術(shù)還顯示出高毒性。
近年來，對植物制劑的研究使得可植入的能夠避免活性物質(zhì)降解的還能夠使它們在確定的時間內(nèi)以可控制方式局部釋放、同時使系統(tǒng)的副作用降低的聚合物系統(tǒng)得到發(fā)展。這些可植入聚合物系統(tǒng)的優(yōu)點最近才促使幾個研究小組研究它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用(Langer R，“用于將藥物送入腦中的聚合物植入物”，《控制釋放雜志》(J.ControlledRelease)，1653-60，1991)。特別地，在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤切除壁中植入這樣的系統(tǒng)延緩了腫瘤的復(fù)發(fā)，延長了患者的存活時間。在手術(shù)腔孔周圍仍會有構(gòu)成90％在距手術(shù)病灶兩厘米處出現(xiàn)復(fù)發(fā)的成因的隔離的惡性細(xì)胞。在這個區(qū)域，神經(jīng)組織是功能性的，血腦屏障還是完整的，這樣制約了通常的放射療法和化學(xué)療法的作用。
曾研制了各種可植入的釋放活性分子的聚合物系統(tǒng)，并且在動物體內(nèi)進(jìn)行了試驗。
曾研制出一種由PCPP-SA(聚[1，3-雙(羧基苯氧基)丙烷-共-癸二酸])組成的并釋放BCNU(GLIADEL)的可生物降解盤的系統(tǒng)，盡管臨床研究結(jié)果不太好(Brem H，“治療腦腫瘤的聚合物”，《生物材料》(Biomaterials)，11699-701，1990；Brem H，Mahaley MS，Vick NA，Black KL，ScholdSC，Eller TW，Cozzens JW，Kenealy JN，“用藥物聚合物植入物治療復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的間質(zhì)性化學(xué)治療”，《神經(jīng)外科學(xué)雜志》，74441-446，1991；Brem H，Walter KA，Langer R，“用于惡性腦腫瘤治療的作為控制給藥手段的聚合物”，《Eur J.Pharm Biopharm》，39(1)2-7，1993；Brem H，Piantadosi S，Burger PC，Walker M等人，《通過用于化學(xué)治療再發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤的可生物降解聚合物，手術(shù)中控制送藥安全和效率的安慰劑對照試驗》，3451008-1012，1995)。
曾研制釋放BCNU的微球，但動物研究結(jié)果不太鼓舞人心(Torres Al，Boisdron-Cell M，Benoit JP，“負(fù)載BCNU微球配方藥物穩(wěn)定性和溶解度對微封裝方法設(shè)計的影響”，《微封裝雜志》(J.Microencapsulation)，1341-51，1996；Painbeni T.Venier-JulienneMC，Benoit JP，“負(fù)載聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)BCNU-微球的內(nèi)部形態(tài)。對藥物穩(wěn)定性的影響”，《Eur.J.Pharm.Biopharm》，1998，45，31-39)。
本發(fā)明的目的是可植入的可生物降解的釋放抗癌劑的微球在治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤方面的用途。這些微球的應(yīng)用與放射治療和外科手術(shù)相結(jié)合。在切除腫瘤后，采用組織內(nèi)注射法將釋放抗癌劑的可生物降解微球植入手術(shù)病灶處。然后，手術(shù)后最多七天內(nèi)就進(jìn)行放射治療。
由于應(yīng)用這些微球，本申請人非常有利地將成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的存活期延長一倍。事實上，應(yīng)用本發(fā)明微球能夠達(dá)到至少90星期的存活期。
因此，本發(fā)明涉及釋放放射敏感抗癌劑的可生物降解微球在制備以與放射治療時間同時、分開或錯開方式用于治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的藥物方面的用途，所述微球用來植入切除神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤后的手術(shù)病灶，其特征在于含有抗癌劑的微球用聚合物包裹，該聚合物可延緩釋放抗癌劑，并且在一段時間內(nèi)在主質(zhì)間隙保持治療有效濃度，以便使如此治療的患者存活期達(dá)到至少約90星期，優(yōu)選地約130星期，更優(yōu)選地160星期。
被用于本發(fā)明范圍內(nèi)的微球含有優(yōu)選地是親水的和/或不通過血腦屏障的抗癌劑。有利地，該抗癌劑沒有中樞神經(jīng)毒性。這種抗癌劑優(yōu)選地對分裂細(xì)胞起作用。
抗癌劑由放射敏感的抗癌化合物組成，或由含有至少一種放射敏感抗癌化合物的抗癌化合物的混合物組成，一種或多種所述抗癌化合物例如選自5-氟尿嘧啶(5-FU)、鉑類，如卡鉑和順鉑，紫杉烷，如decétaxel和paciltaxel，吉西他濱，VP16，絲裂霉素，碘苷，topoisomérase 1抑制劑，如伊立替康、托泊替堪和喜樹堿，亞硝基脲，如BCNU、ACNU或MCNU，甲氨蝶呤，博來霉素，阿霉素，癌得星和長春新堿，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素，如IL2、IL6、IL12和IL13以及干擾素。
抗癌劑優(yōu)選地是5-FU。
5-FU是已有的并且為人們所熟知的抗有絲分裂劑。這是一種非常容易通過血腦屏障的化合物，因此它的活性通過局部用藥而增加(Bourke RS，West CR，Chheda G.等人，“靈長類動物靜脈注射5-氟尿嘧啶后，5-氟尿嘧啶進(jìn)入腦脊液和腦中并在其中分布的動力學(xué)”，《癌研究》(CancerRes.)，331735-1746，1973；Gerosa MA，Dougherty DV，Wison CB，Rosenblum ML，“腦腫瘤模型的改進(jìn)治療，第2部分借助BCNU和5-氟尿嘧啶進(jìn)行順序治療”，《神經(jīng)外科學(xué)雜志.》58368，1983；Kotsilimbas DG，Karpf R，Meredith S，Scheinberg LC，“不經(jīng)腸的5-FU對實驗?zāi)X腫瘤影響的評價”，《神經(jīng)學(xué)》，16916-918，1966；Levin VA，Edwards MS，Wara WM，Allen，J，Ortega J，Vestnys P，“借助5-氟尿嘧啶和1-(2-氯乙基)-3-環(huán)己基-1-亞硝基脲(CCNU)、接著采用羥基脲、醚醇硝唑和輻照作用于腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤腦腫瘤研究中心和兒童癌組的實驗研究”，《神經(jīng)外科學(xué)》(Neurosurgery)，14679-681，1984；OdaY，Tokuriki Y，Tsuda E，Handa H，Kieler J，“惡性腦腫瘤中抗癌丸、被嵌埋入硅橡膠中的5-FU和尿激酶的試驗”，《第六屆歐洲神經(jīng)外科學(xué)會議會議錄，Acta neurochirurgica，增刊》，28489-490，1979；PennRD，Kroin JS，Harris JE，Chiu KM，Braun DP，“采用順鉑和氟尿嘧啶對鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)行瘤內(nèi)化學(xué)治療”，《應(yīng)用神經(jīng)生理學(xué)》(Appl.Neurophysio.)46240-244，1983；Shapiro WR，“化學(xué)治療實驗?zāi)X腫瘤的研究1-(2-氯乙基)-3-環(huán)己基-1-亞硝基脲，vinseristine和5-氟尿嘧啶的評價”，《國家癌癥研究所雜志》(J.Nat.Cancer Institute)，46(2)，359-368，1971；Shapiro WR，Green SB，Burger PC，Selker RG，VanGilder JC，Robertson JT，Mahaley SM，“新診斷惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者在經(jīng)過或未經(jīng)靜脈內(nèi)注射5-氟尿嘧啶的情況下動脈與靜脈BCNU隨機比較”，《神經(jīng)外科學(xué)雜志.》，76772-781，1992；Soloway AH，MarkVH，Dukat EG等人，“腦腫瘤的化學(xué)治療，I-移植的鼠科動物成室管膜細(xì)胞瘤”，《癌化學(xué)治療報告》(Cancer Chemother Rep.)361-4，1964)。
5-FU活性還會由于延長給藥而增強。5-FU是一種通過干擾核酸合成起作用的試劑。研究表明，僅30-50％鼠類惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(L9)和14-44％人類惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞任何時候都發(fā)生分裂。此外，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞循環(huán)期較長(神經(jīng)膠質(zhì)瘤L9為20小時，而人的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤為3-7天)。然而，5-FU在血漿中的清除率較快(半衰期為30分鐘)(NeuweltEA，Barnett PA，F(xiàn)renkel EP，“嚙齒動物中，化學(xué)治療劑在正常腦中的滲透性與往由鳥類肉瘤病毒引發(fā)的腦腫瘤的輸送藥物輸送問題的觀察”，《神經(jīng)外科學(xué)》，14154-160，1984)。因此，5-FU不能夠通過系統(tǒng)用藥或局部注射破壞大量的惡性細(xì)胞。
5-FU對快速再生組織呈現(xiàn)重要活性，還具有出人預(yù)料的神經(jīng)毒性。5-FU參與快速生長組織特別需要的以保證其增殖和再生的核酸合成。這當(dāng)然不是在正常狀態(tài)下有絲分裂稀少的腦組織的情況，只是在神經(jīng)膠質(zhì)總體中突然發(fā)生。5-FU毒性作用限制了采用一般的方法用藥，其毒性作用基本上屬于血液病學(xué)和胃-腸病學(xué)范疇。如果曾公開過不多的5-FU神經(jīng)學(xué)副作用，則它們很少被了解的發(fā)病機理或許是多因子的(5-FU降解代謝產(chǎn)物阻斷Krebs循環(huán)，或先前存在的硫胺缺乏加重)(Aoki N，“由5-氟尿嘧啶衍生物引起的可逆腦白質(zhì)病，表現(xiàn)為運動不能性緘默癥”，《SurgNeurol》，25279-282，1986；Moore DH，F(xiàn)owler WC，Crumpler LS，“5-氟尿嘧啶神經(jīng)毒性，病例報告”，《Gynecol Oncology》，36152-154，1990)。
最后，5-FU是放射敏感的(Koutcher JA，Alfieri AA，Thaler h等人，“通過生物化學(xué)調(diào)節(jié)和5-FU增強輻射”，《Int.J.Radit.Biol.Phys.》，391145-1152，1997)。60年代以來，通過動物模型和通過活體外腫瘤細(xì)胞證明在這些分開治療法的每種治療里5-FU/放射治療結(jié)合的優(yōu)越性(Basshaw M，“放射治療中可能的加強效力作用”，《Amer J.Roentgenol》，85822-833，1961；Vietti T，Eggerding F，ValerioteF，“X-輻射和5-氟尿嘧啶對移植白血病細(xì)胞存活的聯(lián)合作用”，《J.Natl.Inst.》，47865-870，1971)。這種協(xié)同作用是由于腫瘤細(xì)胞總體同步以及5-FU降低細(xì)胞修復(fù)機制。曾對人體試驗過放射治療與抗嘧啶(5-FU或BrudR)的聯(lián)合作用(Goffman TE，Dachowski LJ，Bobo H等人，“國家癌癥研究所階段I/II關(guān)于用碘脫氧尿核苷和超分離輻射處理的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤多形式研究的長期探索”，《臨床腫瘤學(xué)雜志》(J.ClinicalOncology)，10264-268，1992)。這里通過系統(tǒng)給藥可以進(jìn)一步說明無肯定功效的原因。
當(dāng)抗癌劑是5-FU時，腦脊液中的抗癌劑濃度是主質(zhì)間隙中濃度的反映，該抗癌劑濃度是3-20納克/毫升。
為了限制在被用于本發(fā)明范圍的微球中含有的抗癌劑的神經(jīng)毒性，有利地往所述抗癌劑中添加一種神經(jīng)保護化合物。這種神經(jīng)保護化合物例如選自肽生長因子，如NGF或BDNF。
被用于本發(fā)明范圍內(nèi)的可生物降解微球用一種聚合物包裹，該聚合物可延緩釋放抗癌劑，并且在至少三星期、優(yōu)選地至少四星期的時間內(nèi)，在主質(zhì)間隙保持治療有效的濃度。
該聚合物選自乙基纖維素、聚苯乙烯、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(d，l-乳酸)和聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)。
該聚合物優(yōu)選地是聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)或PLAGA，它是一種已被批準(zhǔn)用于緩釋植物制劑配方中的可生物降解聚合物(與PCPP-SA不同，PCPP-SA還未批準(zhǔn)大規(guī)模臨床應(yīng)用)。
聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)優(yōu)選地是50∶50 PLAGA(即含有等量乳酸與乙醇酸)，例如由法國BI Chimie公司提供的ResomerRG 506，其分子量等于72000，多分散性指數(shù)等于1.8，特性粘度為0.80dl/g(在25℃下0.1％聚合物氯仿溶液)。
PLAGA是疏水共聚物，它通過水解反應(yīng)引起的降解得到兩種通常的生物基質(zhì)，乳酸與乙醇酸，它們在需氧糖酵解后新陳代謝成CO2和H2O?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)表明呼吸過程是除去這兩種基質(zhì)的基本過程。PLAGA生物降解速度取決于乳酸與乙醇酸各自的比例。PLAGA的生物相容性非常好，對異物可引起適度反應(yīng)(Visscher GE，RL Robinson，HV Mauding，F(xiàn)ong JW，Pearson JE，Argentieri GJ“50∶50聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)微膠囊的生物降解和組織反應(yīng)”，《Biomed.Mat.Res.》，19349-365，1985)。PLAGA加入外科手術(shù)線的組合物中(Frazza EJ，Schmidit EE，“新的可吸收的縫合用線”，《J.Biomed.Mater.Res.》，543-58，1971)，該組合物呈可在皮下植入的植物制劑形式(Jalil R，Nixon JR，“可生物降解的聚(乳酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)微膠囊與制備技術(shù)和釋放性質(zhì)相關(guān)的問題(評論)”，《微封裝雜志》，7297-325，1990)。業(yè)已證明，50∶50 PLAGA微球可以采用γ輻照進(jìn)行消毒，并且一旦采用立體定位技術(shù)植入嚙齒動物的腦中，它們在兩個月內(nèi)完全生物降解，同時只是引起星細(xì)胞和組織細(xì)胞類的非特定性適度反應(yīng)(Menei P，Daniel V，Montero-Menei C，Brouillard M，Pouplard-Barthelaix A，Benoit JP“聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球體的生物降解和腦組織的反應(yīng)”，《生物材料》(Biomaterials)，14470-478，1993；Menei P，Croue A，DanielV，Pouplard-Barthelaix A，Benoit JP“三種植入腦中微球的最終結(jié)果與生物相容性”，《J.Biomed.Mat Res.》281079-1085，1994)。這后一結(jié)果由Kou JH，Emmett C，Shen P等人在“在腦中聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)植入物的生物侵蝕作用和生物相容性”，《控制釋放雜志》，43123-130，1997中予以證實。
本發(fā)明的生物降解微球的平均直徑優(yōu)選地是48±20微米，更優(yōu)選地是46±7微米。它們含有15-35重量％抗癌劑、優(yōu)選地19-27％5-FU、更優(yōu)選地20％5-FU，和65-85重量％聚合物。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，負(fù)載5-FU的50∶50 PLAGA微球是特別優(yōu)選的。
在體外，負(fù)載5-FU的50∶50 PLAGA微球可以釋放5-FU達(dá)21天。在體內(nèi)，植于兔子皮下的這些微球能夠在23天內(nèi)產(chǎn)生平穩(wěn)5-FU血漿濃度。依舊在體內(nèi)，在嚙齒動物的腦中，至少直到第19天還在微球中可見到5-FU晶體。在兔子體內(nèi)，在腦內(nèi)植入PLAGA-5-FU微球(7毫克5-FU/千克)后，在血清中未檢測到任何痕量5-FU，這揭示在系統(tǒng)循環(huán)過程中通過的藥品量幾乎為零。
在嚙齒動物腦內(nèi)植入總劑量為17毫克5-FU/千克的PLAGA-5-FU微球后，未觀察到任何系統(tǒng)毒性信號，也未觀察到任何臨床的或組織的神經(jīng)毒性信號。在24Gy分份劑量下，用5-FU微球/腦放射治療的聯(lián)合治療腦是完全允許的(Menei P，“采用立體定位植入微球在SNC中的向量化”，《Thése d’Universitéen Sciences Pharmaceutiques，Université，d’Angers，1995》)。最后，采用立體定位術(shù)往鼠體內(nèi)發(fā)展的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6)中植入的這些微球明顯地降低了死亡率(Menei P，Boisdron-Celle M，Croue A，Guy G，Benoit JP“在正常鼠與患有C6-神經(jīng)膠質(zhì)瘤的鼠體內(nèi)立體定位植入含有5-氟尿嘧啶的生物降解微球所產(chǎn)生的作用”，《神經(jīng)外科學(xué)》，39117-124，1996)。
有利地，所述微球在滅菌溶液中制成懸浮液，該懸浮液被注入在切除腫瘤后的手術(shù)病灶的壁中。
滅菌溶液優(yōu)選地含有-以重量/體積表示1-1.5％，優(yōu)選地1.25％增粘劑，例如羧甲基纖維素鈉，-0.5-1.5％，優(yōu)選地1％表面活性劑，例如聚山梨酸酯80，以及-3.5-4.5％，優(yōu)選地4％等滲劑，例如甘露糖醇。
這些微球優(yōu)選地在就要注射前臨時制成懸浮液。該懸浮液優(yōu)選地含有3毫升上述滅菌液和700-800毫克可生物降解微球。
在證實成膠質(zhì)細(xì)胞瘤診斷與宏觀上切除神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤后，將該微球懸浮液在手術(shù)病灶壁的至少每一cm2植入至少2厘米深度，優(yōu)選地2-3厘米深度。
當(dāng)所述抗癌劑是5-FU時，注入的懸浮液總劑量相應(yīng)于5-FU的量為50-200毫克。
放射治療定位在腫瘤的體積，輻照的體積包括手術(shù)前的腫瘤與在所有方向上至少2厘米的邊緣，施用總劑量為50-60Gy。
優(yōu)選在手術(shù)后的第2天至第7天之間開始進(jìn)行放射治療?？倓┝?0-60Gy是在4-8星期時間內(nèi)分開使用的，例如按照每星期5次。
優(yōu)選地，在約6個星期里總劑量為60Gy，更優(yōu)選地在6.5個星期里按照每星期5次進(jìn)行放射治療。
在切除腫瘤后立即注入這些微球之后，在再次產(chǎn)生腫瘤的情況下，采用立體定位法可以一次或多次重新注入微球。
被用于本發(fā)明范圍內(nèi)的微球，可以根據(jù)Boisdron-Celle M，Menei P，Benoit JP在“含有5-氟尿嘧啶的可生物降解微球的制備方法，《J PharmPharmacol》47108-114，1995”中描述的方法的一種變化形式采用乳化-提取技術(shù)進(jìn)行制備。
本發(fā)明還涉及一種借助被用于本發(fā)明范圍內(nèi)的聚合物包裹的含有抗癌劑的微球的制備方法。該方法重要步驟是制備其中抗癌劑和聚合物分散在有機溶劑中的有機相。有機相和含水相制成乳液，然后通過添加水提取有機溶劑。最后，過濾所得到的微球懸浮液。
首先，本發(fā)明方法的特征在于在加入聚合物之前，在強烈攪拌下，將抗癌劑分散到有機溶劑中。
根據(jù)對現(xiàn)有技術(shù)的方法所作的修改，在星形球磨機中研磨活性組分。所得到的晶體尺寸是15-50微米。待包封晶體尺寸及其分散液事實上是用于控制包封率和體外釋放動力學(xué)的基本標(biāo)準(zhǔn)。
然后，在圓底管中，在用均化棒攪拌下，在加入聚合物之前將活性組分分散在有機溶劑、優(yōu)選地二氯甲烷中。
這種均化作用能夠得到均勻的懸浮液，還能夠不同研磨過程之間的差別，降低以及活性組分晶體尺寸。
在無助溶劑的溶劑中制備有機相。無助溶劑存在即使在得到的顆粒含有較少孔的情況下也能夠在乳化階段延緩聚合物沉淀。
活性組分分散液被傾入第一個反應(yīng)器。
以質(zhì)量比為8-13％，優(yōu)選11％加入聚合物。得到的有機相在室溫中在不斷攪拌下保持2-4小時，然后在溫度1-5℃、優(yōu)選2℃下保持約15分鐘。在室溫下攪拌有機相更長的時間可保證聚合物在溶劑中完全溶解。
在第二個反應(yīng)器中，制備含水相，同時優(yōu)選地將該含水相保持在與有機相同樣的溫度下，優(yōu)選地在2℃。降低含水相和有機相的溫度可導(dǎo)致它們的粘度增加與包封率增加。含水相例如是10％PVA水溶液。
使用兩個夾套反應(yīng)器，冷凍液在這兩個反應(yīng)器中串聯(lián)循環(huán)。當(dāng)將有機相與含水相混合時，兩者的溫度有利地是相同的，優(yōu)選地等于約2℃。良好的溫度控制事實上同時調(diào)節(jié)了顆粒尺寸，活性組分的溶解速度和溶劑的提取速度。
有機相從第一個反應(yīng)器被傾注到第二個反應(yīng)器中。含水相/有機相的體積比是80/3至120/3，優(yōu)選地是100/3。
得到的乳液攪拌至少3分鐘，優(yōu)選地3-6分鐘，更優(yōu)選地5分鐘。對這一時間間隔的選擇直接地與釋放動力學(xué)、特別是24-48小時《突然發(fā)作》作用相關(guān)聯(lián)。
與充分乳化時間相配合，無助溶劑存在這一條件允許處在表面的活性組分或包裹不好的活性組分即使在開始階段的釋放動力學(xué)比較好地得到控制的情況下也被溶解。
為了提取有機溶劑，往乳液中加水，乳液/水的體積比是1/4至1/2，優(yōu)選地等于1/3。水的提取溫度是1-5℃，優(yōu)選地等于4℃。
為了限制不同批量之間的可變性以及為了爭取時間，可在同一個反應(yīng)器中進(jìn)行乳化和提取步驟。為了制約活性組分過度溶解，水的提取溫度較低。
得到的微球懸浮液被混合幾分鐘，然后在惰性氣氛下過濾。在惰性氣氛下操作能夠制約產(chǎn)品被污染的危險。
任選地根據(jù)上述方法得到的微球有利地進(jìn)行凍干。
向2-5克微球粉末(濾餅)中添加10毫升滅菌水。全部冷凍到-40℃，然后放入凍干機中。凍干18小時。操作完畢，第二次干燥溫度應(yīng)該保持在10℃以下。
這些微球應(yīng)該保存在+4℃，即使干燥也如此。
本發(fā)明還涉及由滅菌溶液和上述任選地按照上述方法得到的釋放抗癌劑的生物降解微球組成的懸浮液，該滅菌液含有以質(zhì)量/體積計1-1.5％增粘劑、0.5-1.5％表面活性劑和3.5-4.5％等滲劑，釋放抗癌劑的生物降解微球是用聚合物包裹的，微球的比例是每毫升滅菌溶液為200-300毫克，優(yōu)選地每毫升為230-270毫克。
這些微球優(yōu)選地由15-35重量％抗癌劑和65-85重量％聚合物組成。
該聚合物有利地是聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)，它優(yōu)選地含有等量乳酸和乙醇酸。
滅菌溶液優(yōu)選地含有以重量/體積計1.25％羧甲基纖維素鈉、1％聚山梨酸酯80和4％甘露糖醇。
通過下述實施例非限制性地說明本發(fā)明。
實施例1根據(jù)Boisdron-Celle M，Menei P和Benoit JP在“含有5-氟尿嘧啶的可生物降解微球的制備方法，《J Pharm Pharmacol》47108-114，1995”中描述的方法的一種變化形式采用乳化-溶劑提取技術(shù)制備微球。
研磨5-FU在Pulverisette 7型星形球磨機(Fritsch)中研磨5-FU。在每個裝7個球的壇中加入8.5克5-FU。以速度7研磨10分鐘。在層流式排風(fēng)罩下回收粉末。得到的晶體尺寸是15-50微米，可分成兩部分細(xì)部分(粒度小于1微米)和粗部分(大于30微米)。
5-FU在有機溶劑中的分散使用超-turrax型均化器，在圓底管中以13500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢鑼⒛ニ榈?-FU分散于45毫升二氯甲烷中達(dá)3分鐘。
有機相的制備將5-FU分散液移注到150毫升夾套式冷凍反應(yīng)器中。往其中添加PLAGA，以便使PLAGA/二氯甲烷比例等于11％。在20℃用槳葉以450轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢栌袡C相4小時，然后在2℃攪拌15分鐘。在這個反應(yīng)器中，借助低溫恒溫器將其溫度保持不變，大約相差0.1℃。
乳液的制備在6升夾套式冷凍反應(yīng)器中，制備1500毫升10％經(jīng)壓熱作用被保持在2℃的PVA水溶液。然后，通過第一個反應(yīng)器底部的閥口，將有機相移注到這個反應(yīng)器中。有機相在5-10秒內(nèi)流入用以375轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)槳葉攪拌的含水相中。含水相/有機相的體積比等于100/3。
乳液攪拌4分45秒。
提取乳液準(zhǔn)備好后，往乳液倒入4.5升4℃提取水，乳液/水的體積比等于1/3。提取2分鐘。
過濾通過不銹鋼槽底部移注第二個反應(yīng)器中的全部內(nèi)容物，然后施加氮氣壓力。用孔直徑等于3微米的過濾器過濾該懸浮液。
在全部懸浮液通過過濾器后，濾餅用3升滅菌水洗滌兩次。
所得到微球的抗癌劑包封率是20％。在篩分后，在爐中解吸二氯甲烷達(dá)48小時。然后包裝微球，并用19kGyγ-輻射滅菌。滅菌后檢測包封率。然后測量痕量的殘留溶劑。有利地檢測二氯甲烷殘留率為0.5％。檢測得到的微球的無菌性及其體外釋放動力學(xué)。
所得到微球的活性組分含量是23±3.5％。
根據(jù)前面描述的方案進(jìn)行了多批試驗，根據(jù)等同于46±7微米(所制備的批量的平均值的平均值)的批量總量計算顆粒平均尺寸為48±20微米。
所得到微球的活性組分含量是23±3.5％，平均尺寸為48±20微米。
實施例2采用實施例1的乳化-溶劑提取技術(shù)制備微球。
-研磨5-FU通過研磨4克5-FU如實施例1所述方式進(jìn)行。
得到的晶體尺寸是15-50微米，分成兩部分細(xì)部分(粒度小于1微米)和粗部分(大于30微米)。
5-FU在有機溶劑中的分散使用超-turrax型均化器，通過在圓底管中以13 500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢鑼⒛ニ榈?-FU分散于40毫升二氯甲烷中達(dá)3.5分鐘。
-如實施例1所述制備有機相和乳液。
-如實施例1所述進(jìn)行提取和過濾。
得到的微球特性如下5-FU含量22％尺寸46±7微米在用19kGy輻射滅菌24小時后的突然發(fā)作效果40±4％。
實施例3用實施例1的50∶50PLAGA/5-FU微球進(jìn)行階段I/II開放試點臨床研究。
在含有下述物質(zhì)的溶液中臨時將得到的微球制成懸浮液-以重量/體積計1.25％羧甲基纖維素鈉(Cooper)，-1％聚山梨酸酯80，-4％甘露糖醇，以及-其數(shù)量足以得到總體積3毫升注射制劑的水。
該溶液預(yù)先用壓力釜在121℃滅菌20分鐘，然后采用其劑量為5kGy-25kGy、優(yōu)選地19kGy的γ-輻射進(jìn)行放射滅菌。
由于需要避免產(chǎn)生泡沫，所以這種懸浮液的制備過程難以應(yīng)付。在其制備后立刻注射懸浮液，因為微球易于沉積在注射器中，并堵塞注射器。
在宏觀上切除神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤后，將微球懸浮液按照每次注射為100微升植入至少每平方厘米手術(shù)病灶的壁里，其深度為2-3厘米。
用1毫升注射器和一根18ga(1.3×45mm)導(dǎo)管(InsyteVialonTM)進(jìn)行注射，抽出導(dǎo)管的金屬管心針，以便只保留具有非傾斜泡沫塑料端頭的塑料導(dǎo)管，往腦組織注射懸浮液。使用1毫升注射器同樣也是必要的。用傾斜針注射懸浮液會遇到血腫和微球回流的危險。導(dǎo)管直徑應(yīng)該小到足以不使腦組織受到創(chuàng)傷，但又應(yīng)該大到足以不被微球懸浮液堵塞。
應(yīng)該非常緩慢地注射，導(dǎo)管在取出之前應(yīng)該在原位停留幾分鐘，以便避免微球回流。在注射部位施加一片1厘米2可吸收的郁血敷料(Surgical或Spongel)。
研究中所涉及患者的年齡是18-68歲，無患瘤病史，且Karnofsky指數(shù)高于60，具有引起小腦幕上成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的臨床歷史和圖像，經(jīng)過宏觀上完全切除手術(shù)，他們的手術(shù)中組織研究(根據(jù)OMS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行壞死，血管增生，核多型和有絲分裂活性)證實成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的診斷。
按照下列標(biāo)準(zhǔn)排除患者新陳代謝機能不全，妊娠，其他在前的癌癥病。
開始準(zhǔn)備三組以便研究增加5-氟尿嘧啶劑量的效果按照時間順序排列，70，132和264毫克，在試驗過程中觀察這組治療耐受性后再開始下組的治療。
由于接受132毫克5-FU的患者體內(nèi)突然出現(xiàn)II級神經(jīng)學(xué)毒性，以及根據(jù)治療方案停止的規(guī)定，停止治療升級，后續(xù)患者接受同樣的132毫克劑量。
在手術(shù)后的第2天至第7天之間開始通常的外部放射治療(根據(jù)手術(shù)前IRM檢查的腫瘤體積定位，使用能量為10MV)。使用總劑量為60Gy，在6.5星期內(nèi)每星期5次，則每次1.8Gy共33次。輻照的體積包括手術(shù)前的腫瘤，以及在所有方向上至少兩厘米的邊緣。
對患者進(jìn)行臨床和放射學(xué)監(jiān)視掃描72小時，以確證宏觀上完全切除，并在第10、20和30天進(jìn)行臨床評價。在第10和30天進(jìn)行IRM檢查。最后，在72小時、第10、20和30天測量血液和腦脊液中的5-FU含量。根據(jù)由世界衛(wèi)生組織得到的標(biāo)準(zhǔn)按級評價(神經(jīng)學(xué)的，血液學(xué)的，粘液的和心臟病學(xué)的)毒性。一個月后，在臨床上每兩個月監(jiān)測患者情況一次并且每三個月進(jìn)行IRM檢查一次。
所有患者都觀察到輕微的術(shù)后貧血、白血球過多和輕微的淋巴細(xì)胞減少癥。
藥物學(xué)研究能夠證明在腦脊液(LCR)中5-FU緩釋長達(dá)30天以上，而臨時通過系統(tǒng)循環(huán)的分子比率較低。在植入后一個月，5-FU尚以顯著濃度存在于LCR中。
5-FU在LCR中釋放曲線表明，劑量為70和132毫克時分別在第10天和第20天出現(xiàn)峰值。在一半患者體內(nèi)從第10天開始就未檢測到5-FU血漿含量。
所有治療患者體內(nèi)均呈現(xiàn)極佳的系統(tǒng)耐受性。未觀察到LCR的化學(xué)或細(xì)胞構(gòu)成的任何變化。使用132毫克治療的患者由于在放射治療期間出現(xiàn)腦水腫導(dǎo)致無法繼續(xù)提高劑量。
八個患者，其中四位男士和四位女士，平均年齡為48.5歲，Karnofsky指數(shù)高于90，因此他們都被包括在研究范圍內(nèi)。第一組三個人接受劑量為70毫克，第二組五個人接受132毫克。
對基于少量患者進(jìn)行的統(tǒng)計而言，這些初步的存活結(jié)果是不可解釋的。但是，它們是非常鼓舞人心的。在以上評價中，在第一治療組(70毫克)中，三位患者在第61、114和125星期死亡。應(yīng)指出在114星期死亡的患者死于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的肺部轉(zhuǎn)移。在第二治療組(132毫克)中，三位患者在第31、59和82星期死亡，2位患者在159和172星期仍處于馳張狀態(tài)，這些初步結(jié)果有記載日期。
患者平均存活98星期(在文獻(xiàn)中，符合同樣標(biāo)準(zhǔn)的患者平均存活50.6星期，Devaux BC，O’Fallon JR，Kelly PJ，“惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的切除、活組織切片檢查與存活”，《神經(jīng)外科學(xué)雜志》，78767-775，1993)。八個患者中的五個患者，即62％患者存活18個月，而在文獻(xiàn)中，對于符合被容納于這種研究標(biāo)準(zhǔn)的患者而言，存活18個月的比例為20％(DevauxBC，O’Fallon JR，Kelly PJ，“惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的切除、活組織檢查與存活”，《神經(jīng)外科學(xué)雜志》，78767-775，1993)。
權(quán)利要求
1.釋放放射敏感抗癌劑的可生物降解微球在制備藥物方面的用途，該藥物以與放射治療時間同時、分開或錯開方式用于治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，所述微球用來植入神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤切除后的手術(shù)病灶中，其特征在于含有抗癌劑的微球用聚合物包裹，該聚合物可延緩釋放抗癌劑并且在一定時間內(nèi)在主質(zhì)間隙保持治療有效濃度，以便使如此治療的患者存活期達(dá)到至少約90星期，優(yōu)選地約130星期，更優(yōu)選地約160星期。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述抗癌劑是親水的和/或不通過血腦屏障。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述抗癌劑不具有中樞神經(jīng)毒性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項的用途，其特征在于所述抗癌劑由放射敏感的抗癌化合物組成，或由含有至少一種放射敏感的抗癌化合物的抗癌化合物混合物組成，所述抗癌化合物選自5-氟尿嘧啶、鉑類如卡鉑和順鉑，紫杉烷如decétaxel和paciltaxel，吉西他濱，VP16，絲裂霉素，碘苷，topoisomérase 1抑制劑如伊立替康、托泊替堪和喜樹堿，亞硝基脲如BCNU、ACNU或MCNU，甲氨蝶呤，博來霉素，阿霉素，癌得星和長春新堿，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素如IL2、IL6、IL12和IL13以及干擾素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于抗癌劑是5-氟尿嘧啶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于在腦脊髓液中5-FU的濃度是主質(zhì)隙間中濃度的反映，其濃度是3-20納克/毫升。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項的用途，其特征在于往抗癌劑中添加選自肽生長因子如NGF或BDNF的神經(jīng)保護化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項的用途，其特征在于包裹所述微球的聚合物延緩釋放抗癌劑，并且在主質(zhì)間隙保持所述治療有效濃度達(dá)至少三星期，優(yōu)選地至少四星期。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項的用途，其特征在于該聚合物選自乙基纖維素、聚苯乙烯、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(d，l-乳酸)和聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任一項的用途，其特征在于包裹微球的聚合物是聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其特征在于包裹微球的聚合物是聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)，其中含有等量的乳酸與乙醇酸。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求1～11中任一項的用途，其特征在于所述微球的平均直徑是48±20微米，優(yōu)選地46±7微米。
13.根據(jù)權(quán)利要求1～12中任一項的用途，其特征在于所述微球含有15-35重量％抗癌劑和65-85重量％聚合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求5或13的用途，其特征在于所述微球含有19-27％5-FU，優(yōu)選地20％5-FU。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～14中任一項的用途，其特征在于所述微球在滅菌溶液中制成懸浮液，得到的懸浮液用于被注入在切除神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤后的手術(shù)病灶壁，其特征還在于所述滅菌溶液含有以質(zhì)量/體積表示1-1.5％增粘劑，0.5-1.5％表面活性劑，以及3.5-4.5％等滲劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其特征在于該溶液含有以重量/體積表示1.25％羧甲基纖維素鈉，1％聚山梨酸酯80，以及4％甘露糖醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的用途，其特征在于所述微球懸浮液注入至少每平厘米手術(shù)病灶壁中，深度至少兩厘米，優(yōu)選地2-3厘米。
18.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于注入的5-FU總劑量是50-200毫克，優(yōu)選地130毫克。
19.根據(jù)權(quán)利要求1～18中任一項的用途，其特征在于放射治療定位于腫瘤體積，其特征還在于輻照的體積包括手術(shù)前的腫瘤與在所有方向上至少2厘米的邊緣，其特征還在于施用總劑量為50-60Gy。
20.根據(jù)權(quán)利要求1～19中任一項的用途，其特征在于優(yōu)選地在手術(shù)后的第2天至第7天開始進(jìn)行放射治療。
21.根據(jù)權(quán)利要求1～20中任一項的用途，其特征在于在約6個星期里，用總劑量為60Gy進(jìn)行放射治療。
22.根據(jù)權(quán)利要求15-17或19-21中任一項的用途，其特征在于在重新形成腫瘤的情況下，采用立體定位分一次或多次注射微球懸浮液。
23.通過乳化-提取制備含有聚合物包裹的抗癌劑的可生物降解微球的方法，其中包括將抗癌劑和聚合物分散在有機溶劑中，將得到的有機相與含水相混合以便制成乳液，然后通過加入水提取有機溶劑，然后過濾得到的微球懸浮液，其特征在于在加入聚合物之前，在強烈攪拌下將抗癌劑分散到所述有機溶劑中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于所述有機溶劑是二氯甲烷。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于所述含水相和有機相混合時具有相同溫度，優(yōu)選地等于約2℃。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一項的方法，其特征在于所述有機相含有11％聚合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-26中任一項的方法，其特征在于所述含水相/有機相比例等于100/3。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項的方法，其特征在于由含水相和有機相組成的乳液混合至少3分鐘。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-28中任一項的方法，其特征在于加入提取有機溶劑所需要的水，其比例是乳液/水的體積比等于1/3。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-29中任一項的方法，其特征在于提取有機溶劑所需要的水的溫度是4℃。
31.根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項的方法，其特征在于在被分散到有機溶劑中之前研磨抗癌劑，以便使抗癌劑晶體尺寸是15-50微米。
32.根據(jù)權(quán)利要求23-31中任一項的方法，其特征在于在添加提取水后，得到的懸浮液在惰性氣氛下過濾。
33.根據(jù)權(quán)利要求23-32中任一項的方法，其特征在于所述微球被凍干。
34.由滅菌溶液和可生物降解微球組成的懸浮液，該滅菌溶液含有以質(zhì)量/體積計1-1.5增粘劑、0.5-1.5％表面活性劑和3.5-4.5％等滲劑，所述可生物降解微球釋放用聚合物包裹的抗癌劑，微球比例是每毫升滅菌溶液為200-300毫克。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的懸浮液，其特征在于所述微球由15-35重量％抗癌劑和65-85重量％聚合物組成。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35的懸浮液，其特征在于所述聚合物是優(yōu)選地含有等量乳酸和乙醇酸的聚(d，l-乳酸-共-乙醇酸)。
37.根據(jù)權(quán)利要求34-36中任一項的懸浮液，其特征在于所述滅菌溶液含有以重量/體積計1.25％羧甲基纖維素鈉，1％聚山梨酸酯80和4％甘露糖醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及釋放放射敏感抗癌劑的可生物降解微球在制備藥物方面的用途,該藥物以與放射治療時間同時、分開或錯開方式用于治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。應(yīng)用本發(fā)明的可生物降解微球能夠達(dá)到患者存活期至少90星期,同時在一定時間內(nèi)在主質(zhì)間隙保持治療有效濃度。使用的微球優(yōu)選地含有在聚(d－l－乳酸－共－乙醇酸)中包裹的5－氟尿嘧啶。在腫瘤切除后,采用組織內(nèi)注射將微球植入手術(shù)病灶壁中。在約六個星期里,以60Gy劑量對腫瘤體積進(jìn)行定位放射治療。本發(fā)明還涉及采用乳化－提取制備可生物降解微球的方法,以及含有任選地采用這種方法得到的可生物降解微球的懸浮液。
文檔編號A61K9/16GK1356892SQ00809160
公開日2002年7月3日 申請日期2000年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月17日
發(fā)明者N·費森特, J－P·比諾特, P·米耐爾 申請人:埃迪克埃迪法姆藥品實驗室