專利名稱：：淫羊藿甙在預防治療性功能障礙以及與改善血管收縮有關(guān)疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及淫羊藿甙在制備用于預防治療性功能障礙藥物中的用途，以及與改善血管收縮有關(guān)疾病的用途。男性的性功能包括性欲、陰莖勃起、射精和性快感，是在神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，陰莖血管系統(tǒng)的復雜的生理反映。故如果上述系統(tǒng)的某一過程出現(xiàn)異常既可能引起性欲減退、陰莖勃起障礙、射精障礙或陰莖疲軟障礙等疾病，而且，這種疾病可以單獨出現(xiàn)或相互合并出現(xiàn)。男性性功能障礙的發(fā)病率大約占成人男性的30-60％，并有隨著年齡增加而增加的趨勢。傳統(tǒng)的醫(yī)學把性功能障礙通稱為陽萎、早泄，直到最近十年以前，把性功能障礙的原因大部分被認為只是心理性原因。但是隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)達已經(jīng)明確了在50％以上的性功能障礙患者中發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)系、血管系、內(nèi)分泌系疾病以及患有高血壓病、糖尿病、服用各種藥物等器質(zhì)性原因。男性的性功能主要是在有各種性刺激時，在神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下通過血管系統(tǒng)的復雜的生理反映使陰莖勃起。這種陰莖的勃起過程首先是依靠陰莖小動脈的擴張使陰莖血流量增加，相繼出現(xiàn)陰莖海綿體平滑肌松弛而海綿體小孔膨脹，促使血液流入量近一步增加，導制陰莖海綿體內(nèi)壓升高，壓迫陰莖白膜下的小靜脈阻斷血液流出，從而導致陰莖海綿體內(nèi)血液充盈而陰莖堅硬勃起其強度可達到插入陰道，并維持勃起的時間足以達到性高潮而射精。這種陰莖勃起過程中陰莖海綿體平滑肌的松弛作用起著關(guān)鍵作用，而且陰莖勃起過程受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。動物實驗表明許多局布因子影響陰莖勃起功能如去甲腎上腺素(NA)、神經(jīng)肽Y(NPY)、乙酰膽堿(Ach)、前列腺素(PGE)、五羥色胺(5-HT)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、血管活性腸肽(VIP)、內(nèi)皮素(EDRF)等。近來的研究表明，一氧化氮(NO)在陰莖勃起過程中起重要作用。當性刺激時NO由分布在陰莖的副交感神經(jīng)和非腎上腺素非乙酰膽堿能神經(jīng)(NANC)末梢釋放，而且NO也在分布于血管內(nèi)皮層的內(nèi)皮細胞和陰莖海面體竇內(nèi)皮細胞釋放，NO可激活平滑肌細胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)合成增加，也可激活蛋白酶G(PKG)，PKG可以使鈣通道關(guān)閉和鉀通道開放，兩種作用均可引起陰莖海面體平滑肌松弛導致陰莖勃起。環(huán)磷酸鳥甘(cGMP)又被磷酸二酯酶(PDE)滅活。性功能障礙可分為性欲減退，勃起障礙，性高潮障礙和射精障礙。性功能障礙的原因有血管神經(jīng)性、內(nèi)分泌性、心理性病變、糖尿病、高血壓、脊髓神經(jīng)損傷、吸煙等因素均可引起性功能障礙。傳統(tǒng)的觀點認為性功能障礙主要是由于心理性原因引起。治療上用口服藥如安定劑曲唑酮，和育亨賓等。但是這種藥物的作用機制尚不明確，其療效不高，并有不同程度的副作用。近年來隨著弄清陰莖勃起機制，各種對陰莖海綿體平滑肌有松弛作用的藥物企圖用來診斷和治療男性性功能障礙，目前，已有用血管擴張劑如櫻束堿(paparvarin)、芬托拉明(phentolamine)、前列腺素E1(prostajlandinE1)等藥物直接陰莖海綿體內(nèi)注射療法來治療陰莖勃起障礙獲得較滿意的療效。但是，這種療法可以引起局布疼痛、持續(xù)性陰莖勃起、陰莖纖維化等副作用故臨床上常被限制使用。最近，美國發(fā)明的治療勃起障礙的口服藥物磷酸二酯酶V抑制劑(Viagra)被世人矚目，上述藥品作為化學性假體僅僅是用來一次誘發(fā)陰莖勃起，并有不同程度的副作用，如面紅、頭痛、視覺障礙、低血壓等，特別是對有心血管疾病的患者安全性有爭議值得留心。因此，安全而有效的增進人體本能性勃起功能的藥物有待于研究開發(fā)，最近的研究力求于開發(fā)安全有效的NO供體用來治療性功能障礙。生藥淫羊藿在傳統(tǒng)醫(yī)學界里用來滋補強壯劑的處方中常常作為一種成份，但是其作用機制尚未弄清。近來的對淫羊藿有效成份研究證明淫羊藿中含有許多成份，如淫羊藿甙、揮發(fā)油、蠟醇、州一烷、植物甾醇、鞣質(zhì)、亞油酸等。近來又分離出微量的magnoflorin、淫羊藿糖甙A、epimedinA，B，C、槲皮素、脫水淫羊藿甙-3-O-鼠李糖甙等。其中淫羊藿甙目前僅被用做淫羊藿成份分析用標準試劑。一些研究報告淫羊藿具有抗疲勞作用、增進免疫功能以及改善肝臟功能。但是到目前為止，還沒有關(guān)于淫羊藿甙單體用來治療性功能障礙的研究報告。本發(fā)明的目的是尋找并開發(fā)淫羊藿甙新的醫(yī)藥用途本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿甙出人意料的具有強烈松弛陰莖海綿體平滑肌的作用，還具有對大動脈平滑肌輕度的松弛作用，其藥理作用與平滑肌細胞內(nèi)一氧化氮(NO)-cGMP通路的活性增強有關(guān)。從而可用于改善和增進陰莖勃起功能以及與改善血管收縮有關(guān)疾病的癥狀。因此，本發(fā)明涉及淫羊藿甙在制備用于預防治療性功能障礙的藥物中的用途以及與改善血管收縮有關(guān)疾病用途。本發(fā)明涉及下試本發(fā)明涉及淫羊藿甙在制備用于預防治療性功能障礙的藥物中的用途以及制備與改善血管收縮有關(guān)疾病藥物中的用途。本發(fā)明涉及用于預防或治療性功能障礙和血管收縮有關(guān)疾病的藥物組合物，其包括作為活性成分的淫羊藿甙及藥用載體和賦形劑。本發(fā)明涉及預防或治療性功能障礙和血管收縮有關(guān)疾病的方法，包括給需要預防或治療性功能障礙和血管收縮有關(guān)疾病的患者預防或治療有效量的淫羊藿甙或含淫羊藿甙的藥物組合物。淫羊藿甙由生藥淫羊藿分離出來的屬于黃酮甙類單體，其化學結(jié)構(gòu)式C33H40O15分子量676．67，熔點225-230℃。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中使用的淫羊藿甙可以單獨使用或以藥物組合物形式使用。藥物組合物包括作為活性成份的淫羊藿甙及藥用載體。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物，可按本領(lǐng)域以知方法制備并可以通過口服或非腸道或局部途經(jīng)給藥。口服制劑包括如片劑、口嚼劑，膠囊、懸浮液、溶液等，非腸道給藥制劑包括如注射液。局部給藥制劑包括如霜劑、軟膏劑、貼劑，噴霧劑等。根椐本發(fā)明，淫羊藿甙是從淫羊藿生藥中通過有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取得到。可使用的有機溶劑包括醇類如甲醇、乙醇等、鹵代烷類如二氯甲烷、氯仿、醚類如乙醚、酮類如丙酮、脂類如乙酸甲脂、乙酸乙脂、烴類如己烷等。下面的實施例用來更詳細的說明本發(fā)明，但不意味著本發(fā)明僅限于此。實施例1淫羊藿甙的制備提取方法(1)取干燥淫羊藿(地上部分)500克加MeOH10升，加溫提取3日，共3回。過瀘回收溶媒，減壓濃縮獲得MeOH提取物。MeOH提取物加水混懸后用同量的己烷提取共4次，取水層濃縮到1／3量。在此濃縮水層中加5％檸檬酸混懸(pH=5．5)，再用同等量的CHCl3提取，再加適量NH4OH混懸(pH=10)，再用同等量的CHCl3提取。此過程反復3次。最終堿性水層用同等量丁醇反復提取3次，獲得淫羊藿甙粗品(icariinrichfraction，IRF)(利用HPLC分析法測定結(jié)果淫羊藿甙含量為8％)。提取方法(2)取干燥淫羊藿(地上部分)500克加EtOH10升，80℃加溫匯流提取3次，每次1小時，共3回。過濾，減壓回收乙醇濃縮成漿狀。加4倍量水分散后靜止3小時除去葉綠素幾蠟脂等，正丁醇翠取4次后合并濾液，減壓濃縮。用40-60目聚酰氨柱吸附，30％乙醇洗脫至無色，洗脫液減壓濃縮。加70％乙醇(1∶20)溶解，靜止8小時，過濾得淫羊藿總甙。淫羊藿總甙與無水乙醇(1∶15)反復洗脫重結(jié)晶得淫羊藿總甙粗品。淫羊藿總甙含量52％。淫羊藿甙分離淫羊藿甙或淫羊藿總甙粗品溶化在MeOH，吸附在硅膠干燥，再加入已備好的硅膠柱(8×60cm)中，以CHCl∶MeOH=5∶1，4∶1，3∶1，2∶1的順序溶出，各溶出的分液濃縮，再用MeOH／H2O混和液析出淡黃色結(jié)晶。該結(jié)晶在UV發(fā)色，pauly試劑顯陽性反映，TLC分析結(jié)果Rf值為0．6，熔點239℃。確認為是純品淫羊藿甙(淫羊藿甙，利用HPLC分析法測定結(jié)果淫羊藿甙含量為99．8％))。實驗1安全性實驗按照急性毒性試驗規(guī)則利用SD系大白鼠雌雄各5只為1組，共分4組，第1組口服給藥量為淫羊藿甙3g／kg，第2組2g／kg，第3組1g／kg，第三組0．5g／kg。投藥后觀察7目的結(jié)果，LD50雄性為1．88g／kg，雌性為1．95g／kg。實驗2藥效及藥理作用機制實驗原理男性的性功能主要是在有各種性刺激下時，在神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下通過血管系統(tǒng)的復雜的生理反映促使陰莖勃起。這種陰莖的勃起過程首先是依靠陰莖小動脈的擴張作用和陰莖海綿體平滑肌松弛作用，陰莖海綿體竇膨脹促使陰莖海綿體血液流入量增加，導制陰莖海綿體內(nèi)壓升高而壓迫陰莖白膜下的小靜脈以阻斷血液流出，從而導致陰莖海綿體內(nèi)血液充盈而陰莖堅硬勃起。這種陰莖勃起過程中，陰莖海綿體平滑肌的松弛作用起著關(guān)鍵作用。故具對陰莖海棉體平滑肌有松弛作用的藥品有助于陰莖勃起功能。陰莖海綿體平滑肌的松弛作用也受非腎上腺素非已酰膽堿(NANC)能神經(jīng)和內(nèi)皮細胞松弛因子(EDRF)的調(diào)節(jié)，而這種EDRF中一氧化氮(NO)起著重要的作用。NO或含有NO的物質(zhì)擴散到平滑肌細胞內(nèi)，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，使cGMP合成增加而誘發(fā)陰莖海綿體平滑肌松弛促使陰莖勃起。陰莖海綿體內(nèi)的cGMP又被磷酸二酯酶V型失去活性。所以，促使陰莖海棉體平滑肌NO生成增加，或促進鳥苷酸環(huán)化酶活性，或抑制磷酸二酯酶的活性的藥品，能使cGMP合成或活性增加，促進陰莖勃起故對性功能障礙有治療作用。利用陰莖海棉體活體組織在體外進行實驗(invitro)，觀察藥物對其張力的影響，或測定藥物對磷酸二酯酶的影響，是研究藥物陰莖勃起功能的有效實驗方法。2．1．淫羊藿甙對家兔陰莖海面體平滑肌松弛作用用雄性家兔(新西蘭家兔，體重2．5-3．0kg)，分離出陰莖海面體平滑肌，在體外進行了淫羊藿甙的藥理藥效實驗。使用的家兔共60只，觀察了不同濃度淫羊藿甙對陰莖海面體平滑肌張力的影響，并觀察了同濃度淫羊藿甙對腹部大動脈平滑肌張力的影響。為了研究淫羊藿甙對陰莖海面體平滑肌松弛作用的藥理機制，觀察了已酰膽堿(NANC)能神經(jīng)阻斷劑阿托品，前列腺素E1抑制劑消炎痛，抑制NO生成或NO活性的試劑Nw-nitric-L-精氨酸(L-NNA)和連苯三酚、鳥磷酸環(huán)化酶活性抑制劑亞甲蘭、1H-[1，2，4]噁二唑并[4，3，-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)對淫羊藿甙對陰莖海面體平滑肌松弛作用的影響。實驗方法家兔用戊巴比妥鈉(30-50mg／kg)麻醉后切除陰莖和腹部大動脈，在持續(xù)供給95％氧氣和5％二氧化碳混和氣體并盛有Tyrode營養(yǎng)液并保持衡溫37．5℃的容器中，將陰莖海綿體分離成2×2×6mm大小的肌條，并將在大動脈中分離出4mm寬的動脈環(huán)，分別在盛有Tyrode溶液10ml并持續(xù)供給95％氧氣和5％二氧化碳混和氣體的玻璃器管浴中，一端在底部固定，另一端連接力位移傳導器上。陰莖海綿體條和動脈環(huán)的緊張度的變化，利用多道記錄儀(TSD105，BiopacSystems，SantaBarbara，CA，USA)測定并記氯，觀察了淫羊藿提取物和淫羊藿甙對陰莖海綿體條和大動脈環(huán)的緊張度所引起的效應。為了誘導起初安靜狀態(tài)陰莖海棉體條和動脈環(huán)的張力，將陰莖海面體條和動脈環(huán)牽拉到2克的張力，效準1．5-2小時。當利用苯副林(PHE；5×10-6M)誘發(fā)收縮反應后再用臺氏溶液洗去至到回復基線。此法反復三次以上，如三次收縮反應幅度之差在10％以內(nèi)時，定為效準安靜狀態(tài)陰莖海棉體條和動脈環(huán)的張力，進行下一步藥效分析。每個平滑肌條或環(huán)在實驗過程中的先后實驗間隔保持30分鐘，使其回復到安靜狀態(tài)陰莖海棉體條和動脈環(huán)的張力后再進行下一步實驗。a．淫羊藿提取物和淫羊藿甙對陰莖海綿體條和大動脈環(huán)的緊張度所引起的效應實驗為了觀察淫羊藿提取物和淫羊藿甙對陰莖海綿體條和大動脈環(huán)的緊張度所引起的效應，將陰莖海綿體條和大動脈環(huán)利用苯福林(PHE；5×10-6M)誘發(fā)收縮，保持平臺時，將淫羊藿提取物和淫羊藿甙以濃度遞增的量(淫羊藿提取物1-50mg／ml，淫羊藿甙10-10-104M)依次投入，并觀察其個個濃度對平滑肌的松弛效應。每個藥物濃度至少觀察8只動物肌條或肌環(huán)的藥物效應并作統(tǒng)計學分析。b．淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應機制實驗b-1．觀察了已酰膽堿(NANC)能神經(jīng)阻斷劑阿托品(10-6M)對淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應的影響b-2．觀察了前列腺素E1抑制劑消炎痛(10-4M)對淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應的影響b-3．觀察了抑制NO生成或NO活性的試劑Nw-nitric-L-精氨酸(L-NNA)(10-4M)和連苯三酚(10-4M)對淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應的影響b-4．觀察了鳥磷酸環(huán)化酶活性抑制劑亞甲蘭(10-4M)，1H-[1，2，4]噁二唑并[4，3，-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)(10-4M)對淫羊藿甙對陰莖海面體平滑肌松弛作用的影響為了觀察上述各種試劑對淫羊藿甙對陰莖海綿體條松弛效應的影響，將陰莖海綿體條利用苯福林(PHE；5×10-6M)誘發(fā)收縮，保持平臺時，將各種試劑按照各自的濃度分別投入后，等待20分鐘，再將陽藿甙以濃度遞增的量(淫羊藿甙10-10-10-4M)依次投入，并觀察其個個濃度淫羊藿甙對平滑肌的松弛效應。與透各種試劑前的松弛程度作比較，分析其對淫羊藿甙對陰莖海綿體條松弛效應的影響。每個藥物濃度至少觀察5只動物肌條或肌環(huán)的藥物效應并作統(tǒng)計學分析。實驗使用溶液苯福林鹽酸鹽，氯化乙酰膽堿，硫酸阿托品，連苯三酚，消炎痛，Nω-nitric-L-精氨酸，1H-[1，2，4]噁二唑并[4，3，-a]喹喔啉-1-酮來自SigmaChemicalCo．(St．Louis，MO，USA)產(chǎn)品，亞甲蘭來自MallinckrodtChemicalCo．(St．Louis，MO，USA)產(chǎn)品。Tyrode溶液的組成(mEq／l)Na+(153．6)，K+(5．3)，Ca++(3．0)，Mg++(1．2)，Cl-(157．2)，H2PO4-(0．6)，SO4-(1．2)，HCO3-(7．1)，葡萄糖(11．4)。統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)用計算機分析(Acqkowlege3．2program，Biopacsystems，USA)且所有松弛反應用最大松弛反應百分比表示，最大松弛指在所有試驗中PHE誘導的最大收縮點與曲線中最大向下偏差之間的距離。統(tǒng)計分析用Student’st試驗進行。不同藥物濃度下的平滑肌張力變化用log衰減分析測定。如p值小于0．05時被認為統(tǒng)計學上有意義。所有值用平均標準誤差表示。實驗結(jié)果c．淫羊藿提取物和淫羊藿甙對陰莖海綿體條和大動脈環(huán)的緊張度所引起的效應實驗觀察淫羊藿提取物和淫羊藿甙對陰莖海綿體條和大動脈環(huán)的緊張度所引起的效應結(jié)果，結(jié)果見表1和表2。由表l和表2中的數(shù)據(jù)可看到，淫羊藿提取物和淫羊藿甙對利用苯福林(PHE5×10-6)誘發(fā)收縮的陰莖海綿體條和大動脈環(huán)，顯示出濃度依存勝的松弛作用(p＜0．001)。淫羊藿甙的半數(shù)有效濃度(EC50)在陰莖海綿和動脈環(huán)分別為4．67×104M，2．71×103M。這種結(jié)果表明淫羊藿甙對陰莖海綿體的松弛作用較對動脈環(huán)的松弛作用強5．8倍(p＜0．001)。表1。淫羊藿提取物(IRF)對利用苯福林(PHE5×10-6M)誘發(fā)收縮的陰莖海綿體條和大動脈環(huán)表現(xiàn)出濃度依存性的松弛作用。表2。淫羊藿甙對利用苯福林(PHE5×10-6M)誘發(fā)收縮的陰莖海綿體條和大動脈環(huán)表現(xiàn)出濃度依存性的松弛作用。淫羊藿甙粗品(IRF)和淫羊藿甙的半數(shù)有效濃度(EC50)不同藥物濃度下的平滑肌張力變化用log衰減分析結(jié)果，淫羊藿甙粗品(IRF)在陰莖海綿體和動脈環(huán)的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為4．08mg／ml，22．4mg／ml。淫羊藿甙在陰莖海綿體和動脈環(huán)的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為4．67×lO-4M，2．83×10-3M。按照淫羊藿甙粗品(IRF)中淫羊藿甙含量8％計算可換算得出淫羊藿甙濃度為4．08×lO4M，2．64×lO-3M，這種結(jié)果與淫羊藿甙的半數(shù)有效濃度(EC50)4．67×10-4M，2．83×10-3相差無幾。說明淫羊藿甙是淫羊藿成分中的主要藥效成分，并且對陰莖海綿體的松弛效應較大動脈環(huán)強5．5倍以上。淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應機制實驗1．在觀察己酰膽堿(NANC)能神經(jīng)阻斷劑阿托品(10-6M)對淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應的影響的結(jié)果表明，淫羊藿甙對用阿托品預前處理的陰莖海綿體條所引起的松弛效應較對照組無顯著差異(p＞0．05)，這說明這種松弛效應不受阿托品的影響。2．在觀察前列腺素E1抑制劑消炎痛(10-4M)對淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應的影響的結(jié)果表明，淫羊藿甙對用消炎痛預前處理的陰莖海綿體條所引起的松弛效應較對照組無顯著差異(p＞0．05)，這說明這種松弛效應不受消炎痛的影響。結(jié)果見表3。3．在觀察抑制NO生成或NO活性的試劑Nw-nitric-L-精氨酸(L-NNA)(10-4M)和連苯三酚(10-4M)對淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的松弛效應的影響的結(jié)果表明，淫羊藿甙對用Nw-nitric-L-精氨酸(L-NNA)(10-4M)和連苯三酚(10-4M)預前處理的陰莖海綿體條所引起的松弛效應較對照組顯著被抑制(p＜0．001)，這說明這種松弛效應與NO生成或NO活化作用有關(guān)。結(jié)果見表3。4．在觀察鳥磷酸環(huán)化酶活性抑制劑亞甲蘭(10-4M)，1H-[1，2，4]噁二唑并[4，3，-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)(10-4M)對淫羊藿甙對陰莖海面體平滑肌松弛作用的影響的結(jié)果表明，淫羊藿甙對用亞甲蘭(10-4M)，1H-[1，2，4]噁二唑并[4，3，-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)(10-4M)預前處理的陰莖海綿體條所引起的松弛效應比對照組顯著被抑制(p＜0．001)，結(jié)果見表4。上述實驗結(jié)果表明淫羊藿甙對平滑肌的松弛效應與一氧化氮(NO)-鳥磷酸環(huán)化酶(GMP)活化作用有關(guān)。結(jié)果見表3。表3破壞內(nèi)皮細胞，連苯三酚，亞甲蘭，ODQ，阿托品，消炎痛前處理后，淫羊藿甙對利用苯福林(PHE；5×10-6M)誘發(fā)收縮的陰莖海綿體條松弛效應的影響。<tablesid="table1"num="001"><table>淫羊藿甙濃度(M)10-610-510-4P值對照組(n=8)1．23±0．824．42±1．0823．12±1．36破壞內(nèi)皮細胞(n=5)0．82±0．583．23±0．8915．68±1．15＜0．001連苯三酚前處理(n=5)0．85±0．453．45±0．7318．12±1．08＜0．01亞甲蘭前處理(n=5)0．52±0．682．02±0．4513．45±1．12＜0．001ODQ(n=5)0．42±0．481．85±0．3510．45±1．08＜0．001阿托品前處理(n=5)1．21±0．584．11±0．9821．78±1．06＞0．05消炎痛前處理(n=5)1．18±0．484．09±1．0820．12±1．14＞0．05</table></tables>表4不同濃度ODQ予處理對淫羊藿甙對PHE預接觸海綿體肌肉條的松弛作用的反應(PHE；5×10-6M)實驗3淫羊藿甙對磷酸二酯酶活性的影響實驗方法1．人血小板中分離磷酸二酯酶酸二酯酶V型不僅分布在陰莖海綿體，還分布在血小板。利用血小板分離出磷酸二酯酶V型，分析藥物對其活性的影響是一種常規(guī)實驗方法。其方法是將新鮮人血液(360gm)離心分離(360g)10分鐘，得出血小板豐富血漿(PRP)，再將PRP離心分離(1400g)10分鐘沉淀血小板。取1ml沉淀的血小板，用冰冷緩沖液(Hepes20nM，Sucrous0．25M，EDTA1mM，苯甲基磺酰氟化物(PMSF)1mM，pH7．2)混勻漂浮后，用超聲波震蕩器(Celldistuptor，BurkardScientific，Uxbridge，Middlesex，UK)破壞細胞膜。細胞溶解物遠心分離(799g)10分鐘后，在次連續(xù)離心分離(165．000g)60分鐘，取上層液用PharmaciaFPLC(PharmaciaLTD．，MiltonKeynes，UK)將復合酶分離出來備用。為了利用Mono-Q離子交換色譜法提純磷酸二酯酶，利用Mono-Q柱(5ml×50mm)，緩沖液A5ml和緩沖液B10ml反復沖洗后，遠心分離(165．000g)得到的上清液10ml，放入Mono-Q柱，流速定為1ml／min。再讓復合酶的活性成分以1ml／分鐘的流速通過線性梯度鹽(lineargradientsalt)(0-0．5MNaCl)分析各種酶成分。在所得到的各種酶成分分別測定其活性，收集對活性酶成分，放入液氮瓶備用。2．篩選抑制酶活性物質(zhì)磷酸二酯酶的活性分析在最終反應容量0．5ml進行，而且從加入酶到反應開始的操作在冰上做準備。分析用緩沖液(Tris40mMpH8．0，MgCl210mM，BSA0．125mg／ml，2-巰基乙醇3．75mM)每次使用新鮮配制的緩沖液，被酶作用物[2H]cGMP(ca．28ci／mmol；ca．100，000cpm／100μL)是事前用分析用緩沖液做好準備備用。PDEV型的活性檢測方法是利用[3H]cGMP標記的同位素兩步分析法。測定時將[3H]cGMP200μL加入試管內(nèi)，再加入被試物質(zhì)(淫羊藿甙10-10M-10-4M)或?qū)φ瘴镉猛緿MSO)100μL和提純的磷酸二酯酶100μL，再加入緩沖液到0．5ml，在30℃衡溫下反應20分鐘后，將試管浸入開水中以終止反應。反應終了后試管內(nèi)加入蛇毒(OphiophagusHannah；SigmaChemicalCo)100μL(1mg／ml)，30℃衡溫下孵化10分鐘，將[3H]5-GMP轉(zhuǎn)化成[3H]鳥苷。被轉(zhuǎn)換的[3H]鳥苷在AG1-X2resion(Bio-Rad)反應器中，利用NaOH(0．1N)在離子交換柱型色譜分析洗脫后得到的樣品，測定其放射性來分析磷酸二酯酶V的活性，3．實驗結(jié)果本實驗結(jié)果淫羊藿甙對磷酸二酯酶V活性有濃度依賴性抑制作用(10-8M，0．06％；10-7M，32．7％；10-6M，56．2％；10-5M，83．7％；10-4M，99．9％)，EC50為0．43μM。見下表。表5。淫羊藿甙對磷酸二酯酶V活性的抑制作用(％)。通過實驗證明，淫羊藿甙對陰莖海綿體比對大動脈環(huán)有強大的松弛作用，而且淫羊藿甙的陰莖海綿體平滑肌的松弛作用的機制是，通過增加NO的生成和鳥磷酸環(huán)化酶活化作用，并抑制磷酸二酯酶的活性來阻止cGMP的滅活，使陰莖海綿體平滑肌內(nèi)cGMP濃度增加而松馳陰莖海綿體，誘發(fā)陰莖勃起。實驗4。臨床效果為了了解淫羊藿甙的臨床效果，在56名性功能障礙為主述并自愿受試者為對象利用國際性功能評價詢問表(InternationalIndexforSexualFunction．IIEF-V)進行了安慰劑對照，二重雙盲預備臨床實驗。被試者平均年齡為39±6．1歲，發(fā)病期間為5．4±3．7年。其中患糖尿病17例，高血壓病9例，心臟病8例。實驗藥品(含淫羊藿甙50mg／片)和安慰劑包裝相同，透藥者和服藥者均不知道藥品情報的條件下進行實驗。被選的自愿者不隨機的分成兩組，投用安慰劑或?qū)嶒炈幤?2片／次，3次／日)，口服1個月?；颊咴谕端幥昂头幫炅撕蠓謩e添寫性功能評價詢問表(共5項，各項5度評分)，比較用藥前后的性功能變化通過Studentttest分析來評價藥效。實驗結(jié)果，在治療前受試者性功能評價分數(shù)分別為，對勃起和勃起的維持功能的自信感評分為1．82±0．54，陰莖可插入陰道的勃起頻度評分為1．89±0．67，性交時陰莖插入陰道并維持勃起的頻度評分為1．82±0．65，性交時陰莖勃起和勃起維持困難評分為1．89±0．61，對性生活的滿足度評分為1．79±0．62。治療后性功能評分分別為，對勃起和勃起的維持功能的自信感評分中淫羊藿甙組為3．32±0．39，安慰劑為2．04±0．63，陰莖可插入陰道的勃起頻度評中淫羊藿甙組為3．11±0．32，安慰劑為2．07±0．88，性交時陰莖插入陰道并維持勃起的頻度評分中淫羊藿甙組為3．18±0．47，安慰劑為2．17±0．97，性交時陰莖勃起和勃起維持困難評分中淫羊藿甙組為3．25±0．43，安慰劑為2．18±0．92，對性生活的滿足度評分中淫羊藿甙組為3．36±0．47，安慰劑為2．14±0．95，服用淫羊藿甙片組的評分比較安慰劑顯著增高(p＜0．01)?？傮w臨床效果淫羊藿甙片組和安慰劑分別為75．4％和35．4％。除4名患者有輕微的胃腸道反應外未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。患糖尿病，高血壓和心臟病患者在臨床效果和副作用方面無顯著差異。結(jié)果見下表。表5。淫羊藿甙對性功能障礙治療效果的IIEF評分表權(quán)利要求1．淫羊藿甙在制備用于預防或治療性功能障礙和血管收縮有關(guān)疾病藥物中的用途。2．用于預防或治療性功能障礙和血管收縮有關(guān)疾病的藥物組合物，其包括作為活性成分的淫羊藿甙及要用載體和賦形劑。3．根據(jù)權(quán)利要求1的用途或權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述的藥物或藥物組合物含10-500毫克的淫羊藿甙。4．根據(jù)權(quán)利要求1-3的用途或藥物組合物其中所述的藥物或藥物組合物是以片劑，丸劑，膠囊，懸浮液，溶液，注射劑，霜劑，軟膏，噴霧劑，口嚼劑，貼劑形式使用。5．根據(jù)權(quán)利要求1-3的用途或藥物組合物，其中所述的藥物給藥途經(jīng)可以為口服，舌下，經(jīng)皮，經(jīng)肌肉或皮下，皮膚粘膜，尿道，陰道，或靜脈。全文摘要淫羊藿甙在預防治療性功能障礙以及與改善血管收縮有關(guān)疾病的用途。文檔編號A61K9/48GK1282584SQ0011833公開日2001年2月7日申請日期2000年6月14日優(yōu)先權(quán)日1999年6月17日發(fā)明者辛鐘成申請人:辛鐘成