專利名稱：整體決策液份分級(jí)的制作方法
整體決策液份分級(jí)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/168，892、在2009年4月13日申請(qǐng)的美國專利的權(quán)益， 為所有目的此處直接地通過參考合并其整體。聯(lián)邦贊助的研究或研發(fā)下做出的關(guān)于發(fā)明權(quán)利的聲明不適用對(duì)于“順序表”、表格或以光盤提交的計(jì)算機(jī)程序列表附錄的參考不適用
背景技術(shù)：
體液是生物顆粒在液體中的復(fù)雜的懸浮物。例如，血液，包括血漿和細(xì)胞(紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞、血小板)，且細(xì)胞占有血液的大約陽％。血漿大部分是水，且血漿轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、離子、維生素、酶、荷爾蒙和其他化學(xué)物質(zhì)到身體中的細(xì)胞。血紅細(xì)胞的尺寸大約6到8 μ m,且用作為提供氧氣給細(xì)胞。白細(xì)胞直徑為約10到 13 μ m，且它們通過對(duì)抗外來病毒和細(xì)菌作為免疫系統(tǒng)的一部分來保護(hù)身體免受疾病。血小板是最小的細(xì)胞，1. 5到3 μ m,它們通過形成血凝塊來停止流血。除了血液之外，液體諸如有唾液、眼淚、尿液、腦脊液以及其他與各種器官(如， 肺)相接觸的含有細(xì)胞與生物顆粒的混合物的其他體液。呈現(xiàn)在特定體液(如，血液)中的細(xì)胞和生物顆粒的類型和量表現(xiàn)出有關(guān)生物體的健康的信息，且在傷口被感染的個(gè)體的情況下，表現(xiàn)出與疾病的診斷、預(yù)后有關(guān)的信息。相比血液細(xì)胞的標(biāo)稱濃度，一些細(xì)胞和生物顆粒的量很稀少。盡管它們稀少，這些細(xì)胞或生物顆?？赡茈s亂地聯(lián)系到體內(nèi)所發(fā)生的改變個(gè)體健康狀態(tài)的重要的事件。這些細(xì)胞一般被稱為“稀有細(xì)胞”。例如，從原發(fā)性腫瘤處的癌細(xì)胞的擴(kuò)散是主導(dǎo)癌癥病人的復(fù)發(fā)可能性和存活率的重要因素。由于癌細(xì)胞不規(guī)律地生長且丟失了彼此粘附的能力，它們可能進(jìn)入血液、淋巴循環(huán)并在整個(gè)全身循環(huán)。這些細(xì)胞一般被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、播散腫瘤細(xì)胞(DTC)、循環(huán)癌細(xì)胞(CCC)、循環(huán)上皮細(xì)胞(CEC)、潛伏腫瘤細(xì)胞(OTC)或者其他類似的改變，來指示這些細(xì)胞的移動(dòng)的本質(zhì)，這與固體腫瘤的直接活組織切片檢查獲得的樣本相反。CTC已經(jīng)在經(jīng)受所有主要癌癥的病人的血液中探測(cè)到，主要癌癥有前列腺、乳腺、胃、結(jié)腸直腸、腎、肺、 胰腺及其他。以此方式，已經(jīng)研發(fā)了計(jì)算體液中呈現(xiàn)的CTC的測(cè)試來輔助提供對(duì)于癌癥病人的預(yù)后。還可使用“CTC測(cè)試”來監(jiān)測(cè)病人對(duì)于特定治療(如，放射或化學(xué)療法)草案 (protocol)的反應(yīng)?；贑TC測(cè)試的結(jié)果，癌癥病人可通過最小化附加的不必要的以及昂貴的診斷測(cè)試和治療來避免很大的花費(fèi)，而這些花費(fèi)經(jīng)常不被健康保險(xiǎn)所覆蓋，例如計(jì)算機(jī)斷層照相法(CT)或者正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)掃描，或者可縮短無效的藥物治療。然而，CTC在周邊血中呈現(xiàn)出極其低的濃度，估計(jì)數(shù)量級(jí)為每IO6到IO7單核細(xì)胞中有一個(gè)腫瘤細(xì)胞，這等于每0. 5ml到5ml周邊血中有一個(gè)腫瘤細(xì)胞。以這樣低的濃度，必
4須篩選帶有約100百萬單核細(xì)胞的樣本來以99. 995%的確定度探測(cè)到至少一個(gè)CTC。使用傳統(tǒng)技術(shù)，諸如以一般800細(xì)胞/秒掃描的自動(dòng)數(shù)字顯微鏡(ADM)，需要18個(gè)小時(shí)來完成這樣大小的樣本，表現(xiàn)出其用于醫(yī)療用途在費(fèi)用上和時(shí)間上的不實(shí)際。例如，可采用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來確定血液樣本中CTC的出現(xiàn)或量。然而，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀需要將細(xì)胞按行線性地組織，并單個(gè)地探測(cè)每一個(gè)細(xì)胞，因?yàn)槭褂矛F(xiàn)有技術(shù)并不能正確地說明兩個(gè)細(xì)胞的同時(shí)探測(cè)。在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中，聚焦激光束，以使它們?cè)谌魏谓o定的時(shí)間僅照亮單個(gè)顆粒。例如，如果一個(gè)無熒光的細(xì)胞與被設(shè)置為可由流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀探測(cè)的到的熒光細(xì)胞同時(shí)流過探測(cè)容積(detection volume)，不能被流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀察覺到的這個(gè)非熒光細(xì)胞，可被引導(dǎo)到與熒光細(xì)胞一樣的軌跡中。為了防止流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的誤解，通常將細(xì)胞懸浮液沖淡或減緩速度來容許細(xì)胞之間的充分的間距而防止探測(cè)容積中兩個(gè)細(xì)胞的重疊。當(dāng)前現(xiàn)有技術(shù)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀具有上限為整理100，000對(duì)象/ 秒。因此，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀并不適于探測(cè)或再現(xiàn)稀有細(xì)胞。在分析大量細(xì)胞的時(shí)候， (連續(xù)地)每次探測(cè)一個(gè)細(xì)胞以及確定每一個(gè)細(xì)胞的軌跡是很費(fèi)時(shí)間的。例如，由于十毫升血液含有大約一百億個(gè)細(xì)胞，以每秒100，000細(xì)胞的速度(這是現(xiàn)有技術(shù)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的上限速度)，將需要100，000秒或28小時(shí)來完整地整理IOmL的內(nèi)容。對(duì)于稀有細(xì)胞， 一般需要7-15mL的血液來收集統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義重大的量的稀有細(xì)胞。使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來再現(xiàn)稀有細(xì)胞是對(duì)醫(yī)療資源不切實(shí)際的浪費(fèi)，且可帶來非常高的測(cè)試成本。因此，需要簡單的和成本/時(shí)間-效益的技術(shù)用于探測(cè)和量化在液體樣本中的稀有顆粒和細(xì)胞。本發(fā)明通過提供用于探測(cè)液體樣本中稀有顆粒的方法和裝置來滿足這些和其他需要。

發(fā)明內(nèi)容
除了其他方面，本發(fā)明提供了通過排序液份(aliquots)快速地掃描大容積液體來探測(cè)和/或量化所期望的生物顆粒的方法和裝置。在一個(gè)方面中，所采用的概念，被稱為整體決策液份排序(Ensemble-Decision Aliquot Ranking) ( “eDAR”)，對(duì)于探測(cè)生物液體中的稀有細(xì)胞非常有用。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于在液體樣本中探測(cè)稀有顆粒的方法，所述方法包括以下步驟探測(cè)在液體樣本的液份中稀有顆粒的存在或不存在、基于稀有顆粒的存在或不存在而給液份分配一個(gè)值、且基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。在第二個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于提供給對(duì)象對(duì)與生物液體中稀有顆粒的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的情況的診斷或預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟探測(cè)生物液體的液份中稀有顆粒的存在或不存在、基于稀有顆粒的存在或不存在而給液份分配一個(gè)值、且基于所分配的值而向?qū)ο筇峁┰\斷或預(yù)后。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供用于探測(cè)液體樣本中稀有顆粒的設(shè)備，所述設(shè)備包括至少第一個(gè)輸入通道、至少兩個(gè)出口通道、能探測(cè)液體樣本的液份中一個(gè)或多個(gè)稀有顆粒的至少一個(gè)探測(cè)器、用于引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)的機(jī)制、以及能基于所述液份中稀有顆粒的存在、不存在、標(biāo)識(shí)、成分或量能給所述液份分配一個(gè)值的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)與所述探測(cè)器和用于引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)的機(jī)制之間通信。
附圖簡述

圖1示出對(duì)液份中多個(gè)顆粒的同時(shí)探測(cè)以及液份的方向。圖2示出用在eDAR中的帶有孔的掩模，用于改進(jìn)信號(hào)-噪聲比。圖3示出用在eDAR中的帶有很近間距的孔的掩模，用于改進(jìn)信號(hào)-噪聲比。圖4示出包括單個(gè)流動(dòng)通道、2個(gè)激光器和三個(gè)探測(cè)器的eDAR裝置。圖5示出包括三個(gè)流動(dòng)通道、激光器和探測(cè)器的eDAR裝置。圖6示出包括三個(gè)流動(dòng)通道、激光器和三個(gè)探測(cè)器的eDAR裝置。圖7示出包括五個(gè)流動(dòng)通道、激光器和三個(gè)探測(cè)器的eDAR裝置。圖8示出用eDAR(上面板)和商用儀器(Veridex，s Cellkarch，下面板)從血液中計(jì)數(shù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的比較。圖9A-C示出在各種照明環(huán)境下使用eDAR從病人血液中捕獲的癌細(xì)胞的光學(xué)圖像 (箭頭標(biāo)記CTC)。圖9A是在血紅細(xì)胞當(dāng)中的CTC的明場(chǎng)圖像。圖9B是指示泛細(xì)胞角蛋白的出現(xiàn)的熒光圖像。圖9C示出CD45的出現(xiàn)的熒光圖像，因此排除了將白血細(xì)胞錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)為CTC的可能性。圖10A-D示出從一般的癌細(xì)胞中辨別出來的癌干細(xì)胞的光學(xué)圖像。箭頭指示癌干細(xì)胞(⑶44+/⑶M-)。圖IOA是用于探測(cè)Alexa 488-抗-⑶44(綠色)的熒光圖像 (50-540nm)。圖IOB是用于探測(cè)Alexa 647-抗-CD24 (紅色)的熒光圖像(645_700nm)； 圖IOC是明場(chǎng)圖像。圖IOD是指示⑶44+/⑶24-的合成圖像(箭頭指示癌干細(xì)胞)。圖IlA-D示出用于把懸浮液分成液份的設(shè)備1110的操作。圖12A-C示出設(shè)備1210，其被用于采用在節(jié)點(diǎn)處1240結(jié)合的五個(gè)液體通道 (1211、1212、1213、1214和1215)把懸浮液分成液份。圖13示出從2個(gè)雪崩光電二極管(APD)收集來的熒光信號(hào)，2個(gè)雪崩光電二極管位于節(jié)點(diǎn)1116(或者1240)上游和上游不同位置。繪圖1310示出來自一個(gè)APD的軌跡 1311，所述一個(gè)APD配置為探測(cè)探測(cè)容積1140(或1270)處的液份中EpCAM分子的存在，而繪圖1320示出來自配置為探測(cè)通道1114(或1214)中的EpCAM分子的存在的第二個(gè)APD 的信號(hào)軌跡1321。圖14示出繪圖1410，示出使用eDAR隨脈沖長度而變化的所再現(xiàn)到的癌細(xì)胞的百分比。軌跡1420示出當(dāng)脈沖寬度為IOms或以下的時(shí)候，在正確的通道中收集到100%的癌細(xì)胞。圖15示出帶有軌跡1520的繪圖1510，軌跡1520示出隨進(jìn)入流速而變化的回收到的稀有細(xì)胞的百分比。圖16示出使用由不可混合的階段(phase)所分離的分離的液體的液份來在到達(dá)探測(cè)容積之前封裝生物顆粒。本發(fā)明的具體描述I.概覽在一個(gè)方面，本發(fā)明提供在液體樣本中用于探測(cè)和/或回收稀有顆粒的方法與裝置。這個(gè)方面所體現(xiàn)的概念在此處被稱為“整體決策液份分級(jí)”或“eDAR”。在一個(gè)實(shí)施例中，這個(gè)eDAR方法論可被表征為(i)探測(cè)液體樣本的液份中稀有顆粒的存在或者不存在， ( )根據(jù)稀有顆粒的存在或不存在而給液份進(jìn)行分級(jí)，以及(iii)基于所分配的分級(jí)來引導(dǎo)整個(gè)液份的流動(dòng)或收集。對(duì)于尋找稀有細(xì)胞，eDAR提供了速度上的極大優(yōu)勢(shì)。作為示例，假設(shè)IOmL懸浮液含有10個(gè)期望的稀有細(xì)胞。在這個(gè)情況下，約99. 9999%的懸浮量沒有含有一個(gè)期望的稀有細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)，諸如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、FACS等，總是對(duì)包含在整個(gè)懸浮容積中的每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)掃描，導(dǎo)致幾乎所有的時(shí)間浪費(fèi)在掃描不含理想細(xì)胞的99. 9999%的懸浮量上。eDAR通過把懸浮液分成液份而容許對(duì)整個(gè)懸浮液的很快的高級(jí)別的篩分。如果細(xì)胞的確是稀有的，大多數(shù)液份不含有任何期望的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，這些液份分級(jí)為空，且通過第一通道丟棄。反之，的確含有稀有細(xì)胞的少量液份被分級(jí)為非零，且被收集在另外的通道或腔體中。以這樣的方式，eDAR不同于傳統(tǒng)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀通過如下操作(1)通過使用套流(sheath flow)來包含顆粒-行，從而以單個(gè)列隊(duì)(file)(也就是，一個(gè)一個(gè)按行)流動(dòng)生物顆粒，(2) 一次僅探測(cè)一個(gè)生物顆粒，以及C3)確定所探測(cè)的生物顆粒的軌跡。如果所探測(cè)到的生物顆粒是期望的，例如，以多種方法中的一個(gè)方法引導(dǎo)該生物顆粒沿著特定的軌跡到的收集容器。如果所探測(cè)到的生物顆粒是不期望的，以不同的軌跡弓丨導(dǎo)生物顆粒到達(dá)不同的收集容器。相比于傳統(tǒng)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，eDAR審查所有液份，也就是，液體的三維子部分， 來對(duì)整個(gè)液份做出整體決策。不同于連續(xù)化(液體的1-維子部分，這導(dǎo)致將生物顆粒排列在單行中)或者平面化(液體的2-維子部分，這導(dǎo)致將生物顆粒排列在平面中的多個(gè)平行的行中)，液份法(aliquoting)提供了很高的吞吐量。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀能分析液份，因?yàn)樘綔y(cè)器被設(shè)置為僅收集來自單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞的單個(gè)平面的信號(hào)。在探測(cè)點(diǎn)或平面之外的生物顆粒對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中所使用的探測(cè)器而言是看不見的，因此，套流、引導(dǎo)緩沖或其他水力或幾何聚集機(jī)制對(duì)于防止生物顆粒移動(dòng)到探測(cè)點(diǎn)或平面外是必要的。eDAR分析一個(gè)完整液份，此液份跨(span)生物顆粒的一個(gè)平面或?qū)右陨稀Ｔ趀DAR中，分析發(fā)自整個(gè)液份的信號(hào)，而不是來自單個(gè)探測(cè)點(diǎn)或平面的信號(hào)。eDAR提供超越現(xiàn)有方法的極大增加的靈敏度來探測(cè)或分離稀有細(xì)胞。eDAR的探測(cè)組件可探測(cè)發(fā)自整個(gè)液份內(nèi)的單個(gè)光子，且因此不會(huì)錯(cuò)失表現(xiàn)出可探測(cè)的特性的生物顆粒。假陰性的比率是極低的，因?yàn)橐悍莘旨?jí)被設(shè)置為僅消除那些被分級(jí)為完全沒有所期望的生物顆粒的液份?？稍诩膊〉纳飳W(xué)和診斷的多種應(yīng)用中使用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，包括從體液中捕捉癌細(xì)胞或癌癥干細(xì)胞用于癌癥預(yù)后；用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的諸如賈第鞭毛蟲病或似隱孢菌素之類的寄生蟲；用于瘧疾診斷的感染瘧疾的紅血球；用于HIV監(jiān)測(cè)的淋巴細(xì)胞和白血球； 用于疾病篩查的母血中的胎細(xì)胞；用于治療的干細(xì)胞；用于與朊病毒相關(guān)的疾病(如，狂牛病)篩查的感染朊病毒的細(xì)胞。除了瘧疾，還可使用本發(fā)明的主題用于監(jiān)測(cè)人類免疫缺陷病毒(HIV)診斷和監(jiān)測(cè)中的⑶4+T-淋巴細(xì)胞(⑶4+T-細(xì)胞)的監(jiān)測(cè)。絕對(duì)的⑶4+T-淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)可用作在感染 HIV的病人中開始抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和機(jī)會(huì)性感染預(yù)防的標(biāo)準(zhǔn)。白細(xì)胞(血白細(xì)胞)的一部分，⑶4+T-淋巴細(xì)胞的減少，強(qiáng)烈地相關(guān)于免疫防御的下降。⑶C公共衛(wèi)生服務(wù)已經(jīng)強(qiáng)烈推薦在所有感染HIV的人中每3-6個(gè)月監(jiān)測(cè)CD4+T-淋巴細(xì)胞(CD4+T-細(xì)胞)的水平作為開始合適的治療策略和評(píng)估治療效果的方法。
在一些實(shí)驗(yàn)室中，使用三個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的產(chǎn)品來建立絕對(duì)的⑶4+T細(xì)胞數(shù)量全部的血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞的百分比和淋巴細(xì)胞是⑶4+T-細(xì)胞的百分比。諸如 FACSCount (BD Bioscience)之類的單個(gè)平面流式細(xì)胞儀在發(fā)展中國家不能商業(yè)地獲得或者不能作為便攜式設(shè)備。可使用本發(fā)明主題的實(shí)施例來從其他白細(xì)胞和RBC中快速地辨別出CD4+T-淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例所用的附加的可能的分離、濃縮和/或隔離的應(yīng)用，包括基因失調(diào)的出生前診斷的母血的胎細(xì)胞監(jiān)測(cè)和朊病毒探測(cè)。朊病毒包括通過修改核酸步驟來對(duì)抗失活的一小部分感染的蛋白質(zhì)顆粒。除外，可使用根據(jù)本發(fā)明主題的實(shí)施例用于胎細(xì)胞或其他微生物顆?；蚣{米生物顆粒。II.定義如此處所使用的，“液體樣本”是指可能含有或可能不含感興趣的稀有顆粒的任何液體。在特定實(shí)施例中，液體樣本可以是生物液體樣本，例如血液樣本、血漿樣本、唾液樣本、尿液樣本、淋巴樣本、脊髓液樣本等。在其他實(shí)施例中，樣本可以是環(huán)境液體樣本，例如來自湖、河、海洋、池塘、溪流、泉水、濕地、水庫等的液體樣本。在還有其他實(shí)施例中，樣本可以是水的樣本，例如，來自脫鹽植物、水處理植物、水庫、泉水、溪流、冰川水流、水塔或者可實(shí)現(xiàn)為可攜帶的水的水源的任何其他水源。如此處所使用的，“稀有顆粒”是指以低水平在液體樣本中出現(xiàn)的細(xì)胞或分子。在特定實(shí)施例中，稀有顆?？梢允羌?xì)胞、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)絡(luò)合物、核酸、核蛋白復(fù)合體、碳水化合物、代謝物、新陳代謝作用之副產(chǎn)物等。在特定實(shí)施例中，如果在液體樣本中的濃度低于全部顆?？偭康募s10%的顆?？杀徽J(rèn)為是稀有的，或者低于液體中全部顆?？偭康?%， 8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%,0. 5%,0. 1%,0. 05%,0. 01%或更少。在還有其他實(shí)施例中，稀有顆粒在液體樣本中以每IO3液體全部顆粒總量中出現(xiàn)小于約1個(gè)，或者在液體全部顆?？偭恐忻縄O4, IO5, IO6, IO7, IO8, IO9, IO10, IO11, IO12中出現(xiàn)小于約1個(gè)，或者更少。在特定實(shí)施例中，稀有顆粒是稀有細(xì)胞。稀有細(xì)胞可以是有核的或者無核的。稀有細(xì)胞，包括但不限于，表達(dá)惡性顯形的細(xì)胞；胎細(xì)胞，包括孕婦外周血中的胎細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，諸如從腫瘤中流到血液或其他體液中的腫瘤細(xì)胞；感染病毒的細(xì)胞，諸如感染HIV的細(xì)胞、帶有感興趣的基因的轉(zhuǎn)感染的細(xì)胞；以及在經(jīng)受致敏失調(diào)(autoreactive disorder) 的對(duì)象的周邊血中出現(xiàn)的T-細(xì)胞或B-細(xì)胞的異常子類型。如此處所使用的，“整體決策(ensemble-decision)，，是指基于在顆粒的整體或分組中特性的存在或不存在的探測(cè)而做出的決策。在特定實(shí)施例中，將基于含有多個(gè)顆粒的液體樣本的液份中單個(gè)獨(dú)特顆粒的存在或不存在而做出整體決策。重要地，基于單個(gè)顆粒的存在或不存在而做出的整體決策將被應(yīng)用到整個(gè)液份(也就是，應(yīng)用到液份中出現(xiàn)的全部顆粒)。如此處所使用的，“液份”是指將被分析的液體樣本的全部容積的一部分。液份占有三維空間且其中的顆粒沒有組織地隨機(jī)地分布。液份具有有限深度，且顆?？裳卦撋疃确植?，且沒有可辨別的層。在本發(fā)明的上下文中，對(duì)液份按其整體而非子部分加以分析。 片、帶、平面或其他暗示二維空間、并被用于描述一般采用水力聚集的現(xiàn)有的細(xì)胞排序方法 (如，流式細(xì)胞計(jì)分析、FACS等)的類似術(shù)語并不認(rèn)為是液份。在特定實(shí)施例中，液份可包括液體樣本的一部分或更多，例如，約1/2的液體樣本，或約1/3，1/4，1/5，1/6，1/7，1/8，1/9，1/10或更少的液體樣本。在特定實(shí)施例中，液份可包括，例如，10 %的液體樣本，或者約9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%,0. 5%, 0. 1%,0. 05%,0.01%,0. 001 %或更少的液體樣本。這樣，用此處提供的eDAR方法所檢查或處理的液體可被分為，例如，至少約2個(gè)液份，或者至少約3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13， 14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150， 175，200，225，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，1，000，1，100，1，200，1，300， 1，400，1，500，1，600，1，700，1，800，1，900,2, 000,2, 500,3, 000,3, 500,4, 000,4, 500， 5，000，6，000，7，000，8，000，9，000，10，000，20，000，30，000，40，000，50，000，60，000， 70，000，80，000，90，000，100，000，200，000，300，000，400，000，500，000，600，000，700，000， 800，000,900, 000,,1百萬、2百萬、3百萬、4百萬、5百萬、6百萬、7百萬、8百萬、9百萬、1 千萬或更多的液份。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，液體樣本所分成的液份的數(shù)量取決于液體中所希望的稀有顆粒的數(shù)量以及液體樣本的總量。在特定實(shí)施例中，液份可具有體積為，例如，在約0. Inl和約IOml之間、或者在約 Inl和約Iml之間、或者在約Inl和約100 μ L之間、或者在約Inl和約10 μ L之間、或者在約Inl和約1 μ L之間、或者在約Inl和約IOOnL之間。如此處所使用的，術(shù)語“分級(jí)(ranking) ”涉及通過分類來評(píng)估液份的量的特性、 質(zhì)的特性或者重要性。在一個(gè)實(shí)施例中，液份可被分級(jí)為或者是空(例如，當(dāng)在液份中沒有探測(cè)到稀有顆粒的時(shí)候)或者非零(例如，當(dāng)在液份中探測(cè)到至少一個(gè)顆粒的時(shí)候)。在一個(gè)實(shí)施例中，這樣的分級(jí)可以是二元的。在其他實(shí)施例中，可根據(jù)附加類別而分級(jí)液份， 例如，該附加的類別相關(guān)聯(lián)于液份中稀有顆粒的濃度、液份中稀有顆粒的特性、液份中多個(gè)不同稀有顆粒的特性等。以這個(gè)方式，可基于濃度范圍而分配任何數(shù)量的類別，濃度范圍例如，在約1到10之間、在約11到20之間、在約1到50之間、在約51到100之間、在約1到 100之間、在約101到201之間等?？蔀檫@些分類分配一個(gè)對(duì)應(yīng)于一些預(yù)確定的量化或質(zhì)化類別中的一個(gè)的任意數(shù)字(如，0、1、2、3、4、5等)，或分配一個(gè)對(duì)應(yīng)于液份中稀有顆粒的數(shù)量的實(shí)際值或大約數(shù)量的數(shù)字。如此處所使用的，“可探測(cè)到的特性”是指與稀有顆粒相關(guān)聯(lián)的性質(zhì)，例如，光敏、 電活化、生物活性或者磁性質(zhì)，這些性質(zhì)是稀有顆粒本身固有的，或者是與稀有顆粒相接合或相結(jié)合的可探測(cè)到的分子部分(moiety)相關(guān)聯(lián)的。光敏性質(zhì)的示例包括，例如，通常是由生物顆粒形態(tài)(顆粒尺寸、粒度、內(nèi)部亞細(xì)胞結(jié)構(gòu))所引起光強(qiáng)度的變化(光反射、散射、偏差、傳輸或吸收)、熒光、免疫熒光等。電活化性質(zhì)的示例包括，例如，電荷、氧化狀態(tài)、自旋狀態(tài)、電容、電導(dǎo)、電介性質(zhì)、 電泳遷移率或極化性的變化。生物活性的示例包括，例如，使用酶的可探測(cè)到的反應(yīng)，所述酶諸如是堿性磷酸酶 (AP)、辣根過氧化物酶(HRP)、半乳糖苷酶及其化學(xué)發(fā)光的、比色的或化學(xué)熒光的底物， 其包括但不限于TMB (3，3，，5，5，-N四甲聯(lián)苯胺)、0PD(o-苯二胺、ABTSQ，2，-聯(lián)氮雙乙基苯并噻唑啉磺酸)、氯萘酚、AEC (3-氨基-9-乙基咔唑)、DAB ( 二氨基聯(lián)苯胺)、pNPP (P-硝基苯磷酸二鈉)、BCIP/NBT (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭)等。在特定實(shí)施例中，可用于來探測(cè)稀有顆粒的分子部分包括但不限于納米顆粒、微珠、抗體及其碎片、熒光抗體、磁性納米顆粒、聚合物分子、顏料分子、DNA或者RNA分子(如，
9適體)、脂質(zhì)分子、蛋白質(zhì)分子等。如此處所使用的，“抗體”是指含有具體地結(jié)合并識(shí)別抗原的來自免疫球擔(dān)保的框架區(qū)域或其片段的多肽。所識(shí)別出的免疫球蛋白基因包括卡帕、拉姆達(dá)、愛爾法、伽馬、德耳塔、厄普西隆和謬恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為或者卡帕或者拉姆達(dá)。重鏈被分類為伽馬、謬、愛爾法、德耳塔或者厄普西隆，然后其分別地定義免疫球蛋白類別IgG，IgM, IgA, IgD和IgE。一般，抗體的抗原結(jié)合區(qū)是結(jié)合的特異性和親和力是最關(guān)鍵的。抗體可以是從血清多克隆的單克隆的、雜種細(xì)胞或再結(jié)合克隆的，或者可以是嵌合、靈長化或人源化。示范性免疫球蛋白(抗體)的結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。各四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，各對(duì)有一條“輕鏈”(約25kD)和一條“重鏈”(約50-70kD)。各鏈的N末端確定約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別指這些輕鏈和重鏈?？贵w以完整的免疫球蛋白形式或用不同肽酶消化產(chǎn)生許多良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中的二硫連接下面消化抗體，產(chǎn)生F(ab)' 2，F(xiàn)ab的二聚體，其本身是由二硫鍵連接于VH-CHl的輕鏈?？稍跍睾蜅l件下還原F(ab' )2以打斷鉸鏈區(qū)中的二硫連接，從而將F(ab' )2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab'單體。Fab'單體主要是帶部分絞鏈區(qū)的Fab (參見Fundamental Immunology (《基礎(chǔ)免疫學(xué)》，Paul編，第3版，1993年)。 雖然根據(jù)完整抗體的消化定義了不同抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也可用化學(xué)方法或通過重組DNA的方法從頭合成所述Fab'片段。因此，本文中所用術(shù)語抗體，也包括通過全抗體修飾，或用重組DNA方法從頭合成所產(chǎn)生(例如，單鏈Fv)，或用噬菌體展示文庫鑒定的抗體片段(參見如 McCafferty 等，Nature 348 =552-554 (1990)) 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體與標(biāo)記或可檢測(cè)部分偶聯(lián)。本文所述〃標(biāo)記〃或〃可檢測(cè)部分〃是可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理手段檢測(cè)的組合物。例如，有用的標(biāo)記包括但不限于放射性核素、熒光染料(例如、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、俄勒同綠 、羅丹明、德克薩斯紅、異硫氰酸四羅丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、熒光標(biāo)記物(例如綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關(guān)蛋白酶(例如螢光素酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)激活的自淬滅的熒光化合物、納米粒、生物素、地高辛等。在某些實(shí)施方式中，可灌注檢測(cè)試劑以選擇性地標(biāo)記或突出顯示分離細(xì)胞。這種試劑的例子包括但不限于熒光、免疫熒光、染料偶聯(lián)的分子(例如抗體、fab片段、適體、聚合物、配體、激動(dòng)劑、拮抗劑或它們的組合)磁性、電活化、生物活化或光致活化的化合物。 一個(gè)例子是采用與作為上皮癌細(xì)胞中細(xì)胞骨架的整合組分的細(xì)胞角蛋白反應(yīng)的染料。其它染料的例子包括異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)的小鼠抗-人上皮抗體(HEA)和藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)的抗-CD45。用于表面選擇性捕獲的抗體的示例包括但不限于泛細(xì)胞角蛋白抗體A45B/B3、AE1/AE3、或CAM5. 2 (識(shí)別細(xì)胞角蛋白8 (CK8)、細(xì)胞角蛋白18 (CK18)、或細(xì)胞角蛋白19(CK19)的抗體)和針對(duì)乳腺癌抗原NY-BR-1(又稱為B7^P、ANKRD30A、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域30A) ；B305D同種型A或C(B305D-A或B305D-C;也稱為抗原B305D) ；Hermes抗原(也稱為抗原⑶44、PGP1) ；E-鈣粘著蛋白(也稱為桑葚胚粘著蛋白-1、⑶Hl)；癌-胚胎抗原(CEA ；也稱為CEACAM5或癌-胚胎抗原相關(guān)細(xì)胞粘著分子5) ； β -人絨毛膜促性腺素(β-HCG ；也稱為CGB、絨毛膜促性腺素、β多肽)；組織蛋白酶_D(也稱為CTSD)；神經(jīng)肽Y受體也稱為NPTOR)；脂多糖相關(guān)蛋白3、LAP3、融合肽；趨化因子(C)CC基序受體 4 ；CXCR4)；)；癌基因ERBBl (也稱為c-erbB-l、表皮生長因子受體、EGFR) ；Her_2Neu (也稱為 c-erbB-2 或 ERBB2) ；GABA 受體 A、pi ( π )多肽(也稱為 GABARAP、GABA-A 受體、pi ( π ) 多肽(GABA A(π)、丫-氨基丁酸4型受體？丨(31)亞基)、或6八81^) ；ppGalNac-T(6)(也稱為β -1-4-Ν-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶6、GalNAc轉(zhuǎn)移酶6、GaINAcT6、UDP-N-乙酰-d_半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶6、或GALNT6) ；CK7 (也稱為細(xì)胞角蛋白7、肌凝集素、SCL、角蛋白7、或KRT7) ；CK8(也稱為細(xì)胞角蛋白8、角蛋白8、或KRT8) ；CK18(也稱為細(xì)胞角蛋白18、角蛋白18、或KRT18) ；CK19(也稱為細(xì)胞角蛋白19、角蛋白19、或KRT19)； CK20(也稱為細(xì)胞角蛋白20、角蛋白20、或KRT20) ；Mage (也稱為黑色素瘤抗原家族A亞型或MAGE-A亞型)；Mage3 (也稱為黑色素瘤抗原家族A3或MAGA3)；肝細(xì)胞生長因子受體 (也稱為HGFR、腎細(xì)胞乳頭狀癌2、RCCP2、原癌基因met、或MET)；粘蛋白-I (也稱為MUC1、 癌抗原15. 3、(CA15. 3)、癌抗原27. 29 (CA 27. 29) ；CD227抗原、上皮唾液蛋白、上皮膜抗原 (EMA)、多態(tài)性上皮粘蛋白(PEM)、花生反應(yīng)性尿粘蛋白(PUM)、腫瘤相關(guān)糖蛋白(TAG12))； 毛囊腫病液蛋白(也稱為G⑶FP-15、催乳素誘導(dǎo)蛋白、PIP)；尿激酶受體(也稱為uPR、 CD87抗原、纖溶酶原激活劑受體尿激酶型、PLAUR) ；PTHrP(甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白；也稱為 PTHLH) ；BS 106(也稱為B511S、小乳腺上皮粘蛋白、或SBEM)；前列腺蛋白類親脂素B(LPB、 LPHB、也稱為抗原BU101、分泌球蛋白家庭I-D成員2，SCGB1-D2)；乳腺球蛋白2 (MGB2 ；也稱為乳腺球蛋白B、MGBB, Lacryglobin(LGB)親脂素C(LPC、LPHC)，分泌球蛋白家庭2A成員1、或SCGB2A1)；乳腺球蛋白(MGB ；也稱為乳腺球蛋白1，MGB 1、乳腺球蛋白A、MGBA、分泌球蛋白家庭成員2A成員2、或SCGB2A》；乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(Maspin，也稱為絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑分支B (卵清蛋白)成員5、或SERPINBO ；前列腺上皮特異性Ets轉(zhuǎn)錄因子(PDEF ；也稱為不育阿爾法基序指向域-包含ets轉(zhuǎn)錄因子、或SPDEF)；腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1(也稱為大腸癌抗原C017-1A、上皮糖蛋白2(EGP2)、40kDa的上皮糖蛋白(EGP40)、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、上皮特異性抗原(ESA)，胃腸道腫瘤相關(guān)抗原 733-2 (GA733-2)、KSl/4抗原、染色體4表面標(biāo)記物1的膜成分(M4S1) ,MK-I抗原、MIC18抗原、TR0P-1抗原、或TACSTD1)；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(也稱為端粒酶催化亞基、或TERT)；三葉因子1 (也稱為乳腺癌雌激素誘導(dǎo)序列、BCEI、胃腸三葉蛋白、GTF、pS2蛋白、或TFF1)；葉酸； 或三葉因子3 (也稱為腸三葉因子、ITF、pi. B ；或TFF3)的抗體。涉及稀有顆粒如蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞時(shí)，術(shù)語"特異性(或選擇性)結(jié)合"抗體或"特異性(或選擇性)與……免疫反應(yīng)"指能在粒子和其它生物物質(zhì)的異質(zhì)群體中確定是否存在該稀有顆粒的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，指定抗體與特定稀有顆粒的結(jié)合至少為背景的兩倍，更典型地是背景的10-100倍以上。在這些條件下與抗體特異性結(jié)合需要選擇對(duì)特定粒子特異性的抗體。例如，可選擇多克隆抗體以僅獲得與選定抗原特異性免疫反應(yīng)而不與其它蛋白質(zhì)反應(yīng)的哪些多克隆抗體?？赏ㄟ^消減與其它分子交叉反應(yīng)的抗體來實(shí)現(xiàn)該選擇。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于探測(cè)樣本液體中一個(gè)或多個(gè)生物顆粒的方法；所述方法包括a)詢查所述樣本液體的一個(gè)或多個(gè)液份；b)在單個(gè)測(cè)量中，探測(cè)在所述一個(gè)或多個(gè)液份的每一個(gè)中所述一個(gè)或多個(gè)稀有生物顆粒的存在或不存在，其中，所述一個(gè)或多個(gè)液份中的至少一個(gè)含有多個(gè)生物顆粒；以及c)基于所述一個(gè)或多個(gè)稀有顆粒的存在或不存在而分級(jí)所述液份。在特定實(shí)施例中，稀有生物顆粒是細(xì)胞。在特定實(shí)施例中，稀有生物顆粒是熒光標(biāo)記的細(xì)胞。在此處所提供的方法的一些實(shí)施例中，在單個(gè)測(cè)量中探測(cè)多個(gè)參數(shù)。在特定實(shí)施例中，多個(gè)參數(shù)是不同的熒光顏色。在此處所提供的方法的特定實(shí)施例中，通過添加防止樣本中包括所述生物顆粒或其組合物的細(xì)胞凝結(jié)的抗凝血?jiǎng)?、混合物來穩(wěn)定樣本液體。在一些實(shí)施例中，液份分級(jí)是二元的，例如如果液份未含有稀有顆粒則分配值 “0”，如果含有的話，則分配值“1”。在其他實(shí)施例中，分級(jí)是非二元的，例如，基于在液份中出現(xiàn)的稀有顆粒的數(shù)量而分配值，或者樣本中稀有顆粒的特性而分配值。在特定實(shí)施例中， 用計(jì)算機(jī)和代表分級(jí)算法的軟件來執(zhí)行分級(jí)。在一些實(shí)施例中，此處提供的方法還包括基于液份的分級(jí)而使液份在不同通道的步驟。例如，基于分配給液份的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。在特定實(shí)施例中，通過使用外部場(chǎng)(fi eld)或通過創(chuàng)建流動(dòng)分布而實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在特定實(shí)施例中，所述方法可包括使用類似所述分級(jí)通過收集和/或匯聚液份來集中所述稀有顆粒。在此處提供的方法的一些實(shí)施例中，稀有顆粒選擇以下細(xì)胞構(gòu)成的組癌細(xì)胞、癌干細(xì)胞、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、感染瘧疾的紅血球、淋巴細(xì)胞、白血球、胎細(xì)胞、干細(xì)胞和感染朊病毒的細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于探測(cè)樣本液體中一個(gè)或多個(gè)生物顆粒的設(shè)備； 所述設(shè)備包括a)用于探測(cè)在所述一個(gè)或多個(gè)液份的每一個(gè)中的一個(gè)或多個(gè)稀有生物顆粒的存在會(huì)不存在的一個(gè)或多個(gè)探測(cè)器，其中所述一個(gè)或多個(gè)液份中的至少一個(gè)含有多個(gè)生物顆粒；以及b)帶有用于基于所述一個(gè)或多個(gè)稀有顆粒的存在或不存在而分級(jí)所述液份軟件的計(jì)算機(jī)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述分級(jí)是二元的。在其他實(shí)施例中，其中所述設(shè)備被用于探測(cè)多個(gè)類型的生物顆粒，所述分級(jí)是非二元的。在特定實(shí)施例中，所述設(shè)備可進(jìn)一步包括多個(gè)通道，用于基于所述分級(jí)而引導(dǎo)所述液份。在具體實(shí)施例中，用抗凝血?jiǎng)?fù)合物、優(yōu)先結(jié)合至(bind to)稀有顆粒的復(fù)合物、 防止生物顆粒凝結(jié)的復(fù)合物或其組合來處理所述通道。在特定實(shí)施例中，所述設(shè)備可進(jìn)一步包括用于追蹤并操作所述生物顆粒的軌跡的電極。在其他實(shí)施例中，所述設(shè)備可進(jìn)一步包括用所附的磁性顆粒來分離生物顆粒的磁性元件。在還有其他實(shí)施例中，所述設(shè)備可進(jìn)一步包括用于追蹤并操作所述生物顆粒的軌跡的聲學(xué)元件。在此處提供的設(shè)備和裝置的特定實(shí)施例中，所述設(shè)備包括選自以下的一個(gè)或多個(gè)探測(cè)器照相機(jī)、電子倍增器、電荷耦合器件(CCD)圖像傳感器、光電倍增管(PMT)、雪崩二極管(APD)、單光子雪崩二極管(SPAD)或者互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CM0Q圖像傳感器。在此處提供的設(shè)備和裝置的特定實(shí)施例中，所述設(shè)備可進(jìn)一步包括用于詢查所述樣本液體的一個(gè)或多個(gè)液份的一個(gè)或多個(gè)源。例如，電磁輻射源。在具體實(shí)施例中，用于詢查的一個(gè)或多個(gè)源選自激光器(固態(tài)、二極管泵浦、離子或染色)、發(fā)光二極管(LED)、燈、 電弧放電、磁性脈沖或自然光。在還有其他實(shí)施例中，當(dāng)生物顆粒表現(xiàn)出諸如化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光之類的發(fā)光的時(shí)候，不需要用于詢查液份的源。
III.
具體實(shí)施例方式A.探測(cè)方法在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了了用于探測(cè)液體樣本中稀有顆粒的方法，所述方法包括如下步驟(a)探測(cè)所述液體樣本的液份中稀有顆粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有顆粒的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。在一個(gè)實(shí)施例中，探測(cè)所述稀有顆粒的存在的步驟包括如下子步驟(i)在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為包括所述探測(cè)試劑和稀有顆粒的混合物的狀況下使所述液體樣本與探測(cè)試劑接觸；以及(ii)在液體樣本的液份中探測(cè)在步驟(i)中所形成的混合物的存在或不存在。在特定實(shí)施例中，探測(cè)試劑可包括標(biāo)記的或未標(biāo)記的抗體、抗原結(jié)合片段、適體、 聚合物、納米顆粒、微珠、熒光抗體、磁性納米顆粒、聚合物分子、染料分子、適體、液體分子、 蛋白質(zhì)分子等。在另一個(gè)實(shí)施例中，探測(cè)所述稀有顆粒的存在的步驟包括如下子步驟(i)用電磁輻射的外部源來詢查所述液份；以及(ii)探測(cè)所述稀有顆粒的熒光。在一個(gè)實(shí)施例中，所述稀有顆?？砂晒鈽?biāo)記的細(xì)胞。在特定實(shí)施例中，熒光標(biāo)記的細(xì)胞可包括表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞、或者已經(jīng)用熒光探測(cè)試劑標(biāo)記的細(xì)胞。例如，急促地或穩(wěn)定地表達(dá)紅色或綠色熒光蛋白的細(xì)胞。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，其中稀有顆粒表現(xiàn)出固有的化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光，探測(cè)稀有顆粒存在的步驟包括探測(cè)所述稀有顆粒的生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光。在特定實(shí)施例中，所述稀有顆粒可以是細(xì)胞、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)絡(luò)合物、核酸、核蛋白復(fù)合體、碳水化合物、代謝物、新陳代謝作用之副產(chǎn)物等。在特定實(shí)施例中，所述稀有顆粒是細(xì)胞。在具體實(shí)施例中，細(xì)胞可以是癌細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、癌干細(xì)胞、表現(xiàn)出癌表面抗原的癌細(xì)胞，例如，選自以下組成的組CD44，CD2, CD3,⑶10，⑶14，⑶16，CD24.⑶31， CD45, CD64, CD 140b 或其組合。通過灌注可選擇地聯(lián)結(jié)上生物標(biāo)記的其他試劑，癌干細(xì)胞可區(qū)別于普通的癌細(xì)胞，它們可包括但不限于 CD44，CD2, CD3, CD10, CD14, CD16, CD24. CD31, CD45, CD64 或 CD140b。在特定實(shí)施例中，其中所述稀有顆粒是癌細(xì)胞，液份中被標(biāo)識(shí)為具有稀有細(xì)胞的細(xì)胞將被進(jìn)一步個(gè)別地仔細(xì)研究。例如，這些細(xì)胞可被進(jìn)一步經(jīng)由傳統(tǒng)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或eDAR而分開或分類，且可剖析期望的細(xì)胞來理解操作細(xì)胞機(jī)制的起源?？蓡为?dú)地分析每一個(gè)細(xì)胞中的內(nèi)容，DNA、RNA、DNA序列、代謝物、脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)內(nèi)容等。在其他實(shí)施例中，稀有細(xì)胞可以是寄生細(xì)胞或器官，例如，賈第鞭毛蟲屬或似隱孢菌屬的種類、感染了原形體種類的紅血球、感染了 HIV的淋巴細(xì)胞或白血球、母血中的胎細(xì)胞、干細(xì)胞、感染了朊病毒的細(xì)胞、CD4+T-細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施例中，液體樣本可包括多于一個(gè)類型的稀有顆粒，例如2，3，4，5，6，7， 8，9，10種或更多類型的稀有顆粒。相應(yīng)地，在特定實(shí)施例中，液體樣本同時(shí)地接觸多個(gè)可區(qū)分的探測(cè)試劑，每一個(gè)探測(cè)試劑在足以將多個(gè)探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為包含探測(cè)試劑和多個(gè)稀有顆粒的混合物的狀況下具有不同特異性。在一些實(shí)施例中，同時(shí)地探測(cè)多個(gè)混合物，例如，通過使用包括多于一個(gè)的詢查設(shè)備和/或多于一個(gè)探測(cè)設(shè)備的eDAR裝置。例如，在有兩個(gè)稀有顆粒需要被同時(shí)探測(cè)的情況下，每一個(gè)稀有顆?？山佑|可區(qū)分的探測(cè)試劑，每一個(gè)探測(cè)試劑可被兩個(gè)探測(cè)設(shè)備中的一個(gè)所探測(cè)。進(jìn)一步，其中所述探測(cè)試劑包括熒光分子部分、兩個(gè)詢查設(shè)備(如，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于不同熒光分子部分的激發(fā)波長的不同波長的輻射的兩個(gè)激光器)可被使用，且通過兩個(gè)不同的探測(cè)設(shè)備可探測(cè)分別得熒光輻射。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施例中，通過不同波長的熒光，探測(cè)試劑是可區(qū)分的。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，可連續(xù)地探測(cè)兩個(gè)或更多的稀有顆粒。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法可包括在eDAR裝置的第一位置處探測(cè)第一稀有顆粒，在eDAR裝置的第二位置處探測(cè)第二稀有細(xì)胞。以這個(gè)方式，存在第一和第二顆粒的液份可在第一探測(cè)步驟之后、 在第二探測(cè)步驟之后、或者在兩個(gè)探測(cè)步驟之后被弓I導(dǎo)。在本發(fā)明的特定實(shí)施例中，來自細(xì)胞整體的特性的探測(cè)可以是同時(shí)的或者隨時(shí)間累積的。例如，特性的探測(cè)可馬上從含有生物顆粒整體的大的液份中馬上(“同時(shí)”)地發(fā)
出ο在特定實(shí)施例中，其中以同時(shí)的方式來執(zhí)行方法，所述生物顆粒可由可變速度的液流來攜載。作為示例，當(dāng)生物顆粒穿過探測(cè)容積的時(shí)候，可以穩(wěn)定的流動(dòng)來攜載生物顆粒?？蛇x地，當(dāng)細(xì)胞穿過探測(cè)容積的時(shí)候，可停止、減速或加速流動(dòng)?？捎靡韵轮械囊粋€(gè)來在探測(cè)容積的上游或下游調(diào)節(jié)流動(dòng)閥門、外罩、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、光場(chǎng)、氣源壓力、固態(tài)顆粒、薄膜、 不溶的液滴、重力差分、或者用來改變通道的表面張力的鍍層。在此處提供的方法的一些實(shí)施例中，在液體樣本連續(xù)地流經(jīng)流動(dòng)通道的過程中執(zhí)行探測(cè)步驟。在特定實(shí)施例中，獨(dú)立的液份并不是物理地分隔的，而是通過光探測(cè)步驟定義的，也就是，液份可被定義為在探測(cè)發(fā)生的時(shí)刻在探測(cè)容積中呈現(xiàn)的顆粒的整體。在特定實(shí)施例中，探測(cè)事件以常規(guī)頻率發(fā)生，這取決于探測(cè)容積的大小和液體樣本的流速。例如，如果特定裝置的探測(cè)容積是 ο μ L且液體樣本以IOOyL/秒的速度流過所述裝置，將以每0. 1秒，或者IOHz的速度來探測(cè)不同的液份。在特定實(shí)施例中，取決于裝置的幾何形狀和將要被處理的液體的量，分離的液份以0. IkHz到IOOMHz之間的速率通過探測(cè)容積。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的液份以約IOHz 到約IOMHz之間的速率穿過探測(cè)容積。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的液份可以約0. IkHz到約 100ΜΗΖ之間的頻率穿過探測(cè)容積，或者在約IkHz到約10ΜΗΖ之間、約IkHz到約5ΜΗΖ之間、 約IkHz到約IMHZ之間。在特定實(shí)施例中，液份穿過探測(cè)容積的頻率可至少在約0. IkHz, 或者至少在約 0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30， 35，40，45，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，400，500，600，700，800 或 900kHz, 或者至少約 1MHz、或者在至少約 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70， 80，90 或 IOOMHz。在此處提供的方法的其他實(shí)施例中，對(duì)來自細(xì)胞整體的特性的探測(cè)可隨著時(shí)間而從小的探測(cè)容積發(fā)出(“累積的”)，該探測(cè)容積是單個(gè)細(xì)胞數(shù)量級(jí)的，但是在流動(dòng)的幫助下有多個(gè)細(xì)胞經(jīng)過該探測(cè)容積。eDAR的累積模式區(qū)別于從單個(gè)生物顆粒發(fā)出的相繼的信號(hào)或幀的延時(shí)覆蓋(time-lapse overlay)；單個(gè)生物顆粒的延時(shí)覆蓋并不組成生物顆粒的整
14體。在同時(shí)的模式和累積的模式二者中，僅在探測(cè)到來自細(xì)胞整體的特性之后才呈現(xiàn)決策。在此處提供的方法的還有其他實(shí)施例中，在探測(cè)之前可物理地分離液份。這可通過例如，通過空氣或連續(xù)的不溶于油的液相將樣本液體分離為分離的水性液份，例如，分為液滴。在一個(gè)實(shí)施例中，用于分離液份的不溶的相可包括有機(jī)相、油、諸如礦物油和黃豆油之類的自然油、諸如AR-20，AS-4之類的硅油、PDMS油、諸如Fluorinert和全氟萘烷之類的氟化油、諸如十六烷和乙酰苯之類的有機(jī)溶劑、蠟、空氣或氣體。在特定實(shí)施例中，不溶的相可以是連續(xù)的(也就是，整體地圍繞著分離的液份)或者是分段的(也就是，僅占有分離的液份之間的間隔而不是完整地圍繞著液份)。例如，圖16示出整體地圍繞著分離的液份的不溶的相(1642)。在一個(gè)實(shí)施例中，分離的液份是液滴。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的液份是栓體 (plug) ο在一個(gè)實(shí)施例中，分離的液份可在與流動(dòng)通道流體相通的流動(dòng)通道中被相繼地形成在eDAR裝置上。在特定實(shí)施例中，分離的液份可被形成在eDAR外部，但是經(jīng)由管、接口或與流動(dòng)通道流體相通的互連而流入該裝置的流動(dòng)通道中。在一個(gè)實(shí)施例中，可將表面活性劑添加到細(xì)胞懸浮液或不溶的相中來穩(wěn)定分離的液份。表面活性劑可包括白蛋白(?；蛉搜灏椎鞍?、司盤80、普流羅尼克、八乙二醇一癸醚、四乙二醇一癸醚、諸如3-(N，N-二甲基十二烷銨)丙烷磺酸鹽(DDAPS)之類的兩性離子表面活性劑、諸如二辛基磺基丁二酸鈉(AOT)之類的陰離子表面活性劑、諸如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)之類的陽離子表面活性劑和硅基、PEG化和氟化表面活性劑。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，液體樣本可被分為液份且在探測(cè)步驟之前，被物理地分在eDAR裝置的不同的流動(dòng)通道或腔體中。然后可并行地(也就是，同時(shí)使用多個(gè)探測(cè)設(shè)備或單個(gè)探測(cè)設(shè)備)或相繼地(例如，通過引導(dǎo)獨(dú)立的液份繼續(xù)地通過一個(gè)或多個(gè)探測(cè)容積) 執(zhí)行接下來的探測(cè)步驟。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，液體樣本，例如，生物學(xué)液體樣本，在探測(cè)稀有顆粒之前可被穩(wěn)定。在特定實(shí)施例中，可用試劑來穩(wěn)定液體，所述試劑包括但不限于，抗凝劑，諸如檸檬酸鹽、肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、環(huán)己二胺四乙酸 (DCTA)或乙二醇雙四乙酸(EGTA)；乙醛，諸如亞甲醇、甲醛、雙咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、六亞甲基四胺、多聚甲醛、戊二醛或乙二醛等的氨化物或氨基化合物的羥甲基衍生物。在本發(fā)明的還有其他實(shí)施例中，此處提供的方法可被進(jìn)一步與在分通道 (channeling)所期望的液份之后發(fā)生的次級(jí)過程相連接?？膳c此處提供的方法相連接的過程和/或功能的示例包括，例如，標(biāo)識(shí)細(xì)胞內(nèi)容(如，DNA、RNA、小RNA、脂質(zhì)、代謝物、碳水化合物或細(xì)胞內(nèi)包裹的蛋白質(zhì))的選擇性反應(yīng)。這些反應(yīng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、等溫PCR、確定DNA的外遺傳狀態(tài)的反應(yīng)、確定小RNA和siRNA內(nèi)容的單分子雜交反應(yīng)或者適體(DNA的短鏈)選擇性反應(yīng)。在特定實(shí)施例中，此處提供的方法可進(jìn)一步與液份或細(xì)胞分離之后的實(shí)驗(yàn)方案相連接?？膳c此處提供的方法相連接的實(shí)驗(yàn)的非限制性示例包括基于核酸的方法，諸如RNA 提取(帶有或沒有擴(kuò)增)、cDNA合成(逆轉(zhuǎn)錄)、基因微陣列、DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(單個(gè)、嵌套式、實(shí)時(shí)定量或接頭引物)或者DNA甲基化分析；細(xì)胞術(shù)方法，諸如熒光原位雜化(FISH)、激光捕獲微分析、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)、細(xì)胞培養(yǎng)或比較基因組雜交(CGH)研究；化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，諸如電泳、Southern印跡分析或酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)；確定小RNA和siRNA內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)；確定DNA/RNA內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)；確定脂質(zhì)內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)；確定碳水化合物內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)；確定代謝物內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)；確定蛋白質(zhì)內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)；以及功能細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(如，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)
寸J寸°在還有另一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的方法可還與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相連接，例如，進(jìn)一步分開或分離在所選的液份中出現(xiàn)的稀有顆粒。在一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的方法所使用的eDAR的通道可與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀流體相通。在特定實(shí)施例中，eDAR和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的連接容許所選擇的液份被進(jìn)一步檢查或連續(xù)地歸類來豐富稀有顆?；蚣?xì)胞的量。在此處提供的方法的特定實(shí)施例中，這個(gè)配置容許上游對(duì)稀有顆粒或細(xì)胞的粗略歸類，且在僅引導(dǎo)含有稀有顆粒或細(xì)胞的液份進(jìn)入下游過程，所述下游程序諸如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其是費(fèi)時(shí)、高成本和/或勞動(dòng)密集的。在特定實(shí)施例中，可使用此處提供的eDAR裝置來執(zhí)行此處提供的方法。1、有利特征如上所述，部分地由于對(duì)全部液份(而不是單個(gè)的細(xì)胞或顆粒)的整體探測(cè)和分級(jí)，eDAR技術(shù)相比傳統(tǒng)的目前使用的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀方法更快速且更為價(jià)廉。一些特征對(duì)于改進(jìn)的eDAR方法有幫助。例如，在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，液份包括多于單個(gè)的顆粒、細(xì)胞或熒光實(shí)體。在這個(gè)方面，可同時(shí)詢查含有多個(gè)細(xì)胞或顆粒而不是單個(gè)細(xì)胞或顆?；蛘?維細(xì)胞或顆粒層的分離的容積。在此處提供的方法的相關(guān)的實(shí)施例中，液體的顆?；蚣?xì)胞不需要連續(xù)地(也就是沒有重疊出現(xiàn)地一個(gè)接著另一個(gè))進(jìn)入探測(cè)點(diǎn)或容積。在相關(guān)的實(shí)施例中，顆粒不需要以單行或?qū)觼磉M(jìn)入探測(cè)點(diǎn)或容積。相應(yīng)地，在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，單個(gè)液份中的多個(gè)生物顆粒，可同時(shí)可通過流動(dòng)通道的橫截面或橫截容積，例如，詢查和/或探測(cè)容積。在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，不需要套流、引導(dǎo)緩沖或其他碳水化合物或幾何聚焦機(jī)制來使生物顆粒集中為單行用于詢查和/或探測(cè)。在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，采用全部液份的分級(jí)方案或值分配方案，而不是分類單個(gè)生物顆粒。在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，同時(shí)地探測(cè)顆?；蚣?xì)胞的整體，例如作為更大的液體樣本中的單個(gè)液份。在相關(guān)的實(shí)施例中，對(duì)于液份的確定影響包含在液份中的顆?；蚣?xì)胞的整個(gè)整體。在還有另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例中，在液份中被同時(shí)地探測(cè)的顆?；蚣?xì)胞的整體將保持為顆粒或細(xì)胞的整體。2、液份分級(jí)在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，如果該液份含有稀有顆粒則分配第一值給該液份，或者如果該液份沒有含有稀有顆粒則分配第二值給該液份。在具體實(shí)施例中，分級(jí) (也就是，值的分配)是二元的。例如，含有至少一個(gè)稀有顆粒的每一個(gè)液份被分配為值1， 而沒有含有稀有顆粒的每一個(gè)液份被分配為值0。
在此處提供的方法的另一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)液份中出現(xiàn)的稀有顆粒的量而分配值給液份。例如，含有4個(gè)稀有顆粒的液份可被分配為值4?？蛇x地，含有4顆粒的液份可根據(jù)稀有顆粒量的特定范圍而被分配值，所述范圍例如0到5個(gè)顆粒、1到10個(gè)顆粒、4到6 個(gè)顆粒，等。在此處提供的方法的還有另一個(gè)實(shí)施例中，其中在單個(gè)液體樣本中出現(xiàn)多于一個(gè)類型的稀有顆粒，根據(jù)液份中任何稀有顆粒的識(shí)別性(identity)來分配值給液份。例如， 其中液體樣本含有兩個(gè)稀有顆粒，A和B，既沒有含有A也沒有含有B的液份可被分配為值 0，僅含有A的液份可被分配為值1，僅含有B的液份可被分配為值2，既含有A又含有B的液份可被分配為值3。相應(yīng)地，在此處提供的方法的一個(gè)其中在單個(gè)液體樣本中出現(xiàn)多于一個(gè)類型的稀有顆粒的實(shí)施例中，分級(jí)(也就是，值的分配)不是二元的。在特定實(shí)施例中，分配的非空的值可取決于稀有顆粒的識(shí)別性或者稀有顆粒的濃度。在特定實(shí)施例中，具有同樣的被分配的值的多個(gè)液份可被聚集或引導(dǎo)在一起。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，需要主動(dòng)性的決定來分級(jí)或分配值給液份。在特定實(shí)施例中，使用計(jì)算機(jī)、控制器、帶有集成電路的芯片、電路板、電子元件、軟件和/或算法來分級(jí)或分配值給液份。3、液份弓I流和液體流動(dòng)在本發(fā)明的特定實(shí)施例中，基于分配給液份的值而引導(dǎo)液份的流動(dòng)或收集。例如， 在液體樣本中出現(xiàn)單個(gè)類型的稀有顆粒的實(shí)施例中，可引導(dǎo)被分配了空或“0”值的液份到第一通道(被引導(dǎo))或廢棄出口，而被分配了正的或“1”值的液份可被引導(dǎo)到第二通道或收集腔體中。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，其中在液體樣本中出現(xiàn)了多于一個(gè)類型的稀有顆粒， 可基于液份中出現(xiàn)的稀有顆粒的具體成分而引流液份。在一個(gè)實(shí)施例中，沒有含有稀有顆粒的液份可被引導(dǎo)到第一通道或廢物出口，含有第一種類型的稀有顆粒的液份可被引導(dǎo)到第二通道或第一收集腔體中，含有第二種類型的稀有顆粒的液份可被引導(dǎo)到第三通道或第二收集腔體中。在特定實(shí)施例中，含有多于一種類型的稀有顆粒的液份可被引導(dǎo)到特定流動(dòng)通道或收集腔體中。可選地，可引導(dǎo)液份到混合或稀釋腔體中，接著被混合或被稀釋的液份可被進(jìn)一步分為子液份，這樣稀有細(xì)胞被分入到不同的子液份中。然后可再次探測(cè)子液份中的稀有細(xì)胞，這樣可將稀有細(xì)胞彼此分開。在此處提供的方法的一個(gè)實(shí)施例中，可通過使用外部場(chǎng)或通過創(chuàng)建流動(dòng)分布來執(zhí)行引流的步驟(也就是，引導(dǎo)液份的流動(dòng)或收集)。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，一旦液份被分級(jí)，可使用外部場(chǎng)來改變液份方向。場(chǎng)可被包括電場(chǎng)、磁場(chǎng)、動(dòng)電、電泳、介電泳、水力、重力、風(fēng)力或光學(xué)力?？蛇x地，可引入不與細(xì)胞懸浮液相溶的物質(zhì)(諸如空氣、不相溶的有機(jī)液體或微珠)來減少外部的流動(dòng)分布。在特定實(shí)施例中，可由例如，引起液壓的方法和設(shè)備來傳遞流動(dòng)，這些方法和設(shè)備包括但不限于那些在機(jī)械原理(如，外部注射泵、氣動(dòng)薄膜泵、振動(dòng)薄膜泵、真空設(shè)備、離心力和毛細(xì)管作用)；電或磁原理(如，電滲流動(dòng)、動(dòng)電泵壓電/超聲波泵、磁流體插頭、電流體力學(xué)泵和磁流體力學(xué)泵)；熱力學(xué)原理(如，氣泡發(fā)生/減少相改變量擴(kuò)增)；表面濕潤原理(如，電濕潤、化學(xué)地、熱力地和減少放射性地表面張力梯度)等基礎(chǔ)上操作的方法和設(shè)備。在還有其他實(shí)施例中，通過重力反饋、表面張力(像校準(zhǔn)動(dòng)作)、靜電力(動(dòng)電流動(dòng))、離心流動(dòng)(設(shè)置在光盤上的基體并轉(zhuǎn)動(dòng))、磁性力(震蕩離子導(dǎo)致流動(dòng))、磁流體力合真空或壓力差而傳遞或引流液體。在特定實(shí)施例中，液體流動(dòng)控制設(shè)備，諸如那些相關(guān)于引起液壓或液體驅(qū)動(dòng)力的方法和設(shè)備而列舉的液體流動(dòng)控制設(shè)備，可連接至本發(fā)明主題的入口接口或出口接口。在一個(gè)示例中，在入口和出口的一個(gè)或兩個(gè)處設(shè)置多個(gè)接口，并且一個(gè)或多個(gè)接口連接至液體流動(dòng)控制設(shè)備。B、診斷和預(yù)后方法在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了對(duì)于相關(guān)于液體樣本中稀有顆粒的存在相關(guān)聯(lián)的狀況，用于提供對(duì)象診斷或預(yù)后的方法，所述液體樣本例如是生物學(xué)液體，諸如血液樣本。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括如下步驟(a)探測(cè)所述生物學(xué)液體的液份中稀有顆粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有顆粒的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括如下步驟(a)在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為包括所述探測(cè)試劑和稀有顆粒的混合物的狀況下使來自對(duì)象的生物學(xué)液體與探測(cè)試劑接觸； (b)在生物學(xué)液體的液份中探測(cè)在步驟(a)中所形成的混合物的存在或不存在；(c)基于在步驟(a)中形成的混合物的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(d)基于所分配的值而提供診斷或預(yù)后給所述對(duì)象。在另一個(gè)實(shí)施例中，探測(cè)所述稀有顆粒的存在的步驟包括如下子步驟(i)用電磁輻射的外部源來詢查所述液份；以及(ii)探測(cè)所述稀有顆粒的熒光。在100多年前，物理學(xué)家已知癌癥是由脫落細(xì)胞進(jìn)入血液而擴(kuò)散的。隨著血液攜載這些癌細(xì)胞從一個(gè)器官到另一個(gè)器官，癌癥轉(zhuǎn)移。這些脫落的腫瘤細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于從周邊血中計(jì)數(shù)和分離這些癌細(xì)胞的準(zhǔn)確的方法。血液中對(duì)于CTC的準(zhǔn)確探測(cè)被證明是非常困難的，因?yàn)檫€存在著無法估計(jì)數(shù)量的紅和白血球。多到50億紅血球和5百萬白血球共存才能找到單個(gè)CTC，探測(cè)CTC的問題相當(dāng)于逐個(gè)在干草堆中找針。通過準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)血液中癌細(xì)胞的數(shù)量，本發(fā)明提供對(duì)于癌擴(kuò)散過程的實(shí)時(shí)快照。 CTC血液測(cè)試與傳統(tǒng)預(yù)后工具(如，淋巴節(jié)點(diǎn)的狀態(tài)、腫瘤尺寸和形態(tài)特征)的最大的不同之處在于可使用CTC血液測(cè)試來提供關(guān)于癌癥治療是否有效的早期反饋。經(jīng)受6個(gè)月化療的病人可每3-4周測(cè)量他們的CTC計(jì)數(shù)；如果計(jì)數(shù)維持為高，腫瘤學(xué)家可相信現(xiàn)在的治療是無效的并開出新的藥物。從病人的角度而言，進(jìn)行CTC測(cè)試可(1)通過免除無效的化療而提供很大的節(jié)省，這種無效的化療可能需要每種藥物約$3，000-S10, 000/月的花費(fèi)，(2)給他們珍貴的機(jī)會(huì)在太晚之前尋找到有效的治療。單憑這些理由就足夠重要到讓腫瘤學(xué)家常規(guī)地處方昂貴的放射成像掃描(如，CT或MRI)。然而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了快速、價(jià)廉的CTC測(cè)試，它較便宜、更安全、更可重現(xiàn)、且快于放射成像掃描六周提供了同樣的，或者是更準(zhǔn)確的，預(yù)后信息。目前沒有可用的生物標(biāo)記測(cè)試提供類似的優(yōu)勢(shì)。
由于探測(cè)的癌細(xì)胞的高度敏感性，此處描述的方法提供了在癌細(xì)胞的濃度達(dá)到競爭技術(shù)的較低探測(cè)極限之前探測(cè)癌細(xì)胞的潛在。這意味著此處提供的方法能相比競爭技術(shù)更早地獲得有意義的結(jié)果。因此，并不是將本技術(shù)的使用限制在階段IV的轉(zhuǎn)移癌，腫瘤學(xué)家可將其使用向早期的診斷(也就是，階段III、階段II、階段I或轉(zhuǎn)移的、或癌癥之前的) 擴(kuò)展，例如，通過周期性地處方此處提供的方法用于那些還沒有表現(xiàn)出癌癥癥狀的一般公眾。一般地，健康的人血液中沒有任何CTC ；如果使用本發(fā)明在沒有疑似的病人中探測(cè)到任何CTC，那么可指定進(jìn)一步的測(cè)試(如，CT、MRI)來定位腫瘤病確認(rèn)狀態(tài)。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用本發(fā)明分離出的腫瘤細(xì)胞可被進(jìn)一步經(jīng)受分組分析 (如，根據(jù)基因型或顯型)來研發(fā)出靶向治療。作為示例，被分離出的腫瘤細(xì)胞可與結(jié)合至特定藥物靶點(diǎn)上的熒光抗體一起培養(yǎng)來確定藥物靶點(diǎn)的存在或表達(dá)的程度。一旦確定了藥物靶點(diǎn)的表達(dá)，腫瘤學(xué)家可確保從靶項(xiàng)為該表達(dá)而特別研發(fā)的藥物中選擇。在一個(gè)示例中， 被分離出的腫瘤細(xì)胞可與特定結(jié)合至Her2受體上的熒光抗體一起培養(yǎng)來確定乳腺腫瘤脫落的CTC是否是Her2-陽性。如果經(jīng)分離的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較高的Her2表達(dá)，腫瘤學(xué)家可指定Herceptin (曲妥珠單抗)，因?yàn)檫@個(gè)藥物是被設(shè)計(jì)為靶向并阻礙HER2蛋白質(zhì)過表達(dá)的功能。其他已知的藥物靶點(diǎn)，包括BCR-ABL或PDGFR (由藥物Gleevec靶向)、ERBB2 (由 Here印tin靶向)、EFGR(由Iressa、Tarceva靶向)、RAR-阿爾法(由ATRA靶向)、雌激素受體(由Tamoxifen靶向)、芳香酶(由Letrazole靶向)、男性激素受體(由Flutamide, Biclutamide靶向)、CD20 (由Rituximab靶向)、VEGF-受體(由Avastin革巴向)，也可類似地在指定合適的化療方案之前，從被分離的腫瘤細(xì)胞中篩選出來。在具體實(shí)施例中，稀有顆粒是癌細(xì)胞或循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。在其他實(shí)施例中，稀有細(xì)胞是寄生細(xì)胞或器官，例如，賈第鞭毛蟲屬或似隱孢菌屬的種類、感染了原形體種類的紅血球、感染了 HIV的淋巴細(xì)胞或白血球、母血中的胎細(xì)胞、干細(xì)胞、感染了朊病毒的細(xì)胞、 CD4+T-細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于診斷瘧疾的方法，所述方法包括使用此處提供的 eDAR方法和/或裝置來探測(cè)感染了瘧原蟲的紅血球。在一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于診斷HIV感染的方法，所述方法包括使用此處提供的eDAR方法和/或裝置來探測(cè)感染了 HIV的淋巴細(xì)胞或白血球。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于診斷與朊病毒相關(guān)聯(lián)的疾病的方法，所述方法包括使用此處提供的eDAR方法和/或裝置從來自人類或其他動(dòng)物(如，牛)的生物液體中探測(cè)先兆(prior)。在一個(gè)實(shí)施例中，與朊病毒相關(guān)聯(lián)的疾病是瘋牛病。1、診斷癌癥在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述方法包括使用此處提供的eDAR方法和/或裝置在來自對(duì)象的血液樣本中探測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在特定實(shí)施例中，對(duì)象是之前被診斷為階段I、階段 II、階段III或階段IV癌癥的病人。在特定實(shí)施例中，其中在來自之前被診斷為癌癥的病人的血液樣本中探測(cè)到CTC，病人可能進(jìn)一步被診斷為轉(zhuǎn)移癌。在一個(gè)實(shí)施例中，提供用于為之前被診斷為固體腫瘤的對(duì)象診斷轉(zhuǎn)移癌的方法， 所述方法包括如下步驟(a)在來自對(duì)象的血液樣本的液份中探測(cè)CTC的存在或不存在； (b)基于所述CTC的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。在一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中CTC的不存在相關(guān)于對(duì)象不具有轉(zhuǎn)移癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中至少一個(gè)CTC的存在相關(guān)于對(duì)象具有轉(zhuǎn)移癌。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中至少參考數(shù)量個(gè)CTC的存在相關(guān)于對(duì)象具有轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施例中，所述方法可進(jìn)一步包括步驟(d)如果在血液樣本中沒有探測(cè)到CTC，診斷對(duì)象為不具有轉(zhuǎn)移癌，或者，如果在血液樣本中探測(cè)到至少一個(gè)CTC，診斷對(duì)象為具有轉(zhuǎn)移癌。在相關(guān)實(shí)施例中，提供了用于監(jiān)測(cè)被診斷為癌癥的對(duì)象，包括使用此處提供的 eDAR方法在來自對(duì)象的血液樣本的液份中探測(cè)CTC的存在或不存在。在特定實(shí)施例中，可定期監(jiān)測(cè)病人看癌癥到轉(zhuǎn)移癌的過程，例如，一年至少一次、一年至少兩次，或者每年至少約3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。在一些實(shí)施例中，可監(jiān)測(cè)對(duì)象至少一個(gè)月一次，或者一個(gè)月至少約2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。在一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中CTC的不存在相關(guān)于對(duì)象不具有轉(zhuǎn)移癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中至少一個(gè)CTC的存在相關(guān)于對(duì)象具有轉(zhuǎn)移癌。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中至少參考數(shù)量個(gè)CTC的存在相關(guān)于對(duì)象具有轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施例中，所述方法可進(jìn)一步包括步驟(d)如果在血液樣本中沒有探測(cè)到CTC，診斷對(duì)象為不具有轉(zhuǎn)移癌，或者，如果在血液樣本中探測(cè)到至少一個(gè)CTC，診斷對(duì)象為具有轉(zhuǎn)移癌。對(duì)于在血液樣本中探測(cè)到CTC的實(shí)施例，所述方法可進(jìn)一步包括對(duì)被標(biāo)識(shí)為含有 CTC的一個(gè)或多個(gè)液份加以進(jìn)一步分析而標(biāo)識(shí)這個(gè)CTC細(xì)胞或多個(gè)CTC細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)特性。例如，含有CTC的液份或一組液份可被與對(duì)一個(gè)或多個(gè)癌癥特定的表面活性劑而專用的一個(gè)或多個(gè)探測(cè)試劑相接觸。通過確定哪些癌癥特定的活性劑呈現(xiàn)在CTC表面，可設(shè)計(jì)治療來靶向所表達(dá)的表面活性劑?？杀换?yàn)的癌癥特定的表面活性劑的非限制性示例， 包括，但不限于BCR-ABL或PDGFR(由藥物Gleevec靶向)、ERBB2 (由Here印tin靶向)、 EFGR(由Iressa、Tarceva靶向)、RAR-阿爾法(由ATRA靶向)、雌激素受體(由Tamoxifen 靶向)、芳香酶(由Letrazole靶向)、男性激素受體(由Flutamide,Biclutamide靶向)、 CD20(由Rituximab靶向)、VEGF-受體(由Avastin靶向)等。相應(yīng)地，在特定實(shí)施例中， 該方法可進(jìn)一步包括基于呈現(xiàn)在CTC上的特定表面活性劑的探測(cè)而為對(duì)象分配靶向治療的步驟。在特定實(shí)施例中，可使用此處提供的eDAR方法來執(zhí)行進(jìn)一步的分析，例如在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為帶有呈現(xiàn)在CTC表面上的癌癥特定活性劑的混合物的狀況下將所聚集的液份和多個(gè)不同標(biāo)簽的探測(cè)試劑相接觸，并使用多個(gè)探測(cè)設(shè)備探測(cè)該混合物。在其他實(shí)施例中，進(jìn)一步分析可通過將初步的eDAR方法和傳統(tǒng)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或免疫化學(xué)方法(如，免疫印記、ELISA、xMAP多種分析，等)結(jié)合起來執(zhí)行。在特定實(shí)施例中，用于探測(cè)CTC的eDAR設(shè)備可與用于執(zhí)行進(jìn)一步分析的第二設(shè)備或裝置流體相通。在被診斷為轉(zhuǎn)移癌的對(duì)象的實(shí)施例中所述方法可還包括為對(duì)象分配用于轉(zhuǎn)移癌的治療。在還有一個(gè)具體實(shí)施例中，提供了用于診斷有癌的對(duì)象的方法，所述方法包括從取自對(duì)象的血液樣本中探測(cè)CTC。例如，在來自之前沒有被診斷為癌癥的對(duì)象的血液樣本中探測(cè)CTC。在一些實(shí)施例中，對(duì)象可能有得癌癥或癌癥發(fā)展的高風(fēng)險(xiǎn)，例如，對(duì)象可具有癌癥家族史、是抽煙者、或者已經(jīng)暴露給致癌物(也就是，石棉、苯、鎘、氡、放射能等)。這樣，在特定實(shí)施例中，提供了用于監(jiān)測(cè)之前沒有被診斷為癌癥的對(duì)象的方法，所述方法包括如下步驟(a)在來自對(duì)象的血液樣本的液份中探測(cè)CTC的存在或不存在；(b)2基于所述CTC的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。在一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中CTC的不存在相關(guān)于對(duì)象不具有轉(zhuǎn)移癌。 在另一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中至少一個(gè)CTC的存在相關(guān)于對(duì)象具有癌癥。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，血液樣本中至少參考數(shù)量個(gè)CTC的存在相關(guān)于對(duì)象具有癌癥或轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施例中，所述方法可進(jìn)一步包括步驟(d)如果在血液樣本中沒有探測(cè)到CTC，診斷對(duì)象為不具有癌癥，或者，如果在血液樣本中探測(cè)到至少一個(gè)CTC，診斷對(duì)象為具有癌癥。在特定實(shí)施例中，可如上所述地執(zhí)行探測(cè)CTC的存在或不存在的步驟，例如，通過 (i)在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為含有所述探測(cè)試劑和稀有顆粒的混合物的狀況下將來自對(duì)象的生物液體和探測(cè)試劑接觸；以及(ii)在生物液體的液份中探測(cè)在步驟(i)中形成的混合物的存在或不存在，或者通過(i)用電磁輻射的外部源來詢查所述液份；以及(ii)探測(cè)所述稀有顆粒的熒光。2、用于提供預(yù)后的方法在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于對(duì)與生物液體中稀有顆粒的存在相關(guān)聯(lián)的疾病或狀況的診斷的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括如下步驟(a)探測(cè)來自對(duì)象的生物樣本的液份中稀有顆粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有顆粒的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集；以及(d)如果在樣本中沒有探測(cè)到稀有顆粒則提供好的預(yù)后，或，如果在樣本中探測(cè)到稀有顆粒則提供不佳的預(yù)后。在其他實(shí)施例中，基于液份中稀有顆粒的量或特性而分配值給液份。在這些實(shí)施例的特定實(shí)施例中，就樣本中稀有顆粒的量而提供好的或不佳的預(yù)后。例如，在一個(gè)是示例中，如果在樣本中稀有顆粒的量小于預(yù)確定的參考值，則提供好的預(yù)后，而如果在樣本中稀有顆粒的量等于或大于預(yù)確定的參考值，則提供不佳的預(yù)后。在特定實(shí)施例中，預(yù)確定的參考值可相關(guān)于對(duì)特定治療有所反應(yīng)的可能性，或者整體存活或無疾病存活一段時(shí)間(例如至少6個(gè)月或者至少1年、2，3，4，5，6，7，8，9，10， 15，20或更多年)的可能性。在特定實(shí)施例中，可如上所述地執(zhí)行探測(cè)稀有顆粒的存在或不存在的步驟，例如， 通過(i)在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為含有所述探測(cè)試劑和稀有顆粒的混合物的狀況下將來自對(duì)象的生物液體和探測(cè)試劑接觸；以及(ii)在生物液體的液份中探測(cè)在步驟(i)中形成的混合物的存在或不存在，或者通過(i)用電磁輻射的外部源來詢查所述液份；以及(ii) 探測(cè)所述稀有顆粒的熒光。在特定實(shí)施例中，可使用此處提供的方法來提供對(duì)于與稀有顆粒相關(guān)聯(lián)的任何疾病的預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于瘧疾的預(yù)后的方法，所述方法包括使用此處提供的 eDAR方法和/或裝置從來自個(gè)體的血液樣本中探測(cè)感染了瘧原蟲的紅血球的數(shù)量，并且如果在血液樣本中探測(cè)到的受感染的紅血球的全部數(shù)量小于預(yù)確定的參考值的話則提供好的預(yù)后，或者，如果在樣本中探測(cè)到的受感染的紅血球的全部數(shù)量等于或大于預(yù)確定的參考值的話則提供不佳的預(yù)后。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于HIV感染的預(yù)后的方法，所述方法包括使用此處提供的eDAR方法和/或裝置從來自個(gè)體的血液樣本中探測(cè)感染了 HIV病毒的淋巴細(xì)胞或白血球的數(shù)量，并且如果在血液樣本中探測(cè)到的受感染的細(xì)胞的全部數(shù)量小于預(yù)確定的參考值的話則提供好的預(yù)后，或者，如果在樣本中探測(cè)到的受感染的細(xì)胞的全部數(shù)量等于或大于預(yù)確定的參考值的話則提供不佳的預(yù)后。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于和朊病毒相關(guān)聯(lián)的疾病的預(yù)后的方法，所述方法包括使用此處提供的eDAR方法和/或裝置從來自個(gè)體的生物液體樣本中朊病毒的數(shù)量，并且如果在樣本中探測(cè)到的朊病毒的全部數(shù)量小于預(yù)確定的參考值的話則提供好的預(yù)后，或者，如果在樣本中探測(cè)到的朊病毒的全部數(shù)量等于或大于預(yù)確定的參考值的話則提供不佳的預(yù)后。在特定實(shí)施例中，預(yù)確定的參考值可相關(guān)于對(duì)特定治療有所反應(yīng)的可能性，或者整體存活或無疾病存活一段時(shí)間(例如至少6個(gè)月或者至少1年、2，3，4，5，6，7，8，9，10， 15，20或更多年)的可能性。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于為被診斷為固體腫瘤的對(duì)象提供預(yù)后的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括如下步驟(a)在來自對(duì)象的血液樣本的液份中探測(cè)CTC 的存在或不存在；(b)基于所述CTC的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集；以及(d)如果沒有探測(cè)到CTC，則提供好的預(yù)后， 或者，如果探測(cè)到CTC則提供不佳的預(yù)后。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了為診斷為轉(zhuǎn)移癌的對(duì)象提供預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟(a)在來自對(duì)象的血液樣本的液份中探測(cè)CTC的存在或不存在；(b)基于在液份中探測(cè)到的CTC的數(shù)量分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集；以及⑷如果血液樣本探測(cè)到的CTC的全部數(shù)量小于預(yù)確定的參考值，則提供好的預(yù)后，或者，如果血液樣本探測(cè)到的CTC的全部數(shù)量等于或大于參考值則提供不佳的預(yù)后。在特定實(shí)施例中，預(yù)確定的參考值可相關(guān)于對(duì)特定治療有所反應(yīng)的可能性，或者整體存活或無疾病存活一段時(shí)間(例如至少6個(gè)月或者至少1年、2，3，4，5，6，7，8，9，10， 15，20或更多年)的可能性。3、監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展或?qū)χ委煹姆磻?yīng)在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展或?qū)χ委煹姆磻?yīng)的方法，所述方法包括使用此處提供的eDAR方法和/或裝置探測(cè)液體樣本中的稀有顆粒。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括如下步驟(a)探測(cè)在第一時(shí)間取自對(duì)象的第一生物樣本的多個(gè)液份中稀有顆粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有顆粒的存在、不存在、 量或識(shí)別性而分配值給所述液份；(c)確定來自第一樣本的所有液份的總體值；(d)探測(cè)在第二時(shí)間取自對(duì)象的第二生物樣本的多個(gè)液份中稀有顆粒的存在或不存在；(e)基于所述稀有顆粒的存在、不存在、量或識(shí)別性而分配值給所述液份；(f)確定來自第二樣本的所有液份的總體值；以及(g)比較分配給第一樣本的總體值和分配給第二樣本的總體值，其中當(dāng)與第一樣本比較的時(shí)候，分配給第二樣本的增加的值相關(guān)于疾病的進(jìn)展和/或?qū)τ谥委煹牟患训姆磻?yīng)，和/或，當(dāng)與第一樣本比較的時(shí)候，分配給第二樣本的下降的值相關(guān)于疾病的衰退和/或?qū)τ谥委煹暮玫姆磻?yīng)。在特定實(shí)施例中，可進(jìn)一步基于為收集所分配的值而引導(dǎo)液份到特定通道或腔體 (帶有通道的)中，進(jìn)一步濃縮、或進(jìn)一步分析。在特定實(shí)施例中，在疾病診斷或治療方案開始之后可有規(guī)律地采用監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展或?qū)τ谥委煹姆磻?yīng)的方法。例如，可從對(duì)象處至少一年一次、至少一年兩次收集樣本，或者一年至少約3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。在一些實(shí)施例中，可監(jiān)測(cè)對(duì)象至少一個(gè)月一次， 或者一個(gè)月至少約2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。在特定實(shí)施例中，其中發(fā)現(xiàn)了疾病的進(jìn)展或?qū)τ谥委煹牟患训姆磻?yīng)，該方法可進(jìn)一步包括如下步驟分配治療、增加劑量方案、改變治療方案等。在特定實(shí)施例中，與稀有顆粒相關(guān)聯(lián)的疾病或狀況可以是癌癥、瘧疾、HIV/艾滋、 與朊病毒相關(guān)的疾病等。C、監(jiān)測(cè)水質(zhì)的方法在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了使用此處提供的eDAR方法或裝置，通過探測(cè)水樣本中的一個(gè)或多個(gè)稀有顆粒污染物來監(jiān)測(cè)水質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括如下步驟(a)在取自水源的樣本的液份中探測(cè)水污染物的存在或不存在；(b)基于液份中水污染物的存在、不存在、量或識(shí)別性而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)液份的流動(dòng)或收集，藉此基于分配給在本方法中所探測(cè)的所有液份的總體值而確定水源的質(zhì)量。在特定實(shí)施例中，水源可以是湖、池、河、溪或其他自然水體。在這些實(shí)施例的特定實(shí)施例中，可測(cè)試水來確定或預(yù)測(cè)人為物體或活動(dòng)對(duì)或者將對(duì)水體產(chǎn)生的影響，或者評(píng)估使用這個(gè)水體提供飲用水給人類的可行性或安全性。在其他實(shí)施例中，水源可以是在水處理廠、水庫、水塔處的池、池塘或者收集了用于提供飲用水給人類的其他水體。在這些實(shí)施例的特定實(shí)施例中，可測(cè)試水來評(píng)估使用這些水體提供飲用水給人類的可行性或安全性。在特定實(shí)施例中，使用此處提供的方法來定期地監(jiān)測(cè)用于提供飲用水給人類的水源的水質(zhì)，例如，在水處理廠或在水塔或水庫處。例如，可監(jiān)測(cè)水源至少一年一次、至少一年兩次，或者一年至少約3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。在一些實(shí)施例中，可監(jiān)測(cè)對(duì)象至少一個(gè)月一次，或者一個(gè)月至少約2，3，4，5或更多次。在還有其他實(shí)施例中，可測(cè)試水至少一周一次、或者一周至少2，3，4，5，6或更多次，或者每天至少一次、或者每天至少2，3，4，5，6，7， 8，9，10或更多次。在其他實(shí)施例中，可使用此處提供的方法來確定自然災(zāi)害(如，在颶風(fēng)、海嘯、地震之后)、事故或恐怖行動(dòng)之后，使用水體提供飲用水給人群的可行性或安全性。測(cè)試或監(jiān)測(cè)水安全性或質(zhì)量的方法可包括對(duì)稀有顆粒的探測(cè)，所述稀有顆粒是水污染物，例如，諸如賈第鞭毛蟲、似隱孢菌素種類之類的寄生蟲或者以低量引起公眾健康危險(xiǎn)的其他有機(jī)或無機(jī)的水污染物。D、裝置在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于探測(cè)生物液體中稀有顆粒的設(shè)備。在一個(gè)方面，所述設(shè)備包括(a)至少第一個(gè)輸入通道；(b)至少兩個(gè)出口通道； (c)能探測(cè)生物樣本的液份中一個(gè)或多個(gè)稀有顆粒的至少一個(gè)探測(cè)器；(d)用于引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)的機(jī)制；以及(e)能基于所述液份中稀有顆粒的存在、不存在、特性、成分或量能給所述液份分配一個(gè)值的分級(jí)設(shè)備，其中計(jì)算機(jī)與所述探測(cè)器和用于引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)的機(jī)制之間通信。在一些實(shí)施例中，所述裝置包括用于詢查液份的源。在其中稀有顆?；蚣?xì)胞固有
23地表現(xiàn)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光的其他實(shí)施例中，所述裝置可能不需要用于詢查液份的源。在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括由壁封圍的和/或在襯底上微制作的流動(dòng)通道，其所帶有的設(shè)計(jì)特征最小化對(duì)稀有細(xì)胞的無意傷害。減少稀有細(xì)胞的無意傷害減少了假陰性率，其可導(dǎo)致錯(cuò)誤的病人診斷或預(yù)后。流動(dòng)通道可進(jìn)一步包括具有水動(dòng)力設(shè)計(jì)的孔的通道來用最小壓力或傷害排出生物細(xì)胞，如美國專利申請(qǐng)?zhí)?007/0037172和 2008/0M8499中所描述的那樣。這樣的通道，在上述專利申請(qǐng)中被稱為一維(1_D)孔，減少了在細(xì)胞排出過程中細(xì)胞所經(jīng)歷的水動(dòng)力的壓力，且因此減少了細(xì)胞消散(lysis)的可能性。帶有I-D孔的通道可戰(zhàn)略性地根據(jù)美國專利號(hào)2008/03183M中所描述的“流出過濾”配置而設(shè)置，從而進(jìn)一步再引導(dǎo)、分割、阻尼或分散流動(dòng)，因此減少在排出時(shí)刻細(xì)胞所經(jīng)歷的沖擊力。封閉流動(dòng)通道的壁可使用根據(jù)PCTPCT/US2009/02^6中描述的步驟的UV-加工過程從醫(yī)療設(shè)備梯度聚合物的生物兼容襯底材料來制造，這樣eDAR裝置可遵循引導(dǎo)醫(yī)療設(shè)備制造的規(guī)則。1、用于引導(dǎo)液份流動(dòng)的機(jī)制在特定實(shí)施例中，用于引導(dǎo)流動(dòng)的機(jī)制引導(dǎo)液份的流到第一出口通道(如果液份含有稀有顆粒)或到第二出口通道(如果液份沒有含有稀有顆粒)。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于引導(dǎo)流動(dòng)的機(jī)制，取決于稀有顆粒的識(shí)別性、成分或量而引導(dǎo)含有稀有顆粒的液份的流到多個(gè)出口通道的一個(gè)中。在特定實(shí)施例中，用于引導(dǎo)液份的流動(dòng)的機(jī)制包括電極、磁性元件、聲學(xué)元件、電致動(dòng)元件、電場(chǎng)或磁場(chǎng)。在還有其他實(shí)施例中，用于引導(dǎo)液份的流動(dòng)的機(jī)制包括一個(gè)或多個(gè)電致動(dòng)的閥門或活塞，其中所述閥門或活塞在至少第一方向的流動(dòng)通道中控制液體的流動(dòng)，所述第一方向的流動(dòng)通道與第一輸入通道和兩個(gè)出口通道在第一節(jié)點(diǎn)處交匯。在一個(gè)實(shí)施例中，螺線管活塞是電致動(dòng)螺線管閥門的子組件。在還有一個(gè)實(shí)施例中，螺線管活塞通過模制被嵌入在設(shè)備中。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，所嵌入的螺線管活塞可被經(jīng)由管道液體相通的螺線管閥門所替代。在一個(gè)具體實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括用于追蹤和/或操作顆粒、液份或液體樣本的軌跡或流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)電極。在特定實(shí)施例中，電極基于例如介電泳或電濕潤的現(xiàn)象而增強(qiáng)液份的分離。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的裝置可包括用于追蹤和/或操作顆粒、液份或液體樣本的軌跡或流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)聲學(xué)元件。在特定實(shí)施例中，可使用聲學(xué)元件來用聲能(如， 聲泳力、超聲或超音波(megasonic))來操作所選擇的顆?；蚣?xì)胞的軌跡而基于細(xì)胞對(duì)壓縮的壓力波的反應(yīng)改進(jìn)細(xì)胞分離。在另一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括磁性元件，用于分離結(jié)合至或由磁性顆粒束縛住的稀有顆?；蚣?xì)胞。在特定實(shí)施例中，基于附著在顆?；蚣?xì)胞上的微磁或納米磁顆粒的磁化系數(shù)，磁性元件可增強(qiáng)液份、顆?；蚣?xì)胞的分離。在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括使用液壓改變、流速改變或電滲流速改變來操作所選顆?；蚣?xì)胞的軌跡。2、探測(cè)設(shè)備在特定實(shí)施例中，探測(cè)器選自以下組成的組照相機(jī)、電子倍增器、電荷耦合器件(CCD)圖像傳感器、光電倍增管(PMT)、雪崩二極管(APD)、單光子雪崩二極管(SPAD)以及互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CM0Q圖像傳感器。在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置包括光的、電的、聲的或磁性探測(cè)器來追蹤所選細(xì)胞的動(dòng)作或列舉液份中存在的所選的顆?；蚣?xì)胞。在一些實(shí)施例中，此處提供的裝置或方法可結(jié)合各種配置的熒光(單或者多顏色)顯微鏡成像，其包括但不限于，明場(chǎng)、外延、共焦的、DIC(微分干涉差)、暗場(chǎng)、霍夫曼、或者相位對(duì)比。在一些實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括多個(gè)探測(cè)設(shè)備，例如，至少2，3，4，5，6，7， 8，9，10或更多個(gè)探測(cè)設(shè)備。對(duì)于執(zhí)行本發(fā)明的一些方法，可能需要多個(gè)探測(cè)設(shè)備，例如，其中在液體樣本中出現(xiàn)多于一個(gè)的稀有顆?；蚣?xì)胞，使用多于一個(gè)的細(xì)胞標(biāo)記來區(qū)分不同細(xì)胞類型、或者同時(shí)探測(cè)多個(gè)探測(cè)試劑。3、詢查設(shè)備在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括用于詢查或激發(fā)液份中出現(xiàn)的可探測(cè)到的成分的源。在特定實(shí)施例中，用于詢查的源選自，例如，激光(固態(tài)、二極管泵浦、 離子或染色)、發(fā)光二極管(LED)、燈、電弧放電、磁性脈沖或自然光源。在一些實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括多個(gè)詢查設(shè)備，例如，至少2，3，4，5，6，7， 8，9，10或更多個(gè)探測(cè)設(shè)備。對(duì)于執(zhí)行本發(fā)明的一些方法，可能需要多個(gè)詢查設(shè)備，例如，其中在液體樣本中出現(xiàn)多于一個(gè)的稀有顆?；蚣?xì)胞，使用多于一個(gè)的細(xì)胞標(biāo)記來區(qū)分不同細(xì)胞類型、或者同時(shí)探測(cè)多個(gè)探測(cè)試劑。4、分級(jí)設(shè)備在特定實(shí)施例中，分級(jí)設(shè)備可選自計(jì)算機(jī)、控制器、帶有集成電路的芯片、電路板、電子元件、軟件、算法或其組合。5、流動(dòng)通道和腔體在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可被包括多個(gè)流動(dòng)通道，包括一個(gè)或多個(gè)輸入流動(dòng)通道(也就是將液份引入探測(cè)容積的通道)和一個(gè)或多個(gè)輸出通道(也就是，將液份引出探測(cè)容積的通道)。在一些實(shí)施例中，如此處提供的裝置可包括至少約1，2，3，4，5，6， 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100 或更多個(gè)輸入通道和至少約 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30， 35，40，45，50，60，70，80，90，100或更多個(gè)輸出通道的組合。在特定實(shí)施例中，裝置可包括多個(gè)連接至主通道的流動(dòng)通道來注入附加液體而改變局部速度。在一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括由以下材料制成的壁所封閉的流動(dòng)通道或腔體，所述材料包括但不限于聚合物材料(聚二甲基硅氧烷(PDMQ、聚氨酯甲基丙烯酸酯(PUMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、 聚對(duì)二甲苯、聚氯乙烯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚已酸內(nèi)酯、聚酮、聚鄰苯二甲酰胺、纖維素乙酸酯、聚丙烯腈、聚砜、環(huán)氧聚合物、熱塑料、含氟聚合物和聚偏二氟乙烯、聚酰胺、聚酰亞胺)、無機(jī)材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融石英、陶瓷、玻璃 (有機(jī))、金屬和/或其他材料及其組合。在特定實(shí)施例中，壁材料可由以下材料制成多孔膜、毛料的織造或非織造纖維(諸如布或網(wǎng))、金屬(如，不銹鋼或蒙乃爾銅-鎳合金)、玻璃、紙張或合成纖維(如，尼龍、 聚丙烯、聚碳酸酯、聚對(duì)二甲苯和各種聚酯)、燒結(jié)的不銹鋼和其他金屬以及諸如氧化鋁、硅或碳之類的多孔無機(jī)材料。在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可包括用化學(xué)或生物分子預(yù)先處理過的流動(dòng)通道或腔體。例如，通道或腔體可被用抗凝血?jiǎng)?fù)合物處理來防止或減少液體樣本中顆粒的聯(lián)結(jié)、用優(yōu)選結(jié)合至液體樣本的顆粒(例如稀有顆?；蚣?xì)胞)的復(fù)合物處理、或者用防止或減少液體樣本中的顆粒凝聚或聚集的復(fù)合物處理。在一個(gè)實(shí)施例中，通道或腔體表面可用抗凝血?jiǎng)?fù)合物處理、用優(yōu)選結(jié)合至循環(huán)腫瘤細(xì)胞的復(fù)合物處理、或者用防止細(xì)胞粘住的復(fù)合物處理。在特定實(shí)施例中，通道或腔體表面可被化學(xué)改性來增強(qiáng)濕潤性或者幫助對(duì)所選細(xì)胞、顆?；蚍肿拥奈?。表面改性化學(xué)物質(zhì)可包括但不限于硅烷，諸如三甲基氯硅烷 (TMCS)、六甲基二硅氮烷(HMDQ、十三氟-1，1，2，2_四氫辛烷、正辛基二甲基化氯硅烷、氯二甲基辛硅烷、十八烷基三氯硅烷(0化)或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 ’聚合物如丙烯酸、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺(DMA)、丙烯酸-2-羥乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氮雜環(huán)丙烷(PEI)、聚乙二醇(PEG)、環(huán)氧聚二甲基丙烯酰胺(印oxy pol y(dimethylacrylamide) (EPDMA)或 PEG — 甲氧基丙煉酸酉旨(PEG—monomethoxyl acrylate)；表面活性劑如普流羅尼克(Pluronic)表面活性劑、基于聚乙二醇(PEG)的表面活性劑、十二烷基磺酸鈉(SDQ十二烷基三甲基氯化銨(DTAC)、十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)或聚凝胺(PB)；纖維素衍生物如羥丙基纖維素(HPC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)， 胺如乙胺、二乙胺、三乙胺或三乙醇胺，含氟化合物如包含聚四氟乙烯(PTFE)或特氟隆的化合物。6、用于背景降噪(Background Reduction)的裝置在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括用于降低額外背景信號(hào)和/或改進(jìn)信號(hào)-噪聲比的裝置。通過降低額外背景信號(hào)和改進(jìn)信號(hào)-噪聲比，因?yàn)榭蓽?zhǔn)確地探測(cè)到來自甚至高度稀釋的液份的微弱信號(hào)，增強(qiáng)了探測(cè)的靈敏度。也就是說，信號(hào)-噪聲比越好，可掃描的液份越大。直接結(jié)果就是，由于需要掃描的液份越少(但是量更大)相應(yīng)地增加了液體流通量。在一個(gè)實(shí)施例中，用于降低背景信號(hào)的裝置包括掩模(mask)。掩?？砂ㄈ魏涡螤罨虼笮〉娜魏螖?shù)量的孔，帶有或不帶有間歇間距地位于任何位置。例如，圖3示出含有孔陣列(311)的掩模(301)，位于探測(cè)容積和探測(cè)器之間，用于選擇性地容許通過可探測(cè)到的特性。在特定實(shí)施例中，掩?？砂ü庠?，其選擇性地通過特定波長的光，例如，低通、 高通或帶通濾波器或者聲光調(diào)制器、空間光調(diào)制器、光斷路器、人造全息圖、物理孔或電流計(jì)掃描器。在其他實(shí)施例中，掩?？砂ù判栽?，其選擇性地防止磁場(chǎng)的通過。在一些實(shí)施例中，可使用其他完成信號(hào)-噪聲比類似增益的其他設(shè)備來代替掩?；蚺c掩模協(xié)同使用。例如，在特定實(shí)施例中，可使用選自以下的設(shè)備來增加信號(hào)-噪聲比 鎖定放大器、掃描探測(cè)器、調(diào)制的詢查器或探測(cè)器、或者調(diào)制頻率或強(qiáng)度任何裝置。在還有其他實(shí)施例中，可使用帶有直接結(jié)合到內(nèi)的掩模的空間調(diào)制功能的探測(cè)器來與此處提供的裝置協(xié)同使用。在特定實(shí)施例中，不存在獨(dú)立的掩模。在其他實(shí)施例中，也存在獨(dú)立的掩模。結(jié)合掩模功能的探測(cè)器的非限制性示例包括光電二極管陣列或帶有空間像素化的照相機(jī)，這樣獨(dú)立光電二極管的信號(hào)或照相機(jī)的選擇像素可被移除或保留。7、附加元件在特定實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括以耦合至此處提供的eDAR方法的方式對(duì)于執(zhí)行實(shí)驗(yàn)、處理或測(cè)試有用的附加元件。在一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)電阻加熱元件來執(zhí)行片上細(xì)胞試驗(yàn)，諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。在還有其他實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)電極，例如，來進(jìn)行片上化學(xué)實(shí)驗(yàn)，諸如電泳或電色譜。在另一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的裝置可進(jìn)一步包括過濾器元件。在具體實(shí)施例中， 過濾器元件的形式可為微柱、微撞擊器、微篩、帶有比生物顆粒更小的孔的通道、帶有使生物顆粒不能進(jìn)入孔但液體被容許圍繞生物顆粒周圍通過孔的孔的通道(“1-D通道”)、微珠、多孔膜、從壁的突出、粘合涂層、毛料的織造或非織造纖維(諸如布或網(wǎng))、金屬(如，不銹鋼或蒙乃爾銅-鎳合金)、玻璃、紙張或合成纖維(如，尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對(duì)二甲苯和各種聚酯)、燒結(jié)的不銹鋼和其他金屬以及諸如氧化鋁、硅或碳之類的多孔無機(jī)材料。例如，圖16示出過濾元件(1622)，其可被設(shè)置在通道中，諸如在出口通道(1621)， 用于選擇性地容許流體部分的通過同時(shí)留住所期望的生物顆粒。在還有另一個(gè)實(shí)施例中，此處提供的裝置可被連接至傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀。例如，圖16示出可與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀流體相通的出口通道(1621)(帶有或不帶有過濾器元件162 ，這樣含有稀有細(xì)胞1602的分離的液份1661被進(jìn)一步連續(xù)地(一個(gè)細(xì)胞接一個(gè)細(xì)胞地)檢查或排序。IV.示例A.示鑼Ij 1用于探測(cè)或量化液體中的稀有顆粒的，帶有單個(gè)入口和出口接口的eDAR裝置的示例。圖4示出eDAR裝置的示例，包括將細(xì)胞懸浮液分為液份的設(shè)備011)、詢查設(shè)備 G21和42 、探測(cè)或成像設(shè)備031、432和43 和分級(jí)設(shè)備(計(jì)算機(jī)，未示出)。在這個(gè)具體示例中，將細(xì)胞懸浮液分為液份的設(shè)備Gll)可包括含在壁和流體接口 012和413)中的流體通道G14)。激光器作為詢查設(shè)備。將帶有光電二極管、光電倍增器或照相機(jī)的倒置顯微鏡用作探測(cè)設(shè)備。在通道(414)和探測(cè)設(shè)備031、432和43 之間的路徑中放置掩模051)。計(jì)算機(jī)接收來自探測(cè)設(shè)備的信號(hào)并通過算法來分級(jí)液份。然后計(jì)算機(jī)基于分級(jí)的值(也就是在液體樣本中稀有顆粒的存在、不存在、特性或成分)而引導(dǎo)液份到合適的通道中。盡管圖4示出三個(gè)探測(cè)設(shè)備031、432和43 和兩個(gè)詢查設(shè)備021和42 ，實(shí)踐中 eDAR可僅包括一個(gè)探測(cè)設(shè)備和一個(gè)詢查設(shè)備、或者眾多的探測(cè)設(shè)備和詢查設(shè)備。在圖4中所示的裝置的一個(gè)用途中，詢查設(shè)備G21和422)包括488nm固態(tài)二極管泵浦激光器和633nmHeNe激光器，這些激光被引入倒置顯微鏡。在進(jìn)入顯微鏡物鏡之前， 使用圓柱形光具整形兩個(gè)激光束來形成10比1縱橫比的準(zhǔn)直的橢圓光束。使用半波晶片和偏振光束分光器的組合，可調(diào)節(jié)每一個(gè)光束的強(qiáng)度，而鏡子獨(dú)立地引導(dǎo)光來創(chuàng)建空間協(xié)同定位的激發(fā)區(qū)域。來自生物顆粒的熒光在穿過帶通濾波器之前，通過兩個(gè)二向色鏡子將其分為三個(gè)波長帶，并重新聚焦在三個(gè)單光子雪崩二極管(SPAD:431、432和43 上。一個(gè)SPAD收集波長范圍560-6IOnm的熒光，第二個(gè)SPAD收集645-700nm范圍的熒光，第三個(gè) SPAD收集范圍500-M0nm。SPAD的輸出被送向帶有計(jì)數(shù)器/定時(shí)器板的計(jì)算機(jī)并被用數(shù)個(gè)算法加以分析。B.示例 2用于探測(cè)或量化液體中稀有顆粒的，帶有兩個(gè)出口接口的eDAR裝置。圖5示出eDAR裝置，包括將細(xì)胞懸浮液分為液份的設(shè)備(510)、詢查設(shè)備(521)、 探測(cè)或成像設(shè)備(531)、分級(jí)設(shè)備(計(jì)算機(jī)，未示出)和根據(jù)所分配的分級(jí)而引導(dǎo)液份的裝置。這個(gè)裝置還包括單個(gè)入口接口(511)、兩個(gè)出口接口(512和513)、以及在單個(gè)點(diǎn)結(jié)合來將液體分成液份的三個(gè)流體通道(514)。激光器用作詢查設(shè)備(521)，帶有光電二極管、 光電倍增器的倒置顯微鏡或照相機(jī)作為探測(cè)設(shè)備(531)。掩模(551)被置于通道(514)和探測(cè)設(shè)備(531)之間。計(jì)算機(jī)接收來自探測(cè)設(shè)備的信號(hào)并通過算法來分級(jí)液份。然后設(shè)備利用電、磁、水力或氣動(dòng)裝置根據(jù)所分配的分級(jí)來引導(dǎo)液份進(jìn)入出口 512或出口 513。除了上述的具有單個(gè)詢查設(shè)備和單個(gè)探測(cè)設(shè)備的eDAR之外，可使用多個(gè)詢查和探測(cè)設(shè)備來與此處描述的eDAR裝置協(xié)同使用。例如，圖6示出帶有一個(gè)詢查設(shè)備(640)和三個(gè)探測(cè)設(shè)備(650、651和652)的eDAR裝置。C.示例 3用于探測(cè)或量化液體中稀有顆粒的，帶有多個(gè)入口和/或出口接口的eDAR裝置。
在本發(fā)明的各方面中，eDAR裝置可包括多個(gè)入口和/或出口接口。例如，圖7示出帶有五個(gè)接口(711、712、713、714和715)和結(jié)合在單個(gè)點(diǎn)處的五個(gè)液體通道716的用于將懸浮液分成液份的設(shè)備(710)?？墒褂靡粋€(gè)或多個(gè)接口作為液體入口 ；可使用一個(gè)或多個(gè)接口作為液體出口。例如，可使用該裝置，這樣兩個(gè)接口用作入口接口、三個(gè)接口用作出口接口，或者可使用為一個(gè)接口用作入口接口、四個(gè)接口用作出口接口等。理論上，設(shè)備(710) 可包括任意數(shù)量的液體入口和出口以及任意數(shù)量的流體通道。這些液體通道可在多于一個(gè)點(diǎn)處匯聚，且匯聚點(diǎn)并不必須由液體入口或出口所圍繞。D.示仿Ij 4用eDAR探測(cè)乳腺癌病人血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。來自階段IV的轉(zhuǎn)移乳腺癌病人的新近靜脈穿刺的血液從單個(gè)穿刺孔抽入三個(gè)獨(dú)立的管子。第一血液部分(第一管)被丟棄以避免來自皮膚穿刺的上皮細(xì)胞的可能的污染。第二管被收集到含有穩(wěn)定試劑的Veridex’ s Cell&ive管子中，用于使用Veridex’ s CellSearch系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞探測(cè)。第三部分被收集到含有EDTA抗凝血?jiǎng)┑氖占苤校糜谑褂胑DAR進(jìn)行單獨(dú)分析。第三部分用下列物質(zhì)培養(yǎng)酶、定色劑、滲透試劑和靶向鼠抗泛角蛋白、⑶45和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的熒光抗體。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性標(biāo)識(shí)被定義為細(xì)胞表達(dá)鼠抗泛角蛋白和EpCAM，而不是⑶45。⑶45—般被認(rèn)為是白細(xì)胞共同抗原且表示白血細(xì)胞。結(jié)合所有三個(gè)抗體的物體被認(rèn)為是假陽性，一般是蛋白質(zhì)聚合的結(jié)果。簡短地，以約在10-500 μ L/分鐘的流速，予以抗體標(biāo)記的5到IOmL血液樣本流過如示例1中所描述的eDAR裝置，使用提供7. 6psi的壓縮空氣源驅(qū)動(dòng)該流動(dòng)。eDAR裝置在連續(xù)流動(dòng)(同時(shí))模式中操作。對(duì)于這些試驗(yàn)，使用200μπι寬50μπι高的微通道。對(duì)于予以抗體標(biāo)記的混合物的詢查，在約488nm和633nm提供線共焦激發(fā)束，其照亮約5-10 μ m 薄的片光。這樣，線共焦探測(cè)容積具有約200μπι(寬)Χ50μπι(高)Χ10μπι(厚)的尺寸， 提供約0. InL的探測(cè)容積。三個(gè)SPAD探測(cè)設(shè)備在10000Hz采樣率操作，被設(shè)置為探測(cè)從 450-610nm、645-700nm和500_540nm的細(xì)胞發(fā)出的熒光信號(hào)。以這個(gè)速率，每一個(gè)液份在約InL到50nL的數(shù)量級(jí)，估計(jì)為含有5-250個(gè)白血細(xì)胞和5000-25000個(gè)紅血細(xì)胞。對(duì)于 5-10mL的樣本，因此以500 μ L/分鐘的流速，花費(fèi)10-20分鐘來處理這個(gè)樣本。以此方式處理的5mL樣本將被分為每份體積50nL的10000個(gè)液份。這樣，如果使用具有兩個(gè)出口通道的eDAR裝置，在不使用過濾器的情況下，僅在 10分鐘內(nèi)就將含有200CTC的5mL樣本減少為10 μ L的體積。如果eDAR裝置進(jìn)一步與流式細(xì)胞儀液體接觸，通過在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀之前實(shí)現(xiàn)eDAR步驟，在5mL中出現(xiàn)的所有200CTC 細(xì)胞將在2%的正常時(shí)間中被計(jì)數(shù)和/或個(gè)別地分離。圖8示出使用Veridex的CelBearch系統(tǒng)(下面板)和eDAR(上面板)的來自階段IV乳腺癌病人(在不同日期抽取的不同病人)的27個(gè)血液樣本的CTC計(jì)數(shù)。如清楚地示出的，使用Cellkarch系統(tǒng)，大多數(shù)病人樣本被認(rèn)為零個(gè)CTC計(jì)數(shù)。反之，由eDAR分析的同樣的病人樣本抽取的超過50%被發(fā)現(xiàn)含有200-400CTC計(jì)數(shù)。這充分地展示了使用 eDAR的相對(duì)于使用Veridex的商用CelBearch系統(tǒng)的100多倍的靈敏度。eDAR的增加的靈敏度可歸于通過液份分級(jí)對(duì)CTC和背景之間的準(zhǔn)確的辨別和掩模的使用。也如圖8中所示，由eDAR分析的病人樣本的100%指示CTC的存在，而由Veridex 的商用Cellkarch系統(tǒng)分析的病人樣本的只有40%指示任何CTC的任何存在。這展示了 eDAR所提供的極低的假陰性率。CTC測(cè)試的高假陰性率可導(dǎo)致對(duì)于轉(zhuǎn)移的不準(zhǔn)確的預(yù)后， 并給病人錯(cuò)誤的安全感認(rèn)為現(xiàn)有治療方案是足夠的。圖9中提供了由這個(gè)eDAR方法所探測(cè)的CTC的示例圖像。簡單地說，這個(gè)圖示出在各種照明環(huán)境下使用eDAR從病人血液中捕獲的癌細(xì)胞的光學(xué)圖像(箭頭標(biāo)記CTC)。圖 9A是在血紅細(xì)胞當(dāng)中的CTC的明場(chǎng)圖像。圖9B是指示泛細(xì)胞角蛋白的出現(xiàn)的熒光圖像。 圖9C示出無⑶45出現(xiàn)的熒光圖像，因此排除了將白血細(xì)胞錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)為CTC的可能性。E.示{列 5在很多癌細(xì)胞中對(duì)于癌干細(xì)胞的探測(cè)。由eDAR隔離的癌細(xì)胞可被進(jìn)一步分析來區(qū)分生物體液中的子總體 (subpopulation)。通過灌注靶向特定蛋白質(zhì)的附加熒光抗體，可將一些癌細(xì)胞與其他區(qū)分開。例如，表達(dá)CD44而不是CDM蛋白的癌細(xì)胞目前被稱為癌干細(xì)胞，因?yàn)榕c較高的轉(zhuǎn)移潛在性相關(guān)。其他蛋白質(zhì)可相關(guān)聯(lián)于細(xì)胞的各種特性。例如，圖10示出對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)識(shí)(用箭頭標(biāo)記)。簡短地，乳腺癌細(xì)胞 (MCF-7)用 Alexa 488-抗-CD44 (陽性)和 Alexa 647-抗-CD24 (陰性)標(biāo)記。圖 10A 是用于探測(cè)Alexa 500-抗-CDM (綠色)的熒光圖像088_540歷)；圖10B是用于探測(cè)Alexa 647-抗-CDM (紅色)的熒光圖像(645-700nm)；圖10C是明場(chǎng)圖像。圖10D是指示CD44+/ ⑶24-的合成圖像(箭頭指示癌干細(xì)胞)。癌細(xì)胞的大約25 %被發(fā)現(xiàn)表達(dá)⑶44而不是⑶M， 因此滿足了癌干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。以這個(gè)方式，可使用eDAR來區(qū)分生物液體中的癌細(xì)胞的子總體。
F.示例 6使用分離的液份的eDAR探測(cè)。在此處提供的方法的一個(gè)示例中，可通過使用分離的水液份來操作eDAR，所述液份由不溶的相(Phase)分開，從而在探測(cè)步驟之前封住生物顆粒。圖16示出以這個(gè)方式操作的eDAR裝置。例如，含有不期望的細(xì)胞(1601)和期望的細(xì)胞1602的細(xì)胞懸浮液被分為分離的液份(1631、1641、1651和1661)，它們由不溶的相(1642)彼此分離。分離的液份在流動(dòng)通道(160 中被引導(dǎo)成從左向右流動(dòng)。當(dāng)液份1641通過探測(cè)容積(1604 ；圓柱形外形)的時(shí)候，同時(shí)地探測(cè)分離的液份(1641)中封住的多個(gè)細(xì)胞。如果沒有探測(cè)到期望的細(xì)胞，將此分離的液份(1641)分級(jí)為空并引導(dǎo)向通道1611(見，例如，液份1651)。如果探測(cè)到任何期望的細(xì)胞，將此分離的液份分級(jí)為非零，并引導(dǎo)向通道1621(見，例如，液份1661)。在一個(gè)實(shí)施例中，可在通道1621中設(shè)置過濾元件1622，以容許流體部分通過的同時(shí)留住所期望的生物顆粒。在一個(gè)實(shí)施例中，eDAR裝置可連接至傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀。例如， 在圖16中，通道1621可與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀流體相通(帶有或不帶有過濾器元件1622)，這樣含有稀有細(xì)胞1602的分離的液份1661被進(jìn)一步連續(xù)地(一次一個(gè))檢查或歸類。不溶的相(1642)可以是如圖16中連續(xù)的(也就是，整體地圍繞著分離的液份) 或是分段的(也就是，不溶的相1642僅占據(jù)分離的液份之間的間距但不是完整地圍繞著液份)。G.示例 7作為本發(fā)明的一個(gè)方面的利用的示例，如果IOmL細(xì)胞懸浮液在100億不希望的細(xì)胞之間僅含有9個(gè)期望的稀有顆粒，以最簡單的方式，eDAR將需要探測(cè)來自10個(gè)液份含有的所期望的細(xì)胞的特性。由于只有9個(gè)期望的細(xì)胞，至少一個(gè)液份完全沒有所期望的細(xì)胞且可被分級(jí)為空并馬上被丟棄。所丟棄的部分中含有的不期望的細(xì)胞不需要個(gè)別地被篩查。因此，僅取10液份時(shí)，至少全部量的1/10被立刻丟棄了，1/10的不希望的細(xì)胞(包含在被丟棄的量中)不需要獨(dú)立地被探測(cè)?？陀^地看，用一個(gè)決定將10億個(gè)不期望的細(xì)胞作為整體排除。使用當(dāng)前現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞分類器，以70000物體/秒的極限速度，這個(gè)決定導(dǎo)致1，000, 000, 000/70, 000 = 14，300秒或4小時(shí)的時(shí)間的節(jié)省。這導(dǎo)致時(shí)間效率上的極大提尚。接著上述場(chǎng)景，假設(shè)如果IOmL細(xì)胞懸浮液被分為每個(gè)100 μ L的100個(gè)液份，由于細(xì)胞懸浮液的全部量僅含有9個(gè)期望的細(xì)胞，至少91個(gè)部分不會(huì)含有任何所期望的細(xì)胞。 因此，通過僅執(zhí)行100次掃描以及做出100個(gè)決定，可以立刻排除91液份xlOO μ L = 9. lmL。 包含在被丟棄的部分中的細(xì)胞將是91億個(gè)細(xì)胞，或者在100個(gè)決定中排除91%的不期望的細(xì)胞。H.示例 8圖1示出本發(fā)明的具體實(shí)施例，其中在同時(shí)方式的操作中在液份中探測(cè)稀有顆粒特性。簡短地說，含有不期望的細(xì)胞(101)和期望的稀有細(xì)胞(10 的細(xì)胞懸浮液在流動(dòng)通道(103)中被引導(dǎo)從左向右流動(dòng)。在給定時(shí)間，多個(gè)細(xì)胞可穿過由陰影的圓柱形所封閉的探測(cè)容積(104)并被同時(shí)地探測(cè)。如果沒有探測(cè)到期望的細(xì)胞，等同于探測(cè)容積的液份被分級(jí)為空，并引導(dǎo)向通道111。如果探測(cè)到任何期望的細(xì)胞，液份被分級(jí)為非零且被引導(dǎo)向通道121。
可選地，可在通道12中設(shè)置過濾元件(121)，選擇性地容許流體部分通過的同時(shí)留住所期望的生物顆粒。過濾器元件可形為微柱、微撞擊器、微篩、帶有比生物顆粒更小的孔的通道、帶有使生物顆粒不能進(jìn)入孔但液體被容許圍繞生物顆粒周圍通過孔的孔的通道 (“1-D通道”)、微珠、多孔膜、從壁的突出、粘合層、毛料的織造或非織造纖維(諸如布或網(wǎng))、金屬(如，不銹鋼或蒙乃爾銅-鎳合金)、玻璃、紙張或合成纖維(如，尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對(duì)二甲苯和各種聚酯)、燒結(jié)的不銹鋼和其他金屬以及諸如氧化鋁、硅或碳之類的多孔無機(jī)材料。I.示例 9在以同時(shí)模式運(yùn)行的eDAR的另一個(gè)示例中，所述方法可進(jìn)一步包括選擇性地掩模液份從而減少額外背景信號(hào)和改進(jìn)信號(hào)-噪聲比。圖2示出使用含有孔陣列012)的掩模011)，其位于探測(cè)容積和探測(cè)器之間，用于選擇性地容許通過可探測(cè)到的特性。通過掩模011)的使用可同時(shí)探測(cè)多個(gè)生物顆粒。通過降低額外背景信號(hào)和改進(jìn)信號(hào)-噪聲比， 因?yàn)榭蓽?zhǔn)確地探測(cè)到來自甚至高度稀釋的液份的微弱信號(hào)，增強(qiáng)了探測(cè)的靈敏度。也就是說，信號(hào)-噪聲比越好，可掃描的液份越大。直接結(jié)果就是，由于需要掃描的液份更少(但是量更大)相應(yīng)地增加了液體流通量。如果沒有探測(cè)到期望的生物顆粒，等同于探測(cè)容積的液份被分級(jí)為空，并引導(dǎo)向通道221。如果探測(cè)到任何期望的生物顆粒，液份被分級(jí)為非零且被引導(dǎo)向通道222。J.示例 10圖IlA部分，這是設(shè)備710(圖7)的放大的示圖，示出設(shè)備1110，用于用在節(jié)點(diǎn) 1116處匯聚的五個(gè)液體通道(1111、1112、1113、1114和1115)來將懸浮液分為液份。流體通道1111、1112、1113帶由液體流向節(jié)點(diǎn)1116，而流體通道1114和1115帶著液體離開節(jié)點(diǎn) 1116。螺線管活塞1120位于通道1111的頂部，而螺線管活塞1121位于通道1112的頂部。 螺線管活塞1120和1121被配置為按壓在彈性聚二甲基硅氧烷(PDMQ薄膜上，薄膜將活塞 1120和1121與通道1111和1112中的液體分開。圖11的A部分示出用于將懸浮液分為液份的設(shè)備1110的操作。通過將螺線管活塞1120按壓在位于流體通道1111的頂部的PDMS薄膜，通道1111被關(guān)閉。同時(shí)，螺線管活塞1121被設(shè)置為容許液體穿過通道1112流向節(jié)點(diǎn)1116。因此，進(jìn)入通道1112的含有稀有細(xì)胞的血液被轉(zhuǎn)向左邊的出口通道1114(見B部分，0ms)。為引導(dǎo)液份1130進(jìn)入右邊的出口通道1115，螺線管活塞1120從位于流體通道1111的頂部的PDMS薄膜上被縮回，而螺線管活塞1121被按壓向位于流體通道1112的頂部的PDMS薄膜。這導(dǎo)致引導(dǎo)含有稀有細(xì)胞的血液的液份1130進(jìn)入右邊的出口通道1115 (C部分，5ms且D部分，10ms)。如所描述的， 使用螺線管活塞的液份重引導(dǎo)只需要5ms的很少時(shí)間。K.示例 11圖12的A部分示出用于用在節(jié)點(diǎn)1240聚集的五個(gè)液體通道(1211、1212、1213、 1214和121 把懸浮液分成液份的設(shè)備1210。流體通道1211、1212、1213帶著液體流向節(jié)點(diǎn)1對(duì)0，而流體通道1214和1215帶著液體離開節(jié)點(diǎn)1240。螺線管活塞1220連接至接口 1216，接口 1216經(jīng)由管道1221與通道1211流體相通，而螺線管活塞1222連接至接口 1217， 接口 1217經(jīng)由管道1223與通道1212流體相通。用電或者計(jì)算機(jī)信號(hào)(如，TTL信號(hào))來致動(dòng)螺線管閥門1220和1222關(guān)閉或打
31開。當(dāng)螺線管閥門1220被關(guān)閉而螺線管閥門1222保持打開的時(shí)候，位于入口通道1213中的含有稀有細(xì)胞的血液的液份1260被轉(zhuǎn)向左邊的出口通道1214 (見B部分，Oms)。當(dāng)螺線管閥門1220被打開而螺線管閥門1222保持關(guān)閉的時(shí)候，位于入口通道1213中的含有稀有細(xì)胞的血液的液份1260被轉(zhuǎn)向右邊的出口通道1215(見C部分，2ms)。使用螺線管閥門 1220和1222的組合的液份重導(dǎo)向可在2ms的很少的時(shí)間內(nèi)將液份從一個(gè)通道引導(dǎo)到另一個(gè)通道。L.示例 12為了測(cè)試eDAR設(shè)備的性能，根據(jù)如下步驟制備血液和癌細(xì)胞的混合物用20μ L 的熒光EpCAM抗體來標(biāo)記lxlOE6/mL MCF-7細(xì)胞。然后用Isoton血球稀釋液將這個(gè)細(xì)胞混合物稀釋為lxlOE5cellS/mL。然后將10 μ L這種被稀釋的細(xì)胞混合物添加到2mL全部人血中，并流過分液份的(aliquoting)設(shè)備。除非另有表示，在分液份的設(shè)備中的流速標(biāo)準(zhǔn)地為30 μ L/分鐘。圖13示出從2個(gè)雪崩光電二極管(APD)收集來的熒光信號(hào)，這2個(gè)雪崩光電二極管位于節(jié)點(diǎn)1116(或者1240)上游和上游不同位置。曲線1310示出來自一個(gè)APD的軌跡 1311，所述一個(gè)APD配置為探測(cè)探測(cè)容積1140(或1270)處的液份中EpCAM分子的存在，而曲線1320示出來自配置為探測(cè)頻道1114(或1214)中的EpCAM分子的存在的第二個(gè)APD 的信號(hào)軌跡1321。信號(hào)峰值1312基本符合信號(hào)峰值1322，指示液份的分通道是正確的，導(dǎo)致較高的稀有細(xì)胞的再現(xiàn)率。為了進(jìn)一步調(diào)查eDAR設(shè)備的性能，計(jì)數(shù)被轉(zhuǎn)向正確的流動(dòng)通道的癌細(xì)胞的數(shù)量并隨后對(duì)其收集(“再現(xiàn)”)，同時(shí)調(diào)整螺線管閥門(1220、1222)或活塞(1120、1121)保持關(guān)閉或打開的時(shí)間長度(“脈沖長度”)。通過將收集在正確通道中的稀有細(xì)胞的數(shù)量來除以位于探測(cè)容積1140或1270的APD所探測(cè)的稀有細(xì)胞的數(shù)量而計(jì)算再現(xiàn)百分比。圖14的曲線1410，示出使用eDAR隨脈沖長度而變化的所再現(xiàn)到的癌細(xì)胞的百分比。軌跡1420示出當(dāng)脈沖寬度為IOms或以下的時(shí)候，在正確的頻道中收集到100%的癌細(xì)胞。當(dāng)脈沖寬度上升，軌跡1420下降，表示一些細(xì)胞落在了錯(cuò)誤的通道中。通過調(diào)節(jié)進(jìn)入通道1113(或1213)的流速，我們還可觀察到可優(yōu)化再現(xiàn)。圖15示出帶有軌跡1520的曲線1510，軌跡1520示出隨進(jìn)入流速而變化的再現(xiàn)到的稀有細(xì)胞的百分比。當(dāng)流速在30yL/分鐘以下的時(shí)候，再現(xiàn)率位于89-100%之間。然而，隨著流速增加， 再現(xiàn)率下降，指示越來越多的稀有細(xì)胞丟失到了錯(cuò)誤的通道中。應(yīng)該理解，本文描述的示例和實(shí)施例是僅用于解說的目的，并且按照這些示例和實(shí)施例的各種變形和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是被暗示了的，且包括在本申請(qǐng)的精神實(shí)質(zhì)和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。如此處引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過引用通用地整體結(jié)合于此。
權(quán)利要求
1.用于探測(cè)在液體樣本中的稀有顆粒的方法，所述方法包括如下步驟(a)探測(cè)所述液體樣本的液份中稀有顆粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有顆粒的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(c)基于所分配的值而引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)或收集。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，探測(cè)所述稀有顆粒的存在的步驟包括如下子步驟(i)在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為包括所述探測(cè)試劑和稀有顆粒的混合物的條件下使所述液體樣本與探測(cè)試劑接觸；以及( )探測(cè)在所述液體樣本的液份中，在步驟(i)中所形成的混合物的存在或不存在。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，探測(cè)所述稀有顆粒的存在的步驟包括如下子步驟(i)用電磁輻射的外部源來詢查所述液份；以及 ( )探測(cè)所述稀有顆粒的熒光。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，探測(cè)稀有顆粒的存在的步驟包括探測(cè)所述稀有顆粒的生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光。
5.如權(quán)利要求1到4中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，所述稀有顆粒是稀有細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1到5中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，所述液份含有多于一個(gè)稀有顆粒。
7.如權(quán)利要求1到6中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，所述液體樣本是生物液體。
8.如權(quán)利要求1到7中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，所述液體樣本同時(shí)地接觸多個(gè)可區(qū)分的探測(cè)試劑，每一個(gè)探測(cè)試劑在足以將所述多個(gè)探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為包含所述探測(cè)試劑和多個(gè)稀有顆粒的混合物的條件下具有不同的特異性。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，同時(shí)地探測(cè)所述多個(gè)混合物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述探測(cè)試劑可由不同波長的熒光區(qū)分。
11.如權(quán)利要求1到10中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，如果所述液份含有稀有顆粒則分配第一值給所述液份，或者如果所述液份沒有含有稀有顆粒則分配第二值給所述液份。
12.如權(quán)利要求1到10中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，所述第一值取決于所述稀有顆粒的識(shí)別性或者所述液份中所述稀有顆粒的濃度。
13.如上述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，具有同樣的所分配的值的多個(gè)液份被聚集在一起。
14.如權(quán)利要求1到13中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，在所述生物樣本連續(xù)流過流動(dòng)通道的過程中執(zhí)行所述探測(cè)步驟。
15.如權(quán)利要求1到13中任一個(gè)所述的方法，其特征在于，在所述探測(cè)步驟之前，物理地分開所述液體樣本的多個(gè)液份。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在所述探測(cè)步驟之前，所述液份被分到獨(dú)立的流動(dòng)通道或腔體中。
17.對(duì)于與生物液體中稀有顆粒的存在相關(guān)聯(lián)的狀況為對(duì)象提供診斷或預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟(a)在適于將探測(cè)試劑轉(zhuǎn)換為包括所述探測(cè)試劑和稀有顆粒的混合物的條件下使來自對(duì)象的生物學(xué)液體與探測(cè)試劑接觸；(b)探測(cè)在生物學(xué)液體的液份中在步驟(a)中所形成的混合物的存在或不存在；(c)基于在步驟(a)中形成的混合物的存在或不存在而分配值給所述液份；以及(d)基于所分配的值而提供診斷或預(yù)后給所述對(duì)象。
18.用于探測(cè)液體樣本中的稀有顆粒的裝置，所述設(shè)備包括(a)至少第一輸入通道；(b)至少兩個(gè)出口通道；(c)能探測(cè)所述液體樣本的液份中一個(gè)或多個(gè)稀有顆粒的至少一個(gè)探測(cè)器；(d)用于引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)的機(jī)制；以及(e)能基于所述液份中所述稀有顆粒的存在、不存在、識(shí)別性、成分或量而分配值給所述液份的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)與所述探測(cè)器和用于引導(dǎo)所述液份的流動(dòng)的機(jī)制相通fn °
19.如權(quán)利要求18所述的裝置，其特征在于，如果液份含有稀有顆粒，所述機(jī)制引導(dǎo)液份流動(dòng)到第一出口通道，或，如果液份沒有含有稀有顆粒，所述機(jī)制引導(dǎo)液份流動(dòng)到第二出 □通道。
20.如權(quán)利要求18或19所述的裝置，其特征在于，所述機(jī)制，取決于稀有顆粒的識(shí)別性、成分或量，而引導(dǎo)含有稀有顆粒的液份流到多個(gè)出口通道的一個(gè)中。
21.如權(quán)利要求18到20所述的任一個(gè)裝置，其特征在于，所述用于引導(dǎo)液份的流動(dòng)的機(jī)制包括電極、磁性元件、聲學(xué)元件或電致動(dòng)的元件。
22.如權(quán)利要求18到20所述的任一個(gè)裝置，其特征在于，用于引導(dǎo)液份的流動(dòng)的機(jī)制包括一個(gè)或多個(gè)電致動(dòng)的閥門或活塞，其中所述閥門或活塞在至少第一定向的流動(dòng)通道中控制液體的流動(dòng)，所述第一定向的流動(dòng)通道與所述第一輸入通道和所述兩個(gè)出口通道在第一節(jié)點(diǎn)處交匯。
23.如權(quán)利要求18到22所述的任一個(gè)裝置，其特征在于，所述探測(cè)器選自由以下組成的組照相機(jī)、電子倍增器、電荷耦合器件(CCD)圖像傳感器、光電倍增管(PMT)、雪崩二極管(APD)、單光子雪崩二極管(SPAD)以及互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CM0Q圖像傳感器。
24.如權(quán)利要求18到23所述的任一個(gè)裝置，其特征在于，所述裝置還包括用于詢查所述液份的電磁輻射源。
全文摘要
除了其他方面，此處提供的是用于從含有生物顆粒的懸浮液中分級(jí)液份的方法和裝置。在特定實(shí)施例中，生物顆粒可以是細(xì)胞、細(xì)胞器官、蛋白質(zhì)、DNA、生物起源物質(zhì)的碎片、覆有生物復(fù)合物的微珠或者病毒顆粒。這樣，可使用此處提供的方法和裝置來量化稀有細(xì)胞，諸如循環(huán)癌癥細(xì)胞、胎細(xì)胞和出現(xiàn)在體液中其他稀有細(xì)胞，用于疾病診斷、預(yù)后或治療。
文檔編號(hào)G01N35/08GK102460154SQ201080026397
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者D·T·趙, J·S·郭, P·G·斯基羅 申請(qǐng)人:華盛頓大學(xué)