專利名稱：用于表達(dá)mphosph1或depdc1多肽的癌癥的肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2006年10月17日提交的美國臨時申請?zhí)?0/852，575的權(quán)益，將其全部內(nèi)容通過提述并入本文。本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及癌癥治療領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及可充當(dāng)及其有效的癌癥疫苗的新肽，還涉及用于治療和預(yù)防的腫瘤的含此類肽的藥物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明了⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識別呈遞在I類MHC分子上的、源自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，并且使腫瘤細(xì)胞溶解。自從作為首個TAA實例的MAGE家族的發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)使用免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA(Boon T. (1993) Int JCancer54:177-80. ；Boon T.等，(1996)J Exp Med 183:725-9. ；van der Bruggen P等，(1991)Science 254:1643-7. ；Brichard V 等，(1993)J Exp Med 178:489-95.；Kawakami Y等，(1994) J Exp Med 180:347-52·)。它們中的一些目前正在臨床開發(fā)中被當(dāng)作免疫治療的祀標(biāo)。迄今為止發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE (van der Bruggen P等，(1991) Science254:1643-7·)、gp 100 (Kawakami Y 等，(1994) J Exp Med 180:347-52. )、SART (Shichi joS 等，(1998) J Exp Med 187:277-88·)、和 NY-ESO-1 (Chen Y. T.等，(1997) Proc. Natl.Acd. Sci. USA，94:1914-8.)。另一方面，已經(jīng)證明，某些已顯示在腫瘤細(xì)胞中以某種程度特異性地過表達(dá)的基因產(chǎn)物被識別為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。這些基因產(chǎn)物包括p53 (Umano Y 等，(2001)Br J Cancer, 84:1052-7.), HER2/neu (Tanaka H 等，(2001)Br JCancer, 84:94-9.)、CEA (Nukaya I 等，(1999) Int. J. Cancer 80,92-7·)等等。盡管關(guān)于TAA的基礎(chǔ)和臨床研究取得了顯著進(jìn)展(Rosenberg SA等，(1998)Nature Med, 4:321-7. ；Mukherji B.等，(1995)Proc Natl Acad Sci USA, 92:8078-82. ；HuX等，(1996) Cancer Res, 56:2479-83.)，然而目前可用的適合于癌癥治療的候選TAA數(shù)非常有限。在癌細(xì)胞中大量表達(dá)并且其表達(dá)限定于癌細(xì)胞的TAA將有望成為免疫治療靶標(biāo)的候選。HLA-A24和HLA-A0201均是日本人和白人的群體中普通的HLA等位基因(Date Y等，(1996)Tissue Antigens 47:93-101. ；Kondo A 等，(1995) J Tmmunol 155:4307-12.；Kubo RT 等，(1994) J Tmmunol 152:3913-24. ;Imanishi 等，Proceeding of the eleventhInternational Histocompatibility Workshop and Conference Oxford UniversityPress,Oxford, 1065(1992) !Williams F 等，(1997)Tissue Antigen49:129-33.)。 因此，由這些HLA等位基因呈遞的癌癥的抗原肽可能在日本人和白人患者的癌癥治療中有特定效用。另外，已知曝露于高濃度的肽通常可導(dǎo)致低親和力CTL的體外誘導(dǎo)，在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上生成高水平的特異性肽/MHC復(fù)合物，這些復(fù)合物能夠有效活化所述CTL(Alexander-Miller 等，(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:4102-7·)。近來由于cDNA微陣列技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建與正常細(xì)胞比較的惡性細(xì)胞的基因表達(dá)綜合譜已經(jīng)成為了可能(Okabe, H.等，(2001) Cancer Res. , 61, 2129-37. ；LinYM.等，(2002) Oncogene, 21; 4120-8. ；Hasegawa S.等，(2002) Cancer Res 62:7012-7·)。這種手段使人們能夠了解癌細(xì)胞的復(fù)雜性質(zhì)和癌發(fā)生的機制，并能更容易地鑒定出腫瘤中表達(dá)失調(diào)的基因(Bienz M.等，(2000)Cell 103,311-20.)。在已被鑒定為在癌癥中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中，MPH0SPHI (M 期憐蛋白 I (M-phase phosphoproteinl) ;GenBank 登錄號NM_016195 ；SEQ ID Nos. I, 2)和 DEPDCl (含 DEP 結(jié)構(gòu)域的蛋白 I (DEP domain containingI) ;GenBank 登錄號 BM683578)是新近發(fā)現(xiàn)的。參見 WO 2004/031413、W02006/085684 和W02007/013，665，將它們的全部內(nèi)容通過提述并入本文。人們已經(jīng)描述了 DETOCl的兩種不同轉(zhuǎn)錄變體，即 DEPDCl Vl (SEQ ID No. 3, 4)和 DEPDCl V2 (SEQ ID No:5，6)。已經(jīng)證明了這些基因在所分析病例的不同癌組織的腫瘤細(xì)胞中特異性地上調(diào)(見下文)；然而，Northern印跡分析證明這些基因產(chǎn)物不存在于正常生命器官中(參見PCT/JP2006/302684)。由于源 自MPH0SPH1和DEroCl的免疫原性肽可能可以用來殺傷表達(dá)這些抗原的腫瘤細(xì)胞，所以發(fā)明人對這些基因特別有興趣。由于細(xì)胞毒性藥物諸如M-VAC經(jīng)常引起嚴(yán)重副作用，所以顯然基于充分了解的作用機制精心選擇新的靶分子對于開發(fā)將不良副作用風(fēng)險最小化的有效抗癌藥物是重要的。為了這個目的，發(fā)明人先前對多種癌癥和正常人組織進(jìn)行了表達(dá)譜分析，并且發(fā)現(xiàn)了在癌癥中特異性過表達(dá)的多種基因(Lin YM,等，Oncogene. 2002 Jun 13; 21:4120-8.；Kitahara O,等，Cancer Res.2001Mayl;61:3544-9. ；Suzuki C,等，Cancer Res. 2003Nov I; 63:7038-41. ; Ashida S, Cancer Res. 2004 Sep I; 64:5963-72. ；0chi K,等，Int JOncol. 2004Mar;24(3):647-55. ；Kaneta Y,等，Int J Oncol. 2003 Sep;23:681-91. ；ObamaK, Hepatology. 2005 Jun;41:1339-48. ；Kato T,等，Cancer Res. 2005 Jull;65:5638-46.；Kitahara 0,等，Neoplasia. 2002 Jul-Aug;4:295-303. ；Saito-Hisaminato A 等，DNA Res2002,9:35-45·)。其中，MPH0SPH1(內(nèi)部編號 C2093)和 DEPDCl (內(nèi)部編號 B5860N)是經(jīng)鑒定在多種癌癥中過表達(dá)的基因。特別地，MPH0SPH1被鑒定為在膀胱癌(bladder cancer)、乳腺癌(breast cancer)、宮頸癌(cervical cancer)、膽管細(xì)胞癌(cholangincellularcarcinoma)、CML、結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer)、胃癌(gastric cancer)、NSCLC、淋巴瘤(lymphoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、前列腺癌(prostate cancer)、腎癌(renalcarcinoma)、軟組織腫瘤(soft tissue tumor)中過表達(dá)。類似地，DEF1DCl被鑒定為在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、SCLC、軟組織腫瘤中過表達(dá)。MPH0SPH1早先被鑒定為在G2/M過渡時被特異性磷酸化的蛋白質(zhì)之一，并且被表征為正端導(dǎo)向的驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白(plus-end-directed kinesin related protein)(Abaza A等，J Biol Chem 2003, 278:27844-52.) 更具體地說，先前已經(jīng)有文獻(xiàn)記載MPH0SPHI是一種正端導(dǎo)向的分子馬達(dá)(plus-end-directed molecular motor),它在胞質(zhì)分裂中扮演重要角色，并且在HeLa細(xì)胞中在分裂后期至分裂末期的過程中在紡錘體的中間區(qū)積累(Abaza A 等，J Biol Chem 2003，278:27844-52 ;Kamimoto T 等，J Biol Chem2001, 276:37520-8) MPHOSPH1 cDNA編碼一種1780個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成NH2-驅(qū)動蛋白馬達(dá)結(jié)構(gòu)域(NH2_kinasin motor domain)、中心卷曲螺旋-莖結(jié)構(gòu)域(central coiled coil-stalk domain)、和 C-球形尾部結(jié)構(gòu)域(C-globular taildomain)。同時，這些數(shù)據(jù)提示MPH0SPH1是NH2型驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白。關(guān)于DETOC1，尚不清楚它的功能。這種蛋白質(zhì)中包含的DEP結(jié)構(gòu)域同樣存在于Disheve 11 ed> Egl-IO 和 Pleckstrin 中。果妮(Drosophila) Dishevelled 中的 DEP 結(jié)構(gòu)域在拯救平面極性缺陷(planar polarity defect)和誘導(dǎo)JNK信號傳導(dǎo)中扮演重要角色；然而，它在人類中的功能尚不清楚。但是，如PCT/JP2006/302684所披露的，DEPDCl siRNA能夠抑制癌細(xì)胞的生長。這些結(jié)果證明DEroci在大多數(shù)癌細(xì)胞的生長中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，已經(jīng)確定MPH0SPH1 (M期磷蛋白I)和DETOCl (含DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白I)在多種癌癥中上調(diào)。更具體地，利用以全基因組cDNA微陣列進(jìn)行的基因表達(dá)譜分析(geneexpression profiling)鑒定了這些基因。如上文所討論的，已經(jīng)證明了 MPH0SPH1和 DEPDCl的表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞中特異性地上調(diào)，包括肺癌和膀胱癌。如表I中所述，證明了MPH0SPH1的表達(dá)在31例膀胱癌的30例中，36例乳腺癌的8例中，全部18例宮頸癌中，17例膽管細(xì)胞癌的5例中，31例CML的25例中，11例結(jié)腸直腸癌的6例中，14例胃癌的6例中，全部5例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，10例骨肉瘤的6例中，22例前列腺癌的7例中，18例腎癌的10例中和21例軟組織腫瘤的15例中有效升高(validly elevated)。同時，如表I中所述，證明了 DEroCl的表達(dá)在25例膀胱癌的23例中，在13例乳腺癌的6例中，全部12例宮頸癌中，全部6例膽管細(xì)胞癌中，4例CML的3例中，4例結(jié)腸直腸癌的2例中，全部6例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，14例骨肉瘤的10例中，24例前列腺癌的11例中，全部14例SCLC中和31例軟組織瘤的22例中有效升高。本發(fā)明基于，至少部分地基于對這些基因的基因產(chǎn)物(MPH0SPH1和DETOCl)的特異性表位肽的鑒定，所述特異性表位肽能夠誘導(dǎo)對相應(yīng)分子有特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)。如下文將詳細(xì)討論的，使用源自MPH0SPH1或DETOCl的HLA_A*2402和HLA-A*0201結(jié)合性候選肽刺激健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。然后建立了針對用各種候選肽沖擊(pulse)過的HLA-A24或HLA-A2陽性靶細(xì)胞具有特定細(xì)胞毒性的CTL克隆和/或細(xì)胞系。這些結(jié)果證實這些肽是HLA-A24或HLA-A2限定性表位肽(HLA-A24 or HLA-A2restricted epitope peptides),其能夠誘導(dǎo)針對表達(dá)MPH0SPH1或DEF1DCl的細(xì)胞的強效且特異性的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防與MPH0SPH1和/或DETOCl的過表達(dá)相關(guān)的疾病，例如癌癥。這些方法包括向需要的受試者施用本發(fā)明的MPH0SPH1和/或DEroCl多肽。這類肽的施用導(dǎo)致抗腫瘤免疫性的誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)受試者體內(nèi)抗腫瘤免疫性的方法，這類方法包括向患者施用MPH0SPH1和/或DEroCl多肽的步驟；本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防與MPH0SPH1和/或DEroCl的過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的藥物組合物，所述組合物包括MPH0SPH1和/或DEroCl多肽。示例性癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、和軟組織腫瘤。
S卩，本申請包括以下實施方案，和它們的任意組合。[I] 一種具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽源自SEQ IDN0:2、4和6的氨基酸序列。[2]—種少于約15個氨基酸的分離的肽，其選自由包含SEQ ID N0:7、8或12的氨基酸序列的肽組成的群組；或一種具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽包含選自SEQ ID N0:7、8和12的氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸。[3]項[2]的具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中從N-末端起的第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。[4]項[2]的具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中C-末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
[5]—種少于約15個氨基酸的分離的肽，其選自由包含SEQ ID N0:9、10、ll、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、253、254 和 255 的氨基酸序列的肽組成的群組；或一種具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽包含選自SEQ ID N0:9、10、
11、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、253、254 和 255 的氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸。[6]項[5]的具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中從N-末端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。[7]項[5]的具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或
亮氨酸。[8] 一種載體，其中的DNA編碼[1]-[7]中任一項的肽。[9] 一種用于治療或預(yù)防與SEQ ID NO: 1、3和/或5所示基因的過表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物包含一種或多種[1]_[7]中任一項的肽。[10]項[9]的藥物組合物，其中所述疾病是癌癥。[11]項[10]的藥物組合物，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。[12] 一種外來體(exosome),其表面上呈現(xiàn)(present)包含[1]_[7]中任一項的肽以及HLA抗原的復(fù)合物。[13]項[12]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A24。[14]項[13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2402。[15]項[12]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2。[16]項[13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。[17] 一種誘導(dǎo)具有高的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括將抗原呈遞細(xì)胞與[1]_[7]中任一項的肽接觸的步驟。[18] 一種通過將T細(xì)胞與[1]_[7]中任一項的肽接觸來誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的方法。[19] 一種誘導(dǎo)具有高的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括將下述基因轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞的步驟，所述基因包含編碼[1]_[7]中任一項的肽的多核苷酸。
[20] 一種分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所述細(xì)胞是通過將T細(xì)胞與權(quán)利要求1-7中任一項的肽接觸而被誘導(dǎo)的，或者所述細(xì)胞是用下述核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)的，所述核酸編碼在HLA-A24或HLA-A2的背景下與權(quán)利要求1-7中任一項的肽結(jié)合的TCR亞基多肽。[21] 一種抗原呈遞細(xì)胞，所述細(xì)胞包含HLA抗原與[1]-[7]中任一項的肽之間形成的復(fù)合物。[22]項[21]的抗原呈遞細(xì)胞，所述細(xì)胞是通過項[17]的方法誘導(dǎo)的。[23] 一種用于抑制表達(dá)SEQ ID NO: 1、3和/或5的基因的細(xì)胞增殖的疫苗，其中所述疫苗包含[1]_[7]中任一項的肽作為活性成分。[24]項[23]的疫苗，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。[25]項[24]的疫苗，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。 [26]項[23]的疫苗，配制成用于向HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2的受試者施用。[27]—種治療或預(yù)防受試者中與SEQ ID NO: 1、3和/或5所示基因的過表達(dá)相關(guān)的疾病的方法，包括向所述受試者施用疫苗，所述疫苗包含一種或多種[1]_[7]中任一項的肽、所述肽的免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或其免疫學(xué)活性片段的多核苷酸。[28]項[27]的方法，其中所述疾病是癌癥。[29]項[28]的方法，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤?；蛘?本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的方法,包括將T細(xì)胞與通過項[19]的方法產(chǎn)生的抗原呈遞細(xì)胞接觸的步驟。在結(jié)合附圖和實施例閱讀以下詳述后，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應(yīng)該理解無論是前述的發(fā)明內(nèi)容還是下文的詳述均為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而非對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可供選擇的實施方案的限制。附圖簡述[圖I]圖IA描述的是用于篩選表位肽的IFN-Y ELISP0T測定法的結(jié)果，所述結(jié)果進(jìn)而證實MPH0SPHl-A24-9-278(SEQ ID NO: 7)是IFN-Y的強力生產(chǎn)者。根據(jù)下文實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自MPH0SHP1的那些肽的CTL。所示為得到的具有可檢測的特異性CTL活性的CTL。具體而言，與對照相比，4號孔中用MPH0SPH1-A24-9-278刺激的細(xì)胞顯示了可識別用肽沖擊過的(peptide pulsed)的祀細(xì)胞的強力IFN-Y產(chǎn)生。圖IB描述的是在有限稀釋(MPH0SPH1-A24-9-278CTL克隆)之后用于篩選CTL克隆的IFN-Y ELISP0T測定法的結(jié)果。擴增(expand)陽性孔中的細(xì)胞并且進(jìn)行有限稀釋。如所示結(jié)果所證實，建立了與針對未用肽沖擊的靶相比針對肽沖擊的靶具有較高的特異性CTL活性的CTL克隆。[圖2]圖2A描述的是用于篩選表位肽細(xì)胞毒性的IFN-Y ELISP0T測定法結(jié)果，所述結(jié)果進(jìn)而證實MPH0SPH1-A24-10-278(SEQ ID N0:8)是IFN-γ的強力生產(chǎn)者。根據(jù)下文實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自MPH0SHP1的那些肽的CTL。所示為得到的具有可檢測的特異性CTL活性的CTL。具體而言，與對照相比，8號孔中用MPH0SPH1-A24-10-278刺激的細(xì)胞顯示了強的IFN-Y產(chǎn)生。圖2B描述的是在有限稀釋(MPH0SPH1-A24-10-278CTL克隆)之后篩選CTL克隆的IFN- y ELI SPOT測定法的結(jié)果。擴增陽性孔中的細(xì)胞并且進(jìn)行有限稀釋。如所示結(jié)果所證實的，建立了與針對未用肽沖擊過的靶相比，針對經(jīng)MPH0SPH1-A24-10-278沖擊的靶具有較高特異性CTL活性的CTL克隆。[圖3]圖3A描述用MPH0SPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO: 7)刺激的CTL克隆的建立。這種CTL克隆展示出高度的針對用MPH0SPH1-A24-9-278沖擊的靶細(xì)胞(A24LCL)的特異性CTL活性，但是針對未用肽沖擊的相同的靶細(xì)胞(A24LCL)未顯示顯著CTL活性。圖3B描述用MPH0SPH1-A24-10-278 (SEQID NO: 8)刺激的CTL克隆的建立。這種CTL克隆展示出高度的針對用MPH0SPH1-A24-10-278沖擊的靶細(xì)胞的特異性CTL活性，而該克隆針對未用肽沖擊的相同靶細(xì)胞(A24LCL)未顯示顯著CTL活性。R表示應(yīng)答物CTL克隆。 S表示刺激物用肽沖擊過的A24-LCL (IxlO4/孔)。[圖4]圖4 描述 MPH0SPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO: 7)在具有 HLA-A24 的靶細(xì)胞表面的表達(dá)。使用由MPH0SPH1-A24-9-278激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆作為效應(yīng)細(xì)胞，測定了針對用全長MPH0SPH1基因和HLA-A*2402分子二者共同轉(zhuǎn)染的C0S7的特異性CTL活性。制備用全長MPH0SPH1轉(zhuǎn)染但不用HLA-A*2402轉(zhuǎn)染的C0S7和用HLA_A*2402轉(zhuǎn)染但不用全長MPH0SPH1轉(zhuǎn)染的C0S7作為對照。CTL克隆針對用MPH0SPH1和HLA-A24 二者共同轉(zhuǎn)染的C0S7展示出高度的特異性CTL活性。然而，該克隆針對未用MPH0SPH1或HLA-A24 (neither MPH0SPH1nor HLA-A24)轉(zhuǎn)染的C0S7未顯示顯著特異性CTL活性。R表示應(yīng)答物CTL克隆。S表示刺激物C0S7轉(zhuǎn)染子(IxlO4/孔)。[圖5]圖5描述的是針對內(nèi)源表達(dá)MPH0SPH1的膀胱癌細(xì)胞系的CTL活性。用MPH0SPH1-A24-9-278肽誘導(dǎo)建立的CTL克隆識別內(nèi)源表達(dá)MPH0SPH1的腫瘤細(xì)胞。HT1376、RT-4和J82細(xì)胞分別內(nèi)源表達(dá)MPH0SPH1。CTL克隆針對具有HLA_A*2402基因型的HT1376顯示了 IFN-Y的產(chǎn)生，但是針對非HLA-A*2402基因型的RT-4和J82未顯示應(yīng)答。[圖6]圖6描述的是使用MPH0SPH1-A24-9-278肽進(jìn)行的體內(nèi)免疫原性分析。在第O天和第7天向BALB/c小鼠皮下注射用IFA綴合的肽。在第14天，收集接種過的小鼠的脾細(xì)胞并用作應(yīng)答細(xì)胞(responder cell)，并且使用IxlO4個用MPH0SPH1-A24-9-278肽沖擊過的RLmalel細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(stimulator cell)來進(jìn)行IFN-Y ELI SPOT測定。標(biāo)明了每只小鼠的點形成計數(shù)(spot forming counts) (SFC);為五只小鼠(Anil Ani5)接種表位肽，為三只小鼠(negal"nega3)注射模擬物IFA乳劑作為陰性對照。[圖7]圖7描述的是篩選表位肽的IFN- Y ELISP0T測定的結(jié)果，該結(jié)果進(jìn)而證實 MPH0SPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO: 9)、MPH0SPH1-A2-9-638 (SEQ ID NO:10)和MPH0SPH1-A2-10-1714(SEQ ID NO: 11)具有強力的IFNi產(chǎn)生活性。根據(jù)下文所列實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自MPH0SHP1的那些肽的CTL。所示為得到的具有可檢測的特異性CTL活性的CTL。具體而言，圖7A證實與對照相比用MPH0SPH1-A2-9-282刺激的I號和5號孔中的細(xì)胞顯示了足以識別用肽沖擊的靶細(xì)胞的強力的IFN- Y產(chǎn)生。圖7B證實與對照相比用MPH0SPH1-A2-9-638刺激的8號孔中的細(xì)胞顯示了足以識別用肽沖擊過的靶細(xì)胞的強力的IFN-Y產(chǎn)生。圖7C證實與對照相比用MPH0SPH1-A2-10-1714刺激的4號孔中的細(xì)胞顯示了可識別用肽沖擊過的靶細(xì)胞的強力的IFN-Y產(chǎn)生。[圖8]圖 8 描述的是用 MPH0SPH1-A02-9-282、(SEQ ID NO: 9) MPH0SPH1-A02-9-638 (SEQID NO: 10)和 MPH0SPH1-A02-10-1714 (SEQ ID NO: 11)刺激的 CTL 細(xì)胞系的建立。擴增陽性孔中的細(xì)胞，并且如所述結(jié)果所示，建立了這樣的CTL細(xì)胞系，所述細(xì)胞系針對用 MPH0SPH1-A02-9-282 沖擊的靶(A)、用 MPH0SPH1-A02-9-638 沖擊的靶(B)或用MPH0SPH1-A02-10-1714沖擊的靶(C)具有更高的特異性CTL活性(相比于針對未用肽沖擊的靶的活性)。 R表示應(yīng)答物CTL細(xì)胞系。S表示刺激物用肽沖擊過的T2 (IxlO4個/孔)。[圖9]圖9A描述在有限稀釋(MPH0SPH1-A2-9-282CTL克隆)之后用于篩選CTL克隆的IFN-Y ELISP0T測定的結(jié)果。擴增陽性孔中的細(xì)胞并且進(jìn)行有限稀釋。如所述結(jié)果所示，建立了這樣的CTL克隆，所述CTL克隆針對用MPH0SPHl-A2-9-282(SEQ ID N0:9)沖擊的靶的特異性CTL活性高于針對未用肽沖擊的靶的活性。圖9B描述的是用MPH0SPH1-A02-9-282刺激的CTL克隆的建立。所述CTL克隆針對用MPH0SPH1-A2-9-282沖擊的靶細(xì)胞(T2)展示出高度的特異性CTL活性，但是針對未用肽沖擊的相同靶細(xì)胞(T2)無顯著CTL活性。R表示應(yīng)答物CTL克隆。S表示刺激物用肽沖擊過的T2 (IxlO4/孔)。[

圖10]圖IOA描述的是用于篩選表位肽的IFN-Y ELISP0T測定的結(jié)果，該結(jié)果進(jìn)而證實DEPDCl-A24-9-294(SEQ ID NO: 12)是強的IFN-Y生產(chǎn)者。根據(jù)下文所列實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自DEroci的那些肽的CTL。所示為得到的表現(xiàn)出可檢測的特異性CTL活性的CTL。用DEroCl-A24-9-294刺激的10號孔中的細(xì)胞與對照相比顯示了可識別用肽沖擊過的靶細(xì)胞的強的IFN-Y生產(chǎn)。圖IOB描述的是在有限稀釋之后(DEroCl-A24-9-294CTL克隆)篩選CTL克隆的IFN- y ELI SPOT測定的結(jié)果。擴增陽性孔中的細(xì)胞并且進(jìn)行有限稀釋。如所述結(jié)果所示，建立了這樣的CTL克隆，所述CTL克隆針對用DEroCl-A24-9-294沖擊的靶的特異性CTL活性高于針對未用肽沖擊過的靶的活性。[圖11]圖11描述的是用DEPDCl-A24-9-294(SEQ ID NO: 12)刺激的CTL克隆的建立。所述CTL克隆顯示出高度的針對用DEroCl-A24-9-294沖擊過的靶細(xì)胞(A24LCL)的特異性CTL活性，而針對未用肽沖擊的相同靶細(xì)胞(A24LCL)未顯示顯著CTL活性。R 表示應(yīng)答物DEPDC-A24-9-294CTL 克隆。
S表示刺激物用肽沖擊的A24-LCL (IxlO4個/孔)。[圖12]圖12 描述的是具有 HLA-A24 的靶細(xì)胞表面上 DEPDC1-A24-9-294(SEQID NO: 12)的表達(dá)。使用由DEH)Cl-A24-9-294激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆作為效應(yīng)細(xì)胞，測定了針對用全長DEPDCl基因和HLA-A*2402分子二者共同轉(zhuǎn)染的C0S7的特異性CTL活性。制備了用全長DEPDCl轉(zhuǎn)染但不用HLA-A*2402轉(zhuǎn)染的C0S7和用HLA_A*2402轉(zhuǎn)染但不用全長DETOCl轉(zhuǎn)染的C0S7作為對照。建立的CTL克隆針對用DEroCl和HLA-A24 二者共同轉(zhuǎn)染的C0S7展示出高度的特異性CTL活性。然而，該克隆針對未用DEroCl或HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7未顯示顯著的特異性CTL活性。R 表示應(yīng)答物DEP-A24-9-294CTL 克隆。S表示刺激物C0S7轉(zhuǎn)染子(IxlO4個/孔)。
[圖13]圖13描述的是針對內(nèi)源表達(dá)DEroCl的膀胱癌細(xì)胞系的CTL活性。用DEPDC1-A24-9-294 妝誘導(dǎo)的建立的 CTL 克隆(established CTL clone induced withDEPDC1-A24-9-294 peptide)識別內(nèi)源表達(dá) DEPDCl 的腫瘤細(xì)胞。HT1376、RT_4 和 J82 細(xì)胞分別內(nèi)源表達(dá)DEroCl。所述CTL克隆針對具有HLA-A*2402基因型的HT1376顯示了 IFN-Y的產(chǎn)生，但是針對非HLA-A*2402基因型的RT-4和J82未顯示應(yīng)答。[圖14]圖14描述的是使用DEroCl-A24-9_29肽進(jìn)行的體內(nèi)免疫原性分析。在第O天和第7天向BALB/c小鼠皮下注射用IFA綴合的肽。在第14天，收集接種過的小鼠的脾細(xì)胞并用作應(yīng)答細(xì)胞，并且使用IxlO4個用DEroCl-A24-9-294肽沖擊過的RLmalel細(xì)胞作為刺激細(xì)胞來進(jìn)行IFN-Y ELISP0T測定。標(biāo)明了每只小鼠的點形成計數(shù)(SFC);為五只小鼠(Αη " η 5)接種表位肽，為兩只小鼠(negal和nega2)注射模擬物IFA乳劑作為陰性對照。[圖15]圖15描述了用于篩選表位肽的IFN-Y ELISP0T測定中DEPDC1-A02-10-644、-10-575、-10-506、-10-765、-10-395、-10-224、-9-297、-10-296 和-10-302 的強力 IFN-Y 產(chǎn)生。以“材料和方法”中描述的方式生成了針對源自DEroci的那些肽的CTL。與對照相比，用DEroCl-A02-10-644刺激的4號和7號孔中的細(xì)胞，用DEroCl-A02-10_575刺激的2號孔中的細(xì)胞，用DEroCl-A02-10-506刺激的7號孔中的細(xì)胞，用DEroCl-A02-10_765刺激的I號孔中的細(xì)胞和用DEroCl-A02-10-395刺激的I號孔中的細(xì)胞，用DEroCl-A02-10_224刺激的I號和2號孔中的細(xì)胞，用DEroCl-A02-9-297刺激的4號孔中的細(xì)胞，用DEPDC1-A02-10-296刺激的3號和4號孔中的細(xì)胞和用DEroCl-A02-10_302刺激的2號、3號、5號和7號孔中的細(xì)胞顯不了強力的IFN-Y產(chǎn)生。[圖16]圖16描述的是用DEPDC1-A02-10-296肽生成的CTL細(xì)胞系的IFN- Y產(chǎn)生。通過DEroCl-A02-10-296肽激發(fā)產(chǎn)生的建立的CTL細(xì)胞系具有強力的IFN-Y產(chǎn)生活性。該圖顯示，針對用肽刺激的靶細(xì)胞產(chǎn)生了 IFN-Y，但是針對未用肽刺激的靶細(xì)胞未顯示IFN-Y產(chǎn)生。使用的靶細(xì)胞是在細(xì)胞表面表達(dá)HLA-A2分子的T2細(xì)胞。
[圖17]圖17描述的是針對內(nèi)源表達(dá)DEroCl和HLA-A2分子的靶的CTL活性。上方圖中顯示的是，用DEroCl-A02-10-296肽產(chǎn)生的、建立的CTL細(xì)胞系，針對內(nèi)源表達(dá)DETOC1V2和HLA-A2的靶細(xì)胞具有IFN-Y產(chǎn)生活性。使用DEroCl-A02-10_296肽的情況在下方圖中顯示。制備了用DEPDC1V1-9-674或DEP-9-462肽刺激的、僅表達(dá)DEPDC1V2和僅表達(dá)HLA-A2的靶細(xì)胞，作為陰性對照。靶細(xì)胞是從穩(wěn)定表達(dá)HLA-A2或模擬物(mock)的HEK293轉(zhuǎn)染子制備的。[圖18]圖18描述的是病例2中的抗原表達(dá)。在病例2中，MPH0SPH1和DETOCl均強力表達(dá)。因此，接種了源自MPH0SPH1和DEroCl的兩類表位肽。[圖19]
圖19描述的是對病例2中膀胱癌局部復(fù)發(fā)的臨床評估。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)評估病例2為SD0[圖20]圖20描述的是病例3中的抗原表達(dá)。在病例3中，DEPDCl強力表達(dá)。因此，我們僅接種了源自DEroci的表位肽。[圖21]圖21描述的是對病例3中轉(zhuǎn)移性肺右葉的臨床評估。在接種之后進(jìn)展速度被降低。特別的是，腫瘤大小在第三個療程之后減小。[圖22]圖22描述的是對病例3中轉(zhuǎn)移性肺左葉的臨床評估。進(jìn)展速度在接種之后被降低。特別的是，腫瘤大小在第三個療程之后減小。[圖23]圖23描述的是病例3中的抗腫瘤效果。在接種之后轉(zhuǎn)移性腫瘤的進(jìn)展速度被降低。[圖24]圖24描述的是病例3中的特異性CTL應(yīng)答。在接種之后強烈地表現(xiàn)特異性CTL應(yīng)答。[圖25]圖25描述的是病例4中的抗原表達(dá)。在病例4中，MPH0SPH1和DETOCl被表達(dá)。因此，接種了源自MPH0SPH1和DEroCl的兩種表位肽。[圖26]圖26描述的是對病例4中膀胱癌局部復(fù)發(fā)的臨床評估。在第一接種療程之后，根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)腫瘤大小降低了 20%。發(fā)明詳述除非另有特定的說明，本說明書中使用的術(shù)語“一個(a)”或“一種(an)”和“該/所述(the)”是指至少一個或至少一種。除非另有定義，本說明書中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意思與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的意思相同。
新的TAA的鑒定，特別是對誘導(dǎo)強力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的那些TAA的鑒定，為人們進(jìn)一步開發(fā)肽接種策略在多種類型的癌癥中的臨床應(yīng)用提供了保證(Boon T等，(1996) J Exp Med 183:725-9. ；van der Bruggen P 等，(1991) Science 254:1643-7.；Brichard V 等，(1993) J Exp Med 178:489-95. ；Kawakami Y 等，(1994) J Exp Med180:347-52. ；Shichi jo S 等，(1998) J Exp Med 187:277-88. ；Chen YT 等，(1997) Proc.Natl. Acd. Sci. USA, 94:1914-8. ；Harris CC, (1996)J Natl Cancer Inst 88:1442-55.；Butterfield LH 等，(1999)Cancer Res59:3134-42. ；Vissers JL 等，(1999)Cancer Res59:5554-9. ；van der Burg SH 等，(1996) J. Immunol 156:3308-14. ；Tanaka F 等，(1997)Cancer Res57:4465-8. ；Fujie T 等，(1999)Int J Cancer 80:169-72. ；Kikuchi M等，(1999)Int J Cancer 81:459-66. ；0iso M 等，(1999)Int J Cancer81:387-94.)。如上所述，人們先前使用cDNA微陣列技術(shù)確定了 MPH0SPH1(M期磷蛋白I ;GenBank登錄號 NM_016195 ;SEQ ID Nos. I, 2)和 DEPDCl (含 DEP 結(jié)構(gòu)域的蛋白 I ;GenBank 登錄號BM683578)，更具體而言是它的兩種變體 DEPDC1V1 (SEQ ID Nos. 3，4)和 DEPDC1V2 (SEQID No. 5，6)在多種癌癥中過表達(dá)。MPH0SPH1先前被鑒定為G2/M過渡時被特異性磷酸化的蛋白質(zhì)之一，并且被表征為正端導(dǎo)向的驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白(Abaza A等，J Biol Chem 2003，278:27844-52.)。更具體地，先前已經(jīng)有文獻(xiàn)記載MPH0SPH1是一種正端導(dǎo)向的分子馬達(dá)，在胞質(zhì)分裂中扮演重要角色，并且在HeLa細(xì)胞中在分裂后期至分裂末期的過程中在紡錘體的中間區(qū)積累(Abaza A 等，J Biol Chem 2003，278:27844-52; Kamimoto T 等，JBiol Chem 2001, 276:37520-8.)。MPHOSPHlcDNA 編碼一種 1780 個氨基酸的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成NH2-驅(qū)動蛋白馬達(dá)結(jié)構(gòu)域(NH2_kinasin motor domain),中心卷曲螺旋-莖結(jié)構(gòu)域，和C-球形尾部結(jié)構(gòu)域。這些數(shù)據(jù)提示MPH0SPH1是NH2型驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白。DEF1DCl 蛋白的功能尚不清楚。在 Dishevelled、Egl-ΙΟ 和 Pleckstrin 中發(fā)現(xiàn)了這種蛋白質(zhì)中包括的DEP結(jié)構(gòu)域。具體而言，果蠅Dishevelled中的DEP結(jié)構(gòu)域在平面極性缺陷的拯救和JNK信號傳導(dǎo)的誘導(dǎo)中扮演重要角色；然而，它在人類中的功能尚不清楚。但是，如PCT/JP2006/302684中所公開的，DEPDCl (內(nèi)部編號B5860N)具有由12和11個外顯子組成的兩種不同的轉(zhuǎn)錄變體，分別對應(yīng)于DEroCl Vl和V2。注意到Vl第8外顯子中的可選變異，并發(fā)現(xiàn)其它剩余的外顯子為兩種變體所共有。V2變體沒有Vl的第8外顯子，但是在最后一個外顯子內(nèi)產(chǎn)生相同的終止密碼子。B5860NV1和B5860NV2變體的全長cDNA序列分別由5318和4466個核苷酸組成。這些變體的ORF始于各自的第I外顯子內(nèi)。最終，Vl和V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼811個和527個氨基酸。siRNA抑制了癌細(xì)胞的生長。這些結(jié)果證實DEroci在大多數(shù)癌細(xì)胞的生長中發(fā)揮重要作用。如PCT/JP2006/302684中所公開的，MPH0SPH1和DEI3DCl在膀胱癌中過表達(dá)，但是在正常組織中顯示最低表達(dá)(minimal expression)。此外,發(fā)現(xiàn)這些基因具有與細(xì)胞增殖相關(guān)的重要功能。在本發(fā)明中，證明了源自MPH0SPH1或DETOCl的肽是限定于HLA-A24和HLA-A2的TAA表位，HLA-A24和HLA-A2是在日本人和白人群體中常見的HLA等位基因。具體而言，利用它們對HLA-A24和HLA-A2的結(jié)合親和力，鑒定了源自MPH0SPH1或DEPDCl的HLA-A24和HLA-A2結(jié)合肽的候選物。在通過裝載有這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激 T 細(xì)胞之后，成功地使用 MPH0SPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO: 7))、MPHOSPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQ ID NO: 8))、MPH0SPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQ IDN0:9))、MPH0SPH1-A2-9-638(RLAIFKDLV(SEQ ID NO: 10))、MPH0SPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV (SEQ ID NO: 11))、DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO: 12))、DEPDCl-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ ID NO: 240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQ IDNO: 241))、DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO: 243))、DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO :244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO :249), DEPDC1-A02-10-224(NMANtSKRGV(SEQ ID NO: 253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQID NO:226)), DEPDCl-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQ ID NO: 254))、DEPDQ-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO: 255))、DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQ ID NO:192)),DEPDCl-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQ ID NO: 195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQID NO : 197) )、DEPDC1-A2-9 -5 6 3 (RLCKSTIEL(SEQ ID NO :209)),DEPDC1-A2-9-653(CVLCCAEEV(SEQ ID NO:225))、DEPDC1-A2-10-674(FLMDhHQEIL(SEQ IDN0:228))和 DEPDCl-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ ID NO: 230))建立了 CTL。這些 CTL 針對用肽沖擊過的A24LCL和T2細(xì)胞展現(xiàn)出強力的細(xì)胞毒活性。此外，源自這些細(xì)胞的CTL 克隆還分別展現(xiàn)出針對表達(dá)MPH0SPH1或DEroCl的HLA-A24或HLA-A2陽性細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性。然而，這些CTL克隆針對僅表達(dá)這些肽(包括HLA-A24、HLA-A2、MPH0SPH1和DEPDCI)中的一種的細(xì)胞不表現(xiàn)細(xì)胞毒活性。這些結(jié)果合起來提示MPH0SPH1和DEroCl作為癌細(xì)胞的 TAA 是有用的，并且 MPH0SPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL(SEQ ID N0:7))、MPH0SPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQ ID NO: 8))、MPH0SPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQID NO: 9))、MPH0SPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO: 10))、MPH0SPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV(SEQ ID NO: 11))、DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO: 12)), DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ ID NO: 240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQ ID NO: 241))、DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO: 243))、DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO:244))、DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249)、DEPDC1-A02-10-224(NMANtSKRGV(SEQ ID NO: 253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQID NO:226)), DEPDCl-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQ ID NO: 254))、DEPDC1-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO: 255)), DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQ ID NO:192)),DEPDCl-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQ ID NO: 195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQID NO : 197))、DEPDC1-A2-9 -56 3 (RLCKSTIEL(SEQ ID NO : 209)),DEPDC1-A2-9-653(CVLCCAEEV(SEQ ID NO:225))、DEPDC1-A2-10-674(FLMDhHQEIL(SEQ IDN0:228))和 DEPDCl-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ ID NO:230))是限定于HLA-A24 或HLA-A2的各TAA的表位肽。由于這些抗原在大多數(shù)癌癥中過表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，它們作為針對癌癥的免疫治療靶是有用的。示例性癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供治療或預(yù)防受試者中與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達(dá)相關(guān)的疾病例如癌癥的方法，這樣的方法包括向需要的患者施用免疫原性肽的步驟，所述肽小于約40個氨基酸，經(jīng)常小于約20個氨基酸，通常小于約15個氨基酸，并且具有SEQ IDN0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列?；蛘?，所述免疫原性肽可以由SEQ ID NOs: 7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 或 255 的序列構(gòu)成，其中
取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個(例如，多至5個)氨基酸，條件是所得變體肽保留所述免疫原性(即，誘導(dǎo)對表達(dá)MPH0SPH1和/或DEroCl的細(xì)胞例如癌癥有特異性的CTL的能力)。取代、缺失或添加的殘基數(shù)通常是5個氨基酸或更少，優(yōu)選4個氨基酸或更少，更優(yōu)選3個氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選一個或兩個氨基酸。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。已知變體肽(即氨基酸序列經(jīng)修飾的肽，所述修飾是通過對原始氨基酸序列進(jìn)行一個、兩個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加來進(jìn)行的)保留原始生物學(xué)活性(MarkDF 等，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6. ；Zoller MJ and Smith Μ, (1982)Nucleic Acids Res 10:6487-500. ；Dalbadie-McFarland G等，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13.) o在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選氨基酸修飾導(dǎo)致對原始氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的保留(該過程被稱為保守氨基酸取代)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的實例包括疏水氨基酸(A、I、L、Μ、F、P、W、Y、V)，親水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、Τ)，以及共同具有以下官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P);含羥基側(cè)鏈(S、T、Y);含硫原子的側(cè)鏈(C、M);含羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D、N、E、Q);含堿側(cè)鏈(base containing side-chain) (R、K、Η);和含芳基側(cè)鏈(aromatic containing side-chain) (H、F、Y、W)。注意，圓括號內(nèi)的字母表示氨基酸的單字母編碼。在優(yōu)選的實施方案中，免疫原性肽是九肽(9聚體)或十肽(10聚體)。本發(fā)明進(jìn)一步提供對受試者中與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，這樣的方法包括向需要的受試者施用本發(fā)明的免疫原性肽，即具有 SEQ ID N0:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列或其變體(即，包括I個、2個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加)的肽，的步驟。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。在本發(fā)明的上下文中，受試者優(yōu)選是哺乳動物。示例性哺乳動物包括，但不限于，例如，人、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛(COW)。在本發(fā)明中，可以藉由體內(nèi)或回體(ex vivo)方案向受試者施用所述肽。此外，本發(fā)明還提供使用九肽或十肽制造用于治療或預(yù)防與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的免疫原性組合物的用途，所述九肽或十肽選自下組具有SEQ IDN0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254和255的氨基酸序列(及其變體)的肽。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。對MPH0SPH 卜 A24-9-278 (IYNEYIYDL(SEQ ID NO : 7))、MPH0SPH 卜 A24-10-278 (IYNEyIYDLF (SEQ ID NO:8)) , MPH0SPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ IDNO :9))、MPH0SPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO: 10))、MPH0SPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV(SEQ ID NO: 11)) , DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQ ID NO:12))、DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQ ID NO: 192))、DEPDC1-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQID NO : 195))、DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL(SEQ ID NO : I 9 7)),DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL(SEQ ID NO: 209))、DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV(SEQID NO :225)) , DEPDCl-A2-10-674 (FLMDhHQEIL(SEQ ID NO :228)),DEPDC1-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ ID NO:230))DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ IDNO:240)),DEPDC1-A02-10-575 (SLLPaSSMLT (SEQ ID NO:241))、DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL(SEQ ID NO:243))、DEPDC1-A02-10_765(KQFQkEYPLI(SEQ ID NO:244))、DEPDC1_A02_
10-395(IMGGSCHNLI(SEQ ID NO:249)、DEPDC1-A02-10_224(NMANtSKRGV(SEQ ID NO:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQ ID NO:226))、DEPDC1-A02-10_296(YELFvNILGL(SEQ ID NO:254))和DEPDC1-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO:255))的同源性分析顯示它們不與源自任何已知的人基因產(chǎn)物的肽具有顯著同源性。因此，顯著降低了針對這些分子的免疫治療產(chǎn)生未知的或不期望的免疫應(yīng)答的可能性。關(guān)于HLA抗原，本文所示數(shù)據(jù)證實使用A-24型或A_2型抗原(據(jù)稱在日本人中高表達(dá))有利于獲得有效的結(jié)果。使用諸如A-2402和A-0201等亞型是更優(yōu)選的。通常，在臨床上，預(yù)先調(diào)查需要治療的患者的HLA抗原類型，進(jìn)而能夠選擇對患者抗原具有高結(jié)合親和力水平或具有通過抗原呈遞而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的能力的適合的肽。此外，為了獲得具有高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力的肽，可以基于天然存在的MPH0SPH1和DETOCl部分肽進(jìn)行I個、2個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加。在本文中，術(shù)語“幾個”意指5個或更少，更優(yōu)選3個或更少。此外，除了天然呈現(xiàn)的肽，由于呈現(xiàn)的肽序列與HLA抗原結(jié)合的規(guī)律性是已知的(Kubo RT,等，(1994) J. Immunol. , 152, 3913-24. ；Rammensee HG，等，(1995)Immunogenetics. 41:178-228. ；KondoA,等，(1995) J. Immunol. 155:4307-12.),所以可以基于這種規(guī)律性對本發(fā)明的免疫原性肽進(jìn)行修飾。例如，可優(yōu)選使用這樣的具有高HLA-24結(jié)合親和力的肽，其中將N末端起的第二個氨基酸用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代。同樣，C-末端氨基酸被取代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽也可優(yōu)選使用。另一方面，可以優(yōu)選使用具有高HLA-A2結(jié)合親和力并且N末端起的第二個氨基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸取代的肽，以及C末端氨基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸的肽。此外，可以向所述肽的N末端和/或C末端添加I至2個氨基酸。然而，當(dāng)所述肽序列與具有其它不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列相同時，可能引發(fā)副作用，諸如針對具體物質(zhì)的自身免疫病或變應(yīng)性癥狀等。因此，優(yōu)選避免所述免疫原性序列與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。這種情況可以通過使用可用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索來避免。如果同源性搜索確認(rèn)自然界中不存在I個、2個或幾個氨基酸不同的肽(peptides in whichl, 2 or several different amino acids donot exist in nature)，那么可以避免上述氨基酸序列被修飾(例如增加HLA抗原的結(jié)合親和力和/或增加CTL誘導(dǎo)能力的修飾)的危險(the danger that modificationsof the above-mentioned amino acid sequence that,for example, increase thebinding affinity with HLA antigens, and/or increase the CTL inducibility can beavoided)。
盡管預(yù)期如上所述對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽可作為高效的癌癥疫苗，但是對于候選肽——它們是以高結(jié)合親和力的存在作為指標(biāo)選擇的——而言，必須考察它們CTL誘導(dǎo)能力是否確實存在CTL誘導(dǎo)能力。CTL誘導(dǎo)能力可以通過常規(guī)方法加以確認(rèn)通過誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如，B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)，或更具體地說，源自人外周血單個核白細(xì)胞的樹突細(xì)胞，并且，在用感興趣的肽刺激之后，與⑶8陽性細(xì)胞混合，再測量針對所述靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。作為反應(yīng)體系，可以使用制備為表達(dá)人HLA 抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如，在 BenMohamed L,等，(2000) Hum. Immunol. ;61 (8) : 764-79Related Articles, Books, Linkout.中描述的那些)。例如，可以用51Cr等對革巴細(xì)胞進(jìn)行放射標(biāo)記，并且可以根據(jù)從靶細(xì)胞釋放的放射性來計算細(xì)胞毒活性?；蛘呖梢赃@樣檢查，通過測量在攜帶固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞的存在下由CTL產(chǎn)生并釋放的IFN- Y，并且使用抗IFN-Y單克隆抗體使培養(yǎng)基上的抑制區(qū)可視化。如上所述對肽的CTL誘導(dǎo)能力的檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的那些肽不一定具有高誘導(dǎo)能力。然而，選自下述肽的九肽或十肽顯示出特別高的CTL誘導(dǎo)能力，所述肽具有 IYNEHYDL(SEQ ID NO:7)、IYNEyIYDLF(SEQ ID NO:8), YIYDLFVPV(SEQID NO:9), RLAIFKDLV(SEQ ID NO: 10)、TMSSsKLSNV(SEQ ID NO: 11)、EYYELFVNI (SEQ ID NO: 12), LLQPHLERV(SEQ ID NO: 192)、LLMRMISRM(SEQ ID NO: 195)、LLTFEYYEL(SEQ IDNO: 197)、RLCKSTIEL(SEQ ID NO: 209)、CVLCCAEEV (SEQ ID NO: 225)、FLMDhHQEIL (SEQID NO:228), ILVVcGYITV(SEQ ID NO: 230)、DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ IDNO:240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQ ID NO:241))、DEPDC1-A02-10-506(QLCRsQSLLL(SEQ ID NO:243))、DEPDC1-A02-10_765(KQFQkEYPLI(SEQ ID NO:244))、DEPDC1_A02-10-395(IMGGSCHNLI(SEQ ID NO:249)、DEPDC1-A02-10_224(NMANtSKRGV(SEQ ID N0:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQ ID NO:226))、DEPDC1-A02-10_296(YELFvNILGL(SEQ IDNO:254))和 DEPDC1-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO:255))所示的氨基酸序列。如上所述，本發(fā)明提供具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，即具有SEQID NOs:7,8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 或255的氨基酸序列或其變體(S卩，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸)的那些肽。因此,優(yōu)選的是,所述由 SEQ ID N0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255或其變體中所示的9個或10個氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列不匹配于另一內(nèi)源蛋白相關(guān)的氨基酸序列。具體而言，在N末端起的第二個氨基酸處取代為亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸取代，在C末端氨基酸處取代為纈氨酸或亮氨酸的氨基酸取代，和在N末端和/或C末端處添加I至2個氨基酸的氨基酸添加是優(yōu)選變體的實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到除了氨基酸取代和添加，所述肽的免疫學(xué)活性片段也可以在本發(fā)明的方法中使用。用于測定活性片段的方法是本領(lǐng)域熟知的。通過用這些經(jīng)修飾的肽進(jìn)行刺激而獲得的CTL克隆能夠識別原來的肽并且引起表達(dá)所述原始肽的細(xì)胞的損害。本發(fā)明的肽能夠使用公知的技術(shù)制備。例如，可以使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成以合成方法制備所述肽。本發(fā)明的肽可以個別地合成或作為更長的包含兩個或多個肽的多肽合成。本發(fā)明的肽優(yōu)選是分離的，即，基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白及其片段。本發(fā)明的肽可以含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化；只要所述修飾不破壞如本文所述的肽的生物學(xué)活性，即與HLA抗原結(jié)合并誘導(dǎo)CTL的能力。其它修飾包括摻入例如可以用于增加肽的血清半衰期的D-氨基酸或其它氨基酸模擬物。本發(fā)明的肽可以作為組合制備，所述組合包括兩個或更多個本發(fā)明的肽，用作與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達(dá)相關(guān)的疾病例如癌癥所用的疫苗，這樣的疫苗在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL0預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。所述肽可以是雞尾酒混合物(cocktail)或者可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使其彼此綴合(conjugate)。例如,可以將所述肽表達(dá)成單一多肽序列。組合中的肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，使所述肽以高密度呈現(xiàn)于抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原上，進(jìn)而誘導(dǎo)CTL，所述CTL特異性地針對所展示的肽和HLA抗原之間形成的復(fù)合物起反應(yīng)?；蛘?，可以用本發(fā)明的肽來刺激表面具有固定化的本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞是通過從受試者取出樹突細(xì)胞來獲得的。向?qū)?yīng)的(respective)受試者再施用這些細(xì)胞可誘導(dǎo)CTL,并且由此能夠增加對革巴細(xì)胞的進(jìn)攻性。
更具體地，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的增殖、轉(zhuǎn)移等的藥物，所述藥物包括一種或多種本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽在治療與MPH0SPH1和/或DEroCl相關(guān)的疾病(例如癌癥)方面尤其有用。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。本發(fā)明的肽可以作為通過常規(guī)配制方法配制好的藥物組合物直接向受試者施用。在這類情況下，除了本發(fā)明的肽，可以適當(dāng)?shù)匕ㄍǔＳ糜谒幬锏妮d體(carrier)、賦形劑等，不對此進(jìn)行具體限制。本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于治療和預(yù)防與MPH0SPH1和/或DEroci相關(guān)的疾病例如癌癥。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。包含一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分、用于治療和/或預(yù)防與MPH0SPH1和/或DEroci過表達(dá)相關(guān)的疾病例如癌癥的免疫原性組合物，可以進(jìn)一步包括佐劑以有效建立細(xì)胞免疫。或者，它們可以與其它活性成分一起施用，諸如抗癌劑。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。合適的劑型包括顆粒。合適的佐劑在文獻(xiàn)中有述(Johnson AG. (1994)Clin. Microbiol. Rev. ,7:277-89.) 示例性佐劑包括，但不限于，磷酸鋁、氫氧化鋁和明礬。此外，可以方便地使用脂質(zhì)體制劑、其中將藥物與幾微米直徑的珠子結(jié)合的顆粒制劑、和其中將脂質(zhì)與所述肽結(jié)合的制劑。施用的方法可以是口服(oral)、真皮內(nèi)(intradermal)、皮下(subcutaneous)、靜脈內(nèi)(intravenous)注射等，并且可以包括系統(tǒng)施用或?qū)Π邢虻哪[瘤附近的局部施用。本發(fā)明的肽的劑量可以根據(jù)所治療的疾病、患者的年齡、體重、施用方法等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。盡管劑量通常為O. OOlmg至lOOOmg，優(yōu)選O. Olmg至IOOmg,更優(yōu)選0. Img至IOmg,優(yōu)選每幾天至幾個月施用一次,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選擇適當(dāng)?shù)膭┝亢褪┯梅椒?，因為對這些參數(shù)的選擇和優(yōu)化完全屬于常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步提供稱作外來體(exosome)的胞內(nèi)泡囊，其表面提呈由本發(fā)明的肽和HLA抗原形成的復(fù)合物。外來體可以通過，例如，使用在國際公布的日文翻譯公布特表平
11-510507號和特表2000-512161號中詳細(xì)描述的方法來制備，并且優(yōu)選使用從治療和/或預(yù)防的目標(biāo)受試者獲得的抗原呈遞細(xì)胞制備。本發(fā)明的外來體可以作為癌癥疫苗接種，類似于本發(fā)明的肽。所用HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者匹配。例如，在日本人群體中，HLA-A24或HLA-A2，尤其是HLA-A2402或HLA-A0201，通常是適合的。在一些實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包括致敏(prime)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的成分。已經(jīng)確定脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)使CTL針對病毒抗原致敏的作用物。例如，可以將棕櫚酸殘基附接于賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，再與本發(fā)明的免疫原性肽連接。然后所述脂質(zhì)化的肽(lapidated peptide)可以直接施用、在微團(tuán)或顆粒中施用、并入脂質(zhì)體中施用、或在佐劑中乳化施用。作為脂質(zhì)致敏CTL應(yīng)答的另一實例，大腸桿菌脂蛋白諸如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine) (P3CSS)當(dāng)共價附接于適當(dāng)?shù)碾臅r可以用于致敏CTL(參見,例如,Deres K,等，(1989)Nature342:561-4.)。本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括編碼一種或多種本文公開的免疫原性肽的 核酸。參見，例如，Wolff JA 等，(1990) Science247:1465-8 ;美國專利第 5, 580, 859 ；5，589，466 ;5，804，566 ;5，739，118 ;5，736，524 ;5，679，647 號；和 W098/04720。基于 DNA 遞送技術(shù)的實例包括“裸DNA”、協(xié)助(bupivicaine、聚合物、肽介導(dǎo)的)遞送、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的遞送(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的遞送(參見，例如，美國專利第5，922，687號)。本發(fā)明的免疫原性肽也可以通過病毒載體或細(xì)菌載體來表達(dá)。合適的表達(dá)載體的實例包括減毒的病毒宿主，諸如痘苗或禽痘。這種方法涉及痘苗病毒的使用，例如，用作表達(dá)編碼所述肽的核苷酸的載體。當(dāng)引入宿主時，所述重組痘苗病毒表達(dá)所述免疫原性肽，并且由此引發(fā)免疫應(yīng)答。可用于免疫方案的痘苗載體和方法在美國專利第4，722，848號中描述。另一合適載體是BCG (卡介苗(Bacille Calmette Guerin))。BCG載體在StoverCK,等，(1991)Nature 351:456-60中描述。可用于治療施用或免疫的多種其它載體，例如，腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒炭疽毒素載體等是本領(lǐng)域已知的。參見,例如，Shata MT，等，(2000)Mol. Med. Today6:66-71 ；Shedlock DJ and Weiner DB.,等，(2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806 ;和 HippJD,等，(2000) In Vivol4:571-85。本發(fā)明還提供使用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。所述抗原呈遞細(xì)胞可以這樣誘導(dǎo)，通過從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)樹突細(xì)胞，再用一種或多種本發(fā)明的肽在體外、回體或在體內(nèi)接觸(刺激)它們。當(dāng)向受試者施用本發(fā)明的肽時，受試者體內(nèi)誘導(dǎo)生成固定有本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞?；蛘?，可以在將本發(fā)明的肽固定至抗原呈遞細(xì)胞之后，將所述細(xì)胞作為疫苗施用于受試者。例如，回體的施用可以包括下列步驟a:從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞，和b:將步驟a的抗原呈遞細(xì)胞與本發(fā)明的肽接觸?？梢詫⑼ㄟ^步驟b獲得的抗原呈遞細(xì)胞作為疫苗施用給受試者。本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)具有高水平的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其中所述方法包括在體外向抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因的步驟，所述基因由編碼一種或多種本發(fā)明的肽的多核苷酸構(gòu)成。引入的基因可以是DNA或RNA的形式。關(guān)于引入的方法，沒有特殊的限制，本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行的多種方法，諸如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔和磷酸鈣方法可以適用。更具體地，轉(zhuǎn)染可以如Reeves ME,等，(1996)Cancer Res.，56:5672-7.；Butterfield LH,等，(1998) J. Tmmunol. , 161:5607-13. ；Boczkowski D,等，(1996) J. Exp.Med.，184:465-72.;國際公布的日文翻譯公布特表2000-509281號中所述來進(jìn)行。通過將基因轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞中，基因在所述細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯等，然后由I類或II類MHC加工獲得的蛋白，再通過呈遞途徑以呈遞部分肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供使用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)CTL的方法。當(dāng)本發(fā)明的肽被施用給受試者時，受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出CTL，由此增強靶向表達(dá)MPH0SPH1和/或DETOCl的細(xì)胞例如癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的強度。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤?；蛘?，本發(fā)明的肽可以在回體的治療方法的背景下使用，其中用一種或多種本發(fā)明的肽在體外接觸(刺激)源自受試者的抗原呈遞細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞或外周血單個核白細(xì)胞，然后，在誘導(dǎo)CTL之后，將細(xì)胞返回受試者。例如，所述方法可以包括以下步驟
a:從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞，b:將步驟a的抗原呈遞細(xì)胞與本發(fā)明的肽接觸，c:將步驟b的抗原呈遞細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞混合并且進(jìn)行共培養(yǎng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞，和d:從步驟c的共培養(yǎng)物收集OT8+T細(xì)胞。步驟d獲得的具有細(xì)胞毒活性的CD8+T細(xì)胞可以作為疫苗向受試者施用。本發(fā)明進(jìn)一步提供使用本發(fā)明的肽產(chǎn)生活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的方法。例如，所述方法可以包括以下步驟a:從受試者收集T細(xì)胞，和b:將T細(xì)胞與以下肽接觸。(I)選自下組的小于約15個氨基酸的分離的肽具有SEQ ID N0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 和 255 的氨基酸
序列的肽。(2)具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽具有選自SEQ IDN0s:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 和 255 的
氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的肽產(chǎn)生APC的方法，所述APC具有誘導(dǎo)活化T細(xì)胞的能力。例如，所述方法可以包括將抗原呈遞細(xì)胞與所述肽接觸以產(chǎn)生在表面呈遞所述肽和HLA抗原的抗原呈遞細(xì)胞的步驟。在本發(fā)明的上下文中，“活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞”誘導(dǎo)IFN-Y產(chǎn)生、IFN-Y釋放和腫瘤細(xì)胞的死亡。本發(fā)明進(jìn)一步提供使用本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞是通過用呈遞一種或多種本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行刺激而被誘導(dǎo)的，優(yōu)選源自作為治療和/或預(yù)防的靶的受試者，并且可以單獨施用或與其它藥物組合施用，所述其它藥物包括一種或多種本發(fā)明的肽或具有抗腫瘤活性的外來體。獲得的細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性地針對呈遞本發(fā)明的肽、或優(yōu)選呈遞與誘導(dǎo)所用的肽相同的肽的細(xì)胞起作用。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)MPH0SPH1和/或DEroCl的細(xì)胞，或是用MPH0SPH1和/或DETOCl基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。由于本發(fā)明的肽的刺激而在細(xì)胞表面呈遞這些肽的細(xì)胞也可成為攻擊的靶。本發(fā)明還提供呈遞HLA抗原與一種或多種本發(fā)明的肽形成的復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞。這些抗原呈遞細(xì)胞是通過與本發(fā)明的肽或編碼這些肽的核苷酸接觸而獲得的，優(yōu)選源自作為治療和/或預(yù)防的靶的受試者，并且能夠作為疫苗單獨施用或與其它藥物組合施用，所述其它藥物包括本發(fā)明的肽、外來體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。本發(fā)明還提供組合物和使用該組合物的方法，所述組合物包含編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)亞基的多肽的核酸。TCR亞基能夠形成TCR，TCR賦予T細(xì)胞對呈遞MPH0SPH1或DEroci的腫瘤細(xì)胞的特異性。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可以鑒定用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的CTL的TCR亞基α鏈和β鏈的核酸(W02007/032255和Morgan等，JImmunol, 171，3288(2003))。衍生的TCR優(yōu)選以高親和力(avidity)結(jié)合展示MPH0SPH1或DEPDCl肽的靶細(xì)胞，并且任選地在體內(nèi)和體外介導(dǎo)對呈遞MPH0SPH1或DETOCl肽的靶細(xì)胞的有效殺傷。 可以將編碼TCR亞基的核酸納入合適的載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領(lǐng)域熟知的。通?？梢詫⑺龊怂峄虬鼈兊妮d體轉(zhuǎn)移至T細(xì)胞中，所述T細(xì)胞優(yōu)選來自患者。有利地，本發(fā)明提供現(xiàn)成組合物(off-the-shelf composition),利用該組合物能夠快速地修飾患者自身的T細(xì)胞(或另一哺乳動物的T細(xì)胞)以迅速且簡單地產(chǎn)生具有卓越的癌細(xì)胞殺傷性質(zhì)的修飾T細(xì)胞。同樣，本發(fā)明提供通過用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)來制備的CTL，所述核酸編碼與MPH0SPH1或DEPDCl 肽(例如在 HLA-A24 或 HLA-A2 的背景下，SEQ ID N0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 或 255)結(jié)合的 TCR 亞基多肽。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL能夠在體內(nèi)歸巢于(home to)癌細(xì)胞，并且通過已知的體外培養(yǎng)方法擴增(例如,Kawakami等，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))?？梢允褂帽景l(fā)明的T細(xì)胞來形成可用于在需要治療或保護(hù)的患者中治療或預(yù)防癌癥的免疫原性組合物(W02006/031221)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“疫苗”(也稱為免疫原性組合物)指當(dāng)接種入動物中時誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性或抑制癌癥的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，提出具有SEQ ID N0:7、8或12的氨基酸序列的多肽是HLA-A24限定性表位肽(restricted epitope peptide),并且提出具有SEQ ID N0:9、10、ll、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列的多肽是HLA-A2限定性表位肽，所述限定性表位肽可以誘導(dǎo)針對表達(dá)MPH0SPH1和/或DEroCl的細(xì)胞例如表達(dá)MPH0SPH1和/或DEI3DCl的癌細(xì)胞的強力且特異性的免疫應(yīng)答。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。因此，本發(fā)明還包括使用具有 SEQ ID N0:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列或其變體(即，包括I個、2個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加)的多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。概括而言，抗腫瘤免疫包括以下列為例的免疫應(yīng)答-針對包含表達(dá)MPH0SPH1和/或DETOCl的細(xì)胞的腫瘤的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)，-識別包含表達(dá)MPH0SPH1和/或DETOCl的細(xì)胞的腫瘤的抗體的誘導(dǎo)，和
-抗腫瘤細(xì)胞因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)。因此，當(dāng)某種肽在接種至動物中時誘導(dǎo)這些免疫應(yīng)答中的任何一種，則判定所述肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的效果。肽對抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可以通過在體內(nèi)或體外觀察宿主中免疫系統(tǒng)對所述肽的應(yīng)答來檢測。例如，用于檢測細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)的方法是公知的。進(jìn)入活體的外來物質(zhì)通過抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的作用被呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞。以抗原特異性方式響應(yīng)于由APC呈遞的抗原的T細(xì)胞由于所述抗原的刺激而分化成細(xì)胞毒性T細(xì)胞(也稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或CTL)，然后增殖；這種過程在本文稱為T細(xì)胞的“活化”。因此，由特定肽造成的CTL誘導(dǎo)，可以通過將所述肽由APC呈遞給T細(xì)胞并且檢測對CTL的誘導(dǎo)來加以評估。此外，APC具有活化⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的效果。由于CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中也很重要，可以利用這些細(xì)胞的活化作用作為指示(indicator)來評估所述肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用。使用樹突細(xì)胞(DC)作為APC來評估CTL誘導(dǎo)作用的方法是本領(lǐng)域熟知的。DC是 在APC中具有最強CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在這種方法中，最初將受試多肽與DC接觸，然后將這種DC與T細(xì)胞接觸。在與DC接觸之后檢測到對感興趣的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用的T細(xì)胞，表明受試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。針對腫瘤的CTL活性可以，例如，使用51Cr-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的裂解作為指示來檢測。或者，公知使用3H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指示項來評估腫瘤細(xì)胞的損害程度。此外，也可以通過測量在攜帶固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞的存在下由CTL產(chǎn)生并釋放的IFN-Y來檢測，所述測量通過用抗IFN- Y抗體使IFN- Y顯現(xiàn)來進(jìn)行，諸如ELISP0T測定法。除了 DC之外，外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)也可用作APC。據(jù)報道通過在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)PBMC使其對CTL的誘導(dǎo)增強。類似地，已經(jīng)證明CTL可通過在鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和IL-7存在下培養(yǎng)PBMC來誘導(dǎo)。通過這些方法確認(rèn)具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽是具有DC活化作用并且繼而具有CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用作針對與MPH0SPH1和/或DEroci過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得了誘導(dǎo)針對與MPH0SPH1和/或DEroCl相關(guān)的疾病(例如癌癥)的CTL的能力的APC可用作針對所述疾病的疫苗。此外，由于APC呈遞多肽抗原而獲得了細(xì)胞毒性的CTL也可用作針對與MPH0SPH1和/或DEroCl相關(guān)的疾病(例如癌癥)的疫苗。這些利用APC和CTL所致的抗腫瘤免疫，用于治療與MPH0SPH1和/或DEroCl相關(guān)的疾病(例如癌癥)的治療方法，稱作細(xì)胞免疫療法。預(yù)期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。通常，在將多肽用于細(xì)胞免疫療法時，可以通過組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并且將它們與DC接觸來增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。多肽對抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可以通過觀察抗腫瘤抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來進(jìn)一步確認(rèn)。例如，當(dāng)在用多肽免疫的實驗動物中誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗所述多肽的抗體，并且腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和/或轉(zhuǎn)移受到這些抗體的抑制時，則確定所述多肽可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性。抗腫瘤免疫性可以通過施用本發(fā)明的疫苗來誘導(dǎo)，并且抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可用于治療和預(yù)防與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達(dá)相關(guān)的疾病，例如癌癥。與MPH0SPH1和/或DEPDCl過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的發(fā)病的治療或預(yù)防可以包括抑制表達(dá)MPH0SPH1和/或DEroci的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的生長，使這些細(xì)胞退化(involution)，和抑制這些細(xì)胞例如癌細(xì)胞的發(fā)生?；加信cMPH0SPH1和/或DEroCl相關(guān)疾病(例如癌癥)的個體的病死率的降低，血液中疾病標(biāo)志物(marker)的減少，伴隨疾病的可檢測癥狀的減輕等也包括在疾病(例如癌癥)的治療或預(yù)防中。這些治療和預(yù)防效果優(yōu)選在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的，例如，在5%或更低的顯著水平觀察，其中將針對MPH0SPH1和/或DEroCl相關(guān)疾病(例如癌癥)的疫苗的治療或預(yù)防效果與未施用疫苗的對照相比。例如,斯氏t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗或ANOVA可以用于測定統(tǒng)計學(xué)顯著性。由于(in that)本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達(dá)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的方法，可以向患有所述疾病或有風(fēng)險發(fā)生(或易患)所述疾病的受試者預(yù)防性或治療性地施用所述治療化合物或組合物。這樣的受試者可以使用標(biāo)準(zhǔn)臨床方法來鑒定。在本發(fā)明的上下文中，預(yù)防施用發(fā)生在明顯的疾病臨床癥狀顯現(xiàn)之前，由此預(yù)防疾病或病癥或者延遲它的發(fā)展。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域背景下，術(shù)語“預(yù)防”包括降低疾病病死率 或發(fā)病率負(fù)荷(burden)的任何活性。預(yù)防可以發(fā)生在初級、次級和三級預(yù)防水平。初級預(yù)防避免疾病的發(fā)生，而次級和三級水平的預(yù)防包括以預(yù)防疾病進(jìn)展和癥狀出現(xiàn)為目的的活動，以及通過恢復(fù)功能和減少疾病相關(guān)的并發(fā)癥來降低已患疾病影響的活動。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“有效的(efficacious) ”指治療導(dǎo)致受試者中癌癥大小、普遍性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力的降低。當(dāng)預(yù)防性施用治療時，“有效的”意思是治療延遲或防止非癌(non cancer)的發(fā)生或減輕癌癥的臨床癥狀。對癌癥的評估可以使用標(biāo)準(zhǔn)臨床規(guī)程進(jìn)行。另外，治療的有效性可以聯(lián)合任何用于診斷或治療癌癥的已知方法來測定。例如，癌癥可以通過組織病理學(xué)診斷或通過鑒定癥狀性異常來診斷。上述具有免疫學(xué)活性的肽，或編碼這樣的肽的多核苷酸或載體，可以與佐劑組合。佐劑指當(dāng)與具有免疫學(xué)活性的肽一起(或相繼)施用時，使針對所述肽的免疫應(yīng)答增強的化合物。合適的佐劑的實例包括霍亂毒素、沙門菌毒素(salmonella toxin)、明礬等，但是不限于此。另外，本發(fā)明的疫苗可以適當(dāng)?shù)嘏c藥學(xué)可接受載體組合。這些載體的實例是無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液(culture fluid)等。另外，疫苗可以按照需要含有穩(wěn)定劑、懸劑、防腐劑、表面活性劑等。所述疫苗可以系統(tǒng)施用或局部施用。疫苗施用可以通過單次施用進(jìn)行或通過多次施用加強(boost)。當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達(dá)相關(guān)的疾病例如癌癥可以例如通過回體方法來治療或預(yù)防。更具體地，收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC，在體外與本發(fā)明的肽接觸。在誘導(dǎo)APC或CTL之后，可以將細(xì)胞施用給受試者。APC也可以通過以回體方式將編碼所述肽的載體引入PBMC來誘導(dǎo)。體外誘導(dǎo)的APC或CTL在施用之前可以加以克隆。通過克隆并培養(yǎng)具有高度的靶細(xì)胞破壞活性的細(xì)胞，可以更有效地實施細(xì)胞免疫療法。另外，以這種方式分離的APC和CTL可以用于這樣的細(xì)胞免疫療法，該細(xì)胞免疫療法不僅可針對細(xì)胞所來源的個體，還可以針對其它個體中相似類型的疾病。在以下實施例中將描述本發(fā)明的多個方面，這些實施例旨在說明本發(fā)明并幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行和使用本發(fā)明。所述實施例不意在以任何方式另外限制本發(fā)明的范圍。 盡管在實施或試驗本發(fā)明時可以使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但是下文將描述幾種合適的方法和材料。
實施例接下來，通過以下實施例來示例(并非限制)本發(fā)明。然而，本文描述的材料和方法等僅為說明本發(fā)明的幾個方面，而不意欲以任何形式限制本發(fā)明的范圍。同樣，在本發(fā)明的實施或檢驗中可以使用與本文所述類似或等同的方法和材料等。實施例I材料和方法細(xì)朐系 A24LCL細(xì)胞(HLA-A24/24)、人的類B淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(humanB-Iymphoblastoid cell line)、T2 細(xì)胞和 C0S7 購自 ATCC。詵擇源自MPH0S0H1和DEPDCl的狀的候詵物使用結(jié)合預(yù)測軟件^BIMAS^(bimas. dcrt. nih. gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)(Parker KC,等,(1994)J Tmmunol· ;152 (I):163-75. ；KuzushimaK,等，(2001) Blood. ;98(6) :1872-81.)預(yù)測了 與 HLA_A*2402 和 HLA_A*0201 分子結(jié)合的源自MPH0S0H1或DEroCl的9聚肽或10聚肽。這些肽依照標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法由Sigma (Sapporo, Japan)合成，并且通過反相HPLC純化。肽的純度(>90%)和身份分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜測定。將肽以20mg/ml溶解在二甲亞砜(DMSO)中并且貯藏在_80°C。體外CTL誘導(dǎo)使用源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來誘導(dǎo)針對HLA上呈現(xiàn)的肽的CTL應(yīng)答。DC是如其它文獻(xiàn)中所述在體外生成的(Nukaya I等，(1999)Int. J. Cancer 80, 92-7. , Tsai V 等，(1997)J. Immunol158:1796-802.)。簡言之，用Ficoll-Paque (Pharmacia)溶液從正常志愿者(HLA_A*2402 和 / 或 HLA_A*0201)分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),通過粘附于塑料組織培養(yǎng)瓶(Becton Dickinson)對所述外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行分離，從而將它們富集成單核細(xì)胞級分。將富集的單核細(xì)胞群體在1000U/mlGM-CSF (Genzyme)和 1000U/ml IL-4 (Genzyme)存在下在含 2% 熱滅活自體血清(AS)的AIM-V(Invitrogen)中培養(yǎng)。培養(yǎng)7天之后，將生成細(xì)胞因子的DC在AM-V中用20mcg/ml合成肽在3mcg/ml β 2-微球蛋白存在下于20°C沖擊4小時。然后將這些肽沖擊過的DC用MMC(30mcg/ml，進(jìn)行30分鐘)滅活，并且以1:20比例與自體⑶8+T細(xì)胞混合，其中所述自體CD8+T 細(xì)胞是通過用 Dynabeads M-450CD8 (Dynal)和 DETACHa BEAD (Dynal)的陽性選擇獲得的。這些培養(yǎng)物放入(set up in)48孔平板(Corning)中;每孔在O. 5ml AIM-V/2%AS中含有L 5xl04個經(jīng)肽沖擊的DC、3xl05個CD8+T細(xì)胞和10ng/ml IL-7 (Genzyme)。三天之后，對這些培養(yǎng)物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度為20IU/ml。在第7天和第14天，進(jìn)一步用經(jīng)肽沖擊的自體DC再次刺激所述T細(xì)胞。每次均通過與上文所述相同的方法制備DC。在第21天，在第3輪肽沖擊之后，用經(jīng)肽沖擊的A24LCL細(xì)胞或T2細(xì)胞來測試CTL。CTL擴增流稈使用類似于Riddell SR,等(Walter EA 等，(1995)N Engl J Med333:1038-44.；Riddel SR,等，(1996)Nature Med. 2:216-23.)所述的方法在培養(yǎng)中擴增CTL。將總共5xl04個CTL在40ng/ml抗⑶3單克隆抗體(Pharmingen)存在下重懸在通過MMC滅活的含兩種人類B淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系的25ml AIM-V/5%AS中。培養(yǎng)開始后的次日，向培養(yǎng)物添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天用含30IU/ml IL-2的新鮮AIM-V/5%AS為培養(yǎng)物補料。CTL克降的律立在96孔圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中稀釋至每孔具有O. 3、I和3個CTL。將CTL與7xl04個細(xì)胞/孔的兩種人類B淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系、30ng/ml抗⑶3抗體和125U/ml IL-2 一起在總共150mcl/孔的含5%AS的AM-V中培養(yǎng)。10天之后向培養(yǎng)基添加50mcl/孔的IL-2，從而使IL-2終濃度達(dá)到125U/ml。在第14天測試CTL的CTL活性，并且使用與上述相同的方法擴增CTL克隆。特異件CTL活件為了檢驗特異性CTL活性，進(jìn)行了 IFN-Y ELISP0T測定和IFN-yELISA。 簡言之，制備了經(jīng)肽沖擊的A24-LCL或T2細(xì)胞(IxlO4/孔)作為刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞或有限稀釋后的CTL克隆作為應(yīng)答細(xì)胞。按照生產(chǎn)流程(undermanufacture procedure)進(jìn)行 IFN-Y ELISP0T 測定和 ELISA。
_8] 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染建立了用Epstein Bar 病毒轉(zhuǎn)化的 HLA-A24B-LCL(A24LCL)。Jiyoye、EB_3、C0S7、HT1376、RT-4和J82購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville, MD)。將A24LCL、Jiyoye和EB-3維持在含10%胎牛血清(GEMINI Bio-Products)和1%抗生素溶液(Sigma)的RPMI1640中。將C0S7、HT1376、RT-4和J82維持在適合的培養(yǎng)基和抗生素中。C0S7和HEK的轉(zhuǎn)染使用FUGENE6 (Roche)進(jìn)行。HEK-A2細(xì)胞，作為表達(dá)HLA_A*0201分子的穩(wěn)定克隆，通過pcDNA6. 2-HLA-A2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立，并且通過有限稀釋方法在5mcg/ml Blastcidin S存在下分離。表位肽在BALB/c小鼠中的免疫原件為了誘導(dǎo)肽特異性CTL，使用每只小鼠IOOml疫苗混合物來提供免疫，所述混合物含有50mcl (IOOmcg)的HLA-A24限定性肽和50mcl IFA。在第O天將所述疫苗皮下注射至右脅進(jìn)行第一次免疫，并且在第7天注射至左脅進(jìn)行第二次免疫。在第14天，使用經(jīng)接種小鼠的脾細(xì)胞，不加以任何體外刺激，作為應(yīng)答細(xì)胞，并且以使用或未使用肽沖擊的RLmalel細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，進(jìn)行IFN-Y ELISP0T測定。癌癥中MPH0SPH1和DEPDCl的表汰增強使用cDNA微陣列從多種癌癥獲得的全局基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(global geneexpression profile data)揭不了 MPH0SPH1 (GenBank 登錄號 NM_016195 ;SEQ ID No. I)和 DEPDCl (GenBank 登錄號 BM683578)(具有兩種變體 DEPDCl Vl (SEQ ID Nos. 3)和DEPDC1V2 (SEQ ID No. 5))的表達(dá)升高。與相應(yīng)的正常組織相比，MPH0SPH1的表達(dá)在31例膀胱癌的30例中，36例乳腺癌的8例中，全部18例宮頸癌中，17例膽管細(xì)胞癌的5例中，31例CML的25例中，11例結(jié)腸直腸癌的6例中，14例胃癌的6例中，全部5例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，10例骨肉瘤的6例中，22例前列腺癌的7例中，18例腎癌的10例中和21例軟組織腫瘤的15例中有效升高。與相應(yīng)的正常組織相比，DEPDCl的表達(dá)在25例膀胱癌的23例中，在13例乳腺癌的6例中，全部12例宮頸癌中，全部6例膽管細(xì)胞癌中，4例CML的3例中，4例結(jié)腸直腸癌的2例中，全部6例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，14例骨肉瘤的10例中，24例前列腺癌的11例中，全部14例SCLC中和31例軟組織瘤的22例中有效升高(表 I)。[表 1]在癌組織中觀察到MPH0SPH1或DEDCl與正常對應(yīng)組織相比的存在上調(diào)的情況的比例
權(quán)利要求
1.ー種分離的肽，其由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列組成；或ー種具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽由SEQ ID N0:12的氨基酸序列組成，在所述氨基酸序列中取代、缺失或添加了 I個或2個氨基酸。
2.權(quán)利要求I的具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中SEQID NO: 12的氨基酸序列的自N-末端起的第二個氨基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸。
3.權(quán)利要求I的具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中SEQID NO: 12的氨基酸序列的C-末端氨基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸。
4.ー種載體，其中的DNA編碼權(quán)利要求1-3中任ー項的肽。
5.一種用于治療或預(yù)防與SEQ ID N0:3和5中任ー個或二者的基因的過表達(dá)相關(guān)的癌癥的藥物組合物，所述組合物包含至少ー種權(quán)利要求I的肽。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
7.—種外來體，所述外來體在其表面上呈現(xiàn)包含權(quán)利要求I的肽以及HLA抗原的復(fù)合物。
8.權(quán)利要求7的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A24。
9.權(quán)利要求8的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2402。
10.一種誘導(dǎo)具有高的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的體外方法，包括下述步驟 (a)將抗原呈遞細(xì)胞與權(quán)利要求I的肽接觸，或 (b)將包含編碼權(quán)利要求I的肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞。
11.ー種誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的體外方法，所述方法是通過將T細(xì)胞與權(quán)利要求I的肽接觸。
12.—種誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的體外方法，包括下述步驟 (i)使抗原呈遞細(xì)胞與權(quán)利要求I的肽接觸，和 ( )將步驟(i)的抗原呈遞細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞混合并將它們共培養(yǎng)。
13.一種分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所述細(xì)胞是通過權(quán)利要求11或12的方法誘導(dǎo)的，或者所述細(xì)胞是被如下所述的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)的，該核酸編碼在HLA-A24的背景下與權(quán)利要求1-3中任一項的肽結(jié)合的TCR亞基多肽。
14.ー種抗原呈遞細(xì)胞，所述細(xì)胞包含HLA抗原與權(quán)利要求I的肽形成的復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞，所述細(xì)胞是通過權(quán)利要求10的方法誘導(dǎo)的。
16.一種用于抑制表達(dá)SEQ ID NO:3和5中任ー個或二者的基因的癌細(xì)胞增殖的疫苗，其中所述疫苗包含權(quán)利要求I的肽作為活性成分。
17.權(quán)利要求16的疫苗，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
18.權(quán)利要求16的疫苗,配制成用于向HLA抗原是HLA-A24的受試者施用。
19.至少ー種權(quán)利要求I的肽或編碼所述肽的多核苷酸在制備用于治療或預(yù)防與SEQID NO:3和5中的任ー個或二者的基因的過表達(dá)相關(guān)的癌癥的藥用疫苗組合物中的用途。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及“用于表達(dá)MPHOSPH1或DEPDC1多肽的癌癥的肽疫苗”，提供具有如SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255中所示氨基酸序列的肽，以及具有取代、缺失或添加1個、2個或幾個氨基酸的上述氨基酸序列的肽，其中所述肽具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防與MPHOSPH1和/或DEPDC1過表達(dá)相關(guān)的疾病例如癌癥的藥物，所述藥物含有這些肽作為活性成分。本發(fā)明的肽也可用作疫苗。
文檔編號A61P35/00GK102850435SQ20121030573
公開日2013年1月2日 申請日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日
發(fā)明者藤岡知昭, 中村佑輔, 角田卓也, 大澤龍司, 志田綠 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司