專利名稱：制備基因庫(kù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物的環(huán)境庫(kù)中制備基因庫(kù)的方法，該基因庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)使得篩選具有目的特性的單個(gè)蛋白成分并且大量生產(chǎn)它們成為可能。這代表了對(duì)以前使用的生產(chǎn)方法的改進(jìn)，以前的生產(chǎn)方法是應(yīng)用從自然中分離的微生物而且生產(chǎn)蛋白質(zhì)混合物，然后直接應(yīng)用或在生產(chǎn)步驟之后進(jìn)行分離。人們已經(jīng)發(fā)展了用來(lái)快速鑒定編碼目的多肽的基因的方法。
在WO93/11249(Novo Nordisk A/S)中敘述了所謂的表達(dá)克隆技術(shù)的實(shí)例。在WO93/11249中公開(kāi)的技術(shù)包括從生物中制備DNA文庫(kù)，該生物被懷疑攜帶編碼具有產(chǎn)生目的活性的多肽的基因。傳統(tǒng)上，用從單個(gè)已知的微生物中分離的DNA產(chǎn)生這樣的文庫(kù)。
WO97/37036中設(shè)計(jì)了篩選具有可選擇特性的微生物的區(qū)域化方法，并且在WO97/37036中敘述了用于從環(huán)境樣本中制備標(biāo)準(zhǔn)化的基因組DNA文庫(kù)的方法。
然而，從未有人描述從生物的環(huán)境庫(kù)中制備基因庫(kù)(其中該基因庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA)的方法。因此，需要建立基于生物學(xué)富集從生物的環(huán)境庫(kù)中篩選潛在的目的基因的方法。
發(fā)明概述已發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用生物學(xué)富集從生物的環(huán)境庫(kù)中篩選潛在的目的基因。因此本發(fā)明提供了從生物的環(huán)境庫(kù)中產(chǎn)生基因庫(kù)的方法，該基因庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA，該方法包括a)對(duì)所述生物的環(huán)境庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基和/或條件適于在該生物庫(kù)中富集攜有所述DNA的生物，和b)從所富集的生物庫(kù)中制備基因庫(kù)。
本發(fā)明還提供了從生物的環(huán)境庫(kù)中篩選目的DNA序列的方法，該方法包括a)對(duì)所述生物的環(huán)境庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基和/或條件適于在該生物庫(kù)中富集攜有所述DNA序列的生物；b)從所富集的生物庫(kù)制備基因庫(kù)；c)篩選包含攜帶有目的基因之DNA的文庫(kù)；和d)篩選從步驟c)中獲得的目的DNA序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供從生物的環(huán)境庫(kù)中制備基因庫(kù)的方法，該基因庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA，該方法包括a)對(duì)所述生物的環(huán)境庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基和/或條件適于在該生物庫(kù)中富集攜有所述DNA的生物，和b)從所富集的生物庫(kù)中制備基因庫(kù)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生物的環(huán)境庫(kù)”意指環(huán)境樣本，該樣本包括微生物和高等動(dòng)物的細(xì)胞，它們含有編碼具有目的活性的多肽的DNA。例如，環(huán)境樣本可以是土壤或植物物質(zhì)、動(dòng)物或昆蟲(chóng)的糞便、昆蟲(chóng)的內(nèi)臟、動(dòng)物的胃等環(huán)境樣本，海水或湖水、污水、廢水等水樣本，污泥或沉淀樣本等，這些樣本包含一種或(在大部分情況下)大量的不同微生物或活細(xì)胞。
在步驟a)中，培養(yǎng)所述樣本，且不需要進(jìn)一步純化。通過(guò)選擇培養(yǎng)樣本的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，可富集或(擴(kuò)增)在特定培養(yǎng)條件下具有最佳生長(zhǎng)并且表達(dá)具有適應(yīng)于培養(yǎng)條件之特點(diǎn)的多肽。在步驟b)中制備的文庫(kù)可以通過(guò)在本領(lǐng)域中任何已知的適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行制備，并不限定于實(shí)施例3和實(shí)施例4中敘述的實(shí)例。
本篩選方法的優(yōu)點(diǎn)主要是新基因的分離，及所致新產(chǎn)物的產(chǎn)生速度大大提高。而且，本方法允許對(duì)多個(gè)多肽活性進(jìn)行篩選，并且可以導(dǎo)致分離編碼同類多肽的幾個(gè)不同基因。通過(guò)利用本發(fā)明，可開(kāi)發(fā)用于分析新酶和其它具有目的活性的多肽的富集培養(yǎng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)生物的環(huán)境庫(kù)，該培養(yǎng)基含有針對(duì)具有目的活性的多肽的底物。可用于富集含不同類型基因產(chǎn)物之生物環(huán)境庫(kù)的底物有很多。例如，編碼具有目的活性的多肽(例如果膠酶)的DNA可用其底物(如果膠)進(jìn)行篩選。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，底物構(gòu)成培養(yǎng)基的碳源和/或氮源。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，底物包括果膠、直鏈淀粉、纖維素、半乳聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖、脂類、半纖維素或者它們的組合。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，富集是通過(guò)一個(gè)或更多的生長(zhǎng)條件完成的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)條件包括pH值和溫度。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，被用來(lái)完成富集步驟a)的生長(zhǎng)條件包括任何pH值范圍，即pH0-12，優(yōu)選約pH6-9，特別是pH9-12，以及任何溫度范圍，即0-120℃，優(yōu)選約25-30℃，優(yōu)選約30-50℃，更優(yōu)選50-70℃。
在用于篩選潛在的目的生物環(huán)境庫(kù)的方法中，重要的步驟是選擇最佳起始庫(kù)。為了選擇可分解植物(或動(dòng)物)來(lái)源的天然化合物的多肽的編碼DNA，優(yōu)選觀察可有效分解這類起始物質(zhì)的天然群落生境。在分解植物物質(zhì)中特別有效的動(dòng)物的實(shí)例是反芻動(dòng)物、白蟻和昆蟲(chóng)(sensu lato)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從動(dòng)物的胃或昆蟲(chóng)內(nèi)臟中分離微生物庫(kù)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，從牛的瘤胃中分離微生物庫(kù)。
同樣，當(dāng)篩選編碼具有目的活性(即能在諸如強(qiáng)堿性條件下工作)的多肽的DNA時(shí)，重要的是從同等強(qiáng)堿性群落生境中分離微生物庫(kù)。本領(lǐng)域中眾所周知，為了使蘇云金桿菌(Bt)毒素具有活性，強(qiáng)堿性條件是必須的[蘇云金桿菌，環(huán)境殺蟲(chóng)劑理論和實(shí)踐，1993,P.F.Entwistl等編，Wiley和Son，英國(guó)]。已知對(duì)Bt毒素敏感的昆蟲(chóng)目幼蟲(chóng)的內(nèi)臟包含強(qiáng)堿性(pH約為10)環(huán)境庫(kù)。這樣的昆蟲(chóng)目尤其是指等翅目、鱗翅目、鞘翅目和雙翅目昆蟲(chóng)。
因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從等翅目、鱗翅目、鞘翅目或雙翅目昆蟲(chóng)的內(nèi)臟中分離微生物庫(kù)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，從選自地夜蛾屬(Agrotis)、Neotermescastaneus、幕谷蛾(Tineola bisselliella)和五月鰓金龜(Melolontha vulgaris)的昆蟲(chóng)的內(nèi)臟中分離微生物庫(kù)。
在從動(dòng)物胃或昆蟲(chóng)內(nèi)臟中分離生物的環(huán)境庫(kù)之前，可用包含針對(duì)目的多肽活性之底物的食物飼養(yǎng)或提供給動(dòng)物或昆蟲(chóng)甚至可以作為主要的碳源和/或氮源，如此進(jìn)行富集是有利的。這使牛的瘤胃和來(lái)自鱗翅目、鞘翅目以及雙翅目幼蟲(chóng)的內(nèi)臟對(duì)于進(jìn)一步經(jīng)特異性底物飼養(yǎng)動(dòng)物富集非常有利。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)給動(dòng)物或昆蟲(chóng)提供食物對(duì)微生物庫(kù)進(jìn)行富集，該食物包括針對(duì)具有目的活性的多肽的底物。
“編碼具有目的活性的多肽的DNA”的具體實(shí)施例包括抗微生物活性和其它酶活性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因庫(kù)富含編碼目的酶活性的DNA。
在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，目的活性是選自下組的酶活性磷酸酶、氧化還原酶(E.C.1)、轉(zhuǎn)移酶(E.C.2)；水解酶(E.C3)如酯酶(E.C.3.1)，尤其是脂肪酶和植酸酶，例如糖苷酶(E.C.3.2)，尤其是木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶，例如肽酶(E.C.3.4)，尤其是蛋白酶；裂解酶(E.C.4)；異構(gòu)酶(E.C.5)；連接酶(E.C.6)在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目的酶包括蛋白酶、脂肪酶、β半乳糖苷酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β葡萄糖淀粉酶、酯酶、半纖維素酶、過(guò)氧化酶、氧化酶、漆酶或葡萄糖氧化酶。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用所述方法獲得的酶是淀粉酶，尤其α淀粉酶或β淀粉酶、阿拉伯糖醇酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果膠甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸己酰酯酶、果膠裂解酶、木聚糖酶、纖維素酶、β葡萄糖苷酶、纖維素生物水解酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶(mannanase)和/或葡萄糖醛酸酶(glucuronisidase)。
包含編碼具有目的活性的多肽的DNA的生物的環(huán)境庫(kù)通常是微生物，例如真細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、藻類和/或原生動(dòng)物。
多肽可以是從任何已知生物中獲得的目的酶。優(yōu)選所述酶可來(lái)自微生物，尤其細(xì)菌、絲狀真菌或酵母。
在本發(fā)明的方法中，所述微生物是富集的培養(yǎng)物，即用特異性底物篩選的培養(yǎng)物，其它生物不能在該底物上生長(zhǎng)或生長(zhǎng)減慢。
本發(fā)明方法的另一個(gè)目的是提供從生物的環(huán)境庫(kù)中篩選目的DNA序列的方法，該方法包括a)對(duì)所述生物的環(huán)境庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基和/或條件適于在該生物庫(kù)中富集攜有所述DNA序列的生物；b)從所富集的生物庫(kù)制備基因庫(kù)；c)篩選包含攜帶有目的基因之DNA的文庫(kù)；和d)篩選從步驟c)中獲得的目的DNA序列。
步驟a)和b)已經(jīng)在上面敘述。在步驟c)中，可篩選具有任何目的活性的克隆，所述克隆經(jīng)證實(shí)含有來(lái)源于步驟b)中制備的基因庫(kù)的DNA序列。這些活性的實(shí)例包括酶活性、抗微生物活性或生物活性。在步驟c)中，篩選包含目的基因的基因組DNA的基因庫(kù)，在步驟d)中，從在步驟c)中篩選的DNA基因庫(kù)中篩選目的DNA序列。步驟c)和d)可以按照在本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
然后在特定的條件下和/或與如化學(xué)化合物或試劑聯(lián)合，分析具有目的活性的多肽是否具有所需性能。可根據(jù)本發(fā)明的方法，篩選包含具有目的活性的多肽的基因庫(kù)，所述目的活性如特異性活性和/或特異性目的特性，例如熱穩(wěn)定性、高pH耐受性、洗滌特性、紡織染色、毛染色或漂白特性、在飼養(yǎng)或食物中的影響等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于分析目的活性和/或特性的適當(dāng)?shù)姆治龇椒ā?br> 在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因庫(kù)包括編碼酶的目的基因，在使酶具有活性的條件下篩選含該酶的基因庫(kù)。這指在例如高溫(如60-110℃)和高pH(如10-12)條件(其可對(duì)具有相對(duì)較高熱穩(wěn)定性的堿性酶DNA序列進(jìn)行分離)下，篩選含此酶的文庫(kù)。然而，pH值可以為約0-約12的任何范圍，溫度可為約5-110℃的任何范圍，優(yōu)選約60-約90℃。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供從生物的環(huán)境庫(kù)中制備的基因庫(kù)，該環(huán)境庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該基因庫(kù)包括具有酶、激素或毒素活性的多肽。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該基因庫(kù)包括如上所述目的酶活性。
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說(shuō)明了本發(fā)明，不認(rèn)為這些實(shí)施例以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1富集程序用約1g土壤樣本(NS Collection)接種分別裝有100ml下述培養(yǎng)基的搖瓶，并在250rpm 60℃保溫過(guò)夜。保溫以后搖瓶中的pH值為9.7-9.9。所有富集均用顯微鏡檢查其生長(zhǎng)。
混合下述10倍濃縮的原液，制備富集培養(yǎng)基。
A: KH2PO44.25g/l
NH4Cl 4.25g/lKCl4.25g/lMgSO4,7H2O 6.25g/lCaCl2,2H2O 3.12g/lB: NaHCO330g/lNa2CO330g/lC 酵母提取物 5g/l果膠果膠35 20g/l纖維素 CMC C-48888 Sigma 10g/l纖維素粉末 20g/l淀粉可溶性淀粉 50g/l在高壓滅菌前煮沸。
所有儲(chǔ)存液均高壓滅菌。
混合100ml A+B+C+100ml果膠或纖維素或淀粉和600無(wú)菌水，制備各種液態(tài)富集培養(yǎng)基。
實(shí)施例2富集文庫(kù)物質(zhì)所述富集被用于制備混合的富集文庫(kù)。取所選富集培養(yǎng)物各50ml離心，所得細(xì)胞沉淀用于產(chǎn)生基因庫(kù)。分別根據(jù)淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶和果膠酶活性篩選文庫(kù)而獲得克隆。
實(shí)施例31號(hào)基因庫(kù)的制備用0.9％NaCl洗滌培養(yǎng)物中的細(xì)胞，并匯集到一個(gè)試管中。用Pitcher等(Pitcher D.G.,saunders N.A.,Owen R.J.(1989)用硫氰酸胍快速提取細(xì)菌染色體DNA.Lett.Appl.Microbiol.,8,151-156)敘述的方法提取DNA?；厥?70微克高分子量DNA。在15PSI壓力下，將溶在25％甘油中的約90微克DNA在霧化器(帶DNA插入子的Bio Neb細(xì)胞破碎系統(tǒng)，Glas-Col儀公司)中破碎45秒。得到2-5kb的DNA。將此DNA在蔗糖梯度上分級(jí)分離(Maniatis等)，收集目的級(jí)分并用EtOH或異丙醇沉淀的方法濃縮。為了修整末端，將4微克DNA用EtOH沉淀并重懸于35微升H2O中。
修整DNA以產(chǎn)生鈍性末端。
35μl DNA(4μg)5μl NEB4緩沖液4μl dNTP(2.5mM原液)4μl T4DNA聚合酶2μl Klenow在室溫使反應(yīng)混合液保溫30分鐘，加入200μl1×TE,pH8.0。用1X酚-氯仿抽提混合物，加入1×CIA、0.1體積的3M NaOAC(pH5.2)，并加入2倍體積的96％EtOH，在冰上放置30分鐘，或于-20℃過(guò)夜，并重溶于16μl H2O中。
將末端修整的DNA與EcoRⅤ新鮮消化的pZero(Invitrogen)連接。
用電穿孔法將連接混合物轉(zhuǎn)入DH10B大腸桿菌細(xì)胞中，按300個(gè)zeocin抗性菌落一等份分裝并凍存。這些凍存物構(gòu)成1號(hào)文庫(kù)。
實(shí)施例4從土壤中分離細(xì)菌并制備2號(hào)基因庫(kù)按Prieme A等和Bakken L.R.(FEMS微生物生態(tài)學(xué)21:59-68,1996)描述的方法從土壤中分離細(xì)菌。50g土壤(從丹麥的Roskilde Fjord獲得)與200ml dH2O攪拌1分鐘(Waring攪拌器)并在冰上放置1分鐘。重復(fù)3次。懸浮液靜置2分鐘，以使大的土壤顆粒沉淀。將30ml懸浮液加到離心管中，隨后通過(guò)注射器將10ml Nycodenz(Nycodenz，溶于水中，濃度為0.8g/ml，過(guò)濾除菌，Nycomed pharma A/S批號(hào)207051)加到該管底部。將樣本用搖旋轉(zhuǎn)(swing-out)轉(zhuǎn)頭以10000×g于20℃不間斷離心2小時(shí)。細(xì)菌集中在Nycodenz相和水相的交界面(土樣沉在管底)，用注射器吸出細(xì)菌。
如Pitcher等(Pitcher D.G.,saunders N.A.,Owen R.J.(1989)用硫氰酸胍快速提取細(xì)菌染色體DNA.Lett.Appl.Microbiol.,8,151-156)敘述的方法提取DNA。
用Sau3A限制性內(nèi)切酶部分消化該DNA，并且在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小分級(jí)(Maniatis等)。從瓊脂糖上切下包含大小相當(dāng)于3kb及3kb以上的DNA的瓊脂糖，并且通過(guò)在1.2％瓊脂糖凝膠上的進(jìn)一步電泳濃縮DNA。用GFX試劑盒(Pharmacia)從瓊脂糖塊中分離DNA。
Sau3A消化的DNA與BamHⅠ新鮮消化的pZero-2(Invitrogen)連接。用電穿孔法將連接混合物轉(zhuǎn)入DH10B大腸桿菌細(xì)胞中，按300個(gè)卡那霉素抗性菌落一等份分裝并凍存。這些凍存物構(gòu)成2號(hào)文庫(kù)。
實(shí)施例5分析1號(hào)文庫(kù)的酶活性淀粉酶分析分析包括以下試劑1:0.1％AZCL直鏈淀粉(MegaZyme，澳大利亞)2:0.1M Tris-Cl緩沖液pH93:MilliQ H2O96孔板每孔中標(biāo)準(zhǔn)體積為150μl(15ml/微平板)。
384孔板每孔中為標(biāo)準(zhǔn)體積60μl(25ml/微平板)。
將細(xì)胞培養(yǎng)65小時(shí)，然后將50μl細(xì)胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或?qū)?0μl細(xì)胞吸到384孔板的60μl分析底物中。將分析平板置一袋中50℃保溫過(guò)夜。孔中為蘭色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)。
阿拉伯聚糖酶分析分析包括以下試劑1:0.1％AZCL去支鏈阿拉伯聚糖(MegaZyme，澳大利亞)2:0.1M Tris-Cl緩沖液pH93:MilliQ H2O96孔板每孔中標(biāo)準(zhǔn)體積為150μl。
384孔板每孔中為標(biāo)準(zhǔn)體積60μl。
將細(xì)胞培養(yǎng)65小時(shí)，然后將50μl細(xì)胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或?qū)?0μl細(xì)胞吸到384孔板的60μl分析底物中。將分析平板置一袋中50℃保溫過(guò)夜?？字袨樘m色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)。
半乳聚糖酶分析包括以下試劑1:0.1％AZCL半乳聚糖(MegaZyme，澳大利亞)2:0.1M Tris-Cl緩沖液pH9
3:MilliQ H2O96孔板每孔中標(biāo)準(zhǔn)體積為150μl。
384孔板每孔中為標(biāo)準(zhǔn)體積60μl。
將細(xì)胞培養(yǎng)65小時(shí)，然后將50μl細(xì)胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或?qū)?0μl細(xì)胞吸到384孔板的60μl分析底物中。將分析平板置一袋中50℃保溫過(guò)夜?？字袨樘m色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)。
果膠酶分析利用multidrop僅將150ml分析混合物裝入編號(hào)的黑色微滴板。隨后用Plate Mate pipetting station將50ml細(xì)胞自動(dòng)地加到分析平板中。平板在室溫中(避光)放置約150-180分鐘，隨后用FPM-2熒光極性分析僅以激發(fā)濾光片(excitation-filter)458/22和激發(fā)濾光片530/30的進(jìn)行分析。通常極化值為約90mP到50-70mP，陽(yáng)性克隆的值低于該極化值。
150μl分析混合物34μg/ml熒光素標(biāo)記的檸檬-果膠77％DE=5.0μl 1g/l溶液。
2mM CaCl2=0.5μl 1M溶液含0.1M NaCl的83體積％0.1M甘氨酸緩沖液=125μl緩沖液pH10.0Mili-Q-H2O=20μl。
木聚糖酶分析包括以下試劑1:0.1％AZCL半木聚糖(MegaZyme，澳大利亞)2:0.1M Tris-Cl緩沖液pH93:MilliQ H2O96孔板每孔中標(biāo)準(zhǔn)體積為150μl。
384孔板每孔中為標(biāo)準(zhǔn)體積60μl。
將細(xì)胞培養(yǎng)65小時(shí)，然后將50μl細(xì)胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或?qū)?0μl細(xì)胞吸到384孔板的60μl分析底物中。將分析平板置一袋中50℃保溫過(guò)夜?？字袨樘m色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)。
在平板上篩選木聚糖酶、半乳聚糖酶和淀粉酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在LB瓊脂平板中37℃條件下篩選2號(hào)基因庫(kù)，該LB瓊脂包括25μg/ml卡那霉素作為抗生素篩選標(biāo)記，及0.03％AZCL-木聚糖+0.03％AZCL-半乳聚糖+0.03％AZCL-直鏈淀粉作為酶的底物。菌落周圍形成藍(lán)暈指示酶活性。為鑒定酶活性，將菌落在含每種AZCL底物的LB平板上再次劃線分離，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)淀粉酶陽(yáng)性菌落。
通過(guò)上述分析篩選從1號(hào)文庫(kù)中獲得的陽(yáng)性克隆。
發(fā)現(xiàn)了3個(gè)淀粉酶陽(yáng)性克隆、2個(gè)木聚糖酶陽(yáng)性克隆、2個(gè)果膠酶陽(yáng)性克隆、2個(gè)半乳聚糖酶陽(yáng)性克隆以及8個(gè)阿拉伯聚糖酶陽(yáng)性克隆。
這些結(jié)果證明用本發(fā)明的方法篩選目的DNA序列是可能的。
實(shí)施例6從白蟻幼蟲(chóng)內(nèi)臟中富集纖維素酶材料白蟻(Neotermes castaneus)幼蟲(chóng)從BAM(Bundesanstalt furMaterialforschung und-Prufung，柏林，德國(guó))獲得。
富集步驟連續(xù)飼養(yǎng)幼蟲(chóng)并用無(wú)菌植物物質(zhì)喂養(yǎng)，所述植物物質(zhì)來(lái)源于裸子植物或被子植物(單子葉或雙子葉)，能夠通過(guò)植物細(xì)胞壁的降解酶活性進(jìn)行酶性(內(nèi)源性或外源性)消化。
通過(guò)解剖進(jìn)一步富集(任選)在立體顯微鏡下斬首處死幼蟲(chóng)，之后篩選內(nèi)臟(包括內(nèi)臟內(nèi)容物)并將幾個(gè)幼蟲(chóng)的內(nèi)臟匯集到一起。
DNA制備利用市售DNA試劑盒(FAST DNA-KitH,Bio 101 Inc,1070Joshua Wav,California,US)，從這些混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備DNA。用這種高質(zhì)量的DNA物質(zhì)制備基因組文庫(kù)，例如按如下的方法進(jìn)行用Sau3A消化，進(jìn)行大小分級(jí)分離并選擇特定大小范圍，將其克隆到λ噬菌體-Zap-Express(AH Diagnostic,Stratagene,US)上。試劑盒制造商提供了完整的實(shí)驗(yàn)方法。
RNA制備利用市售RNA試劑盒和公開(kāi)的方法(如H Dalboge,1997,FEMS微生物學(xué)綜述，21,29-42)，從所述混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備總RNA。然后收獲mRNA部分，根據(jù)這部分mRNA，制備相應(yīng)的cDNA。將其用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)代表在給定的時(shí)間表達(dá)的蛋白。用于mRNA、cDNA和cDNA文庫(kù)產(chǎn)生的方法和參考文獻(xiàn)可以在普通的教科書(shū)中得到(還有例如H Dalboge,1997,FEMS微生物學(xué)綜述，21,29-42)。
基因組文庫(kù)的篩選所制備的文庫(kù)富含特別收益于幼蟲(chóng)飼養(yǎng)條件之生物的DNA改進(jìn)噬菌斑篩選方法使之適用于攜有酶底物的平板(例如，用AZCL蘭色顆粒底物制備，其可從MegaZyme獲得)。產(chǎn)生的色暈表明噬菌體上插入了完整的功能基因，其編碼所需纖維素酶活性。將酶底物加到底層而將噬菌體加到另一上層時(shí)，此方法最為有效。陽(yáng)性噬菌斑在AZCL底物平板上就通過(guò)其蘭色暈測(cè)出。
cDNA文庫(kù)的篩選按照表達(dá)克隆方案(如見(jiàn)HDalboge,1997,(FEMS微生物學(xué)綜述21:29-42)，篩選富含高表達(dá)蛋白的cDNA文庫(kù)，所述蛋白可有效降解喂給幼蟲(chóng)的食物。
鑒定所選的克隆在HE Azur交聯(lián)的蘭色顆粒底物(MegaZyme)上最終鑒定了200多個(gè)纖維素酶活性克隆。直接對(duì)各菌落進(jìn)行PCR(PCR方法參照相關(guān)教科書(shū)，可用Advanced Biotechnologies,Surrey，英國(guó)提供的聚合酶)以便區(qū)別并分組。所用引物基于對(duì)正義和反義cDNA克隆質(zhì)粒pYes-2的識(shí)別和擴(kuò)增(購(gòu)自Invitrogene，美國(guó))。
據(jù)此至少鑒定了4個(gè)不同大小的功能基因。
實(shí)施例7從紡織蛾(textile moth)幼蟲(chóng)內(nèi)臟富集蛋白酶材料幕谷蛾幼蟲(chóng)，鱗翅目紡織蛾從德國(guó)的BAM獲得。標(biāo)準(zhǔn)方案在實(shí)施例6中提及。
富集步驟連續(xù)飼養(yǎng)幼蟲(chóng)并用富含蛋白的無(wú)菌物質(zhì)(如革、毛發(fā)和羊毛)喂養(yǎng)。
通過(guò)解剖進(jìn)一步富集(任選)在立體顯微鏡下斬首處死幼蟲(chóng)，之后篩選內(nèi)臟(包括內(nèi)臟內(nèi)容物)并將幾個(gè)幼蟲(chóng)的內(nèi)臟匯集到一起。
DNA制備利用市售DNA試劑盒，從這些混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備DNA。用這種高質(zhì)量的DNA物質(zhì)制備基因組文庫(kù)。
RNA制備利用市售RNA試劑盒和公開(kāi)的方法，從所述混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備總RNA。然后收獲mRNA部分，根據(jù)這部分mRNA，制備相應(yīng)的cDNA。將其用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)代表在給定的時(shí)間表達(dá)的蛋白。
基因組文庫(kù)的篩選所制備的文庫(kù)富含特別收益于幼蟲(chóng)飼養(yǎng)條件之生物的DNA改進(jìn)噬菌斑篩選方法使之適用于攜有酶底物的平板，其可指示噬菌體上的完整功能基因插入子，其編碼所需蛋白酶活性。
cDNA文庫(kù)的篩選按照表達(dá)克隆方案篩選富含高表達(dá)蛋白的cDNA文庫(kù)，所述蛋白可有效降解喂給幼蟲(chóng)的食物。
鑒定所選克隆通過(guò)在含AZCL-酪蛋白蘭色顆粒的底物平板(MegaZyme)上進(jìn)行篩選，可以鑒定蛋白酶活性克隆。根據(jù)它們特異性裂解的蛋白鍵的類型，可以將所選蛋白酶克隆進(jìn)一步細(xì)分。
實(shí)施例8從五月鰓金龜?shù)挠紫x(chóng)內(nèi)臟富集植物細(xì)胞壁降解酶材料從丹麥的棲息地(Zealand)收集五月鰓金龜?shù)挠紫x(chóng)，那里的土壤中富含非常多樣的各種植物碎屑成分。所述幼蟲(chóng)在土壤中自由生長(zhǎng)，用植物物質(zhì)飼養(yǎng)達(dá)3年。
富集步驟連續(xù)飼養(yǎng)幼蟲(chóng)并用非特異性無(wú)菌植物碎屑喂養(yǎng)，所述植物碎屑包括非常廣泛的分類學(xué)組合物。
通過(guò)解剖進(jìn)一步富集(任選)在立體顯微鏡下斬首處死幼蟲(chóng)，之后篩選內(nèi)臟(包括內(nèi)臟內(nèi)容物)并將幾個(gè)幼蟲(chóng)的內(nèi)臟匯集到一起。
DNA制備利用市售DNA試劑盒，從這些混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備DNA。用這種高質(zhì)量的DNA物質(zhì)制備基因組文庫(kù)。
RNA制備利用市售RNA試劑盒和公開(kāi)的方法，從所述混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備總RNA。然后收獲mRNA部分，根據(jù)這部分mRNA，制備相應(yīng)的cDNA。將其用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)代表在給定的時(shí)間表達(dá)的蛋白。
基因組文庫(kù)的篩選所制備的文庫(kù)富含特別收益于幼蟲(chóng)飼養(yǎng)條件之生物的DNA改進(jìn)噬菌斑篩選方法使之適用于攜有酶底物的平板，其可指示噬菌體上攜有(功能性)基因插入子，其編碼所需植物細(xì)胞壁降解活性。
cDNA文庫(kù)的篩選按照表達(dá)克隆方案(如見(jiàn)H Dalboge,1997,(FEMS微生物學(xué)綜述21:29-42)篩選富含高表達(dá)蛋白的cDNA文庫(kù)，所述蛋白可有效降解喂給幼蟲(chóng)的食物。
鑒定所選克隆通過(guò)用各種AZCL交聯(lián)型蘭色顆粒底物(MegaZyme)進(jìn)行篩選，可以鑒定多種類型的細(xì)胞壁降解酶。
實(shí)施例9從地夜蛾屬幼蟲(chóng)富集淀粉酶材料地夜蛾屬幼蟲(chóng)(鱗翅目)從哥本哈根RVAU(皇家獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)大學(xué))(Peter Esbjerg教授)獲得。
富集步驟連續(xù)飼養(yǎng)幼蟲(chóng)并用無(wú)菌的富含淀粉的物質(zhì)喂養(yǎng)幼蟲(chóng)。
通過(guò)解剖進(jìn)一步富集(任選)在立體顯微鏡下斬首處死幼蟲(chóng)，之后篩選內(nèi)臟(包括內(nèi)臟內(nèi)容物)并將幾個(gè)幼蟲(chóng)的內(nèi)臟匯集到一起。
DNA制備利用市售DNA試劑盒，從這些混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備DNA。用這種高質(zhì)量的DNA物質(zhì)制備基因組文庫(kù)。
RNA制備利用市售RNA試劑盒和公開(kāi)的方法，從所述混合的內(nèi)臟物質(zhì)中制備總RNA。然后收獲mRNA部分，根據(jù)這部分mRNA，制備相應(yīng)的cDNA。將其用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)代表在給定的時(shí)間表達(dá)的蛋白。
基因組文庫(kù)的篩選所制備的文庫(kù)富含特別收益于幼蟲(chóng)飼養(yǎng)條件之生物的DNA改進(jìn)噬菌斑篩選方法使之適用于攜有酶底物的平板，其可指示噬菌體上攜有功能基因插入子，其編碼所需淀粉酶活性。
cDNA文庫(kù)的篩選按照表達(dá)克隆方案(如見(jiàn)H Dalboge,1997,(FEMS微生物學(xué)綜述21:29-42)篩選富含高表達(dá)蛋白的cDNA文庫(kù)，所述蛋白可有效降解喂給幼蟲(chóng)的食物。
鑒定所選克隆用AZCL-直鏈淀粉蘭色顆粒底物在平板上篩選酵母(和噬菌體)菌落。用甘氨酸緩沖液(pH10)覆蓋表達(dá)克隆酵母平板可找出強(qiáng)堿性淀粉酶。經(jīng)緩沖液處理后，僅在顆粒周圍出現(xiàn)擴(kuò)散性蘭色暈的菌落是已插入了編碼堿性淀粉酶的基因并已表達(dá)的克隆。
實(shí)施例10從牛的瘤胃內(nèi)容物富集纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶材料用半?yún)捬醴绞街苯訌膸Н浌艿呐?在RVAU,Rorrendegard,Tastrup，丹麥)中取樣富集方法在取樣前幾周內(nèi)，用特定成分的物質(zhì)喂牛，例如喂富含纖維素酶和其它植物細(xì)胞壁降解酶的干草，喂富含淀粉酶的谷粒以及喂富含蛋白酶大豆的。
通過(guò)解剖進(jìn)一步富集(任選)對(duì)進(jìn)一步解剖的部分進(jìn)行顯微鏡檢，顯示瘤胃中不同程度的食物降解。
DNA制備利用市售DNA試劑盒，從這些混合的瘤胃物質(zhì)中制備DNA。用這種高質(zhì)量的DNA物質(zhì)制備基因組文庫(kù)。
RNA制備利用市售RNA試劑盒和公開(kāi)的方法，從所述混合的瘤胃物質(zhì)中制備總RNA。然后收獲mRNA部分，根據(jù)這部分mRNA，制備相應(yīng)的cDNA。將其用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)代表在給定的時(shí)間表達(dá)的蛋白。
基因組文庫(kù)的篩選所制備的文庫(kù)富含特別收益于飼養(yǎng)條件之生物的DNA改進(jìn)噬菌斑篩選方法使之適用于攜有酶底物的平板，其可指示噬菌體上攜有完整功能基因的插入子，其編碼具有目的活性的酶。
cDNA文庫(kù)的篩選按照表達(dá)克隆方案(如見(jiàn)H Dalboge,1997,(FEMS微生物學(xué)綜述21:29-42)篩選富含高表達(dá)蛋白的cDNA文庫(kù)，所述蛋白可有效降解所喂食物。
鑒定所選克隆發(fā)現(xiàn)了幾種酶活性，例如用HE Azur交聯(lián)型蘭色顆粒底物(MegaZyme)鑒定了20多個(gè)纖維素酶活性克隆。用菌落PCR對(duì)所選克隆進(jìn)行辨別和分組。因此鑒定了至少4個(gè)不同大小的功能基因。
權(quán)利要求
1．一種從生物的環(huán)境庫(kù)中產(chǎn)生基因庫(kù)的方法，該基因庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA，該方法包括a)對(duì)所述生物的環(huán)境庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基和/或條件適于在該生物庫(kù)中富集攜有所述DNA的生物，和b)從所富集的生物庫(kù)中制備基因庫(kù)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括所述DNA編碼的基因產(chǎn)物的底物。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述底物構(gòu)成培養(yǎng)基的碳源和/或氮源。
4．權(quán)利要求2或3的方法，其中所述底物包括果膠、直鏈淀粉、纖維素、半乳糖、木糖或阿拉伯糖或者它們的組合。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述富集通過(guò)一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)限制完成。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述生長(zhǎng)條件包括pH和溫度。
7．權(quán)利要求1-6的方法，其中步驟a)中用于富集的生長(zhǎng)條件為pH9-11和溫度50-70℃。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述生物的環(huán)境庫(kù)從動(dòng)物胃或昆蟲(chóng)內(nèi)臟中分離。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述微生物庫(kù)從牛的瘤胃中分離。
10．權(quán)利要求8的方法，其中所述微生物庫(kù)從等翅目、鱗翅目、鞘翅目或雙翅目昆蟲(chóng)的內(nèi)臟中分離。
11．權(quán)利要求10的方法，其中微生物庫(kù)從選自地夜蛾屬、Neotermescastaneus、幕谷蛾和五月鰓金龜?shù)睦ハx(chóng)的內(nèi)臟中分離。
12．權(quán)利要求8-11的方法，其中通過(guò)給動(dòng)物或昆蟲(chóng)提供食物富集所述微生物庫(kù)，該食物包含針對(duì)具有目的活性的多肽的底物。
13．權(quán)利要求1的方法，其中所述基因庫(kù)富含編碼目的酶活性的DNA。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述目的酶活性包括水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶或連接酶。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所述目的酶包括蛋白酶、脂肪酶、β半乳糖苷酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β葡萄糖淀粉酶、酯酶、半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、氧化酶、漆酶或葡萄糖氧化酶。
16．權(quán)利要求14的方法，其中所述目的酶是果膠酶、淀粉酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶或纖維素酶。
17．權(quán)利要求1的方法，其中所述生物的環(huán)境庫(kù)包含微生物。
18．權(quán)利要求17的方法，其中所述生物的環(huán)境庫(kù)包含產(chǎn)酶微生物。
19．權(quán)利要求17的方法，其中所述微生物包括真細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、藻類和/或原生動(dòng)物。
20．權(quán)利要求1的方法，其中所述生物為富集培養(yǎng)物。
21．從生物的環(huán)境庫(kù)中篩選目的DNA序列的方法，該方法包括a)對(duì)所述生物的環(huán)境庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基和/或條件適于在該生物庫(kù)中富集攜有所述DNA序列的生物；b)從所富集的生物庫(kù)制備基因庫(kù)；c)篩選包含攜帶有目的基因之DNA的文庫(kù)；和d)篩選從步驟c)中獲得的目的DNA序列。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述基因庫(kù)包括目的產(chǎn)酶基因。
23．權(quán)利要求21的方法，其中在使所述酶有活性的條件下在所述基因庫(kù)中篩選酶。
24．權(quán)利要求21的方法，其中在所述基因庫(kù)中篩選果膠酶、淀粉酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶或纖維素酶。
25．一個(gè)基因庫(kù)，其從一個(gè)已富集過(guò)的生物環(huán)境庫(kù)中制備，該環(huán)境庫(kù)富含具有目的活性的多肽的編碼DNA。
26．權(quán)利要求25的基因庫(kù)，其中所述編碼具有目的活性的多肽的DNA包括酶、激素或毒素。
27．權(quán)利要求26的基因庫(kù)，其中DNA是酶，該酶包括果膠酶、淀粉酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶或纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及從生物的環(huán)境庫(kù)中制備基因庫(kù)的方法,該基因庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA。本發(fā)明還提供了從生物的環(huán)境庫(kù)中篩選目的DNA序列的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從生物的環(huán)境庫(kù)中制備的基因庫(kù),該環(huán)境庫(kù)富含編碼具有目的活性的多肽的DNA。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1325445SQ99812823
公開(kāi)日2001年12月5日 申請(qǐng)日期1999年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月28日
發(fā)明者托馬斯·桑德?tīng)? 卡斯滕·肖霍爾姆, 托馬斯·謝弗, 萊尼·蘭格, 菲奧納·達(dá)夫納 申請(qǐng)人:諾維信公司