專利名稱：用于生產(chǎn)γ－癸內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備γ-癸內(nèi)酯的新型方法。
γ-癸內(nèi)酯因其器官感覺特性而是一種重要的芳香化合物，它帶有水果味、桃樣香味和芳香性。一般來說，可以由水果生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯。然而，它在水果中的含量極少，使得不能通過提取或蒸餾的方法經(jīng)濟(jì)地分離它。
因此，近年來已經(jīng)進(jìn)行了大量嘗試以生物技術(shù)方法來制備γ-癸內(nèi)酯。大部分方法使用各種酵母進(jìn)行。在這種情況中，通過酵母轉(zhuǎn)化從其中分離的蓖麻油或蓖麻油酸的甲基酯。在該方法中在75小時(shí)內(nèi)獲得的產(chǎn)量在幾毫克/升到9.4g/l之間改變(FR2 734 843)。
此外，這種方法具有使用尿嘧啶-營養(yǎng)缺陷型物質(zhì)的缺點(diǎn)且由此兩個(gè)分離步驟是生物量形成和產(chǎn)生所必不可少的。
本發(fā)明的目的由此是提供一種盡可能提高產(chǎn)量的方法。
通過使用含有Yarrowia lipolytica的培養(yǎng)物可以達(dá)到這一目的。
按照本發(fā)明，能夠在含有其它微生物的混合物中使用Yarrowialipolytica。然而，優(yōu)選將Yarrowia lipolytica用作純培養(yǎng)物。本發(fā)明特別優(yōu)選培養(yǎng)菌株Yarrowia lipolytica HR145(DSM12397)。
作為本發(fā)明所用的培養(yǎng)物底物，可以使用合成、半合成或復(fù)合的培養(yǎng)基。它們包括碳化合物和氮化合物、無機(jī)鹽、微量元素或不含微量元素和維生素。
作為碳化合物，優(yōu)選可以使用碳水化合物、烴類或有機(jī)堿化學(xué)物質(zhì)。可以優(yōu)選使用的化合物的實(shí)例是糖類、醇類和/或糖醇類、有機(jī)酸類或復(fù)合的混合物。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選油類。
作為糖，優(yōu)選使用葡萄糖?？捎玫拇碱悆?yōu)選包括甘油或甘露糖醇?？梢允褂玫挠袡C(jī)酸類優(yōu)選是檸檬酸。復(fù)合的混合物包括例如麥芽汁、酵母提取物、酪蛋白或酪蛋白水解物。作為油，特別可以使用蓖麻油。在這些情況中，根據(jù)本發(fā)明，可以使用兩種或多種所述化合物的混合物。
作為含氮底物，可以使用無機(jī)化合物。它們的實(shí)例是硝酸鹽和銨鹽。同樣，可以使用有機(jī)氮源。它們包括酵母提取物、大豆粉、棉子粉、酪蛋白、酪蛋白水解物、面筋和玉米漿。還能夠使用兩種或多種所述的化合物作為混合物。
可以使用的無機(jī)鹽包括例如硼酸鹽、碳酸鹽、氯化物、鉬酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽。作為金屬，所述的鹽優(yōu)選含有鈣、鐵、鉀、鈷、銅、鎂、錳、鈉或鋅。根據(jù)本發(fā)明，還可以使用兩種或多種所述鹽的混合物。
培養(yǎng)溫度優(yōu)選在10-40℃的范圍。特別優(yōu)選的范圍在20-35℃，極為優(yōu)選的范圍在25-30℃。
培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為4-9。特別優(yōu)選的范圍在5-8。
在生產(chǎn)過程中，充分通氣是必要的?？梢杂纱嗽O(shè)計(jì)本發(fā)明可以使用的反應(yīng)器。一般來說，根據(jù)本發(fā)明，由此可以使用適合于需氧方法且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的所有生物反應(yīng)器。優(yōu)選可以使用任何適合于需氧浸沒方法的所有裝置。即根據(jù)本發(fā)明，可以使用不帶有或帶有機(jī)械混合裝置的容器。例如，前者包括振蕩器、泡罩塔(Blasensulen)反應(yīng)器或環(huán)路(Schlaufen)反應(yīng)器。后者優(yōu)選包括所有公知帶有以任意方式設(shè)計(jì)的攪拌器的裝置。
本發(fā)明的方法可以連續(xù)進(jìn)行或間歇式進(jìn)行。直至達(dá)到最大量產(chǎn)物的發(fā)酵時(shí)間在36-72小時(shí)的范圍，優(yōu)選48-66小時(shí)的范圍，根據(jù)接種的培養(yǎng)物來計(jì)算。
根據(jù)本發(fā)明，在接種的開始階段、生長過程中或生長完全后加入底物。這可以通過一次添加底物或通過在該過程中連續(xù)依次添加底物來實(shí)現(xiàn)。
然而，優(yōu)選在接種培養(yǎng)物后許多小時(shí)的期限內(nèi)進(jìn)行連續(xù)添加。
使用本發(fā)明所述的方法令人意外地能夠在低于70小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)11g/l以上的γ-癸內(nèi)酯。通過下列實(shí)施例來更具體地描述本發(fā)明和相關(guān)的令人意外的發(fā)現(xiàn)。
給帶有側(cè)頸的兩個(gè)500ml錐形瓶中裝入培養(yǎng)基(1.461g的Na2HPO4×12H2O、0.352g的KH2PO4、0.53g的脲、0.07g的Tween 80、5g的酵母粉、1g的蓖麻油和100ml的水)并將其在121℃下的高壓滅菌器內(nèi)滅菌15分鐘。在冷卻至室溫后，給各燒瓶中接種500μl的Yarrowialipolytica HR145麥芽汁肉湯培養(yǎng)物。
在27℃和100rpm下在回旋機(jī)上將燒瓶培養(yǎng)24小時(shí)。2．在10l發(fā)酵罐內(nèi)生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯將9.8l水裝入發(fā)酵罐并向其中加入14.61g的Na2HPO4·12H2O、53g的脲、50g的MgSO4·7H2O、0.04g的核黃素、500g的酵母粉、7.0g的Tween 80、100g的蓖麻油和5g的消泡劑。在121℃下將該培養(yǎng)基在原位滅菌30分鐘。此外，在高壓滅菌器內(nèi)將稀氫氧化鈉溶液和硫酸以及蓖麻油各500g滅菌。冷卻后，使消泡劑探頭與NaOH的放液接頭連接。在滅菌后pH約為pH7.9。用稀硫酸將pH調(diào)節(jié)至7.0。攪拌速度為400rpm；通氣量為3l/分鐘的壓縮空氣；溫度為27℃。
通過無菌放液接頭給所述發(fā)酵罐中接種初級(jí)培養(yǎng)物。在發(fā)酵過程中，進(jìn)一步加入氫氧化鈉溶液以便將pH保持在pH7.0。根據(jù)需要自動(dòng)添加消泡劑。接種14小時(shí)后，開始添加底物。在4小時(shí)過程中添加500g的蓖麻油。
在約52小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間后，終止發(fā)酵。當(dāng)不再添加更多的氫氧化鈉溶液1小時(shí)時(shí)，達(dá)到終止發(fā)酵的時(shí)間。為了終止發(fā)酵，使用濃硫酸將發(fā)酵罐內(nèi)含物的pH調(diào)至pH2.0并加熱至80℃30分鐘。冷卻后，壓榨出內(nèi)含物用于隨后的檢測(cè)。根據(jù)HPLC,γ-癸內(nèi)酯的終濃度為11,500-12,500ppm。3-羥基-γ-癸內(nèi)酯與γ-癸內(nèi)酯之比小于0.2。
在離心后如果合適，通過公知的物理方法(蒸餾法、提取法等)從所得的培養(yǎng)物肉湯中分離γ-癸內(nèi)酯。3．300l規(guī)模的生產(chǎn)如實(shí)施例1中所述精確制備200ml的初級(jí)培養(yǎng)物并用于接種300l發(fā)酵罐。將140l水預(yù)先加入所述發(fā)酵罐并向其中加入742g的脲、49g的KH2PO4、12g的H2O、7g的酵母提取物和98g的Tween80。在121℃下將該培養(yǎng)基在原位滅菌30分鐘。
冷卻后，使消泡劑探頭與NaOH的放液接頭連接。在滅菌后pH約為7.0。將攪拌速度設(shè)定為180rpm；通氣量達(dá)35l/分鐘且溫度為27℃。在無菌條件下給所述發(fā)酵罐中接種200ml的初級(jí)培養(yǎng)物。在發(fā)酵過程中，使用氫氧化鈉溶液將pH保持在7.0的恒定值。接種約16小時(shí)后，開始添加蓖麻油(7.4kg)且再過4小時(shí)后完成添加。
在69小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間后，終止發(fā)酵。γ-癸內(nèi)酯的終濃度為12.3g/l。由于僅形成了1.53g/l的3-羥基-γ-癸內(nèi)酯，所以3-羥基-γ-癸內(nèi)酯與γ-癸內(nèi)酯之比為0.125。
權(quán)利要求
1．在生物反應(yīng)器內(nèi)制備γ-癸內(nèi)酯的方法，其特征在于使用含有Yarrowia lipolytica的培養(yǎng)物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用由Yarrowialipolytica組成的純培養(yǎng)物。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2之一所述的方法，其特征在于使用Yarrowia lipolytica HR 145(DSM 12397)。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3中之一所述的方法，其特征在于使用合成、半合成或復(fù)合的底物。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4中之一所述的方法，其特征在于使用含有碳化合物或氮化合物、無機(jī)鹽、微量元素和/或維生素的底物。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述底物中含有的碳化合物是糖類、糖醇類、醇、有機(jī)酸類、復(fù)合混合物、油類或這些物質(zhì)中的兩種或多種的混合物。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所用底物中含有葡萄糖、甘油、甘露糖醇、檸檬酸、麥芽汁、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物和蓖麻油或這些物質(zhì)中的兩種或多種的混合物。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中之一所述的方法，其特征在于使用含有無機(jī)化合物和/或含有有機(jī)化合物的底物。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于使用硝酸鹽、銨鹽、酵母提取物、大豆粉、棉子粉、酪蛋白、酪蛋白水解物、面筋和玉米漿。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-9中之一所述的方法，其特征在于使用金屬鈉、鉀、鎂、錳、鈣、鋅或鐵的硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物、碳酸鹽或磷酸鹽或含有這些化合物的兩種或多種底物的混合物。
11．根據(jù)權(quán)利要求1-10中之一所述的方法，其特征在于溫度在10-40℃的范圍，優(yōu)選20-35℃。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-11中之一所述的方法，其特征在于pH在4-11的范圍，優(yōu)選5-8。
13．Yarrowia lipolytica HR 145(DSM 12397)。
14．權(quán)利要求13的Yarrowia lipolytica用于制備γ-癸內(nèi)酯的用途。
15．γ-癸內(nèi)酯的制備方法，其特征在于在發(fā)酵溶液中羥基-γ-癸內(nèi)酯與γ-癸內(nèi)酯之比小于或等于0.25。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用含Yarrowia lipolytica的培養(yǎng)物制備γ癸內(nèi)酯的方法。
文檔編號(hào)C12R1/645GK1324409SQ99812536
公開日2001年11月28日 申請(qǐng)日期1999年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月24日
發(fā)明者J·拉本霍爾斯特, I·加特菲爾德 申請(qǐng)人:哈爾曼及賴默股份有限公司