專利名稱：在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和篩選目的dna文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和篩選目的多核苷酸序列文庫的方法。
背景技術(shù)：
絲狀真菌已經(jīng)被廣泛用作多肽商業(yè)生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。然而，當(dāng)想要生產(chǎn)具有特殊變化特征例如，熱穩(wěn)定性，pH活性變化范圍，比活性，底物特異性，Km,Vmax等等的多肽變異體時，由于在獨(dú)立轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化頻率低和拷貝數(shù)目的差異，變異體編碼序列文庫的構(gòu)建和篩選通常需要使用中介宿主，例如，細(xì)菌細(xì)胞或酵母。
在酵母中構(gòu)建目的多核苷酸序列文庫的幾種方法已經(jīng)被公開，其中于轉(zhuǎn)化相應(yīng)生產(chǎn)宿主，如具有目的多核苷酸序列潛在變異體的絲狀真菌前先在酵母中篩選文庫。
然而經(jīng)常是，在酵母或細(xì)菌中篩選鑒定的多核苷酸序列，當(dāng)轉(zhuǎn)化至相應(yīng)生產(chǎn)型絲狀真菌細(xì)胞時不能表達(dá)或以低水平表達(dá)。這可能由于很多原因，包括密碼子使用的差異，mRNA水平的調(diào)節(jié)，易位裝置，翻譯后修飾機(jī)制(例如，半胱氨酸連接，糖基化和?；Ｊ?，等等。
第二，是否目的多核苷酸序列會在生產(chǎn)宿主中以商業(yè)性應(yīng)用水平表達(dá)是不需預(yù)測的。例如，如果篩選文庫時使用的生物是，例如，細(xì)菌或酵母的細(xì)胞，相應(yīng)的生產(chǎn)型宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞，那么蛋白酶的特點(diǎn)不同。因此，已經(jīng)在酵母中被鑒定的編碼一個或多個目的特征的序列可能被在產(chǎn)物相關(guān)性絲狀真菌宿主細(xì)胞中的蛋白酶所降解。而且，為了通過改變調(diào)節(jié)蛋白或調(diào)節(jié)序列的功能而獲得表達(dá)產(chǎn)物的最佳產(chǎn)量需要對生產(chǎn)宿主的直接操作。
A.Aleksenko和A.J.Clutterbuck(1997.真菌的遺傳學(xué)和生物學(xué)(FungalGenetics and Biology)21:373-387)發(fā)表了使用自主復(fù)制載體，或自主復(fù)制序列(ARS)用于基因克隆和表達(dá)研究。AMA1(在曲霉屬中自主維持)是所討論的質(zhì)粒復(fù)制子元件之一。它由被稱為MATE1(曲霉屬移動型轉(zhuǎn)化增強(qiáng)子)的一種基因組重復(fù)單位以兩個反向拷貝構(gòu)成，其間由一段0.3kb的中心間隔臂分隔。AMA1啟動質(zhì)粒復(fù)制不需要重排，多聚體化(multimerization)或染色體整合。
發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以AMA1為基礎(chǔ)的質(zhì)粒在絲狀真菌中基因克隆時提供兩個優(yōu)點(diǎn)。第一是轉(zhuǎn)化的高頻率，這既增加了潛在文庫的大小，也可排除在中介宿主例如大腸埃希菌中擴(kuò)增文庫的需要，因此可直接用連接混合物轉(zhuǎn)化受體曲霉屬菌株。第二，通過為基因表達(dá)提供穩(wěn)定的和標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境，轉(zhuǎn)化株的性質(zhì)將是一致的。
本發(fā)明的一個目的是通過使用附加型復(fù)制的、DNA載體，提供用于在絲狀真菌細(xì)胞中構(gòu)建和篩選目的多核苷酸序列文庫的改進(jìn)方法，以提供在獨(dú)立轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的高頻轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)的一致高水平。通過縮小在獨(dú)立轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中拷貝數(shù)的差異，可以直接根據(jù)目的特征的表達(dá)鑒定目的多肽變異體。
相應(yīng)地，本發(fā)明第一方面涉及在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和挑選或篩選目的多核苷酸序列文庫的方法，該方法包括(a)用DNA載體群轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中每個載體包括(ⅰ)編碼真菌篩選標(biāo)記和真菌復(fù)制起始序列的多核苷酸序列，其中所述標(biāo)記和復(fù)制起始序列在群體中不變化；和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中DNA載體群包含所述多核苷酸序列的一種以上變異體；(b)在選擇壓力下培養(yǎng)細(xì)胞；(c)挑選或篩選一個或多個表達(dá)目的特征的轉(zhuǎn)化株；和(d)分離目的轉(zhuǎn)化株。
其他方面，本發(fā)明涉及真菌復(fù)制起始序列在構(gòu)建目的多核苷酸序列文庫和篩選或挑選這類多核苷酸序列文庫中的應(yīng)用。
附圖簡述

圖1表示質(zhì)粒pENI1298的限制圖譜，其構(gòu)建在實(shí)施例1中描述；圖2表示質(zhì)粒pENI1299的限制圖譜，其構(gòu)建在實(shí)施例1中描述；圖3表示實(shí)施例5中描述的質(zhì)粒pDM156.2,pJRoy47和pDM222.A的限制圖譜；和圖4表示實(shí)施例5中描述的質(zhì)粒pJRoy44的限制圖譜。
發(fā)明詳述在第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和挑選或篩選目的多核苷酸序列文庫的方法，該方法包括(a)用DNA載體群轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中每個載體包括(ⅰ)編碼真菌篩選標(biāo)記和真菌復(fù)制起始序列的多核苷酸序列，其中所述標(biāo)記和復(fù)制起始序列在群體中不變化；和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中DNA載體群包含所述多核苷酸序列的一種以上變異體；(b)在選擇壓力下培養(yǎng)細(xì)胞；(c)挑選或篩選一個或多個表達(dá)目的特征的轉(zhuǎn)化株；和(d)分離目的轉(zhuǎn)化株。
術(shù)語，“目的多核苷酸序列文庫”表示編碼或具有相同目的功能或活性的多核苷酸序列的集合。文庫可以是“目的多核苷酸序列的變異體的文庫”，這里將其定義為變異體的集合，其中變異體因相對于親本多核苷酸序列具有一個或多個修飾而不同于該親本多核苷酸序列。方便地，所述多核苷酸序列或變異體由至少一個目的親本多核苷酸序列經(jīng)誘變產(chǎn)生，優(yōu)選隨機(jī)誘變，導(dǎo)致在集合中最少有4個且優(yōu)選最少有25個不同多核苷酸序列。對引起親本多核苷酸序列突變的各種有用方法在下面題為“隨機(jī)誘變”和“定域隨機(jī)誘變”部分描述。術(shù)語“修飾”意指在與突變體對比時，在序列中取代，插入和/或缺失一個或多個核苷酸，也可包括兩個或多個不同親本多核苷酸的雜合體。
多核苷酸序列或變異體也可以是親本多核苷酸序列的天然等位基因變異的結(jié)果。等位基因變異體指占居相同染色體位置的基因的兩個或多個替代形式之任一。等位基因的變異通過突變天然地引起且可導(dǎo)致群體內(nèi)表型多態(tài)性。基因突變可以是靜止的(例如，編碼的多肽無變化)或可以編碼有改變了的氨基酸序列的多肽。而且，此文庫的多核苷酸序列并非從一個或多個親本核苷酸序列產(chǎn)生，而是衍生于不同的來源，且編碼來源各異，但具有相同活性或功能的高度相關(guān)的多肽。在此上下文中，“高度相關(guān)”是指多肽具有相同的活性或功能并且此外由具有在下面題為“DNA改組”部分定義的共享保守區(qū)的多核苷酸序列所編碼。
術(shù)語“衍生于”意指多核苷酸序列從特定來源如微生物中分離。多核苷酸序列可以是從無法培養(yǎng)的生物產(chǎn)生的。多核苷酸序列可以是任何具有或編碼目的生物活性或功能的多核苷酸序列，且包括至少六個核苷酸的亞序列以允許核苷酸序列變異體的產(chǎn)生。
關(guān)于文庫中包含的多核苷酸序列所用的術(shù)語“相同活性或功能”意指多核苷酸序列編碼具有相同或相似生物活性或功能(定性判定)的多肽或多核苷酸序列本身具有相同(定性的)活性或功能。例如，多核苷酸序列可具有啟動子活性，即能啟動轉(zhuǎn)錄，或可編碼帶有相同定性活性或功能的多肽，所述活性或功能如相同酶活性或功能，例如蛋白酶，脂肪酶或淀粉酶活性。
術(shù)語“DNA載體”是多核苷酸序列，其具有自主復(fù)制的能力且其能夠包含目的序列。因此一個DNA載體包含復(fù)制起始序列，諸如起點(diǎn)(例如ColE1起點(diǎn)，F(xiàn)1起點(diǎn)，M13起點(diǎn)，2μ起點(diǎn)(酵母)，oriP(EB病毒)(pi))。例如DNA載體可以是質(zhì)粒。
術(shù)語“其中DNA載體群包含多核苷酸序列的一種以上變異體”意指DNA載體群包含編碼或具有目的生物功能或活性的不同的多核苷酸序列。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中目的多核苷酸序列是多肽編碼序列。術(shù)語“多肽”包括肽，寡肽，和蛋白質(zhì)，因此不限于特定長度的編碼產(chǎn)物。多肽可以是宿主細(xì)胞天然的或可以是異源的多肽。術(shù)語“異源的多肽”定義為宿主細(xì)胞的非天然多肽。多肽也可以是重組多肽，其為宿主細(xì)胞天然的多肽，被包含一個或多個外源控制序列的核酸序列編碼，所述控制序列參與該多肽的生產(chǎn)。編碼該多肽的核酸序列可以由下述的某種方式操作。多肽可以是野生型多肽，或經(jīng)使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的相應(yīng)變異體。多肽也可以是雜合體多肽，其包含從至少兩種不同多肽獲得的部分或全部多肽序列的組合，其中這些多肽有一種或以上可以是對所述細(xì)胞而言異源的。多肽進(jìn)一步包括上述多肽的天然等位基因變異和基因工程變異。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，目的多核苷酸序列是通常與多肽編碼序列相關(guān)的控制序列?？刂菩蛄邪ㄅc編碼該多肽序列的核酸序列可操作連接的全部成分，或參與該多肽的生產(chǎn)的全部成分。這些控制序列包括但不局限于此處所述的啟動子，信號序列，前肽序列，轉(zhuǎn)錄終止子，前導(dǎo)序列，啟動子識別序列，增強(qiáng)子序列和poly-A序列。在另一個實(shí)施方案中，目的多核苷酸序列是多肽編碼序列(或此序列的一部分)和a)控制序列(或此控制序列的一部分)或b)兩種或多種控制序列(或這些控制序列的一部分)的組合。每種控制序列對編碼序列而言可以是天然的或外源的。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，由目的多核苷酸序列編碼的多肽是抗體或其一部分，抗原，凝血因子，酶，激素或激素變異體，受體或其一部分，調(diào)節(jié)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，報(bào)道蛋白(reporter)，或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂解酶，異構(gòu)酶，或連接酶。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，過氧化氫酶，纖維素酶，殼多糖酶，角質(zhì)素酶(cutinase)，脫氧核糖核酸酶，葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，鹵過氧物酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，mutanase，氧化酶，果膠分解酶，過氧化物酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，或木聚糖酶。脂肪酶的具體例子是Thermomyces lanuginosa的脂肪酶或該酶的變異體，例如WO97/04079所公開的已在成熟脂肪酶N-末端增加了延伸區(qū)的變異體。
在另一個實(shí)施方案中，所述多肽是人類胰島素或其類似物，人類生長激素，促紅細(xì)胞生成素，或促胰島素激素。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述控制序列是啟動子序列，優(yōu)選真菌啟動子，諸如從編碼米曲霉TAKA淀粉酶的基因衍生的啟動子，NA2-tpi(編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的啟動子的雜合體)和黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶的啟動子。
在另一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述控制序列是啟動子識別序列，如amyR識別序列(WO94/01470),creA(94/13820)和areA(WO95/35385)。
與本發(fā)明有關(guān)的其它目的控制序列的例子列于下面題為“DNA載體和控制序列”的部分。
絲狀真菌的篩選標(biāo)記術(shù)語“選擇壓力”在這里定義為在有效量篩選試劑存在或缺失的情況下，培養(yǎng)包含帶有真菌篩選標(biāo)記基因和目的多核苷酸序列的DNA載體的絲狀真菌細(xì)胞。所述篩選試劑的有效量這里定義為足以從不包含篩選標(biāo)記的細(xì)胞中挑選包含篩選標(biāo)記的細(xì)胞的量。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，真菌篩選標(biāo)記選自能提供對殺生物劑或病毒毒性的抗性，對重金屬毒性的抗性或賦予營養(yǎng)缺陷型以原養(yǎng)型(prototrophy)的產(chǎn)物的編碼基因。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，從酶獲得所述原養(yǎng)型，此酶選自以下代謝途徑核苷酸合成，輔因子合成，氨基酸合成，乙酰胺代謝，脯氨酸代謝，硫酸代謝，和硝酸代謝。
在更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真菌篩選標(biāo)記選自以下基因argB(鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)，amdS(乙酰胺酶)，bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)，hemB(膽色素原合酶)，hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD(硝酸鹽還原酶)，prn(脯氨酸透性酶)，pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)，pyroA,riboB,sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)，和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)。
在合適的培養(yǎng)基中并在適合篩選或挑選轉(zhuǎn)化株的條件下培養(yǎng)真菌細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化體包含帶有或編碼目的特征的目的多核苷酸序列變異體。可以按照本領(lǐng)域篩選多核苷酸序列文庫的熟知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。
復(fù)制起始序列在這里使用的術(shù)語“真菌復(fù)制起始序列”定義為能夠支持染色體外分子如質(zhì)粒等DNA載體在真菌宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的核苷酸序列，通常沒有該DNA載體的結(jié)構(gòu)重排或整合入宿主細(xì)胞基因組。復(fù)制起始序列可以是任何來源只要它能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)復(fù)制起始活性。例如復(fù)制起始序列可以是賦予質(zhì)粒在曲霉屬中復(fù)制的能力的人源端粒(telomer)(Aleksenko和Ivanova,Mol.Gen.Genet.260(1998)159-164)。優(yōu)選地，復(fù)制起始序列從絲狀真菌細(xì)胞獲得，更優(yōu)選曲霉屬，鐮孢霉屬，或鏈格孢屬的菌株，更優(yōu)選構(gòu)巢曲霉，米曲霉，黑曲霉，尖孢鐮孢或互格鏈格孢的菌株。
真菌復(fù)制起始序列可以用本領(lǐng)域熟知的方法鑒定。例如，所述序列可以是目的生物體的基因片段中能夠在酵母中維持自主復(fù)制的序列(Balance和Tumer，基因，36(1985),321-331)，在酵母中的自主復(fù)制是在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制能力的指征。特定序列在真菌內(nèi)的復(fù)制起始活性也可以通過用所選質(zhì)粒復(fù)制子轉(zhuǎn)化真菌并挑選帶有不規(guī)則形態(tài)的菌落來判定，不規(guī)則的形態(tài)意味著切割(sectorial)質(zhì)粒的丟失，其將導(dǎo)致當(dāng)挑選在此質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的基因時在選擇培養(yǎng)基上無法生長(Gems等，基因，98(1991)61-67)。用此法分離了AMA1。分離復(fù)制起始序列的另一方法是分離天然質(zhì)粒(例如由Tsuge等就互格鏈格孢的報(bào)道，遺傳學(xué)，146(1997)111-120)。
真菌復(fù)制起始序列的例子包括但不局限于構(gòu)巢曲霉的ANS1和AMA1序列，例如分別見Cullen,D.，等(1987，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)15:9163-9175)和Gems,D.，等(1991，基因，98:61-67)。
術(shù)語“復(fù)制起始活性”此處用它的傳統(tǒng)意思，即指序列能夠支持染色體外分子如質(zhì)?；駾NA載體在真菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。
術(shù)語“沒有質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)重排”用在這里意思是質(zhì)粒的任何部分既沒有被缺失或被插入質(zhì)粒的另一部分，也沒有任何宿主基因組DNA插入該質(zhì)粒。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中使用的復(fù)制起始序列是選自下組的核酸序列(a)至少50％相同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列，并能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)起始復(fù)制的核苷酸序列；(b)能夠起始復(fù)制的核苷酸序列，其在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與下列兩種物質(zhì)雜交(ⅰ)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互補(bǔ)鏈，其中低嚴(yán)謹(jǐn)性條件定義為在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切并變性的鮭精DNA，和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，洗滌條件定為50℃的2×SSC,0.2％SDS中30分鐘；和(c)(a)或(b)的亞序列，其中該亞序列能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)起始復(fù)制。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的核酸序列的相同程度至少50％，更優(yōu)選約60％，更優(yōu)選約70％，更優(yōu)選約80％，更優(yōu)選約90％，最優(yōu)選約97％(此后稱作“同源多核苷酸”)。同源多核苷酸也包括在真菌細(xì)胞內(nèi)有復(fù)制起始活性的SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的亞序列。為達(dá)本發(fā)明的目的，相同程度可以使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序適當(dāng)判斷，例如由GCG程序包提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學(xué)雜志，48,443-45)，多核苷酸序列的對比使用下列設(shè)置的GAP:GAP生成罰分為5.0,GAP延伸罰分為0.3。
雜交指用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡法，在嚴(yán)謹(jǐn)性由低到高條件下(即，預(yù)雜交和雜交條件為42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200μg/ml剪切并變性的鮭精DNA，和分別對應(yīng)于低，中和高嚴(yán)謹(jǐn)性的25,35或者50％甲酰胺)，將復(fù)制起始序列與來源于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列的寡核苷酸探針雜交。為了鑒別與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源的克隆或DNA，將雜交反應(yīng)用2×SSC,0.2％SDS洗三次每次30分鐘，優(yōu)選洗滌溫度至少50℃，更優(yōu)選至少55℃，更優(yōu)選至少60℃，更優(yōu)選至少65℃，更優(yōu)選至少70℃，最優(yōu)選至少75℃。
寡核苷酸探針可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或它們各自的亞序列。寡核苷酸探針還可以比完整序列短很多，但至少為15，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少40個核苷酸長。既可以用DNA探針也可以用RNA探針。
通常將探針標(biāo)記以檢測相關(guān)基因(例如，用32P,3H,35S，生物素，或抗生物素蛋白標(biāo)記)。例如，與32P-,3H-，或35S-標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交的分子可以用X-線膠片檢測。
當(dāng)分離本發(fā)明應(yīng)用的復(fù)制起始序列時，從預(yù)計(jì)含有該序列的上述生物體制備基因組DNA,cDNA或組合型化學(xué)庫，從中篩選與上述具有復(fù)制起始活性的寡核苷酸探針雜交的DNA。這類其他生物體的基因組DNA或其他DNA可以用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他分離技術(shù)分離。文庫來源的DNA或分離的DNA可被轉(zhuǎn)移和固定在硝酸纖維素膜或其他合適的載體物質(zhì)上。然后可按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法鑒定與SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2同源的克隆或DNA。
用于分離或克隆具有復(fù)制起始活性的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，包括從基因組DNA或cDNA中分離。從這樣的DNA中克隆可受以下影響，例如應(yīng)用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，檢測具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段(見，例如，Innis等，1990,PCR方法及應(yīng)用指南，AcademicPress,New York)。也可以用其他核酸擴(kuò)增方法諸如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，復(fù)制起始序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列，或它們各自的功能亞序列。例如，SEQ ID NO:1的功能亞序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中刪除了5’和/或3’端的一個或多個核苷酸的核酸序列。優(yōu)選地，序列包含至少100個核苷酸，更優(yōu)選至少1000個核苷酸，最優(yōu)選至少2000個核苷酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的序列至少包含SEQ ID NO:2表示的核酸序列。
DNA載體和控制序列在包括編碼真菌篩選標(biāo)記的多核苷酸序列，真菌復(fù)制起始序列和目的多核苷酸序列的DNA載體中，所述多核苷酸序列可以編碼一種多肽，該序列被可操作連接至一個或多個能指導(dǎo)該編碼序列表達(dá)的控制序列。或者，所述多核苷酸序列是一種控制序列，通常根據(jù)所選控制序列的不同，將所示多核苷酸序列可操作連接到多肽編碼序列上，以便估計(jì)該控制序列的活性(并因此能夠挑選帶有所需特征的親本控制序列的變異體)。
用于連接DNA載體各元件的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的(例如，見，Sambrook等，1989，出處同上)。
術(shù)語“可操作連接”這里定義為一種構(gòu)型，其中控制序列被放置在相對于所述多肽編碼序列的相應(yīng)位置，以便使該控制序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)或參與多肽的生產(chǎn)。
在后面進(jìn)一步詳細(xì)討論不同的控制序列?？刂菩蛄惺悄切┍豢刹僮鬟B接到目的多核苷酸序列上者(當(dāng)目的多核苷酸序列編碼多肽時)，和那些組成目的多核苷酸序列者(當(dāng)多核苷酸序列是控制序列時)。可以理解，一個或相同控制序列可作為目的多核苷酸序列(當(dāng)文庫是控制序列文庫時)，或作為參與目的多核苷酸序列所編碼多肽的生產(chǎn)的控制序列(當(dāng)文庫是編碼多肽的目的多核苷酸序列庫時)，下文中將要包括對控制序列的兩類應(yīng)用。
控制序列可以是合適的啟動子序列，即由宿主細(xì)胞識別以便表達(dá)多肽編碼序列的核酸序列。啟動子序列包含調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是任何在指定宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列，其包括突變的，截?cái)嗟?，和雜合的啟動子，并可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因中獲得。
用于指導(dǎo)多肽編碼核苷酸序列在絲狀真菌宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的例子有獲自以下基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸的穩(wěn)定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛菌霉葡萄糖淀粉酶(glaA),Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶，構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶，尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(美國專利第4,288,627號)，及其突變的，切斷的，和雜合的啟動子。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的特別優(yōu)選的啟動子是TAKA淀粉酶，NA2-tpi(黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因啟動子的雜合體)，和glaA啟動子。
控制序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即被絲狀真菌細(xì)胞識別而終止轉(zhuǎn)錄的序列?？蓪⒔K止序列可操作連接到多肽編碼核苷酸序列的3’末端。本發(fā)明中可以使用任何在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有功能的終止子。
優(yōu)選的終止子來自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡萄糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
控制序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，即對絲狀真菌細(xì)胞翻譯很重要的mRNA非翻譯區(qū)。可將前導(dǎo)序列可操作連接到多肽編碼核苷酸序列的5’末端。本發(fā)明中可以使用任何在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有功能的前導(dǎo)序列。
優(yōu)選的前導(dǎo)序列來自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因。
控制序列也可以是多聚腺苷化序列，即可操作連接到多肽編碼核苷酸序列的3’末端的序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時，由絲狀真菌細(xì)胞識別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷化殘基的信號。本發(fā)明可以使用在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有功能的任何多聚腺苷化序列。
優(yōu)選的多聚腺苷化序列來自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡萄糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶，和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
控制序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼連接到所述多肽氨基末端的氨基酸序列，該序列指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。所述多肽編碼性核苷酸序列的5’-末端可天然含有信號肽編碼區(qū)，且該區(qū)天然與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段連接在同一翻譯讀碼框架中?；蛘?，編碼序列的5’-末端可以包含外源信號肽編碼序列。在該編碼序列不包含信號肽編碼區(qū)時需要該外源信號肽編碼區(qū)?；蛘?，可僅將外源信號肽編碼區(qū)代替天然信號肽編碼區(qū)以便增強(qiáng)該多肽分泌。信號肽的編碼區(qū)可獲自曲霉屬物種的葡萄糖淀粉酶或淀粉酶的基因，或Rhizomucor物種的脂肪酶或蛋白酶的基因。然而，在本發(fā)明中可以用指導(dǎo)表達(dá)多肽進(jìn)入絲狀真菌細(xì)胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)。
有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶基因，黑曲霉中性淀粉酶基因，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因，或Humicola lanuginosa纖維素酶基因獲得的信號肽編碼區(qū)。
控制序列也可以是前肽編碼區(qū)，其編碼定位于多肽氨基端的氨基酸序列。已知所得多肽是酶原或前多肽(或某些情況下為酶原)。前多肽一般是無活性的，催化或自催化切割可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓挠谢钚缘亩嚯?。前肽編碼區(qū)可從Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因，或嗜熱毀絲霉漆酶基因中獲得(WO95/33836)。
信號肽和前肽區(qū)兩者都存在于多肽的氨基末端，前肽區(qū)緊鄰多肽的氨基末端，信號肽區(qū)緊鄰前肽區(qū)的氨基末端。
多肽編碼核苷酸序列也可以被可操作連接于一個或多個下述核酸序列，其編碼有利于指導(dǎo)所述多肽表達(dá)的一個或多個因子，例如，轉(zhuǎn)錄活化因子(如，反式作用因子)，伴侶蛋白，和加工型蛋白酶。在本發(fā)明中可以使用任何在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有功能的因子。編碼一或多種這類因子的核酸并非必須與所述多肽編碼核苷酸序列一前一后地排列。
活化因子是一種蛋白，其激活多肽編碼核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄(Kudoa等，1990，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO Journal)9:1355-1364；Jarai和Buxton,1994，當(dāng)代遺傳學(xué)(Current Genetics)26:2238-244；Verdier,1990，酵母6:271-297)。編碼活化因子的核酸序列可以從編碼釀酒酵母血紅素活化因子蛋白1(hapl)，釀酒酵母半乳糖代謝蛋白4(gal4)，構(gòu)巢曲霉氨調(diào)節(jié)蛋白(areA)，和米曲霉α-淀粉酶活化因子(amyR)的基因中獲得。進(jìn)一步的例子見Verdier,1990，出處同上和MacKenzie等，1993，普通分子生物學(xué)雜志(Joumal of General Microbiology)139:2295-2307。
伴侶蛋白是幫助另一種多肽正確折疊的蛋白質(zhì)(Hartl等，1994,TIBS19:20-25；Bergeron等，1994；TIBS 19:124-128；Demolder等，1994，生物技術(shù)雜志(Joumal of Biotechnology)32:179-189；Craig,1993，科學(xué)260:1902-1903；Gething和Sambrook,1992，自然355:33-45；Puig和Gilbert,1994，生物化學(xué)雜志269:7764-7771；Wang和Tsou,1993,The FASEB Journal7:1515-11157；Robinson等，1994,Bio/Technology 1:381-384；Jacobs等，1993，分子微生物學(xué)(Molecular Microbiology)8:957-966)。編碼伴侶蛋白的核酸序列可以從編碼米曲霉二硫化蛋白異構(gòu)酶或釀酒酵母鈣聯(lián)接蛋白，釀酒酵母BiP/GRP78，以及釀酒酵母Hsp70的基因中獲得。進(jìn)一步的例子參見Gething和Sambrook,1992，出處同上，和Hartl等，1994，出處同上。
加工型蛋白酶是切割前肽以產(chǎn)生成熟的具有生化活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak,1994，酵母10:67-79；Fuller等，1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proeedings of the National Academy of Sciences USA)86:1434-1438；Julius等，1984，細(xì)胞37:1075-1089；Julius等，1983，細(xì)胞32:839-852；美國專利第5,702,934號)。編碼加工型蛋白酶的核酸序列可以從編碼釀酒酵母二肽氨肽酶，釀酒酵母Kex2,Yarrowia lipolytica二元加工型蛋白內(nèi)切酶(xpr6)，和尖孢鐮孢金屬蛋白酶(p45基因)的基因中獲得。
添加調(diào)節(jié)序列也是可取的，所述調(diào)節(jié)序列能在絲狀真菌細(xì)胞生長時調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子是那些為應(yīng)答化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)節(jié)性化合物的存在而引起基因表達(dá)開啟或關(guān)閉的系統(tǒng)。TAKAα-淀粉酶啟動子，黑曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子，和米曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子可被用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其他例子是那些允許基因擴(kuò)增的序列，例如，用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，所述多肽編碼核苷酸序列將會與該調(diào)節(jié)序列可操作連接。
向絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入DNA載體可以涉及一段包含原生質(zhì)體形成，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，和細(xì)胞壁以自身熟知的方式再生等的過程。曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的合適方法在EP 238023和Yelton等，1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)81:1470-1474中描述。轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的合適方法由Malardier等，1989，基因78:147-156或WO96/00787中描述。
真菌細(xì)胞用DNA載體群轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。
“絲狀真菌”包括真菌亞門和卵菌亞門的所有絲狀形式真菌(如Hawksworth等定義的，1995，出處同上)。這些絲狀真菌特征在于菌絲體的壁包括殼多糖，纖維素，葡聚糖，脫乙酰殼多糖，甘露聚糖，和其他復(fù)雜的多糖。營養(yǎng)生長方式是菌絲的延長，碳分解代謝是專性需氧的。相對比，釀酒酵母等酵母的營養(yǎng)生長方式是單細(xì)胞菌體的芽生，并且碳代謝可以是發(fā)酵的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是，但不局限于以下物種的細(xì)胞支頂孢屬，曲霉屬，鐮孢屬，腐質(zhì)霉屬，毛霉屬，毀絲霉屬，脈孢菌屬，青霉屬，柱頂孢屬，梭孢殼屬，Tolypocladium，和木霉屬。
本發(fā)明使用的絲狀真菌細(xì)胞通常根據(jù)目的多核苷酸序列選擇。例如，如果目的多核苷酸為可在曲霉屬細(xì)胞中應(yīng)用的控制序列，那么絲狀真菌細(xì)胞通常用曲霉屬細(xì)胞。本發(fā)明使用的絲狀真菌細(xì)胞的例子包括曲霉屬細(xì)胞，支頂孢屬細(xì)胞，鐮孢屬細(xì)胞，腐質(zhì)霉屬細(xì)胞，毛霉屬細(xì)胞，毀絲霉屬細(xì)胞，脈孢菌屬細(xì)胞，青霉屬細(xì)胞，梭孢殼屬細(xì)胞，Tolypocladium細(xì)胞，和木霉屬細(xì)胞。
更具體地，絲狀真菌細(xì)胞是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，構(gòu)巢曲霉，黑曲霉，或米曲霉細(xì)胞；桿孢狀鐮孢，F(xiàn)usarium certealis,Fusarium crookwellense，大刀鐮孢，禾谷鐮孢，禾赤鐮孢，異孢鐮孢，合歡木鐮孢，尖孢鐮孢，多枝鐮孢，粉紅鐮孢，接骨木鐮孢，膚色鐮孢，擬分支孢鐮孢，硫色鐮孢，F(xiàn)usariumtorulosum，類擬絲孢鐮孢，或Fusarium venenatum細(xì)胞(Nirenberg sp.nov；humicola insolens細(xì)胞或humicola lanuginosa細(xì)胞；米赫毛霉細(xì)胞；嗜熱毀絲霉細(xì)胞；粗糙脈孢菌細(xì)胞；產(chǎn)紫青霉菌細(xì)胞；土青霉菌細(xì)胞；或Trichodermaharzianum，康寧木霉，Trichoderma longibrachiatum,Trichoderma reesei，或綠色木霉。
挑選或篩選目的轉(zhuǎn)化株文庫可以理解本發(fā)明方法中用于進(jìn)行挑選或篩選步驟c)的方法取決于所選目的多核苷酸序列。步驟c)中“挑選或篩選一個或多個表達(dá)目的特征的轉(zhuǎn)化株”表示進(jìn)行篩選或挑選以鑒別包含被修飾的目的多核苷酸序列(已經(jīng)于步驟b)的培養(yǎng)中在目的多核苷酸序列的基礎(chǔ)上產(chǎn)生)的轉(zhuǎn)化株，它具有如下例舉的目的活性或功能并可任選具有其它目的特征。因此，如果目的多核苷酸序列編碼具有特定活性或功能的多肽，那么所述篩選將只允許表達(dá)具有目的活性或功能的多肽的轉(zhuǎn)化株生長。因此，如果目的多核苷酸序列編碼具有特定活性或功能的多肽，那么將進(jìn)行篩選以鑒定表達(dá)具有該目的活性或功能的多肽的轉(zhuǎn)化株。例如，如果目的多核苷酸序列編碼酶，如脂肪酶，那么將進(jìn)行挑選或篩選步驟c)以鑒定表達(dá)脂肪酶活性的轉(zhuǎn)化株。如果希望將脂肪酶作為特異性特征，諸如，強(qiáng)耐熱性，那么篩選要在可鑒定具有所需高耐熱性的脂肪酶的條件下(通常為溫度)進(jìn)行。
類似地，如果目的多核苷酸序列是控制序列諸如啟動子序列，那么挑選或篩選步驟c)在可以評定啟動子活性的情況下進(jìn)行。通常，在文庫中目的多核苷酸序列啟動子被可操作連接于另一待轉(zhuǎn)錄序列(例如多肽編碼序列)，從而使該啟動子活性可參照該另一序列的轉(zhuǎn)錄來測定。
在細(xì)菌或酵母宿主中構(gòu)建文庫本發(fā)明也涉及在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和挑選或篩選目的多核苷酸序列文庫的方法，包括(a)用DNA載體群轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中每種載體包括(ⅰ)編碼絲狀真菌篩選標(biāo)記，絲狀真菌復(fù)制起始序列，細(xì)菌或酵母的相應(yīng)篩選標(biāo)記和細(xì)菌或酵母的相應(yīng)復(fù)制起始序列的多核苷酸序列，它們在所述DNA載體群中均無實(shí)質(zhì)的變動，和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中在該DNA載體群中包含一個以上該多核苷酸序列的變異體；(b)在選擇壓力下培養(yǎng)細(xì)菌或酵母細(xì)胞；(c)從(b)的轉(zhuǎn)化株中分離DNA載體；(d)用(c)的DNA載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞；(e)在選擇壓力下培養(yǎng)(d)的絲狀真菌細(xì)胞；(f)挑選或篩選表達(dá)目的特征的一個或多個絲狀真菌轉(zhuǎn)化株；和(g)分離目的絲狀真菌轉(zhuǎn)化株。
用酵母或細(xì)菌作中介宿主的優(yōu)點(diǎn)是，轉(zhuǎn)化頻率比用曲霉屬等絲狀真菌細(xì)胞高100-1000倍，結(jié)果當(dāng)?shù)谝淮螌⒏脑觳⑷芜x連接的DNA載體轉(zhuǎn)化入酵母或細(xì)菌，然后將分離的超螺旋載體轉(zhuǎn)化入絲狀真菌細(xì)胞時得到更大的文庫。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，目的多核苷酸序列文庫通過對至少一個具有或編碼上述目的生物功能的親本多核苷酸序列進(jìn)行隨機(jī)誘變或天然等位基因變異而制備。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸埃希菌菌株。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酵母細(xì)胞是酵母屬的菌株，特別是，釀酒酵母或克魯維糖酵母(Saccharomyces kluyveri)或裂殖酵母屬的菌株。合適的酵母細(xì)胞的其它例子有克魯維酵母屬，諸如乳克魯維酵母，漢遜酵母屬，例如多形漢遜酵母，或畢赤酵母屬，例如巴斯德畢赤酵母。
按照上面的方法，所述DNA載體包含篩選標(biāo)記，其使對轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或酵母細(xì)胞的挑選很容易。細(xì)菌篩選標(biāo)記的例子包括，但不局限于以下抗生素抗性標(biāo)記諸如氨芐青霉素，卡那霉素，紅霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。而且，可通過共轉(zhuǎn)化完成挑選，例如，如WO 91/09129中所述，其中篩選標(biāo)記在單獨(dú)的載體上。
對酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1，和URA3。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌或酵母的篩選標(biāo)記提供對殺生物劑的抗性，其中所述殺生物劑選自氨芐青霉素，卡那霉素，四環(huán)素，氯霉素，新霉素，潮霉素，和氨甲喋呤。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌或酵母的篩選標(biāo)記選自編碼抗殺生物劑或抗病毒毒性，抗重金屬毒性，或賦予營養(yǎng)缺陷型以原養(yǎng)型的基因。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述原養(yǎng)型從選自以下代謝途徑的酶獲得，代謝途徑包括核苷酸的合成，輔因子合成，氨基酸合成，乙酰胺代謝，脯氨酸代謝，硫酸鹽代謝，和硝酸鹽代謝。
為自主復(fù)制，載體可進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使該載體能夠在所選細(xì)菌或酵母細(xì)胞中自主地復(fù)制。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的例子是允許在大腸埃希菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322,pUC19,pACYC177，和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)。
用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的例子是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的組合，ARS4和CEN6的組合。
通過如使用感受態(tài)細(xì)胞，電穿孔，或細(xì)菌細(xì)胞的接合，可實(shí)施細(xì)菌或酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(參見，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港，紐約)。這些細(xì)胞在選擇壓力下的培養(yǎng)可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
在此優(yōu)選使用絲狀真菌篩選標(biāo)記，真菌復(fù)制起始序列和目的多核苷酸序列，例如見題為“絲狀真菌篩選標(biāo)記”和“復(fù)制起始序列”部分。
目的轉(zhuǎn)化株的挑選或篩選可以如上面題為“轉(zhuǎn)化株的挑選或篩選”所述方法進(jìn)行。
目的多核苷酸序列可以理解本發(fā)明對篩選或挑選任何類型的目的多核苷酸序列是有用的。更具體地，用在本發(fā)明方法中的目的多核苷酸序列可以從具有或編碼目的生物活性或功能的親本多核苷酸序列產(chǎn)生。例如，目的多核苷酸序列從編碼目的多肽的基因經(jīng)隨機(jī)誘變產(chǎn)生?；蛘?，目的多核苷酸序列是如上面定義的控制序列，例如，啟動子序列。目的多核苷酸序列也可以從不同來源衍生，諸如上面深入描述的不同天然來源，如微生物。目的多核苷酸序列可以是多肽編碼序列和控制序列的組合。
在優(yōu)選實(shí)施方案中對親本多核苷酸序列的修飾可如下進(jìn)行，即使用物理或化學(xué)誘變劑，使用摻入(doped)寡核苷酸，DNA改組，或?qū)λ龊怂嵝蛄羞M(jìn)行PCR誘變，或用它們的任意組合。
或者，目的多核苷酸序列可以通過將序列突變而獲得，方法是使用易錯聚合酶或使聚合酶在促進(jìn)錯誤形成的亞最佳條件下工作，即易錯PCR，從而造成核苷酸堿基的錯誤摻入。易錯DNA合成可以在體外或體內(nèi)完成，如通過使用各種增變菌株。
隨機(jī)誘變產(chǎn)生編碼修飾的蛋白和酶的多核苷酸序列變體的一般方法以隨機(jī)誘變?yōu)榛A(chǔ)，例見美國專利4,894,331和WO 93/01285。這種方法也可以與本發(fā)明組合應(yīng)用。例如，隨機(jī)誘變時可使用合適的物理或化學(xué)誘變劑，使用合適的寡核苷酸，或?qū)Χ嗪塑账嵝蛄羞M(jìn)行PCR誘變。而且，進(jìn)行隨機(jī)誘變時可使用這些誘變劑的任意組合。誘變劑可以是，例如，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換，易位，倒位，轉(zhuǎn)頻，缺失，和/或插入者。
適合本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變試劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG),O-甲基羥胺，硝酸，乙基甲烷磺酸(EMS)，硫酸氫鈉，甲酸，和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑誘變時常將目的多核苷酸序列在選擇的誘變試劑存在時在適于突變發(fā)生的條件下保溫。
當(dāng)通過使用寡核苷酸進(jìn)行突變時，可在欲變化位置合成寡核苷酸時使寡核苷酸用三個非親本核苷酸與所述寡核苷酸一起摻入。所述摻入可排除非必要氨基酸的相應(yīng)密碼子。可將摻入的寡核苷酸用任何已發(fā)表的技術(shù)摻入目的多核苷酸中，例如用PCR,LCR或任何認(rèn)為合適的DNA聚合酶和連接酶。
優(yōu)選地，用“恒定隨機(jī)摻入”完成摻入，其中各位點(diǎn)的野生型和突變型比是預(yù)先定好的。而且，可通過所述摻入優(yōu)先引入特定核苷酸，并因此優(yōu)先引入一種或多種特定氨基酸殘基。例如，可通過所述摻入在每個位置引入90％野生型和10％突變型。在選擇摻入方案時還應(yīng)考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)限制和遺傳限制?？梢杂肈OPE程序?qū)嵤饺敕桨?參見Tomandl,D.，等，1997，計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)雜志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)11:29-38；Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A.，和Kretzschmar,T.,1998，核酸研究26:697-702)，其特別確保避免停止密碼子的引入。
當(dāng)使用PCR產(chǎn)生突變時，在增加核苷酸錯誤摻入的情況下，對化學(xué)處理或者非處理的目的親本多核苷酸進(jìn)行PCR(Deshler,J.O.,1992，遺傳分析，技術(shù)和應(yīng)用(Genetic Analysis Techniques and Applications)9:103-106；Leung，等，1989，技術(shù)(Technique)1:11-15)。
大腸埃希菌(Fowler，等，1974,Molec.Gen.Genet.133:179-191)，釀酒酵母或任何其他微生物的突變株可用于目的親本多核苷酸序列的隨機(jī)誘變，例如通過將包含親本多核苷酸序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至所述突變株，使帶有質(zhì)粒的突變株生長并從突變株中分離突變質(zhì)粒?？梢詫⑼蛔冑|(zhì)粒隨后轉(zhuǎn)化到表達(dá)生物體內(nèi)。
待誘變的多核苷酸序列可以方便地出現(xiàn)在從包含此序列的生物體制備的基因組或cDNA文庫中?；蛘?，該序列可以出現(xiàn)在合適的載體如質(zhì)?；蚴删w中，所述載體可與誘變劑一起保溫或暴露于該誘變劑。待誘變的多核苷酸序列可以是分離的形式?？梢岳斫獯S機(jī)誘變的多核苷酸序列優(yōu)選是cDNA或基因組DNA序列。突變的DNA序列還可包括編碼允許該突變DNA表達(dá)的功能的DNA序列。
DNA改組按照本發(fā)明快速制備目的多核苷酸序列的變異體的另一方法包括體內(nèi)或體外DNA改組方法，其中DNA改組被定義為在兩個或多個同源多核苷酸之間發(fā)生核苷酸序列片段的體內(nèi)或體外重組，導(dǎo)致相對于原有多核苷酸(即，進(jìn)行改組的多核苷酸)新產(chǎn)生的多核苷酸(即，已經(jīng)進(jìn)行了改組的多核苷酸)包含許多交換的核苷酸片段?？梢栽隗w內(nèi)或在體外通過本領(lǐng)域描述的方法在細(xì)胞內(nèi)完成改組，改組的實(shí)例列于下面。
例如，H.Weber和Weissmann,C.(1983，核酸研究11:5661-5669)描述兩個同源基因之間經(jīng)體內(nèi)重組而修飾基因的方法，其中將重組體用抗性標(biāo)記鑒定和分離。
Pompon等，(1989，基因83:15-24)描述改組哺乳動物細(xì)胞色素P-450基因結(jié)構(gòu)域的方法，其用具有粘性末端的線性化質(zhì)粒及部分同源于該質(zhì)粒末端的DNA片段轉(zhuǎn)化釀酒酵母，從而在釀酒酵母中實(shí)施部分同源序列的體內(nèi)重組。
在WO 97/07205中描述了一種方法，其中多肽變異體通過用質(zhì)粒DNA作模板經(jīng)體內(nèi)重組，改組同源DNA序列的不同核苷酸序列而制備。
美國專利第5,093,257號(Genencor International,Inc.)公開了經(jīng)體內(nèi)重組生產(chǎn)雜交多肽的方法。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，目的變異體多核苷酸序列通過體內(nèi)重組兩個或多個同源的目的多核苷酸序列而獲得，包括(a)鑒定目的多核苷酸序列之間的至少一個保守區(qū)；(b)產(chǎn)生每個目的多核苷酸序列的片段，其中該片段包括(a)的保守區(qū)；和(c)用保守區(qū)作為同源連接點(diǎn)重組(b)的片段。
優(yōu)選地，目的多核苷酸序列編碼多肽或其部分或上述控制序列或兩者的任意組合。
術(shù)語“保守區(qū)”指一段亞序列，其優(yōu)選至少10bp，為兩個或多個序列共有，其中所述亞序列之間相同程度至少約50％，更優(yōu)選地至少60％，更優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少90％，最優(yōu)選地至少97％。
因?yàn)橛盟霰Ｊ貐^(qū)作為兩序列之間“連接點(diǎn)”，故兩序列上所述保守區(qū)的相同程度高至足以在上述的條件下使所述序列雜交，雜交中該保守區(qū)作為連接點(diǎn)。
一種體外改組同源DNA序列的方法如Stemmer描述(Stemmer,1994.美國國家科學(xué)院院報(bào)91:10747-10751；Stemmer,1994.自然370:389-391；Crameri,A.，等，1997.自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)15:436-438)。此方法涉及用體外PCR技術(shù)改組同源DNA序列。包含改組的DNA序列的陽性重組基因根據(jù)表達(dá)蛋白的功能改進(jìn)而選自DNA文庫。
上面的方法在WO 95/22625中也有描述，其涉及改組同源DNA序列。在此方法中重要的步驟是將同源的雙鏈多核苷酸模板切割成所需大小的隨機(jī)片段，隨后將這些同源裝配成全長的基因。
WO 98/41653公開了DNA改組的方法，其中重組的同源多核苷酸文庫是通過在體外DNA合成期間誘導(dǎo)模板轉(zhuǎn)變而從許多不同的親本DNA模板和引物構(gòu)建的。
定域隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變局限在目的多核苷酸序列的一部分上具有優(yōu)勢。例如，待修飾的序列可以是該基因產(chǎn)物活性必需的基因編碼區(qū)或其一部分，或如上所述控制序列或其部分。這樣的控制序列優(yōu)選的例子是啟動子序列，或其功能部分，即，足以影響核酸序列表達(dá)的部分。
例如，當(dāng)目的多核苷酸序列某區(qū)已經(jīng)被鑒定為特殊重要區(qū)時，定域隨機(jī)誘變具有優(yōu)勢。例如，當(dāng)目的多核苷酸序列編碼多肽時，所述重要區(qū)可以是該多肽的指定特性必需的，預(yù)計(jì)該區(qū)的修飾導(dǎo)致一種此特性被改善的變異體。當(dāng)親本多肽的三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明并與其功能相關(guān)時這些區(qū)可被正常地鑒定出來。類似地，當(dāng)目的多核苷酸序列是控制序列，如啟動子時，目的區(qū)可以是預(yù)期對啟動子必需的或參與啟動子活性的區(qū)域。
定域，或區(qū)特異性隨機(jī)誘變通過用如上所述的PCR誘變技術(shù)或任何其他本領(lǐng)域已知的合適的技術(shù)可方便地進(jìn)行?；蛘?，分離編碼待修飾的多核苷酸序列中一部分的核苷酸序列可如下修飾，例如插入合適的載體，隨后將該部分用上述任一種突變方法進(jìn)行誘變。
真菌復(fù)制起始序列的使用在另一方面，發(fā)明涉及真菌復(fù)制起始序列在此處定義的于絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和挑選或篩選目的多核苷酸序列文庫中使用。優(yōu)選地，所述文庫是用本發(fā)明第一或第二方面的方法構(gòu)建的。在優(yōu)選實(shí)施方案中真菌復(fù)制起始序列選自(a)與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％同一性，并能夠起始復(fù)制的復(fù)制起始序列；(b)在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與下列兩種物質(zhì)雜交的復(fù)制起始序列(ⅰ)SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互補(bǔ)鏈，其中低嚴(yán)謹(jǐn)性條件定義為在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切和變性的鮭精DNA，和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，洗滌條件定為50℃的2×SSC,0.2％SDS中30分鐘；和(c)(a)或(b)的亞序列，其中該序列具有復(fù)制起始活性。
優(yōu)選地，復(fù)制起始序列來自絲狀真菌細(xì)胞，特別是來自曲霉屬菌株，如構(gòu)巢曲霉。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中復(fù)制起始序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2發(fā)表的核酸序列，或它們相應(yīng)的功能亞序列。按照此方面使用的復(fù)制起始序列可以如上面題為“復(fù)制起始序列”部分所描述。
目的多核苷酸序列文庫在另一方面，本發(fā)明涉及目的多核苷酸序列文庫，該文庫包括用DNA載體群轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細(xì)胞，其中每個載體包括(ⅰ)編碼絲狀真菌篩選標(biāo)記和絲狀真菌復(fù)制起始序列的基因，其中標(biāo)記或復(fù)制起始序列在群體中均無變動，和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中在所述DNA載體群中包含一個以上所述多核苷酸序列的變異體。
在優(yōu)選實(shí)施方案中該載體進(jìn)一步包括編碼細(xì)菌或酵母篩選標(biāo)記以及細(xì)菌或酵母復(fù)制起始序列的核酸序列。優(yōu)選地，按照本發(fā)明第一或第二方面的方法制備該文庫。優(yōu)選地，該文庫的要素諸如DNA載體和它涉及的成分如這里所述。
本發(fā)明通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述，但不應(yīng)局限于這些。
實(shí)施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)物質(zhì)是至少為試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。
質(zhì)粒pMT1505如下面實(shí)施例1所述構(gòu)建pHelp1包含米曲霉的pyrG基因作為篩選標(biāo)記和在構(gòu)巢曲霉中能夠自主復(fù)制的AMA1序列，其如Gems,D.，等(1991.基因98:61-67)所述pToC68 如EP 0531372中所述(Novo Nordisk A/S)pAHL如WO 92/05249中所述，包含脂肪酶編碼序列pSO2如WO 96/29391中所述，包含米曲霉pyrG基因pENI1127如下面實(shí)施例1所述構(gòu)建pENI1245如下面實(shí)施例1所述構(gòu)建pENI1246如下面實(shí)施例1所述構(gòu)建pENI1298如下面實(shí)施例1所述構(gòu)建pENI1299如下面實(shí)施例1所述構(gòu)建菌株JaL250米曲霉A1560的衍生物，其中pyrG基因已被滅活，如WO98/01470所述DH5a買自GIBCO BRL(Life Technologies,Inc.,Rockville MD)的大腸埃希菌宿主細(xì)胞DLM15:Fusarium venenatum的衍生物，如下面實(shí)施例5所述實(shí)施例1:pENI1298和pENI1299的構(gòu)建通過將來自pHelp1的SphⅠ/NarⅠ片段插入pToC68中構(gòu)建pMT1466。用SphⅠ和StuⅠ消化pMT1466，然后重新連接以構(gòu)建pMT1489。用AatⅡ和NarⅠ消化pMT1489并連接一接頭構(gòu)建pMT1500。用NheⅠ消化pMT1500并重新連接以構(gòu)建pMT1504。將包含構(gòu)巢曲霉基因組DNA的amdS編碼基因的2.7kbXbaⅠ片段(Corrick,C.M.，等，1987，基因53:63-71)插入已經(jīng)用NheⅠ切割的pMT1504中構(gòu)建pMT1505。pMT1505用SalⅠ消化以除去一個AMA1重復(fù)序列和中心間隔區(qū)而構(gòu)建pENI1127。
用HindⅢ切割pENI1127和pMT1505，結(jié)果分別得到2408bp和5253bp的片段，將其從1％瓊脂糖凝膠中純化并克隆到包含脂肪酶編碼序列的pAHL載體的HindⅢ位點(diǎn)。所得的質(zhì)粒分別稱作pENI1245和pENI1246。
將包含pyrG基因的3527bp StuⅠ/BbuⅠ片段從pSO2中切下并插入pENI1245和pENI1246的StuⅠ/BbuⅠ位點(diǎn)。所得質(zhì)粒分別稱作pENI1298和pENI1299。pENI1298的限制酶圖譜如圖1所示，pENI1299的如圖2所示。
實(shí)施例2在獨(dú)立生長的米曲霉轉(zhuǎn)化株中脂肪酶的表達(dá)水平使用標(biāo)準(zhǔn)方法用pENI1298和pENI1299轉(zhuǎn)化JaL250，參見WO 98/01470所述。然后將細(xì)胞在Cove平板上于37℃培養(yǎng)。
保溫三天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化頻率為104-105/μg DNA，其比AMA1序列缺失時的轉(zhuǎn)化頻率增加100-10,000倍。
將pENI1298和pENI1299的三十個獨(dú)立轉(zhuǎn)化株在Cove平板上分離并同時接種于96孔微滴板，其中每孔包含200μl基本培養(yǎng)基1*vogel,2％麥芽糖的(例如，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，第17卷84頁)。
于34℃保溫三天后，測定在微滴板中培養(yǎng)液的脂肪酶活性。從每孔取一份10μl培養(yǎng)液加入微滴板中，每孔含200μl的脂肪酶底物0.018％對硝基苯丁酸酯，0.1％Triton X-100,10mM CaCl2,50mM Tris pH7.5。采用標(biāo)準(zhǔn)酶學(xué)方案(例如，酶動力學(xué)(Enzyme Kinetics),Paul C.Engel，編，1981,Chapman和Hall Ltd.)用動態(tài)微滴板讀取儀(Molecular Device Corp.,SunnyvaleCA)，在五分鐘里每隔15秒用分光光度測定法測定活性。簡言之，用底物轉(zhuǎn)化起始率檢測產(chǎn)物形成，并將其規(guī)定為從5分鐘里每隔15秒的405nm吸收值計(jì)算所得曲線斜率。將相對脂肪酶活性單位針對顯示最高脂肪酶活性的轉(zhuǎn)化體標(biāo)準(zhǔn)化。計(jì)算每組三十個轉(zhuǎn)化株的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
同時，已經(jīng)在Cove平板上37℃培養(yǎng)三天的轉(zhuǎn)化株如上述再于第二塊Cove平板上分離并再次接種微滴板。又培養(yǎng)三天后將測定，再分離和再接種的程序重復(fù)一次。
結(jié)果總結(jié)于下表1中，顯示產(chǎn)生脂肪酶的量，與轉(zhuǎn)化六天后pENI1298轉(zhuǎn)化株的產(chǎn)生量相比。標(biāo)準(zhǔn)差的值很小，說明這30個獨(dú)立生長的轉(zhuǎn)化株中脂肪酶表達(dá)水平幾乎無差異。通常，當(dāng)進(jìn)行絲狀真菌轉(zhuǎn)化時，可見較大的相對標(biāo)準(zhǔn)差(70％-100％)，其原因?yàn)檩d體的隨機(jī)整合入基因組和進(jìn)行整合的載體數(shù)目不同。在最差的和最好的生產(chǎn)型真菌轉(zhuǎn)化株中表達(dá)水平的差異可達(dá)100-1000倍。
表1．三十個獨(dú)立生長的轉(zhuǎn)化株相對于pENI1298轉(zhuǎn)化六天后的脂肪酶平均表達(dá)水平及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)施例3檢測質(zhì)粒的重排將包含pENI1298或者pENI1299的Ja1250轉(zhuǎn)化株在YPD培養(yǎng)基上過夜生長。
用QIAprepMiniprep試劑盒(QIAGEN,Venlo，荷蘭)改良后從每個轉(zhuǎn)化株制備DNA。簡言之，將每個菌株在5ml YPD中生長三天。過濾收集菌絲體并用200ml水沖洗，然后轉(zhuǎn)移至2ml小離心管中，并于60℃真空離心3小時凍干。然后將干燥的菌絲體磨碎并在1ml裂解緩沖液(100mMEDTA,10mM Tris pH8.0,0.1％Triton X-100,500mM鹽酸胍，200mM氯化鈉)中重懸，隨后徹底混合。每管中加入20mg RNAse然后于37℃保溫10分鐘。加入100μg蛋白酶K，使反應(yīng)于50℃保溫30分鐘。然后將每管在標(biāo)準(zhǔn)臺式離心機(jī)上以最大速度離心15分鐘。將上清上樣于QIAprep離心柱，然后離心并棄去濾液。接著用所述試劑盒中提供的0.5ml PB洗柱并再離心1分鐘。棄去過濾物，用試劑盒提供的0.75ml PE洗柱，然后再離心1分鐘。讓柱在空氣中干燥，經(jīng)加入100μl TE緩沖液接著最后一次離心1分鐘而將DNA洗脫。
DNA被轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5a中獲得轉(zhuǎn)化株，證實(shí)所述質(zhì)粒在米曲霉中為附加體形式。按照制造商的說明，用QIAprepMiniprep試劑盒(QIAGEN)從所述細(xì)菌細(xì)胞中純化質(zhì)粒。
然后將純化的質(zhì)粒DNA用ScaⅠ消化，用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠分級分離技術(shù)分析限制酶圖譜。
當(dāng)與原始質(zhì)粒的限制酶圖譜對比時，結(jié)果顯示在五個pENI1299 JaL250轉(zhuǎn)化株中無重排，在八個pENI1298 JaL250轉(zhuǎn)化株中僅一個有重排，顯示質(zhì)粒重排很少發(fā)生。
實(shí)施例4篩選文庫為了鑒定具有改良功能特征的變異體多肽以可比于親本多肽的水平表達(dá)，在米曲霉中構(gòu)建并篩選多核苷酸序列變異體文庫。用pENI1298作模板，下列每種引物2pmol/ml:oligo 19670作為第一引物，第二引物為摻入型oligo23701,23702或23703，如下所述，在下列條件下進(jìn)行PCR:94℃,5分鐘；30循環(huán)(94℃,30秒；50℃,30秒；72℃,1分鐘)，和72℃,5分鐘。Taq聚合酶產(chǎn)品AmpliTaq按供應(yīng)商(Perkin-Elmer Corp.,Branchburg NJ,USA)的建議使用。
19670:SEQ ID NO:323701:SEQ ID NO:423702:SEQ ID NO:523703:SEQ ID NO:6用小離心柱S300(Pharmacia-LKB,Uppsala SE)將所得產(chǎn)物純化。使包括pENI1298 DNA的純化產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，條件如下94℃,5分鐘；30循環(huán)(94℃,1分鐘；50℃,10分鐘；72℃,2分鐘)，和72℃,7分鐘，引物為19671:SEQ ID NO:7。
接著將產(chǎn)物用Dpn1消化以除去模板DNA，然后在94℃保溫30分鐘以滅活Dpn1酶。
用經(jīng)Bal1和SgrA1消化以去除大多數(shù)脂肪酶編碼序列的pENI1298 2μg，和源于23701,23702或23703摻入型oligo反應(yīng)的PCR片段每種5μg轉(zhuǎn)化JaL250。如WO 97/07205所述使載體和PCR片段在體內(nèi)重組。JaL250細(xì)胞也用消化的pENI1298或每種PCR產(chǎn)物單獨(dú)轉(zhuǎn)化。當(dāng)僅用載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞時得到一種轉(zhuǎn)化株，用PCR產(chǎn)物單獨(dú)轉(zhuǎn)化時未得到轉(zhuǎn)化株。
從23701,23702和23703文庫中分別將15,12和26個轉(zhuǎn)化株接種到含200μl的1*vogel,2％葡萄糖培養(yǎng)基的微滴板中，保溫72小時。將JaL250的pENI1298轉(zhuǎn)化株也保溫作為對照。然后在Cove平板上劃線分離所述培養(yǎng)物。培養(yǎng)物中的脂肪酶活性如實(shí)施例2中所述測定并在加去污劑的測定法中測定，后者在微滴板的孔中將10μl微滴板培養(yǎng)物加入200μl用商業(yè)洗衣去污劑制備的脂肪酶底物中。在405nm分光光度下測定活性并如上述實(shí)施例2所述計(jì)算。
將在包含去污劑的測定中顯示活性的每種轉(zhuǎn)化株再于Cove平板上分離。37℃保溫72小時后每個Cove平板上取兩個克隆，連同十個pENI1298轉(zhuǎn)化株一起如上述接種于微滴板上，然后于34℃培養(yǎng)72小時。所有克隆在去污劑測定中顯示活性，而pENI1298轉(zhuǎn)化株無活性。而且，以獨(dú)立復(fù)制型培養(yǎng)物形式生長的轉(zhuǎn)化株顯示出相對相似的活性。結(jié)果總結(jié)于下面表2。
表2對Pnp-丁酸酯和商業(yè)去污劑的脂肪酶活性
因?yàn)榭寺?3701.1在Pnp-丁酸酯和去污劑測定中都表現(xiàn)出良好的表達(dá)及作用，分離其DNA以測定推斷的多肽N-末端序列，其為SPPRRPP。天然N-末端序列為SPIRRE，其編碼被kex2樣蛋白酶切割的前肽。對來自其他轉(zhuǎn)化株的DNA測序，得到以下推斷的N-末端序列23701.2(SPPRRRR),23702.1(SPPRPRRR),23702.7(SPPRPRRP),23703.1(SPPRRRRRP)，和23703.4(SPPRRPRRR)。因此，在生產(chǎn)型宿主中鑒定了可以以相當(dāng)于親本多肽的表達(dá)水平表達(dá)的具有改良功能特征的多肽變異體。
此處所述和權(quán)利要求的發(fā)明不局限于這里公開的具體實(shí)施例，因?yàn)檫@些實(shí)施例意在說明本發(fā)明的幾個方面。任何等價實(shí)施例是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，除了這里展示和描述的那些外，本發(fā)明的各種改動對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是很明顯的。這些改動也包含在附屬的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
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除非另有所指，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和學(xué)術(shù)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員常規(guī)理解的含義相同?？捎门c本文所述類似或等同的材料或方法實(shí)施或檢測本發(fā)明，但優(yōu)選的方法和材料如本文所述。
實(shí)施例5:Fusarium venenatum菌株DLM15的構(gòu)建鐮孢屬菌株A3/5，現(xiàn)已重新分類為Fusarium venenatum(Yoder和Christianson,1998，真菌遺傳學(xué)和生物學(xué)(Fungal Genetics andBiology)23:62-80；O’Donnell等，1998，真菌遺傳學(xué)和生物學(xué)23:57-67)，它獲自Anthony Trinci博士，University of Manchester，曼徹斯特，英國；或作為鐮孢屬ATCC 20334株獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA。命名為CC1-3的Fusarium venenatum A3/5的形態(tài)突變株(Weibe等，1992，真菌學(xué)研究(Mycological Research)96:555-562；Weibe等，1991，真菌學(xué)研究95:1284-1288；Weibe等，1992，真菌學(xué)研究96:555-562)是高度分支的菌落變異體。本試驗(yàn)用的MLY3株源于Fusarium venenatum A3/5的形態(tài)突變株CC1-3。它與CC1-3具有完全相同的互補(bǔ)作用特征。
培養(yǎng)基和溶液每升基本培養(yǎng)基含有6g NaNO3,0.52g KCl,1.52g KH2PO4,1ml COVE痕量金屬溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4.7H2O,342.3g蔗糖，和20g Noble瓊脂，pH6.5。
每升RA孢子形成培養(yǎng)基含有50g琥珀酸，12.1g NaNO3,1g葡萄糖，20ml 50×Vogels，和0.5ml 10mg/ml NaMoO4原液，pH調(diào)至6.0。
每升YEPG培養(yǎng)基含有10g酵母提取物，20g蛋白胨，和20g葡萄糖。
STC包含0.8M山梨醇，25mM Tris pH 8,25mM CaCl2。
SPTC包含40％PEG 4000,0.8M山梨醇，25mM Tris pH8,25mM CaCl2。
每升COVE痕量金屬溶液含有以下組分0.04gNaB4O7·10H2O,0.4gCuSO4·5H2O,1.2g FeSO4·7H2O,0.7g MnSO4·H2O,0.8g Na2MoO2·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O。
每升50×COVE鹽溶液包含下列組分26g KCl,26g MgSO4·7H2O,76g KH2PO4，和50ml COVE痕量金屬。
每升COVE頂層瓊脂糖包含下列組分20ml 50×COVE鹽，0.8M蔗糖，1.5mM氯化銫，1.0mM乙酰胺，和10g低熔點(diǎn)瓊脂糖，pH調(diào)至6.0。
每升COVE培養(yǎng)基包含以下組分342.3g蔗糖，20ml 50×COVE鹽溶液，10ml 1.0M乙酰胺，10ml 1.5MCsCl2，和25gNoble瓊脂。
每升50×Vogels培養(yǎng)基包含下列組分150g檸檬酸鈉，250g KH2PO4,10g MgSO4·7H2O,10g CaCl2·2H2O,2.5ml生物素原液，和5.0ml AMG痕量金屬溶液。
每升Vogel’s/乙酰胺瓊脂包含以下組分30g蔗糖，1×Vogel’s鹽，10mM乙酰胺，15mM CsCl，和25gNoble瓊脂。
每升氟乙酰胺培養(yǎng)基包含以下組分12g醋酸鈉，2g氯化鈉，0.5gMgSO4,3g KH2PO4,0.3g尿素，2g氟乙酰胺，1ml 50×Vogels鹽，和15g瓊脂糖Ⅰ(Amresco；Solon,Ohio),pH6.1。
在Fusarium venenatum MLY3中缺失pyrG基因在Fusarium venenatum表達(dá)宿主MLY3的基因組中缺失未標(biāo)記的pyrG，方法是先缺失pyrG基因，代之以構(gòu)巢曲霉的amds基因，其側(cè)翼為分離自米曲霉pyrG基因上游區(qū)的重復(fù)DNA序列。然后在含氟乙酰胺的平板上培養(yǎng)分離物以篩選所述amdS基因治愈的分離物。
從Fusarium venenatum菌株ATCC 20334中克隆3.9kb的基因組EcoRⅠpyrG片段，插入pUC118的EcoRⅠ位點(diǎn)，從而構(gòu)建質(zhì)粒pDM156.2。該pyrG片段包含完整編碼區(qū)，1.3kb的啟動子和1.5kb的終止子(圖3)。Fusariumvenenatum MLY3的天然pyrG基因經(jīng)同源重組被4.4kb的片段置換，該4.4kb片段中已缺失pyrG的整個開放讀碼框，并代之以amdS基因，其側(cè)翼230bp重復(fù)序列，見圖3。
構(gòu)建pJRoy47。首先構(gòu)建pJRoy43，它包含用SwaⅠ位點(diǎn)置換了pacⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)的pNEB193(New England Biolabs)。為完成此步，制備5’末端包含BamHⅠ位點(diǎn)、中間包含SwaⅠ位點(diǎn)、3’末端包含SalⅠ位點(diǎn)的接頭，制備方法是使下列兩種oligos退火而結(jié)合成雙鏈引物1:SEQ ID NO:8。
引物2:SEQ ID NO:9。
將所得接頭連接至BamHⅠ和SalⅠ消化的pNEB193，得pJRoy43。
接著，選擇米曲霉pyrG基因上游的230bp區(qū)作為Fusarium venenatum中的重復(fù)序列。從米曲霉pyrG質(zhì)粒pJaL335(WO 98/12300)中用下列兩對引物(引物3和4，引物5和6)將此區(qū)擴(kuò)增為兩種不同產(chǎn)物引物3:SEQ ID NO:10。
引物4:SEQ ID NO:11。
引物5:SEQ ID NO:12。
引物6:SEQ ID NO:13。
用Dneasy Plant Mini試劑盒制備約40-50ng的基因組DNA作模板，準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)。每個反應(yīng)包含下列成分40-50ng基因組DNA，引物3和4或引物5和6各50pmol,dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM,1×TaqDNA聚合酶緩沖液，和2.5單位Taq DNA聚合酶。反應(yīng)在Perkin-Elmer 480型熱循環(huán)儀中保溫，其程序如下循環(huán)1在94℃2.5分鐘，72℃2.5分鐘；循環(huán)2-26每個于94℃45秒，50℃45秒，和72℃2分鐘；循環(huán)27在94℃45秒，50℃45秒，和72℃10分鐘。
在1％瓊脂糖凝膠上將反應(yīng)產(chǎn)物分離，得約230bp片段。第一種PCR產(chǎn)物(大約230bp片段)在5’末端包含SwaⅠ位點(diǎn)和3’末端包含EcoRⅤ位點(diǎn)，而第二種產(chǎn)物(大約230bp片段)在5’末端包含EcoRⅤ位點(diǎn)和3’末端包含PmeⅠ位點(diǎn)。將兩種純化重復(fù)片段首先用EcoRⅤ消化并連接在一起。純化(酚-氯仿抽提和乙醇沉淀)后，將連接產(chǎn)物用PmeⅠ和SwaⅠ消化產(chǎn)生大約500bp片段，將此片段用瓊脂糖凝膠電泳和瓊脂水解酶處理以純化。
將所得片段克隆入PmeⅠ和SwaⅠ消化的pJRoy43以制成pJRoy44(圖4)。這個載體包含兩個230bp的重復(fù)片段，中間以EcoRⅤ位點(diǎn)分隔，側(cè)翼為SwaⅠ和PmeⅠ位點(diǎn)。
將包含amdS基因和調(diào)節(jié)區(qū)的EcoRⅠ片段從p3SR2亞克隆中分離(Kelly和Hynes,1985，歐洲分子生物學(xué)組織雜志4:475-479)，用Klenow片段制成平端，并連接至EcoRⅤ消化的pJRoy44以制成pJRoy47(圖3)。
從pJRoy47獲得側(cè)翼為230bp重復(fù)序列的amdS基因作為SwaⅠ/PmeⅠ片段，將其插入EcoRⅤ/StuⅠ消化的pDM156.2中以制得pDM222A(圖3)。將pDM222.A用EcoRⅠ消化，將包含pyrG缺失盒的4.4kb EcoRⅠ片段于轉(zhuǎn)化前用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Chatsworth,CA)純化。
從基本培養(yǎng)基平板上取三個1cm2的Fusarium venenatum MLY3菌絲體柱狀樣本接種于包含500ml RA產(chǎn)孢子培養(yǎng)基的燒瓶中，28℃150rpm保溫2-3天，以形成孢子。用Miracloth(Calbiochem,San Diego,CA)收獲孢子并在Sorvall RC-5B離心機(jī)(E.I.DuPont De Nemours and Co.,Wilmington,DE)上以7000rpm離心20分鐘。將沉淀的孢子用無水蒸餾水洗兩次，用少量水重懸，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
將4×107Fusarium venenatum MLY3的孢子接種在100ml YEPG培養(yǎng)基上并且在24℃,150rpm保溫16小時，制得原生質(zhì)體。將培養(yǎng)物在Sorvall RT6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co.,Wilmington,DE)上以3500rpm離心7分鐘。用30ml 1M MgSO4將沉淀洗兩次，并用5mg/ml NOVOZYME234TM(批號PPM 4356,Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd，丹麥)的1M MgSO4溶液5ml重懸。將培養(yǎng)物在24℃,150rpm保溫直至原生質(zhì)體形成。向該原生質(zhì)體消化液中加入35ml 2M山梨醇，所得混合物于2500rpm離心10分鐘。將沉淀重懸，用STC洗兩次，于2000rpm離心10分鐘使原生質(zhì)體沉淀。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)原生質(zhì)體并在8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液中重懸使終濃度為1.25×107原生質(zhì)體/ml。將原生質(zhì)體在Nalgene Cryo 1℃冷凍箱(VWR Scientific,Inc.,San Francisco,CA)控制速率冷凍后，貯存在-80℃。
將冷凍的Fusarium venenatum MLY3原生質(zhì)體在冰上溶解。將上述pDM222.A的4.4kb EcoRⅠ片段1μg和5μl肝素(5mg/ml的STC)加入50ml無菌聚丙烯試管。加入100μl原生質(zhì)體，輕輕混合，并在冰上靜置30分鐘。加入1ml SPTC，室溫保溫20分鐘。加入25ml 40℃的COVE頂層瓊脂糖(其添加了10mM尿嘧啶核苷)后，將混合物倒在直徑150mm包含COVE瓊脂的平板上以挑選amdS基因的整合。
將Fusarium venenatum MLY3 pyrG基因的天然3.9kb EcoRⅠ片段經(jīng)同源重組用4.4kb片段(其包含pyrG側(cè)翼序列和側(cè)翼有230bp重復(fù)序列的amdS基因)置換。這導(dǎo)致缺失整個pyrG編碼區(qū)以及0.78kb的5’非翻譯區(qū)和0.8kb的3’非翻譯區(qū)。用Southern雜交確認(rèn)缺失盒對天然pyrG基因的置換。Southem雜交可用制造商提供的Amersham(Arlington,IL)Vista和Rapid Hyb方案或者Boehringer Mannheim DIG System方案進(jìn)行。假定缺失體的真菌基因組DNA用Dneasy Plant Mini Kit(Qiagen Chatsworth,CA)制備并用EcoRⅠ消化。用Magnagraph膜(Micron Separations,Inc；Westborough,MA)和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行Southern印跡。按照制造商的說明將膜顯影并用STORM 860(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)掃描熒光素標(biāo)記探針或使膠片曝光以檢查DIG標(biāo)記探針。3.2kb的pyrG探針包含pyrG完整編碼區(qū)，0.64kb的5’區(qū)，以及1.42kb的3’非翻譯區(qū)。
在添加10mM尿苷的RA培養(yǎng)基中28℃,150rpm約3天使缺失體菌株形成孢子，用顯微操作器分離單個孢子。將孢子分離物培養(yǎng)于添加10mM尿苷的Vogel’s/乙酰胺瓊脂上。一份孢子分離物在添加10mM尿苷的RA培養(yǎng)基上形成孢子。將孢子培養(yǎng)物經(jīng)Miracloth過濾以去除菌絲體。五個150mm平板均添加了10mM尿苷的氟乙酰胺培養(yǎng)基，在每個平板上接種經(jīng)證實(shí)為pyrG標(biāo)記缺失體的9.5×105孢子，以篩選amdS標(biāo)記的缺失。這些平板在室溫下保溫最多2周。所得菌落在COVE平板和添加10mM尿苷的氟乙酰胺平板上進(jìn)行亞克隆。對在氟乙酰胺上生長良好但在COVE上生長不良或根本不生長的菌落進(jìn)一步分析。對其中三個菌株的孢子分離物進(jìn)行Southern印跡分析。用EcoRⅠ切割基因組DNA并用上述pyrG探針探測。幾個孢子分離物顯示1.4kb的雜交帶，其表示amdS“l(fā)oop-out”。選擇一個孢子分離物并命名為Fusarium venenatum DLM15。
實(shí)施例6在獨(dú)立生長的Fusarium venenatum DLM15轉(zhuǎn)化株中脂肪酶的表達(dá)水平使用如Royer等1995，生物技術(shù)13:1479-1483所述標(biāo)準(zhǔn)程序，但用硝酸鈉(25mM)取代乙酰胺，從而以pENI1298(實(shí)施例2所述)轉(zhuǎn)化實(shí)施例5描述的pyrG陰性Fusarium venenatum DLM15。然后將細(xì)胞于室溫下在基本平板上培養(yǎng)。保溫2周后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化頻率為50-100/μg DNA，比無AMA1序列者轉(zhuǎn)化頻率增加10-100倍。在基本培養(yǎng)基平板上分離到20個轉(zhuǎn)化株并在室溫下再生長2周。將轉(zhuǎn)化株接種于微滴板上的200μl vogel培養(yǎng)基(如實(shí)施例2)中，所述培養(yǎng)基加有20mM尿苷或不含尿苷，室溫培養(yǎng)。添加了尿苷的轉(zhuǎn)化株生長良好，但在無尿苷的基本培養(yǎng)基平板上分離時不能生長，表明包含pyrG基因的質(zhì)粒已經(jīng)丟失，故說明質(zhì)粒是自主復(fù)制。在添加尿苷的培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化株未檢測到脂肪酶活性。在未添加尿苷的基本培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化株中檢測到脂肪酶活性。與獨(dú)立生長的鐮孢屬轉(zhuǎn)化株相比，平均相對活性為34.8，相對標(biāo)準(zhǔn)差為15％。因此這種質(zhì)粒有有效用于鐮孢屬菌種文庫的創(chuàng)建。
實(shí)施例7檢測PCR片段的共轉(zhuǎn)化進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以評估多PCR片段是否能在同一細(xì)胞中與切割載體(如實(shí)施例4)發(fā)生體內(nèi)重組，并從同一克隆維持多種酶的表達(dá)。制備兩種PCR片段，它們分別包含脂肪酶基因或AMG基因(包括啟動子和終止子)，用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(94℃，分鐘；30個循環(huán)(94℃,30秒；50℃,30秒；72℃,1分鐘)，和72℃,5分鐘),oligo 115120(SEQ ID NO:14),oligo 134532(SEQ IDNO:15)，以及pAHL衍生物(pAHL中脂肪酶變異體)或者pENI1543衍生物(AMG變異體)作為模板。構(gòu)建pENI1543，方法是用oligo 139123(SEQ IDNO:16)和139124(SEQ ID NO:17)產(chǎn)生包含黑曲霉(EMBL:AC:X00548作為模板)的葡萄糖淀粉酶基因(cDNA)的PCR片段，用BglⅡ和SalⅠ將其切割并克隆到已經(jīng)被BamHⅠ和XhoⅠ切割的pAHL中。
將每種PCR片段各約1μg連同已經(jīng)被BalⅠ和SgrAⅠ切割并用小牛腸磷酸酶處理的pENI1299(1μg)轉(zhuǎn)化到Ja1250中(如實(shí)施例4所述)。分離20個轉(zhuǎn)化株并接種至基本培養(yǎng)基(如實(shí)施例4)。將培養(yǎng)基保溫72小時后測定脂肪酶(pnp-丁酸酯活性)和葡萄糖淀粉酶(pnp-吡喃葡糖苷的活性)的存在。無一轉(zhuǎn)化株同時表現(xiàn)出脂肪酶活性和葡糖淀粉酶活性，故表明同一細(xì)胞內(nèi)多個變異體的共轉(zhuǎn)化和表達(dá)很少見，并因此不會成為篩選絲狀真菌文庫時的問題。
實(shí)施例8:pJerS2801和pHPOD1的構(gòu)建將pENI1298的5.8kb BglⅡ/SphⅠ片段，pENI1298的4.0kb BssHⅡ/SphⅠ片段，pBANe6(WO 98/11203描述的TAKA/NA2/TPI啟動子/AMG終止子)的0.75kb BssHⅠ/BglⅡ片段進(jìn)行三片段連接，得pJers2801。將包含Curvulariaverruculosa之鹵過氧物酶(專利WO974102-A1)的PCR片段用oligo 1029fwp(SEQ ID NO:18)和1029rev(SEQ ID NO:19)制備。用SwaⅠ和NotⅠ切割該P(yáng)CR片段并克隆到用同樣限制酶切割的pJers2801中，得pHPOD1。
實(shí)施例9在獨(dú)立生長的轉(zhuǎn)化株中鹵過氧化物酶的表達(dá)水平將pHPOD1轉(zhuǎn)化到實(shí)施例2所述的Ja1250中。得到與pENI1298(實(shí)施例2)幾乎相同的轉(zhuǎn)化頻率。將10個獨(dú)立的曲霉屬轉(zhuǎn)化株接種在96孔微滴板中，每孔含200μl G2-谷氨酸培養(yǎng)基，培養(yǎng)72小時?；景凑誅e Boer等[1987；包含溴過氧物酶的釩在水相和有機(jī)相培養(yǎng)基中具有高度操作穩(wěn)定性的氧化還原酶的例子，生物技術(shù)與生物工程(Biotechnol.Bioeng.)30:607-610]所述方法判定10個轉(zhuǎn)化株中每個的鹵過氧物酶的活性。平均表達(dá)水平為82.5±9.1(相對單位)。獨(dú)立轉(zhuǎn)化株表達(dá)水平間的相對標(biāo)準(zhǔn)差約為11％，出人意外的低。因此本發(fā)明不僅適用于脂肪酶，而且也適用于其他酶。
實(shí)施例10編碼兩種不同酶的兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入Ja1250進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以估價編碼兩種酶的兩種質(zhì)粒是否能轉(zhuǎn)化并保留在生長中的同一細(xì)胞內(nèi)，并因此可以導(dǎo)致一個以上的編碼酶的質(zhì)粒的細(xì)胞外共表達(dá)。
用0.1μg pENI1299和0.1μg pHPOD1共轉(zhuǎn)化Ja1250(如實(shí)施例2)。分離到40個獨(dú)立轉(zhuǎn)化株，接種至基本培養(yǎng)基(如實(shí)施例4)。將培養(yǎng)基保溫72小時后測定脂肪酶的存在(如實(shí)施例4)和鹵過氧化物酶活性(如實(shí)施例8)。無一轉(zhuǎn)化株同時表現(xiàn)脂肪酶活性和鹵過氧化物酶活性，說明多個變異體在同一細(xì)胞內(nèi)的共轉(zhuǎn)化和供表達(dá)是非常低頻的事件，這不是絲狀真菌文庫的篩選中的問題。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和篩選目的DNA文庫<130>5579.204-WO PWL/LiIs<140><141><160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5259<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<400>1aagcttattt tttgtatact gttttgtgat agcacgaagt ttttccacgg tatcttgtaa 60aaatatatat ttgtggcggg cttacctaca tcaaattaat aagagactaa ttataaacta 120aacacacaag caagctactt tagggtaaaa gtttataaat gcttttgacg tataaacgtt 180gcttgtattt attattacaa ttaaaggtgg atagaaaacc tagagactag ttagaaacta 240atctcaggtt tgcgttaaac taaatcagag cccgagaggt taacagaacc tagaagggga 300ctagatatcc gggtagggaa acaaaaaaaa aaaacaagac agccacatat tagggagact 360agttagaagc tagttccagg actaggaaaa taaaagacaa tgataccaca gtctagttga 420caactagata gattctagat tgaggccaaa gtctctgaga tccaggttag ttgcaactaa 480tactagttag tatctagtct cctataactc tgaagctaga ataacttact actattatcc 540tcaccactgt tcagctgcgc aaacggagtg attgcaaggt gttcagagac tagttattga 600ctagtcagtg actagcaata actaacaagg tattaaccta ccatgtctgc catcaccctg 660cacttcctcg ggctcagcag ccttttcctc ctcattttca tgctcatttt ccttgtttaa 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1．一種在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和挑選或篩選目的多核苷酸序列文庫的方法，該方法包括(a)用DNA載體群轉(zhuǎn)化所述真菌細(xì)胞，其中每種載體包括(ⅰ)編碼真菌篩選標(biāo)記和真菌復(fù)制起始序列的多核苷酸序列，其中所述標(biāo)記和復(fù)制起始序列在該群體中不變化；和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中所述DNA載體群包含該多核苷酸序列的一種以上變異體；(b)在選擇壓力下培養(yǎng)所述細(xì)胞；(c)挑選或篩選一個或多個表達(dá)目的特征的轉(zhuǎn)化株；和(d)分離所述目的轉(zhuǎn)化株。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述目的多核苷酸序列文庫制備通過對具有或編碼目的生物活性或功能的至少一個親本多核苷酸序列進(jìn)行隨機(jī)誘變或天然等位基因變異而制備。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸序列編碼多肽或控制序列；或者其中多核苷酸序列編碼多肽或其一部分并進(jìn)一步包括參與該多肽表達(dá)的控制序列或這樣的控制序列的一部分。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是激素，酶，受體或其部分，抗體或其部分，或報(bào)道蛋白，或調(diào)節(jié)蛋白。
5．權(quán)利要求4的方法，其中所述酶是氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，或連接酶。
6．權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，過氧化氫酶，纖維素酶，殼多糖酶，角質(zhì)素酶，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，脫氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，mutanase，氧化酶，果膠分解酶，過氧化物酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，或木聚糖酶。
7．權(quán)利要求1或2的方法，其中所述控制序列是增強(qiáng)子序列，前導(dǎo)序列，poly-A序列，前肽序列，啟動子，復(fù)制起始序列，信號序列，轉(zhuǎn)錄終止子或翻譯終止子。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述啟動子來自米曲霉TAKA淀粉酶，NA2-tpi和黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶的編碼基因。
9．權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述篩選標(biāo)記選自編碼殺生物劑抗性或病毒毒性抗性的基因，編碼對重金屬毒性的抗性的基因，或編碼為營養(yǎng)缺陷型提供原養(yǎng)型的基因。
10．權(quán)利要求9的方法，其中從酶獲得原養(yǎng)型，此酶由以下代謝途徑中挑選，包括核酸合成，輔因子合成，氨基酸合成，乙酰胺代謝，脯氨酸代謝，硫酸代謝，和硝酸代謝。
11．權(quán)利要求9的方法，其中篩選標(biāo)記選自以下基因argB(鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)，amdS(乙酰胺酶)，bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)，hemB(膽色素原合酶)，hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD(硝酸鹽還原酶)，pm(脯氨酸透性酶)，pyrG(乳清酸核苷-5’磷酸脫羧酶)，pyroA,riboB,sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)，和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)。
12．權(quán)利要求1-11的任一種方法，其中所述復(fù)制起始序列是選自下組的核酸序列(a)一種復(fù)制起始序列，其與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％的同一性并能夠起始復(fù)制；(b)一種復(fù)制起始序列，其與(ⅰ)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互補(bǔ)鏈在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，其中所述低嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切并變性的鮭精DNA，和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，洗滌條件定為50℃的2×SSC,0.2％SDS 30分鐘；和(c)(a)或(b)的亞序列，其中該亞序列具有復(fù)制起始活性。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述核酸序列與SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示核酸序列的同一性至少為50％，優(yōu)選約60％，更優(yōu)選約70％，更優(yōu)選約80％，更優(yōu)選約90％，最優(yōu)選約97％。
14．權(quán)利要求12的方法，其中所述復(fù)制起始序列從絲狀真菌細(xì)胞獲得。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是曲霉屬菌株。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述曲霉屬菌株從構(gòu)巢曲霉菌株獲得。
17．權(quán)利要求12-16的任一種方法，其中所述復(fù)制起始序列具有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或它們的相應(yīng)功能亞序列。
18．權(quán)利要求2的方法，其中對親本多核苷酸序列的修飾通過誘變進(jìn)行，優(yōu)選隨機(jī)誘變，方式是使用物理或化學(xué)誘變劑，使用摻入型寡核苷酸，進(jìn)行DNA改組，或通過對該核酸序列進(jìn)行PCR誘變，或者使用它們的任意組合。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述目的多核苷酸序列通過編碼多肽或調(diào)節(jié)序列或其組合的兩個或多個同源核酸序列的體內(nèi)重組產(chǎn)生，包括(a)鑒定所述目的多核苷酸序列中至少一個保守區(qū)；(b)產(chǎn)生每個目的多核苷酸序列的片段，其中所述片段包括(a)的保守區(qū)；和(c)用(a)的保守區(qū)作為同源連接點(diǎn)使(b)的片段重組。
20．權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中用DNA載體群轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細(xì)胞來自支頂孢屬，曲霉屬，鬼傘，鐮孢屬，腐質(zhì)霉屬，毛霉屬，毀絲霉屬，脈孢菌屬，青霉屬，梭孢殼屬，Tolypocladium，或木霉屬。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞是米曲霉，黑曲霉，構(gòu)巢曲霉，Coprinus cinereus，尖孢鐮孢，或Trichoderma reesei細(xì)胞。
22．在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和篩選或挑選目的多核苷酸序列文庫的方法，其中該方法包括(a)用權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的DNA載體群轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中該載體還包括編碼細(xì)菌或酵母篩選標(biāo)記以及細(xì)菌或酵母復(fù)制起始序列的核酸序列；(b)在選擇壓力下培養(yǎng)細(xì)菌或酵母細(xì)胞；(c)從(b)的轉(zhuǎn)化株中分離DNA構(gòu)建體；(d)用(c)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞；(e)培養(yǎng)(d)的絲狀真菌細(xì)胞；(f)挑選或篩選表達(dá)所需特征的一個或多個絲狀真菌轉(zhuǎn)化株；和(g)分離所需絲狀真菌轉(zhuǎn)化株。
23．權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)菌或酵母的篩選標(biāo)記選自編碼殺生物劑抗性或病毒毒性抗性的基因，編碼對重金屬毒性的抗性的基因，或編碼為營養(yǎng)缺陷型提供原養(yǎng)型的基因。
24．真菌復(fù)制起始序列在構(gòu)建目的多核苷酸序列文庫中的應(yīng)用。
25．權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中所述真菌復(fù)制起始序列選自以下核酸序列(a)一種復(fù)制起始序列，其與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％的同一性并能夠起始復(fù)制；(b)一種復(fù)制起始序列，其與(ⅰ)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互補(bǔ)鏈在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，其中所述低嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切并變性的鮭精DNA，和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，洗滌條件定為50℃的2×SSC,0.2％SDS 30分鐘；和(c)(a)或(b)的亞序列，其中該亞序列具有復(fù)制起始活性。
26．權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中所述復(fù)制起始序列獲自絲狀真菌細(xì)胞，尤其曲霉屬菌株，如構(gòu)巢曲霉。
27．權(quán)利要求25或26的應(yīng)用，其中所述復(fù)制起始序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或它們各自的功能亞序列。
28．一種目的多核苷酸序列文庫，其包括用DNA載體群轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細(xì)胞，其中每種載體包括(ⅰ)編碼真菌篩選標(biāo)記和真菌復(fù)制起始序列的基因，其中所述標(biāo)記和復(fù)制起始序列在該群體中不變化；和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中所述DNA載體群包含該多核苷酸序列的一種以上變異體。
29．權(quán)利要求28的文庫，其中所述載體還包括編碼細(xì)菌或酵母篩選標(biāo)記以及細(xì)菌或酵母復(fù)制起始序列的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過使用以附加型復(fù)制的AMA1為基礎(chǔ)的質(zhì)粒載體,在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建和篩選目的多核苷酸序列文庫的方法,從而獲得高頻轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定而常規(guī)的一致的高水平基因表達(dá)。
文檔編號C12N15/10GK1324402SQ99812660
公開日2001年11月28日 申請日期1999年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月26日
發(fā)明者杰斯珀·文德 申請人:諾維信公司