專利名稱：突變芽胞桿菌rna酶基因及其轉(zhuǎn)化植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于在植物的特定部位，特別是在花藥的特異性表達，能有效獲得雄性不育形質(zhì)轉(zhuǎn)化體的突變芽胞桿菌RNA酶(barnase)基因。本發(fā)明還關(guān)于在宿主細胞中表達本發(fā)明的突變芽胞桿菌RNA酶基因的重組載物、利用該載體進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物、和形質(zhì)轉(zhuǎn)化植物的培育方法。
背景技術(shù)：
芽胞桿菌RNA酶(barnase)是來自溶淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquifaciens)的RNA分解酶(RNase)(S.Nishimura and M.Nomura，生物化學生物物理雜志(Biochem.Biophys.Acta)30，430-4311958；R.W.Hartley，J.Mol.Biol.，202，913-9151988)。該酶具有110個氨基酸堿基，是RNA加水分解的酶。在細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)該酶時，它的強有力的RNA分解活性阻礙了細胞的機能，多數(shù)情況下細胞死亡。利用這種性質(zhì)，在植物的規(guī)定部位若能表達芽胞桿菌RNA酶基因，就能有選擇地抑制該部位的機能。
在PCT申請國際公開第8910396號中，報導了一種獲得雄性不育植物的技術(shù)，在花藥組織的照膜(tapetum)細胞中將特異地表達上述芽胞桿菌RNA酶基因結(jié)合在啟動子(promoter)下游，將這樣制成的雄性不育基因?qū)胫参镏?。這種雄性不育化技術(shù)在效率優(yōu)良的F1雜化品種中開發(fā)是非常有用的。
然而，將芽胞桿菌RNA酶基因用作雄性不育基因時，每次都觀察到雄性不育形質(zhì)轉(zhuǎn)化體呈現(xiàn)出很不理想的形質(zhì)。在PCT申請國際公開第9626283號中，雖然就稻屬論述了這樣的問題，但是還報導了，不僅稻屬，萵苣中也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象(科學園藝學(Scientia Horticulturae)55，125-1391993；Arlette Reymaerts，Hilde Van de Wiele，Greta De Sutter，Jan Janssens用于稔性控制的基因工程及其在雜交種子生產(chǎn)中的應(yīng)用(Engineered genes for fertilitycontrol and their application in hybrid seed production))。根據(jù)該報告，使用來自煙草的花藥特異啟動子(TA29)和芽胞桿菌RNA酶的雄性不育基因?qū)肴n苣中時，呈現(xiàn)了活力降低的植物體。
雖然這種現(xiàn)象的真正原因還不知曉，但是作為其機理，例如可以設(shè)想為，所謂基因?qū)氩课坏摹拔恢眯Ч庇绊懙臋C理(PCT申請國際公開第9626283號)。更具體講，表達雄性不育基因作為目的部位的花藥，可培育成所希望的雄性不育植物，但是，在靠近該基因?qū)氩课淮嬖趦?nèi)在性增強子(エンハンサ-)等調(diào)節(jié)因子的影響，即使在花藥組織以外處，也有可能表達極微量的芽孢桿菌RNA酶。這時，可認為因酶活性很強，呈現(xiàn)上述不理想的形質(zhì)。
為了克服這種問題，PCT申請國際公開第9626283號中記載了利用花椰菜的花葉病病毒35S啟動子(以下稱CaMV35S啟動子)的，在花藥以外組織中強有力表達的性質(zhì)，方法如下。即，使用對芽胞桿菌RNA酶有阻礙作用的蛋白質(zhì)芽胞桿菌RNA酶抑制劑(barstar)的方法，將CaMV35S啟動子中結(jié)合有芽胞桿菌RNA酶抑制劑基因同時導入植物體內(nèi)，在花藥以外的組織中，在結(jié)構(gòu)上表達芽胞桿菌RNA酶抑制劑基因，這就是說在花藥以外排除了芽胞桿菌RNA酶的影響。然而，在這種方法中不僅是芽孢桿菌RNA酶基因，而且也必須導入芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，據(jù)此，將這種技術(shù)應(yīng)用于水稻和玉米等種子作物的F1品種培育時，存在產(chǎn)生基因沉默的問題。所謂基因沉默是一種在植物中通過導入多個拷貝的外來基因，抑制該基因表達的現(xiàn)象。直至目前，這種機理還不明確，特別是利用35S啟動子表達外來基因時，很容易產(chǎn)生這種問題(R.B.Flavel，自然科學進展(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 91，3490-34961994；J.Finnegan，生物工程(Bio.Technology)12，883-8881994；M.A.Matzke and A.J.M.Matzke，植物生理學(Plant Physiol.)，107，679-6851995)。在水稻和玉米中，通過在花粉親本(父本)中作為“育性恢復基因”，而保持芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，采用了所謂恢復F1世代花粉育性的方法(C.Mariani，等人，自然(Nature)357，384-3871992)，由此，上述WO96/26283中使用芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的方法，在制成MS植物(母本)時，通過在F1植物中存在多個拷貝的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，在基因沉默的影響下，可以產(chǎn)生抑制它的表達。
發(fā)明概要本發(fā)明提供的方法是不使用芽孢桿菌RNA抑制劑基因，而只使用芽孢桿菌RNA酶基因制備雄性不育植物的方法。
本發(fā)明還提供了在上述方法中使用的突變的芽孢桿菌RNA酶基因子及其制造方法。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明中，至少使一部分的芽孢桿菌RNA酶基因的DNA序列(R.W.Hartley，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)202，913-9151988)進行突變，在植物的花藥下特異性地表達這種突變基因?qū)ㄋ幰酝獾慕M織實際上并不產(chǎn)生不利的影響，可以使該植物實質(zhì)上形成雄性不育。
突變方法可采用部位特異的突變形成法、即根據(jù)限制酶除去一部分片段、Low Fidelity PCR法等公知的方法進行。優(yōu)選的突變方法是Low FidelityPCR法。其詳細情況記載于D.Leung，E.Chen and D.Goedda.技術(shù)(Technique)1，11-151989；Y.Z.Xiaoping and R.H.Ebright，核酸研究(Nucleic Acid Res.)19，60521991；G.C.Rice等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5467-54711992中，本說明書中引用這些內(nèi)容。使用這種技術(shù)方法，使增幅時的反應(yīng)易于引起多個錯誤(エラ-)的條件下進行PCR，能夠在目的DNA片段中有效導入隨機突變。
本發(fā)明中，Low Fidelity PCR法中使用的引物(primer)，和通常的PCR法一樣選取。引物的長度最好是和通常的PCR法相同的堿基數(shù)。
本發(fā)明者們在造型中使用了含有序列1的序列的DNA，將引物1(5′-CGTTCGGCTC GATGGTA CCG GTTATCAACA CGTTTGA-3′、序列6)、引物2(5′-CCTCTAGATT ATCTGATTTT TGTAAAGGTC TGATAATG-3′、序列7)進行組合，在易于引起多個錯誤的條件下不進行PCR，可單獨分離出具有序列3所表示的DNA序列的突變的芽孢桿菌RNA酶基因。這里使用的序列1的序列是在公知的質(zhì)粒(plasmid)PVE 108(WO92/13956)上存在的芽孢桿菌RNA酶基因的編碼區(qū)域內(nèi)的序列，從原本的芽孢桿菌RNA酶基因序列中，在向N末端側(cè)的菌體外的分泌信號時，除去不要的部分。
以同樣的方法，也可獲得進一步突變的突變芽孢桿菌RNA酶基因。
PCR增幅產(chǎn)物是利用慣用技術(shù)，在大腸菌等的宿主中進行克隆，單獨分離含有突變的芽孢桿菌RNA酶基因的大腸菌克隆。在這克隆化中，具有芽孢桿菌RNA基因的克隆，根據(jù)該基因的表達所產(chǎn)生的RNase活性測定，可以進行篩選，根據(jù)芽孢桿菌RNA酶所具有的RNase的活性，可利用大腸菌成長受影響這一現(xiàn)象。根據(jù)下述由2個步序組成的方法可方便地進行篩選。
第一個步序，首先，使用上述得到的突變的芽孢桿菌RNA酶基因配制質(zhì)粒，由此大腸桿菌進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化。這樣獲得的大腸菌形質(zhì)轉(zhuǎn)化株，由于導入的突變芽孢桿菌RNA酶的活性抑制成長。基于這一事實，和沒有導入突變的芽孢桿菌RNA酶而導入對照載體的大腸菌株進行比較，成長很慢，即，對菌落的大小，要選取小的菌落。這樣選取的大腸菌株，可認為含有突變的芽孢桿菌RNA酶基因。為了準確確認由表達的突變芽孢桿菌RNA酶基因引起成長的抑制，以下進行第二個步序。
第二個步序是使用芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。如上所述，芽孢桿菌RNA酶抑制劑是上述的芽孢桿菌RNA酶阻礙的蛋白質(zhì)。在大腸菌中表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑能阻礙芽孢桿菌RNA酶的酶活性，在芽孢桿菌RNA酶存在下能阻礙其活性所分解的mRNA所應(yīng)該的分解。其結(jié)果，在由于芽孢桿菌RNA酶基因使表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的大腸菌進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化時，由于不抑制其生育，所以和利用不含芽孢桿菌RNA酶基因的對照質(zhì)粒進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化時的成長速度進行比較時，兩者的成長速度沒有很大差異，因此，也能預(yù)計到克隆的大小也沒有太大變化?；谶@一原理，由第一步序中選取的大腸菌配制質(zhì)粒，使用它，預(yù)先在結(jié)構(gòu)上表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的其他大腸菌進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化時，可以使和對照質(zhì)粒進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化的大腸菌相同大小的克隆，選作含有突變芽孢桿菌RNA酶基因的克隆。這里使用的，在結(jié)構(gòu)上表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的大腸菌配制，例如，可以用后述實施例1中記載的方法進行。
這樣得到的突變芽孢桿菌RNA酶基因可以根據(jù)需要，按慣用的方法解析DNA序列，詳細研究它的突變狀況。
本發(fā)明突變的芽孢桿菌RNA酶基因的優(yōu)選的一個實例是具有序列3的DNA序列。將這種基因進行編碼的堿基序列，和顯示野生型活性的序列1的堿基序列進行比較時，在從開始密碼子ATG的A數(shù)到第15位處有T的插入，但缺失第333位的A。若按照標準的翻譯方式，當從該序列3的DNA序列第1位的ATG開始翻譯時，將15堿基位插入T的結(jié)果是9位的密碼成為終止密碼，到此停止翻譯。不認為這時由產(chǎn)生的8個氨基酸形成的低聚肽具有芽孢桿菌RNA酶活性，而且，能以正的框架(フレ-ム)開始翻譯的ATG、GTG等密碼子附近也不存在。但是，由芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)恢復的大腸菌生育速度的上述事實，強烈地暗示出由序列3的基因以正框架引起芽孢桿菌RNA酶蛋白質(zhì)的翻譯。作為其理由，在對蛋白質(zhì)的翻譯過程中，核糖體自動錯開地讀框，以進行翻譯，可以認為有可能引起叫做移碼重編碼(Frame Shift Re-coding)現(xiàn)象。在病毒、大腸菌、動物的任何一種基因中都報導了這種現(xiàn)象，一般依賴于特定的堿基序列，并不需要特定的蛋白質(zhì)和翻譯裝置等。翻譯時，根據(jù)移碼的效率是由幾個％到50％的基因而不同。對于突變芽孢桿菌RNA酶基因的情況下，此時的翻譯讀框都有差異，引起效率降低，可以認為產(chǎn)生了少量的正框的翻譯產(chǎn)物，推測原因是這種基因的活性降低的結(jié)果。
例如，通過按Low Fidelity PCR法突變芽孢桿菌RNA酶基因，伴隨著序列3的DNA序列同樣讀框的偏移，以其他理由解釋，極大的可能性是得到了產(chǎn)生翻譯效率降低的其他突變的芽孢桿菌RNA酶基因。即使對序列3的DNA序列中的一個或多個堿基進行置換、缺失、插入、添加，由開始密碼子ATG的A數(shù)到第15位的位點插入T，和/或為使第333位的A缺乏，伴隨著序列3的DNA序列同樣讀框的偏移，最大的可能性是產(chǎn)生翻譯效率降低的突變芽孢桿菌RNA酶基因。我們認為這些突變基因和任何一個序列3的基因都相同，當在植物中表達花藥的特異性時，實際上可以使該植物形成雄性不育，所以序列號3的基因同樣包含在本發(fā)明中。
突變芽孢桿菌RNA酶基因能作為雄性不育的植物導入本基因，實際能形成雄性不育的植物，沒有特殊限定，列舉的具體實例，例如有稻、玉米、煙草、萵苣、菜籽等。其中，水稻和玉米特別好。
為了使植物雄性不育化，發(fā)現(xiàn)在該植物的花藥處形成特異的突變芽孢桿菌RNA酶基因，利用它的RNase活性阻礙花藥的機能。為了表達花藥的特異性，可使用WO92/13957中記載的方法。簡單敘述時，將突變的芽孢桿菌RNA酶基因連接在花藥特異性的啟動子的下游，用表達的載體組合到植物細胞中。
為了組合，有土壤桿菌法、電穿孔處理(エレクトロポレ-シヨン)法、粒子槍(パ-テイクルガン)法等。
為了由形質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物細胞形成植物體，可由形質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物細胞愈傷組織進行再生。這種方法，例如可以按Y.Hiei等人.，Plant J.6，271-2821994中公開的進行。
可以確認，這樣制備的植物體、形成雄性不育化，即使栽培這些植物體，由于沒有從其他植物體接受有育性的花粉，實際上是不育的。
實施例1.配制突變的芽孢桿菌RNA酶基因Low Fidelity PCR按照S.L.Beaucage等人.，Tetrahedron Lett.，22，1859-18621982中所記載的方法，使用DNA合成裝置(アプライドバイオシステムズ社制)，合成引物1(CGTTCGGCTC GATGGTACCG GTTATCAACACGTTTGA、序列號6)和引物2(CCTCTAGATT ATCTGATTTT TGTAAAGGTC TGATAATG、序列號7)。在造模中使用公知的質(zhì)粒pVE 108(WO92/13956)，將引物1和引物2組合進行PCR。pVE 108的芽孢桿菌RNA酶基因的編碼區(qū)域中相對應(yīng)部分的序列示于序列號1中。按下述反應(yīng)條件進行。即，10mMTris-HCl(pH9.5)、50mM KCl、2mM MgCl2、分別在1mM的dNTP、10ng的造模DNA、0.5單位的TaqDNA聚合酶中，按90℃1分、57℃1分、72℃1分，進行50個循環(huán)。
反應(yīng)后，將增幅產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳(2％ SeaKem GTG agarose，1×TAE)進行分離，按DEAE-纖維素法(村松正實編ラボマニコアル遺傳子工學)丸善、1988 PP111)進行精制，在造模中以上述條件下再次進行PCR反應(yīng)。突變導入到芽孢桿菌RNA酶基因片段質(zhì)粒載體的連接酶(ライゲ-シヨン)按照常法，將反應(yīng)產(chǎn)物用SacI、XbaI消化后，用瓊脂糖凝膠電泳進行精制，配制插入片段。將該插入片段導入大腸桿菌的質(zhì)粒進行適當選擇，例如可以使用質(zhì)粒pHM1。質(zhì)粒pHM1將質(zhì)體pBR 322的EcoRI部位進行切斷后，用T4 DNA聚合酶(寶酒造)進行光潔整理后，在其限制酶部位上，從PUC 18用PVuII切下的lacZ的表達合(カヤツト)(322bp)同樣進行光潔整理，進行組合而制成質(zhì)粒。
用SacI、XbaI消化質(zhì)粒pHM 1后，進一步利用小牛小腸的堿性磷酸酯酶(寶酒造)進行脫磷氧化，制成限制酶處理的質(zhì)粒片段。含有突變芽孢桿菌RNA酶基因的上述插入片段，用TaKara連接合Ver 1(TaKara Liga tion KitVer.1)(寶酒造)在限制酶處理的pHM 1中進行連接反應(yīng)(ライゲ-シヨン)。向大腸桿菌導入并選取芽孢桿菌RNA酶活性克隆導入芽孢桿菌RNA酶基因的大腸桿菌，例如按如下方式選取。即，在細胞內(nèi)由于芽孢桿菌RNA酶的活性而分解mRNA，降低了蛋白質(zhì)的合成，其結(jié)果抑制了大腸桿菌的成長。因此，和不含突變芽孢桿菌RNA酶基因的對照質(zhì)粒，進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化的大腸菌菌落比較，菌落大小變得很小，利用這一點，可以選擇由芽孢桿菌RNA酶基因進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。另外，將野生型芽孢桿菌RNA酶保持同等活性的突變芽孢桿菌RNA酶組合到PHM 1中時，由于大腸桿菌不能形成菌落，所以可以選取活性很弱的克隆。
因此將突變芽孢桿菌RNA基因連接的質(zhì)粒用乙醇沉淀后，根據(jù)使用GenePulser(BioRad)的電穿孔法，將該質(zhì)體導入大腸菌LE392株內(nèi)。導入順序根據(jù)BioRad社的指南進行。按照同樣的順序，導入不含突變芽孢桿菌RNA酶基因的對照質(zhì)粒于大腸桿菌LE392株內(nèi)。
之后，將這些形質(zhì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有四環(huán)素(25μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)鋪平，室溫下(25℃)培養(yǎng)72小時后，和導入對照質(zhì)粒pHM 1的大腸桿菌菌落進行比較，將菌落大小中小的菌落選出，作為含導入突變芽孢桿菌RNA酶基因的質(zhì)體的大腸桿菌菌落(表1中A)。根據(jù)芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因選取突變芽孢桿菌RNA酶克隆芽孢桿菌RNA酶抑制劑，如前所述，是對芽孢桿菌RNA酶具有對抗作用的酶。在表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑的大腸桿菌中，可以阻礙芽孢桿菌RNA酶的酶活性，在有芽孢桿菌RNA酶存在下，可以阻礙由其活性分解的mRNA的分解。結(jié)果，將表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑的大腸桿菌插入芽孢桿菌RNA酶基因的質(zhì)粒，進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化時，不抑制它的生育，所以，表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑的大腸菌在不含芽孢桿菌RNA酶基因中的對照質(zhì)粒進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化時，比較其生長速度時，其成長速度，兩者沒有太大差異，因此，可以預(yù)計到菌落大小也不會有太大變化。
按下述制備這種大腸桿菌。將R.W.Hartley，J.Mol.Biol.202，913-9151988中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因作為HindIII和XbaI，和tac啟動子(de Boer等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，21-251983)結(jié)合在讀框(インフレ-ム)內(nèi)，進一步將耐氯霉素的基因(N.K.Alton，和D.VapneK，Nature 282，864-8691979)連同(Herrero等人，J.Bacteriol.172，6557-65671990)中記載的載體，內(nèi)部結(jié)合在轉(zhuǎn)移酶缺損的轉(zhuǎn)座子(defectransposon)，之后，將得到的質(zhì)粒導入大腸桿菌MC 1061菌株內(nèi)，再將這種轉(zhuǎn)座子(含有芽孢桿菌RNA抑制劑基因的合)轉(zhuǎn)移到該大腸桿菌染色體內(nèi)。該大腸桿菌保持穩(wěn)定的芽孢桿菌RNA抑制劑基因合，這可以確認有耐氯霉素性。由于在大腸桿菌MC 1061株中缺損lacI基因，所以常常誘導向tac啟動子，在結(jié)構(gòu)上(constitutive)表達芽孢桿菌RNA抑制劑基因。
按照電穿孔法，將含有突變的芽孢桿菌RNA酶基因作為插入片段的質(zhì)粒，或不含有它的對照質(zhì)粒導入大腸桿菌后，再將這些大腸桿菌在含有IPTG(1mM)、四環(huán)素(25μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基中鋪展，在25℃下培養(yǎng)72小時。之后，從用突變芽孢桿菌RNA酶基因進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落中，同時開始平板培養(yǎng)的導入對照質(zhì)體PHM 1的大腸桿菌菌落進行比較，選取菌落大小無變化的克隆(命名為“#4-31”)，(表1中B)。
表1選取克隆和菌落的大小(mm)選取克隆 PHM1(對照)AE.Coli LE392*11.77±0.33 2.65±0.47B表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑 1.39±0.10 1.55±0.08基因的E.Coli*2*1在LB瓊脂培養(yǎng)基(25μg/ml四環(huán)素)上，28℃下培養(yǎng)48小時后的菌落大小*2在LB瓊脂培養(yǎng)基(25μg/ml四環(huán)素)上，28℃下培養(yǎng)24小時后的菌落大小實施例2突變芽孢桿菌RNA酶基因的堿基序列的確定由實施例1中選取的大腸桿菌，配制適用于本發(fā)明目的的克隆化突變芽孢桿菌RNA酶基因。首先，配制實施例1中選取的克隆#4-31。接著用KpnI、XbaI切取組合在克隆#4-31中的突變芽孢桿菌RNA酶基因片段，同樣用KpnI、XbaI切斷的PUC 119在KpnI、XbaI位點進行連接。將該質(zhì)粒用大腸桿菌增幅后，按使用Taq聚合酶的循環(huán)測序法(サイクルシ-クエンス)(Taq Dye Term inator Cycle Sequencing Kit，Applied Biosystems.Inc.)，按照制造商的指南進行反應(yīng)，接著用Applied Biosystems社制的DNA定序器(373A型)解析序列。結(jié)果得到序列號3中所示的序列。將這種序列和原來的芽孢桿菌RNA酶基因的DNA序列進行比較，在由開始密碼ATG的A數(shù)到第15位處，有T的插入，同時333位的A缺失。
實施例3使用弱毒性突變芽孢桿菌RNA酶基因制備雄性不育的水稻將上述在PUC119中組合進弱毒性突變芽孢桿菌RNA酶基因、質(zhì)粒用限制酶XbaI、KpnI進行切斷，構(gòu)成序列號5中所示的質(zhì)粒載體pTS 431。該pTS 431與已知質(zhì)粒的pVE 108質(zhì)粒(PCT申請國際公開第9213956號)有以下不同點，可以認為除去花藥特異的啟動子和突變芽孢桿菌RNA酶部分外實際上是等同的。
(1)在pVE 108質(zhì)粒中，導入了芽孢桿菌RNA酶基因(序列號1)的部分，本發(fā)明的pTS 431，變成了突變芽孢桿菌RNA酶基因(配列號3)。
(2)在PVE 108質(zhì)粒中，使用了來自煙草的花藥特異的啟動子，而在本發(fā)明的pTS 431中，更改為來自稻屬基因(PCT申請國際公開第9213956號)的花藥特異啟動子。
(3)本發(fā)明中，使用了在芽孢桿菌RNA酶基因的上游，沒有使用PVE 108質(zhì)粒的1376bp的35S3啟動子(EP 0344029)。
(4)本發(fā)明中，使用了在芽孢桿菌RNA酶基因的下游部位，沒有使用PVE 108質(zhì)粒的，從pJD 884(PCT申請國際公開第9309218號)切出的，來自土壤桿菌T-DNA基因7的下游部位的序列。
(5)本發(fā)明中，從來自PUC 19的部分中去除相當于lacZ的區(qū)域。另外，不在突變型中，將組合進過去的芽孢桿菌RNA酶基因的質(zhì)粒(pTS 172示于序列號4中。
從PTS 431(導入突變芽孢桿菌RNA酶基因的質(zhì)粒、序列號5)、pTS172(導入芽孢桿菌RNA酶基因的質(zhì)粒、序列號4)中，利用限制酶EcoRI分別切出約4.5Kbp的片段，插入中間載體pSB 11(T.Komari等人，PlantJ.10(1)，165-1741996)中的EcoRI部位，進一步利用相同重組，將它的T-DNA區(qū)域組合到受體載體pSB 1中(T.Komari等人.，植物(Plant)J.10(1)，165-1741996)。將具有這種重組質(zhì)粒(分別為PSB 1431、PSB 1172)的土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA 4404用于稻屬(品種アサノヒカリ)的形質(zhì)轉(zhuǎn)化中。形質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，雖然基本上按照 江井等人的方法(Plant J.6(2)，271-2821994)，但是，構(gòu)筑的雄性不育因基作為選取標記，由于含有bar基因(將phosphinit hricine acetyl轉(zhuǎn)移酶進行編碼)，所以，對于形質(zhì)轉(zhuǎn)化時的選取，在選取中，形質(zhì)轉(zhuǎn)化使用了Phosphinothricine(濃度10mg/l)。為了選取導入基因的愈傷組織，而使用Phosphinothricine。
在稻屬中，對使用了野生型芽孢桿菌RNA酶基因的情況和使用了突變芽孢桿菌RNA酶基因的情況進行了比較，形質(zhì)轉(zhuǎn)化效率、形態(tài)正常的雄性不育形質(zhì)轉(zhuǎn)化比率，如表2所示，通過導入突變芽孢桿菌RNA酶基因，得到了顯著改善。
表2.形質(zhì)轉(zhuǎn)化效率感染愈傷 再分化愈傷 PCR陽性 形態(tài)正常的雄性組織數(shù) 組織數(shù) 系統(tǒng)數(shù)*1不育系統(tǒng)數(shù)pSB1172(對照) 28388352/83 9/52(17.3％)pSB1431(對照) 787 6943/45*227/28*3(96.4％)*1按PCR檢出芽孢桿菌RNA酶的片段基因*2調(diào)查69個系統(tǒng)中的45個系統(tǒng)*3調(diào)查43個系統(tǒng)中的28個系統(tǒng)發(fā)明效果本發(fā)明中，利用突變制作了效果變?nèi)醯难挎邨U菌RNA酶基因，通過將使用雄性不育基因?qū)胫参镏?，在不用芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因時，只利用單一的基因，成功地獲得了不具有不好形質(zhì)的雄性不育植物。
序列表<110>日本煙草公司<120>突變芽孢桿菌RNA酶基因及其形質(zhì)轉(zhuǎn)化植物<130>980687<160>7<210>1<21>343<212>DNA<213>溶淀粉芽孢桿菌<220><221>NAME/KEYCDS<222>1..336<400>1atg gta ccg gtt atc aac acg ttt gac ggg gtt gcg gat tat ctt cag 48Met Val Pro Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln1 5 10 15aca tat cat aag cta cct gat aat tac att aca aaa tca gaa gca caa 96Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln20 25 30gcc ctc ggc tgg gtg gca tca aaa ggg aac ctt gca gac gtc gct ccg144Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro35 40 45ggg aaa agc atc ggc gga gac atc ttc tca aac agg gaa ggc aaa ctc192Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu
50 55 60ccg ggc aaa agc gga cga aca tgg cgt gaa gcg gat att aac tat aca240Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr65 70 75 80tca ggc ttc aga aat tca gac cgg att ctt tac tca agc gac tgg ctg288Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu85 90 95att tac aaa aca acg gac cat tat cag acc ttt aca aaa atc aga taa336Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg100 105 110ggtaacc343<210>2<211>112<212>PRT<213>溶淀粉芽孢桿菌<400>2Met Val Pro Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln1 5 10 15Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln20 25 30Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro35 40 45Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu50 55 60Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr65 70 75 80Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu
85 90 95Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg100 105 110<210>3<211>342<212>DNA<213><400>3atggtaccgg ttattcaaca cgtttgacgg ggttgcggat tatcttcaga catatcataa 60gctacctgat aattacatta caaaatcaga agcacaagcc ctcggctggg tggcatcaaa120agggaacctt gcagacgtcg ctccggggaa aagcatcggc ggagacatct tctcaaacag180ggaaggcaaa ctcccgggca aaagcggacg aacatggcgt gaagcggata ttaactatac240atcaggcttc agaaattcag accggattct ttactcaagc gactggctga tttacaaaac300aacggaccat tatcagacct ttacaaaaat cagtaatcta ga 342<210>4<211>6548<212>DNA<213>大腸桿菌LE392<220><223>克隆pTS172<400>4aattcaagct tgacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 60ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg120cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt180cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta240aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc300ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa360gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc420cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt480acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact540gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac600aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata660ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta720ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg780gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat840aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt900aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga960aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 1020gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 1080gtgaagatcc tttttggctc gagtctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1140cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1200cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1260gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1320aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1380cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1440tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1500acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1560ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1620ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1680tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1740tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1800ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1860gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 1920cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 1980gcgcgttggc ctgatcagaa ttcatatgca cgtgttcccg atctagtaac atagatgaca 2040ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa 2100tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca 2160tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac 2220cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcttcgg 2280aggttacctt atctgatttt tgtaaaggtc tgataatggt ccgttgtttt gtaaatcagc 2340cagtcgcttg agtaaagaat ccggtctgaa tttctgaagc ctgatgtata gttaatatcc 2400gcttcacgcc atgttcgtcc gcttttgccc gggagtttgc cttccctgtt tgagaagatg 2460tctccgccga tgcttttccc cggagcgacg tctgcaaggt tcccttttga tgccacccag 2520ccgagggctt gtgcttctga ttttgtaatg taattatcag gtagcttatg atatgtctga 2580agataatccg caaccccgtc aaacgtgttg ataaccggta ccatcgcgac ggcttgatgg 2640atctcttgct ggacaccggg atgctaggat gggttatcgt ggccggcgtg cgtgtgtggc 2700ttttgtaggc gccggcgacg gcgggggcaa tgtggcaggt gagtcacggt gcaagcgtgc 2760gcaagtgact gcaacaacca aggacggtca tggcgaaagc acctcacgcg tccaccgtct 2820acaggatgta gcagtagcac ggtgaaagaa gtgttgtccc gtccattagg tgcattctca 2880ccgttggcca gaacaggacc gttcaacagt taggttgagt gtaggacttt tacgtggtta 2940atgtatggca aatagtagta aattttgccc ccattggtct ggctgagata gaacatattc 3000tggaaagcct ctagcatatc ttttttgaca gctaaacttt gcttcttgcc ttcttggtct 3060agcaatgacg ttgcccatgt cgtggcaaac atctggtaag gtaactgtat tcgtttgttc 3120ccttcaacgg ctcaatcccc acaggccaag ctatcctttc cttggcagta taggctcctt 3180gagagattat actaccattt ttaagtgctt ataaagacga tgctctctaa ccagatcgat 3240cagaaacaca aagttttagc agcgtaatat cccacacaca tacacacacg aagctatgcc 3300tcctcatttt ccgagagatt ctgacagtga ccagaatgtc agaatgccat ttcatgggca 3360caagtcgatc cacaagcttc ttggtggagg tcaaggtgtg ctattattat tcgctttcta 3420ggaaattatt cagaattagt gccttttatc ataacttctc tctgagccga tgtggttttg 3480gatttcattg ttgggagcta tgcagttgcg gatattctgc tgtggaagaa caggaactta 3540tctgcggggg tccttgctgg ggcaacattg atatggttcc tgttcgatgt agtagaatac 3600aatataattc cgctcctttg ccagattgcc attcttgcca tgcttgtgat cttcatttgg 3660tcaaatgccg caccactctt ggacaggtat tagctttatt tcctgtggag atggtagaaa 3720actcagctta cagaaatggc atttcacgta gtataacgca agacattagg tactaaaact 3780caactaactg tttccgaatt 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cacgaggagc atcgtggaaa 5520aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgacatc tccactgacg 5580taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 5640catttcattt ggagaggaca cgctgaaatc accagtctct ctctataaat ctatctctct 5700ctctataacc atggacccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga 5760catgccggcg gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg 5820taccgagccg caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta 5880tccctggctc gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg 5940gaaggcacgc aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca 6000ccagcggacg ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca 6060gggcttcaag agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca 6120cgaggcgctc ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa 6180ctggcatgac gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt 6240cctgcccgtc accgagatct gagatcacgc gttctaggat cccccgatga gctaagctag 6300ctatatcatc aatttatgta ttacacataa tatcgcactc agtctttcat 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權(quán)利要求
1.一種突變的芽孢桿菌RNA酶基因，在將芽孢桿菌RNA酶進行編碼的基因時，通過使該基因的DNA序列至少一部分產(chǎn)生突變，在植物中花藥特異性表達該突變基因時，它對于花藥以外的組織，實際上不產(chǎn)生不適宜的影響，實質(zhì)上可以使該植物形成雄性不育化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的基因，其特征是，突變是產(chǎn)生移碼重編碼的突變。
3.一種編碼蛋白質(zhì)的基因，其特征是，在和序列號1中記載的氨基酸序列相同的氨基酸序列進行編碼的DNA序列中，置換、缺失、插入或添加1個或數(shù)個核苷酸，而且，在植物中花藥特異表達時，實際上能使該植物雄性不育化。
4.一種基因，其特征是，在和序列號1中記載的氨基酸序列相同的氨基酸序列進行編碼的DNA序列中，置換、缺失、插入或添加1個或多個核苷酸的DNA序列，在其上游有花藥特異表達的啟動子序列，當導入植物基因時，實質(zhì)上該植物是雄性不育化。
5.一種編碼蛋白質(zhì)的基因，其特征是，序列號3中所示，而且在植物中花藥表達特異性時，實質(zhì)上該植物是雄性不育化。
6.一種基因，其特征是，序列號3所示的序列，在其上游存在具有花藥特異性表達的啟動子序列，導入植物基因中時，實質(zhì)上該植物是雄性不育化。
7.在宿主植物中能表達該基因的重組載體，含有權(quán)利要求1～6中任一項記載的基因。
8.一種使植物形成雄形不育的方法，是通過使用權(quán)利要求1～6中任一項記載的突變芽孢桿菌RNA酶基因使植物進行形質(zhì)轉(zhuǎn)化，花藥特異性表達該突變芽孢桿菌RNA酶基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，由突變芽孢桿菌RNA酶基因產(chǎn)生的植物形質(zhì)轉(zhuǎn)化，是通過向植物基因組中組合該基因。
10.導入權(quán)利要求1～6中任一項記載的基因的形質(zhì)轉(zhuǎn)化植物。
全文摘要
通過在花藥可特異性地只表達芽孢桿菌RNA酶基因,制備沒有不好性質(zhì)的雄性不育植物。通過發(fā)生突變,保持其活性,但降低的芽孢桿菌RNA酶基因?qū)胫参镏?。并在花藥特異性地表達,可有效地獲得雄性不育植物的形質(zhì)轉(zhuǎn)化體。
文檔編號C12N5/10GK1274388SQ9980129
公開日2000年11月22日 申請日期1999年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月4日
發(fā)明者浜田和行, 中木戶文夫 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社