專利名稱：新的人含c2結構域的膜蛋白及其編碼序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域和遺傳工程領域，具體地說，本發(fā)明涉及了一種新的多肽——人含C2結構域的膜蛋白(Novel Human C2 Domains Protein，簡稱“BioHC2”)，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。
C2結構域在自然界中廣泛存在，最先在蛋白激酶C的Ca2+依賴性同工酶中發(fā)現(xiàn)，可能參與Ca2+依賴性的磷脂結合作用。包含C2結構域的大多數(shù)蛋白參與信號傳導或膜運輸活動，如參與構成膜通道、生成脂第二信使、激活GTP合酶、調控蛋白磷酸化等。C2結構域表現(xiàn)出能結合不同配體和底物的顯著特性如Ca2+、磷酸脂、磷酸化肌醇和胞內蛋白等。并非所有含C2結構域的蛋白均受Ca2+調節(jié)，某些C2結構域純粹起結構作用或已失去結合Ca2+的功能[Nalefski EA,et al. Protein Sci 1996;5L:2375-90]。
突觸結合蛋白Ⅰ定位于突觸小泡，參與Ca2+調節(jié)的胞吐作用，與神經傳遞素的釋放有關[Rizo J,et al.J Biol Chem 1998;273:15879-15882]。C2結構域占據(jù)突觸結合蛋白的大部分胞質區(qū)域，形成兩個明顯具不同功能的拓樸折疊結合Ca2+的C2A結構域(類似于Ca2+感受器)和結合高度磷酸化肌醇的C2B結構域[Mikoshiba K,et al. Chem Phys Lipids1999;98:59-67]。排列突出的氨基酸殘基在C2結構域的折疊中起關鍵作用，或為Ca2+結合和調節(jié)所必需的。突觸分泌小泡的C2A結構域結合Ca2+則激活Ca2+調節(jié)的胞吐作用，結合磷酸肌醇則抑制Ca2+調節(jié)的胞吐作用。
C2結構域的結構和功能對于凝結因子Ⅷ(FⅧ)的表達和調節(jié)是重要的。C2結構域包括一個磷脂(PL)結合位點、一個vWF結合位點、一個FⅧ抑制劑同種抗體的共同表位，F(xiàn)Ⅷ的缺損會引致凝血紊亂、A型血友病等[Nogami K,et al.J Biol Chem1999;274:31000-7]。C2結構域可增加底物親和力以激活酶活性，它是磷酸脂酶1的催化活性所必需的，其結構部分缺損會引致酶失活[Lomasney JW,et al.J Biol Chem1999;274:21995-2001]。
研究表明，C2結構域的過度表達或抑制與一些疾病有密切關系，例如免疫紊亂、癌癥等。因此，為診斷、預防、治療相關疾病，研究和開發(fā)人含C2結構域的膜蛋白有重要意義。
本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽——人含C2結構域的膜蛋白(簡稱為“BioHC2”)以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該BioHC2多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼BioHC2的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼BioHC2的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產BioHC2的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的BioHC2多肽的抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供了針對本發(fā)明BioHC2多肽的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供診斷和治療與BioHC2異常相關的疾病的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的人含C2結構域的膜蛋白(BioHC2)，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、類似物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過5％的衍生物。
在本發(fā)明的第二方面，提供分離的編碼這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述BioHC2的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中46-573位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-2535位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明的人的含C2結構域的膜蛋白(BioHC2)和線蟲的含C2結構域的蛋白(U88167)的氨基酸序列同源性比較圖。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的BioHC2蛋白或多肽”是指BioHC2基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化BioHC2?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。BioHC2多肽的純度能用氨基酸分析確定。
本發(fā)明提供了一種新的多肽——BioHC2多肽，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括BioHC2的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明天然的BioHC2相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍之內。
本發(fā)明還提供了分離的核酸(多核苷酸)，該多核苷酸基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。較佳地，本發(fā)明的多核苷酸序列具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一種多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，“核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼BioHC2的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的編碼BioHC2的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經常選用的方法。更經常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉錄，形成質?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory.New York,1989)。還可得到商業(yè)供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶鏈反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定BioHC2轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應用。在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少3個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內，較佳的為1000個核苷酸之內。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針DNA探針可用放射性同位素、熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等進行標記。
在第(4)種方法中，檢測BioHC2基因表達的蛋白產物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因或其各種DNA片段的核苷酸序列，可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et a1.PNAS,1977,74:5463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用BioHC2編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼BioHC2的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術語“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(Rosenberg，et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用于構建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
可用本領域的技術人員熟知的方法來構建含編碼BioHC2的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄?？膳e的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發(fā)明中，編碼BioHC2的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。宿主細胞的代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。也可用MgCl2進行。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science,1984;224;1431)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的BioHC2。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人BioHC2的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化或轉導的宿主細胞；(3)．從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動劑和抑制劑可直接用于疾病治療。BioHC2蛋白或多肽可做為藥物治療C2結構域功能低下或喪失所致的疾病。BioHC2的拮抗劑可用來治療或預防免疫紊亂，免疫紊亂包括但(不局限于)紅斑狼瘡、糖尿病、貧血、凝血障礙、重癥肌無力、血色素沉著癥、血友病等。
BioHC2的拮抗劑或片段或衍生物可用來治療或預防信號傳導或膜運輸功能紊亂等引起的疾病，以及影響神經傳遞素釋放所引起的疾病。
BioHC2的拮抗劑或片段或衍生物可用來治療或預防癌癥，癌癥包括(但并不局限于)腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤等；尤其是腎、膀胱、胰腺、骨、腦、乳腺、子宮、膽囊、肝、肺、甲狀腺、食道、睪丸、皮膚、腸系膜等部位有關的癌癥。與BioHC2特異性結合的抗體可直接用作拮抗劑，或間接以靶向或傳遞機制將藥劑帶到表達BioHC2的細胞或組織中。BioHC2的拮抗劑或片段或衍生物可用來治療或預防癌癥免疫紊亂。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)BioHC2的藥劑的方法。激動劑提高BioHC2刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關的紊亂如各種癌癥。例如，在藥物的存在下，將哺乳動物細胞與標記的BioHC2一起培養(yǎng)，然后測定藥物提高或阻遏BioHC2作用的能力，從而鑒別出激動劑或拈抗劑。
BioHC2的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。BioHC2的拮抗劑可以與BioHC2多肽結合并消除其功能，或是抑制該多肽的產生，或是與該多肽的活性位點結合使該多肽不能發(fā)揮生物學功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將BioHC2加入生物分析測定中，通過測定化合物對BioHC2和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與BioHC2結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對BioHC2分子進行標記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對BioHC2抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。
多克隆抗體的生產可用BioHC2直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到。有多種佐劑可用于增強免疫反應，其中包括但不限于弗氏佐劑等。制備BioHC2的單克隆抗體的技術包括(但不限于)雜交瘤技術(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.Pat No.496778)也可用于生產抗BioHC2的單鏈抗體。
抗BioHC2的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的BioHC2。與BioHC2結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
抗體還可用于設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如BioHC2高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅BioHC2陽性的細胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與BioHC2相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷BioHC2的產生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測BioHC2水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的BioHC2水平，可以用作解釋BioHC2在各種疾病中的重要性和用于診斷BioHC2起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析。例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質譜分析。
編碼BioHC2的多核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于BioHC2的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計用于表達變異的BioHC2，以抑制內源性的BioHC2活性。例如，一種變異的BioHC2可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的BioHC2，雖可與下游的底物結合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用于治療BioHC2表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將編碼BioHC2的多核苷酸轉移至細胞內。構建攜帶編碼BioHC2的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et al.)。另外重組編碼BioHC2的多核苷酸可包裝到脂質體中然后再轉移至細胞內。
多核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
抑制BioHC2 mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼BioHC2的多核苷酸可用于診斷與BioHC2相關的疾病。編碼BioHC2的多核苷酸可用于檢測BioHC2的表達與否或在疾病狀態(tài)下BioHC2的異常表達。如編碼BioHC2的DNA序列可用于對活檢標本進行雜交以判斷BioHC2的表達狀況。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用BioHC2特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測BioHC2的轉錄產物。
檢測BioHC2基因的突變也可用于診斷BioHC2相關的疾病。BioHC2突變的形式包括與正常野生型BioHC2 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點。然而，現(xiàn)在只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復多態(tài)性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關基因相關聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human Chromosomes:a Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
接著，測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與疾病有關的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應于一個基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體(藥學上可接受的載體)組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的本發(fā)明多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內等的給藥途徑。BioHC2以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的BioHC2的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的成熟多肽。該多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的，多核苷酸序列全長為2535個堿基，其開放讀框(46-573)編碼了175個氨基酸。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與線蟲的含C2結構域的蛋白有44％的同源性，由此推斷本發(fā)明新的人BioHC2具有含C2結構域蛋白基因家族相似的結構和功能。經Antheprot軟件分析，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明新的人BioHC2具有一個92-115位氨基酸殘基構成的跨膜片段，由此推斷它是一個跨膜蛋白。
本發(fā)明所提供的人BioHC2的cDNA、寡聚核苷酸、多肽及抗體等，對于研究不同組織和細胞中C2結構域的作用、診斷C2結構域失調的相關性疾病、篩選抑制劑或藥物治療這些疾病有重要價值。
此外，由于本發(fā)明的人BioHC2蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1BioHC2 cDNA的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quick mRNA分離試劑盒(Qiegene公司產品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產品)的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA文庫。用染料終止循環(huán)反應測序試劑盒(Perkin-Elmer公司產品)和ABI 377自動測序議(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5’和3’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)進行比較，結果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆(0865b03)的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，0865b03克隆所含的全長cDNA為2535bp(如SEQ ID NO1所示)，從第46bp至573bp有一個528bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(如SEQ ID NO2所示)。此克隆被命名為pBS-0865b03，其編碼的蛋白質命名為人含C2結構域的膜蛋白(簡稱為“BioHC2”)。
實施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的人BioHC2基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990;215:403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索。與本發(fā)明的人BioHC2基因同源性最高的基因是一種已知的線蟲的含C2結構域蛋白的基因，其編碼的蛋白在Genbank的準入號為U88167。蛋白質同源比較結果示于圖1，兩者高度同源，其相同性為44％；相似性為65％。這表明，本發(fā)明的新多肽具有含C2結構域的蛋白的結構和功能。
實施例3用RT-PCR方法克隆BioHC2基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增引物15’-GCTTTTGTGCTCTTTCTCTT-3’(SEQ ID NO.3)引物25’-TGGGAAAGATTATTTTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)引物1對應于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；引物2對應于SEQ ID NO1中的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃30sec；55℃，30sec；72℃2min。在RT-PCR時同時設β-肌動蛋白為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產品)。DNA序列分析結果表明，PCR產物的DNA序列與SEQID NO1所示的1-2535bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析BioHC2基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。
用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法制備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為SEQ 1所示的PCR擴增的BioHC2編碼區(qū)序列(46bp至573bp)。將32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實施例5重組BioHC2的體外表達、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1的編碼區(qū)序列(46-573位)，設計出一對特異性擴增引物，序列如下引物35’-CCCGGATCCTTGTTACTATTGACATGGAA-3’(SEQ ID No 5)引物45’-CCCGCGGCCGCCTAGCCAAGATTGTTTTTCT-3’(SEQ ID No 6)此兩段引物的5’端分別含有BamHⅠ和NotⅠ酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，BamHⅠ和NotⅠ酶切位點相應于表達載體質粒pET-28b(+)(Novagen公司產品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-0865b03質粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-0865b03質粒10pg、引物3和引物4分別為10pmmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃20s,60℃30s,68℃2min，共25個循環(huán)。用BamHⅠ和NotⅠ分別對擴增產物和質粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0865b03)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0865b03)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.BindQuick Cartridge(Novagen公司產品)進行層析，得到了純化的目的蛋白BioHC2。經SDS-PAGE電泳，在19kDa處得到一單一的條帶。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例6抗BioHC2抗體的產生用多肽合成儀(PE公司產品)合成下述BioHC2特異性的多肽Met-Ile-Pro-Leu-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Trp-Asn-Tyr-Phe(SEQ ID NO7)。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合物，方法參見Avrameas，et al.Immunochemistry,1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經15μg/ml牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與BioHC2結合。
實施例7本發(fā)明的多核苷酸片段用作雜交探針的應用從本發(fā)明的多核苷酸中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針有多方面的用途，如用該探針可與不同來源的正常組織或病理組織的基因組或cDNA文庫雜交以鑒定其是否含有本發(fā)明的多核苷酸序列和檢出同源的多核苷酸序列，進一步還可用該探針檢測本發(fā)明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常組織或病理組織細胞中的表達是否異常。
本實施例的目的是從本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO1中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針，并用濾膜雜交方法鑒定一些組織中是否含有本發(fā)明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。濾膜雜交方法包括斑點印跡法、Southern印跡法、Northern印跡法和復印方法等，它們都是將待測的多核苷酸樣品固定在濾膜上后使用基本相同的步驟雜交。這些相同的步驟是固定了樣品的濾膜首先用不含探針的雜交緩沖液進行預雜交，以使濾膜上樣品的非特異性的結合部位被載體和合成的多聚物所飽和。然后預雜交液被含有標記探針的雜交緩沖液替換，并保溫使探針與靶核酸雜交。雜交步驟之后，未雜交上的探針被一系列洗膜步驟除掉。本實施例利用較高強度的洗膜條件(如較低鹽濃度和較高的溫度)，以使雜交背景降低且只保留特異性強的信號。本實施例選用的探針包括兩類第一類探針是完全與本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO1相同或互補的寡核苷酸片段；第二類探針是部分與本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO1相同或互補的寡核苷酸片段。本實施例選用斑點印跡法將樣品固定在濾膜上，在較高強度的的洗膜條件下，第一類探針與樣品的雜交特異性最強而得以保留。
一、探針的選用從本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO1中選擇寡核苷酸片段用作雜交探針，應遵循以下原則和需要考慮的幾個方面1，探針大小優(yōu)選范圍為18-50個核苷酸；2，GC含量為30％-70％，超過則非特異性雜交增加；3，探針內部應無互補區(qū)域；4，符合以上條件的可作為初選探針，然后進一步作計算機序列分析，包括將該初選探針分別與其來源序列區(qū)域(即SEQ ID NO1)和其它已知的基因組序列及其互補區(qū)進行同源性比較，若與非靶分子區(qū)域的同源性大于85％或者有超過15個連續(xù)堿基完全相同，則該初選探針一般就不應該使用；5，初選探針是否最終選定為有實際應用價值的探針還應進一步由實驗確定。
完成以上各方面的分析后挑選并合成以下二個探針探針1(probel)，屬于第一類探針，與SEQ ID NO1的基因片段完全同源或互補(41Nt)TTGTTGTTACTATTGACATGGAACTACTTCTTGATAATATC探針2(probe2)，屬于第二類探針，相當于SEQIDNO1的基因片段或其互補片段的替換突變序列(41Nt)TGATGGAATGCCTTGAAGTGTAACGAGTTGCGTCAGAATGG與以下具體實驗步驟有關的其它未列出的常用試劑及其配制方法請參考文獻DNAPROBES G H.Keller;M.M.Manak;Stockton Press,1989(USA)以及更常用的分子克隆實驗手冊書籍如《分子克隆實驗指南》(1998年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學出版社。
樣品制備1，從新鮮或冰凍組織中提取DNA步驟1)將新鮮或新鮮解凍的人胎腦組織放入浸在冰上并盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的平皿中。用剪刀或手術刀將組織切成小塊。操作中應保持組織濕潤。2)以1000g離心切碎組織10分鐘。3)用冷勻漿緩沖液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/L Tris-HCl,pH7.5;25mmol/LnaCl;25mmol/L MgCl2)懸浮沉淀(大約10ml/g)。4)在4℃用電動勻漿器以全速勻漿組織懸液，直至組織被完全破碎。5)1000g離心10分鐘。6)用重懸細胞沉淀(每0.1g最初組織樣品加1-5ml)，再以1000g離心10分鐘。7)用裂解緩沖液重懸沉淀(每0.1g最初組織樣品加1ml)，然后接以下的苯酚抽提法。
2，DNA的苯酚抽提法步驟1)用1-10ml冷PBS洗細胞，1000g離心10分鐘。2)用冷細胞裂解液重懸浮沉淀的細胞(1×108細胞/ml)最少應用100ul裂解緩沖液。3)加SDS至終濃度為1％，如果在重懸細胞之前將SDS直接加入到細胞沉淀中，細胞可能會形成大的團塊而難以破碎，并降低的總產率。這一點在抽提＞107細胞時特別嚴重。4)加蛋白酶K至終濃度200ug/ml。5)50℃保溫反應1小時或在37℃輕輕振搖過夜。6)用等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，在小離心機管中離心10分鐘。兩相應清楚分離，否則重新進行離心。7)將水相轉移至新管。8)用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，離心10分鐘。9)將含DNA的水相轉移至新管。然后進行DNA的純化和乙醇沉淀。
3，DNA的純化和乙醇沉淀步驟1)將1/10體積2mol/L醋酸鈉和2倍體積冷100％乙醇加到DNA溶液中，混勻。在-20℃放置1小時或至過夜。2)離心10分鐘。3)小心吸出或倒出乙醇。4)用70％冷乙醇500ul洗滌沉淀，離心5分鐘。5)小心吸出或倒出乙醇。用500ul冷乙醇洗滌沉淀，離心5分鐘。6)小心吸出或倒出乙醇，然后在吸水紙上倒置使殘余乙醇流盡?？諝飧稍?0-15分鐘，以使表面乙醇揮發(fā)。注意不要使沉淀完全干燥，否則較難重新溶解。7)以小體積TE或水重懸DNA沉淀。低速渦旋振蕩或用滴管吹吸，同時逐漸增加TE，混合至DNA充分溶解，每1-5×106細胞所提取的大約加1ul。
以下第8-13步驟僅用于必須除去污染時，否則可直接進行第14步驟。8)將RNA酶A加到DNA溶液中，終濃度為100ug/ml，37℃保溫30分鐘。9)加入SDS和蛋白酶K，終濃度分別為0.5％和100ug/ml。37℃保溫30分鐘。10)用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提反應液，離心10分鐘。11)小心移出水相，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)重新抽提，離心10分鐘。12)小心移出水相，加1/10體積2mol/L醋酸鈉和2.5體積冷乙醇，混勻置-20℃1小時。13)用70％乙醇及100％乙醇洗滌沉淀，空氣干燥，重懸核酸，過程同第3-6步驟。14)測定A260和A280以檢測DNA的純度及產率。15)分裝后存放于-20℃。
樣膜的制備1)取4×2張適當大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，用鉛筆在其上輕輕標出點樣位置及樣號，每一探針需兩張NC膜，以便在后面的實驗步驟中分別用高強度條件和強度條件洗膜。
2)吸取及對照各15微升，點于樣膜上，在室溫中晾干。
3)置于浸潤有0.1mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干置于浸潤有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干。
4)夾于干凈濾紙中，以鋁箔包好，60-80℃真空干燥2小時。
探針的標記
1)3μlProbe(0.1OD/10μl)，加入2μlKinase緩沖液，8-10uCiγ-32P-dATP+2U Kinase，以補加至終體積20μl。
2)37℃保溫2小時。
3)加1/5體積的溴酚藍指示劑(BPB)。
4)過Sephadex G-50柱。
5)至有32P-Probe洗出前開始收集第一峰(可用Monitor監(jiān)測)。
6)5滴/管，收集10-15管。
7)用液體閃爍儀監(jiān)測同位素量8)合并第一峰的收集液后即為所需制備的32P-Probe(第二峰為游離γ-32P-dATP)。
預雜交將樣膜置于塑料袋中，加入3-10mg預雜交液(10×Denhardt,s;6×SSC,0.1mg/ml CTDNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴搖2小時。
雜交將塑料袋剪去一角，加入制備好的探針，封好袋口后，42℃水浴搖過夜。
洗膜高強度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。
2)2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)。
3)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)。
4)0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30分鐘(2次)，室溫晾干。低強度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。
2)2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)。
3)0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)。
4)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)，室溫晾干。
X-光自顯影-70℃，X-光自顯影(壓片時間根據(jù)雜交斑放射性強弱而定)。
實驗結果采用低強度洗膜條件所進行的雜交實驗，以上四個探針雜交斑放射性強弱沒有明顯區(qū)別；而采用低強度洗膜條件所進行的雜交實驗，探針1的雜交斑放射性強度明顯強于其它三個探針雜交斑的放射性強度。因而可用探針1定性和定量地分析本發(fā)明的多核苷酸在不同組織中的存在和差異表達。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)發(fā)明名稱新的人含C2結構域的膜蛋白及其編碼序列(ⅱ)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2535bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO11 GCTTTTGTGCTCTTTCTCTTTGTTGTCTGGAACTTTGAGCTCTACATGATACCACTGGTT61 TTGTTGTTACTATTGACATGGAACTACTTCTTGATAATATCAGGGAAAGATAACAGGCAA121 CGTGATACAGTAGTGGAGGACATGCTAGAGGACGAGGAAGAAGAAGATGACAAAGATGAC181 AAGGACAGTGAAAAAAAGGGATTTATAAATAAAATCTATGCCATCCAGGAGGTATGTGTC241 AGTGTCCAGAACATCCTAGATGAAGTGGCTTCCTTTGGCGAAAGGATAAAGAATACTTTC301 AACTGGACTGTCCCATTCTTAAGCTGGCTGGCCATTGTAGCCCTCTGTGTGTTCACAGCC361 ATCCTGTACTGCATTCCGCTGAGATACATTGTCCTTGTCTGGGGCATCAATAAATTTACA421 AAAAAGCTTCGGAGTCCATATGCAATTGATAACAATGAACTACTTGACTTCCTTTCCAGA481 GTCCCTTCAGATGTACAAGTGGTGCAATACCAAGAACTGAAACCAGATCCTTCTCATAGC541 CCATATAAAAGAAAGAAAAACAATCTTGGCTAGCCAGCTCCCAGCACTGAGGAGACCAGC601 ATCTGTTTGGGAAGATAAAAGAAAAAGCCCTCAGCCTCAGCAGCATTTCCTTTCTTTCTG661 CTTTTTATTTATTTTGCCTTTTTATCATGATCGAGAGAATCTGTAAATAGTGTACAAAGG721 CATATGTCTTTGAATATATACTTCTATTGTACAGACTCAACTTGATAAAGGTTTTGCTAC781 TGCTGTGTCAAAACCTTGTTAGCTGTGGATAATAATATAACACACTGAAAGAACAAATAT841 AAGAATGATAACACTGGAAGATATATTCTTATCTAATTACAAGTGGATTAAATACTCACC901 TGTGCTCTGATTAAATCTACATCAATTGTAAATGTCGATTTGATTTTAAAGTTTTTTTTT961 AATGCGACTATTTTTTATCTGAAAAGTAATCCATTACACTTTTCTATGTTTTATACATTT1021 CAAAAGGGAGGGAAATTCCAAAGCCTGAATAATGGAATGGATACATTTCAATTTAACATA1081 TATTCTGGCTTTAGATCCCGACATTCACTCCTGTGCAAATTACTTAGGTATGACTTAGGC1141 TAATTTTAAGCTAATAAGTGAAGGTACATTCACTCCCTCAAGAGAATCAATACTCAGAAG1201 GTTACAAAGTTTTCTTTATAGAATTTCAATCAATCATTCCATCTAAAACCTTAAAATCTC1261 TACAGGACTACATAACATAAATACTGCCAGTTTATAAACGATTGCCTATCTGAATTTTTA1321 TACCTACCACTACTTTAATTTATACAGTTAGTTAGCAAATTAGCAACCCAGTAAGTACAG1381 TTATCAAAAATACTAGGAAACTATATCCATATCGCTTTTGGTGTCAGATTGTATCTGTGC1441 ATCTAAAAATATTTTAATAAATACTCAAGTGCTCTCAGAGCCTG1501 CTTTCTCATTAGATTACTGAAATGCTTTAATTCATACTATGATTTTGTTATTAGTGTGAA1561 TTTTAATGTAGAGAATTCAGTGTGCTAAGTGATATGCCAGTGTTTCACTACATTCATTTA1621 TTAAAAAAAAATCATTCTTGATTATGCATGAAAACCTGTTTTGTAAAATAAAATAAACTG1681 CTTGGGGGTGGTGGTTGCCTTTATCAATGTTTCACTATTATCATAGAATCTATACTTAAA1741 AATTGCATTCCCAAGACTCTTAAAGTAGTTTTTATATCTCACTCCCTGGTATACTAAGGG1801 AGCATAACTCTGGAGAAAAAATAATTTGGTTGGTTGAGAATGTCTTACTTCCCTGACTTG1861 GTAGGGGACTACACTCAGTTGAAATTGCAGCAGACAATGCTTTGCACTACTTTATTAATA1921 ATAAACTTGGATGGGGTAAAAGTGGGGGTTATACTGGAAAAACTATAGAAAAGCTAAAAG1981 AAATGTATATTTCACTCTAAAGGAAGATTCTTTAACAATAAATGTAATCTCATTGAAGCT2041 GATTTTTAAAGTATTTTTATTTTAGAGATAAGTTGTTAAATACTATTTCTTATAATAGAA2101 CTATTTTGATCTGTTTATATACTATGCTTGAATGTCAATTAAATTCCCTTTCTACAGAAA2161 GGCTTTGACCTCAACATGCTTTATTTAATGTATCATGTTTAAAATGACATGCTTCTGTCT2221 GCATACCATCACTGTTTGTTGCTAAAAACATAATGTTCCATGAACATGATGTTACTACAG2281 AAAGTTTATTGATGAGATAACTGTTTGAAATAACTTTCAATTATACCTTATGTGAGACTT2341 TTATGTTCTGTGCTGACAATGTGTACTCAAATGTCTATAAGCCTGATATTCTACAACCTC2401 AGATGTATCTAGTGGATAGTAACCATTAACAGATGACTAATTTGTTTCACTGTATCAAAT2461 TTCAGATGTTTAGTTCAATGGTAATGCTGACTACACATTCACTGTATTAAATACAAAAGA2521 AAATAATCTTTCCCA(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度175個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅲ)序列描述SEQ ID NO21 Met Ile Pro Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Thr Trp Asn Tyr Phe16 Leu Ile Ile Ser Gly Lys Asp Asn Arg Gln Arg Asp Thr Val Val31 Glu Asp Met Leu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Asp46 Lys Asp Ser Glu Lys Lys Gly Phe Ile Asn Lys Ile Tyr Ala Ile61 Gln Glu Val Cys Val Ser Val Gln Asn Ile Leu Asp Glu Val Ala76 Ser Phe Gly Glu Arg Ile Lys Asn Thr Phe Asn Trp Thr Val Pro91 Phe Leu Ser Trp Leu Ala Ile Val Ala Leu Cys Val Phe Thr Ala106 Ile Leu Tyr Cys Ile Pro Leu Arg Tyr Ile Val Leu Val Trp Gly121 Ile Asn Lys Phe Thr Lys Lys Leu Arg Ser Pro Tyr Ala Ile Asp136 Asn Asn Glu Leu Leu Asp Phe Leu Ser Arg Val Pro Ser Asp Val151 Gln Val Val Gln Tyr Gln Glu Leu Lys Pro Asp Pro Ser His Ser166 Pro Tyr Lys Arg Lys Lys Asn Asn Leu Gly(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO3GCTTTTGTGCTCTTTCTCTT 20(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO4TGGGAAAGATTATTTTCTTT 20(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO5CCCGGATCCTTGTTACTATTGACATGGAA 29(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個堿基
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO6CCCGCGGCCGCCTAGCCAAGATTGTTTTTCT 31(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅲ)序列描述SEQ ID NO7Met-Ile- Pro- Leu- Val- Leu- Leu- Leu- Leu -Leu- Thr-Trp- Asn- Tyr- Phe 1權利要求
1.一種分離的人BioHC2多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的片段、類似物或衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，它是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過5％的衍生物。
3.如權利要求2所述的多肽，其特征在于，它是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是選自下組(a)編碼具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；(c)與(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是編碼具有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列是具有SEQ ID NO.1中46-573位的序列或具有SEQ ID NO.1中1-2535位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于，它是由權利要求4所述多核苷酸與質粒、病毒或表達載體構建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，其特征在于，它是選自于下列一種宿主細胞(a)用權利要求7所述的重組載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求4所述多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
9.一種具有BioHC2活性的多肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括(a)在適合表達BioHC2條件下，培養(yǎng)權利要求8所述的工程化宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有BioHC2活性的多肽。
10.一種能與多肽結合的抗體，其特征在于，所述抗體是能與BioHC2特異性結合的抗體。
11.一類模擬或調節(jié)多肽活性或表達的化合物，其特征在于，它是模擬BioHC2的活性化合物，或促進BioHC2的活性的化合物，或拮抗BioHC2的活性的化合物，或抑制BioHC2的活性的化合物。
12.如權利要求11所述的化合物，其特征在于，它是SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13.一種權利要求11所述化合物的應用，其特征在于，所述化合物用于調節(jié)BioHC2在體內、體外活性的方法。
14.一種檢測與權利要求1所述的BioHC2多肽相關的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于，是通過選自下組的方法來檢測相關的疾病或疾病的易感性(a)間接或直接檢測所述多肽表達量是否異常；(b)間接或直接檢測所述多肽活性是否異常；(c)直接或間接檢測多核苷酸中引起所述多肽表達量或活性異常的核苷酸變異。
15.如權利要求1所述多肽的應用，其特征在于，它應用于篩選BioHC2的模擬物、激動劑、拮抗劑或抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
16.如權利要求4所述的核酸分子的應用，其特征在于，它作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
17.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽和/或權利要求4所述的多核苷酸以及藥學上可接受的載體。
18.如權利要求1所述的多肽的應用，其特征在于，用所述多肽制備用于調節(jié)及治療跨膜運輸功能紊亂、信號傳導障礙等多種疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的人含C2結構域的膜蛋白(Novel Human C2 Domains Protein,簡稱“BioHC2”),編碼此多肽的多核苷酸和經重組技術產生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了將此多肽和多核苷酸用于治療跨膜運輸功能紊亂、信號傳導障礙等多種疾病的方法。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了基于鑒別此核酸序列中的突變和此多肽表達水平改變的診斷測定方法。本發(fā)明還公開了編碼這種新的BioHC2的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/64GK1296954SQ99124028
公開日2001年5月30日 申請日期1999年11月19日 優(yōu)先權日1999年11月19日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海生元基因開發(fā)有限公司