專利名稱：應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞/組織三維培養(yǎng)器及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程中組織醫(yī)學工程技術(shù)中的細胞／組織培養(yǎng)器及其培養(yǎng)方法，特別是涉及一種具有應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器及其培養(yǎng)方法。
細胞培養(yǎng)技術(shù)和裝置的發(fā)展已有百余年歷史，但是，90年代中期以前，醫(yī)學界未能培養(yǎng)出具有與在體組織功能相同或相似的生物細胞／組織來。其主要原因是不可避免的重力作用使得細胞(或微載體)沉降于培養(yǎng)器底部，這樣細胞在培養(yǎng)器器壁之間的接觸抑制使得所培養(yǎng)的細胞不能真正三維生長，從而限制了細胞功能分化，長不成所需要的組織。另外一般生物化學工程中使用的生物反應器，如借助于機械攪拌(包括實驗室用的搖瓶、搖床等)或吹入氣體引起強迫對流等方法避免培養(yǎng)物沉降，并改善x營養(yǎng)供應。這種方法在微生物培養(yǎng)(如抗生素生產(chǎn))中是成功的，但對于哺乳動物細胞培養(yǎng)來說是不適宜的。因為(1)哺乳動物細胞培養(yǎng)比微生物‘嬌嫩’得多，機械攪拌造成的流動剪切和直接作用很容易損傷乃至破壞細胞，造成壞死。
(2)機械攪拌造成的流動剪切使得細胞難以(甚至不能)聚集，而細胞聚集是從細胞培養(yǎng)成組織的第一步。
空間微重力環(huán)境為細胞三維生長創(chuàng)造了條件，美國宇航局(NASA)從80年代中期著手發(fā)展空間生物反應器，90年代初期發(fā)展了旋轉(zhuǎn)式生物反應器(RWV)。在文獻[1]Culturing aFuture，F(xiàn)all，1998，Microgravity News中有介紹；應用旋轉(zhuǎn)式生物反應器在低剪應力條件下實現(xiàn)了細胞三維培養(yǎng)，并在1995、1997年兩次航天飛機搭載實驗中成功地培養(yǎng)出結(jié)腸癌等組織。經(jīng)組織切片觀察表明它具有和在體組織相似的結(jié)構(gòu)，而且其尺寸比用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的組織大的多，達厘米量級。但是，該裝置是在兩個同步旋轉(zhuǎn)的同心圓筒之間進行細胞培養(yǎng)，可以利用流體動力學效應，使細胞或微載體懸浮，進行三維培養(yǎng)，而且流動剪應力趨于零。
但從生物力學的觀點來看，過分強調(diào)零剪應力對于培養(yǎng)功能高度分化的組織來說違背了生物力學的應力-生長適應性原理，因為(1)生物體內(nèi)的器官和組織都是在一定力學環(huán)境里發(fā)揮其功能的，正常生物條件下，活體器官、組織內(nèi)的應力(應變)分布應符合該組織、器官功能，而合理的應力分布是誘導細胞分化，長成具有和在體組織相同(或相似)功能的組織的重要條件。
(2)國外和我們關(guān)于流體動力對血管內(nèi)皮細胞生長的影響的研究均表明，在培養(yǎng)細胞的過程中應力是調(diào)控細胞結(jié)構(gòu)和功能(基因表達)的一個重要的因素。在細胞離體培養(yǎng)過程中，力學環(huán)境不僅影響細胞的聚集、粘附(細胞-細胞，細胞-基質(zhì)表面等)，還影響其微結(jié)構(gòu)和基因表達，進而影響細胞間通訊和功能分化。合理的力學環(huán)境將誘導、維持、促進并優(yōu)化細胞的分化，形成一定的結(jié)構(gòu)，長成具有特定功能的組織。
(3)實驗表明(i)細胞生長過程中必然在周圍介質(zhì)里造成應力(即細胞生長本身將改變自身的力學微環(huán)境)。(ii)細胞生長引起的應力導致周圍生物大分子排列有序化，可見應力是細胞間通訊的重要內(nèi)容，也是細胞功能分化、進行組織構(gòu)建的一個重要的信號系統(tǒng)。
另外，以1997年進行的軟骨培養(yǎng)實驗為例，如表1所示，盡管地面上用RWV培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨GAG的含量及集合強度與天然軟骨無統(tǒng)計差異，但細胞含量及動力學剛度與天然軟骨有顯著差異。前者和軟骨組織的活性密切相關(guān)，而后者則是關(guān)節(jié)軟骨的功能的重要表征。關(guān)節(jié)軟骨是承受動力學載荷的組織，故從生物力學觀點來看，造成RWV系統(tǒng)培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨和天然軟骨這種重大差異的主要原因在于RWV系統(tǒng)中的應力不能滿足誘導并節(jié)軟骨功能分化的需要。
表1 RWV系統(tǒng)在地基和空間培養(yǎng)的軟骨組織的若干性能參數(shù)與天然軟骨的比較
*表示達到同一水平供一種既可滿足細胞三維生長條件，又可隨著培養(yǎng)過程中細胞生長，聚集、功能分化的需要來調(diào)控培養(yǎng)介質(zhì)應力水平(從零剪應力到所培養(yǎng)細胞／組織的生理應力)以創(chuàng)造一個合理的力學環(huán)境，來誘導細胞功能定向分化的，生長成一定結(jié)構(gòu)的、具有特定功能的細胞／組織的可對應力分布進行有效調(diào)控的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器，包括由氣室、細胞培養(yǎng)室、培養(yǎng)液流動室三層同心圓筒套裝構(gòu)成的培養(yǎng)器主體、底座上固定的支架、由馬達和變速器組成的傳動機構(gòu)，供液-排液及供氣-排氣系統(tǒng)，其特征在于筒壁上設有簍孔的內(nèi)筒外表面上貼敷有液／液交換膜，其內(nèi)腔為培養(yǎng)液流動室，筒壁上設有簍孔的中筒外表面上貼敷有氣／液交換膜，其內(nèi)腔為細胞培養(yǎng)室，外室筒壁上設有進氣孔和出氣孔，其內(nèi)腔為氣室，作為氣室的外筒固定在支架上，不作軸向旋轉(zhuǎn)，而作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒和作為細胞培養(yǎng)室的中筒分別由各自的由馬達和變速器組成的傳動機構(gòu)驅(qū)動作軸向旋轉(zhuǎn)，其軸向旋轉(zhuǎn)的角速度相同或不同，作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒中同心地設置一根端部超出培養(yǎng)液流動室筒壁上設置的液／液交換膜軸向邊緣的細長培養(yǎng)液流動管，其進口端的內(nèi)筒上安裝一與支架固定的隔離器，隔離器為一空心圓柱體，其內(nèi)部徑向設置與其中心線垂直的培養(yǎng)液進口和代謝物出口，培養(yǎng)液進口和代謝物出口中分別安裝進液管和代謝物出液管，進液管與內(nèi)筒中設置的培養(yǎng)液流動管相連通，代謝物出液管與內(nèi)筒中培養(yǎng)液流動管管外的空腔，即代謝物環(huán)形回流通道相連通，隔離器中培養(yǎng)液進口和代謝物出口之間設置將其密封隔開的密封圈；供氣-排氣系統(tǒng)包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與外筒上的進氣口相連通；供液-排液系統(tǒng)包括培養(yǎng)液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器上的培養(yǎng)液進液管相連通。所述的氣源與氣室相連的輸氣管道上設有穩(wěn)壓、調(diào)壓閥，氣室的出氣口通過輸氣管道連接余氣收集器；隔離器上的代謝物出液管通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養(yǎng)液透析器，培養(yǎng)液透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通培養(yǎng)液儲液器，儲液器出口通過輸液管道與隔離器上的進液管相連通。
使用上述應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器進行細胞／組織三維培養(yǎng)的方法，按常規(guī)培養(yǎng)工藝將培養(yǎng)物、新鮮培養(yǎng)液裝入本發(fā)明的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器內(nèi)，培養(yǎng)條件與常規(guī)工藝的培養(yǎng)條件相同，其特征在于培養(yǎng)器內(nèi)應力可調(diào)控，即在細胞培養(yǎng)之初，作為細胞培養(yǎng)室的中筒及作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒軸向同步旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速決定于不同培養(yǎng)物的尺度在培養(yǎng)介質(zhì)中的懸浮，大于或等于培養(yǎng)物懸浮的最小角速度，一般轉(zhuǎn)速為5-40轉(zhuǎn)／分，此時，細胞培養(yǎng)室內(nèi)剪應力分布趨于零，隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，內(nèi)筒和中筒的軸向旋轉(zhuǎn)由同步旋轉(zhuǎn)變?yōu)椴顒有D(zhuǎn)，并且可調(diào)控，其差動范圍為 此時，細胞培養(yǎng)室內(nèi)的剪應力由趨于零到所培養(yǎng)細胞／組織的生理應力，在培養(yǎng)過程中，其供氣-排氣系統(tǒng)的氣源對氣室的供氣流量為0．4-10ml／min，供液-排液系統(tǒng)對細胞培養(yǎng)室的供液流量為0．1-10ml／min。
所述的細胞培養(yǎng)室內(nèi)剪應力可調(diào)控通過供液-排液系統(tǒng)中的阻尼器調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力和／或直接調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力改變培養(yǎng)液流動室內(nèi)的壓力分布，來改變細胞培養(yǎng)室內(nèi)的二次流。
所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力可調(diào)控通過供氣-排氣系統(tǒng)中的穩(wěn)壓、調(diào)壓閥改變氣室內(nèi)壓力，以調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)的壓力。
所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力可調(diào)控在培養(yǎng)液中加入調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)粘度，改變剪應力的無毒、有利細胞生長的粘度與培養(yǎng)液不同的添加物，所加入的添加物包括高分子右旋糖酐dextran2000T。
本發(fā)明原理根據(jù)流體力學原理若兩個同軸圓筒以等角速度旋轉(zhuǎn)，經(jīng)過一定的時間，充滿于其間的粘性流體就會象固體一樣以和圓筒相同的角速度旋轉(zhuǎn)，各層流體之間沒有相對運動，因而整個流場中流動剪應力為零，這就不會損傷細胞，而且有利于細胞聚集。而且在一定的角速度下，細胞、微載體細胞聚集體等可以借助于流體動力的作用，克服重力沉降而懸浮于培養(yǎng)液中，避免了與容器壁接觸而導致接觸抑止，從而確保細胞能真正三維生長。
本發(fā)明提供的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器和培養(yǎng)方法，按常規(guī)培養(yǎng)工藝將培養(yǎng)物、新鮮培養(yǎng)液裝入本發(fā)明的培養(yǎng)器內(nèi)，培養(yǎng)條件和常規(guī)培養(yǎng)條件相同，其區(qū)別在于培養(yǎng)器內(nèi)剪應力可調(diào)控。在細胞培養(yǎng)之初，內(nèi)筒和中筒同步旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速決定于不同培養(yǎng)物(細胞、微載體、細胞-材料構(gòu)架種植體)的尺度在培養(yǎng)介質(zhì)中的懸浮(不沉降條件)，如

圖1所示。此時，介質(zhì)內(nèi)剪應力水平趨于零，有利于細胞聚集、粘附；而隨著細胞聚集體的形成，再把內(nèi)筒和中筒的旋轉(zhuǎn)變?yōu)椴顒有D(zhuǎn)，來調(diào)控細胞培養(yǎng)室內(nèi)的剪應力分布，以誘導細胞功能的定向分化。剪應力水平的控制，因培養(yǎng)目標、生長狀況而異。應力調(diào)控可通過以下途徑實現(xiàn)(1)內(nèi)筒和中筒的旋轉(zhuǎn)差動旋轉(zhuǎn)，在穩(wěn)定性界限內(nèi)，流動剪應力水平的改變可達3～4個量級；(2)調(diào)節(jié)內(nèi)筒轉(zhuǎn)速，和／或通過供液-排液系統(tǒng)中的阻尼器和／或液泵的輸出壓力改變培養(yǎng)液流動室內(nèi)的壓力分布，從而改變細胞培養(yǎng)室內(nèi)的二次流，一達到調(diào)控細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)應力分布的目的；(3)通過供氣排氣系統(tǒng)中穩(wěn)壓、調(diào)壓閥調(diào)控進入氣室的氣流來改變氣室內(nèi)壓力，調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)的壓力水平；(4)通過培養(yǎng)液供液-排液系統(tǒng)，在培養(yǎng)液中加入添加物，調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)的粘度，以改變其剪應力水平，而實現(xiàn)從細胞培養(yǎng)開始時細胞培養(yǎng)室內(nèi)剪應力為零到隨細胞聚集體形成剪應力為所培養(yǎng)的細胞／組織的生理應力，所加入的添加物的添加的量視培養(yǎng)目標來定。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法既可用于細胞懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)，亦可用於細胞一材料構(gòu)架件聚集體等培養(yǎng)。至于培養(yǎng)液的組分則因培養(yǎng)對象而異。PH值、溫度等條件和常規(guī)的細胞培養(yǎng)相同。只是在必要時，可加入添加物調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的粘度和密度，以利于培養(yǎng)物懸浮，并改變介質(zhì)剪應力水平。所述的添加物包括高分子右旋糖酐等。
為維持細胞生長化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，必須保證足夠的氧和營養(yǎng)的供應，并能及時帶走代謝產(chǎn)物。單純靠擴散是不能滿足需要的，而傳統(tǒng)生物反應器的攪拌或氣升法也是不適用的(會損傷細胞或改變其結(jié)構(gòu)、功能)。這是細胞／組織三維培養(yǎng)器的又一關(guān)鍵技術(shù)問題。本發(fā)明的培養(yǎng)器具有合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的范圍內(nèi)，不致?lián)p傷細胞或?qū)е录毎Y(jié)構(gòu)-功能的質(zhì)的改變。
本發(fā)明的培養(yǎng)器借助流體動力避免重力沉降，確保培養(yǎng)物懸浮三維生長。
本發(fā)明的效果1．本發(fā)明提供的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器按照不同的培養(yǎng)對象(細胞、組織等)，在不同的細胞培養(yǎng)階段，有效地調(diào)控細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)的剪應力分布，改善生長環(huán)境以利于細胞生長、運動、聚集、粘附，并誘導其分化，以形成所需要的特定組織。
2．本發(fā)明中培養(yǎng)液流動室、細胞培養(yǎng)室和氣室是三層同心圓筒，內(nèi)筒為培養(yǎng)液流動室，新鮮培養(yǎng)液進入培養(yǎng)液流動室，經(jīng)液／液交換膜進入細胞培養(yǎng)室，代謝物由液／液交換膜流出后，由于離心力的作用，形成二次流。從擴散輸運變?yōu)閷α饕粩U散輸運，營養(yǎng)供應效率提高且趨于均勻，不易形成“死區(qū)”。另一方面，氣室在細胞培養(yǎng)室外側(cè)，氧氣通過氣／液交換膜進入培養(yǎng)場后，可借助細胞培養(yǎng)室流動徑向壓力梯度傳向深部，同樣，細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)的二次流亦有利于氧輸運且趨于均勻。
3．本發(fā)明可通過供液-排液系統(tǒng)和供氣-排氣系統(tǒng)中阻尼器和泵，改變流動參數(shù)，并對氧和培養(yǎng)液輸運進行在線調(diào)節(jié)，從而提高對氧和營養(yǎng)輸運效率，以利于細胞生長、運動、聚集、粘附，并誘導其分化，以形成所需要的組織。
4．該培養(yǎng)器有自動供氣-排氣、供液-排液系統(tǒng)，實現(xiàn)了在線供氣、供液的連續(xù)運行；并通過氣路上的穩(wěn)壓、調(diào)壓閥可調(diào)節(jié)培養(yǎng)液流動室內(nèi)壓力分布，而改變液／液交換膜的交換效率，利用流體動力效應，提高氧和營養(yǎng)物的輸運效率。
5．當其轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)物尺寸符合一定的匹配條件時，該培養(yǎng)器也可在地面重力環(huán)境里使用，利用流體動力克服重力沉降，確保細胞三維生長，實現(xiàn)真正的三維培養(yǎng)。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細說明；附圖1為本發(fā)明的培養(yǎng)器中培養(yǎng)物尺寸d和懸浮培養(yǎng)所需最低轉(zhuǎn)速示意圖附圖2為本發(fā)明的隔離器結(jié)構(gòu)示意圖；附圖3為本發(fā)明的三維培養(yǎng)器結(jié)構(gòu)示意圖；附圖4為內(nèi)筒、中筒和外筒的半徑及轉(zhuǎn)速的示意圖；附圖5為本發(fā)明三維培養(yǎng)器的輸液-排液路徑方塊圖；附圖6為本發(fā)明三維培養(yǎng)器的輸氣-排氣路徑方塊圖；其中細胞培養(yǎng)室1 液／液交換膜2培養(yǎng)液流動室3進液管4 代謝物出液管5隔離器6氣室7 氣／液交換膜8進氣口9出氣口10變速器11、12 馬達13、14支架15 底座16 培養(yǎng)器主體17內(nèi)筒18 中筒19 外筒20培養(yǎng)液流動管21 培養(yǎng)液進口22 代謝物出口23代謝物環(huán)形回流通道24密封圈25 儲液器26液泵27 輸液管道28 阻尼器29透析器30氣／液交換器31 代謝物收集器32
氣源33 穩(wěn)壓、調(diào)壓閥34輸氣管道35、36余氣收集器37內(nèi)筒轉(zhuǎn)速ω1中筒轉(zhuǎn)速ω2內(nèi)筒轉(zhuǎn)速ω3內(nèi)筒直徑R1中筒直徑R2外筒直徑R3實施例1按圖3制作一臺應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器，包括由氣室7、細胞培養(yǎng)室1、培養(yǎng)液流動室3三層同心圓筒套裝構(gòu)成的培養(yǎng)器主體17、底座16上固定的支架15、由馬達和變速器組成的傳動機構(gòu)，供液-排液及供氣-排氣系統(tǒng)，其特征在于筒壁上設有簍孔的內(nèi)筒18外表面貼敷有液／液交換膜2，其內(nèi)腔為培養(yǎng)液流動室3，半徑為R1，由馬達13驅(qū)動的變速器11帶動培養(yǎng)液流動室3的軸轉(zhuǎn)動，培養(yǎng)液流動室3隨軸一起以角速度ω1旋轉(zhuǎn)，通過貼敷在培養(yǎng)液流動室3外表面上的液／液交換膜2與細胞培養(yǎng)室1進行物質(zhì)交換，細胞獲得營養(yǎng)，排出代謝產(chǎn)物；筒壁上設有簍孔的中筒19外表面貼敷有氣／液交換膜8，其內(nèi)腔為細胞培養(yǎng)室1，半徑為R2，由另一套馬達14驅(qū)動的變速器12帶動細胞培養(yǎng)室1的軸轉(zhuǎn)動，細胞培養(yǎng)室1隨軸一起以角速度ω2旋轉(zhuǎn)；外筒20筒壁上設有進氣孔9和出氣孔10，其內(nèi)腔為氣室7，由進氣口9進入的新鮮氣體，在氣室7中通過貼敷在細胞培養(yǎng)室1外表面上的氣／液交換膜8進行氣體交換，為細胞培養(yǎng)室1提供氧氣，交換的二氧化碳氣由出氣口10排出，作為氣室7的外筒20固定在支架15上，不作軸向旋轉(zhuǎn)，而作為培養(yǎng)液流動室3的內(nèi)筒18和作為細胞培養(yǎng)室1的中筒19分別由各自的由馬達13、14和變速器11、12組成的傳動機構(gòu)驅(qū)動作軸向旋轉(zhuǎn)，其軸向旋轉(zhuǎn)的角速度ω1和ω2相同或不同，作為培養(yǎng)液流動室3的內(nèi)筒18中同心地設置一根培養(yǎng)液流動管21，其進口端的內(nèi)筒上安裝一與支架15固定的隔離器6，隔離器6為一空心圓柱體，其內(nèi)部徑向設置與其中心線垂直的培養(yǎng)液進口22和代謝物出口23，培養(yǎng)液進口22和代謝物出口23中分別安裝進液管4和出液管5，進液管4與內(nèi)筒中設置的培養(yǎng)液流動管21的相連通，出液管5與內(nèi)筒內(nèi)腔中的代謝物環(huán)形回流通道24相連通，液泵19將新鮮培養(yǎng)液從固定在隔離機構(gòu)6培養(yǎng)液進口管4泵入，隔離器6中培養(yǎng)液進口22和代謝物出口23之間及代謝物出口2的另一側(cè)分別設置將其密封隔開的密封圈25，供氣-排氣系統(tǒng)包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道上裝有調(diào)壓、穩(wěn)壓閥并與外筒20上的進氣口9相連通，進氣口9入口處設有進氣濾膜，外筒20上的出氣口10通過輸氣管道連通余氣收集器。供液-排液系統(tǒng)包括培養(yǎng)液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器6上的培養(yǎng)液進液管4相連通，隔離器6上的代謝物出液管5通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養(yǎng)液透析器，培養(yǎng)液透析器出口分別連通代謝物收集器及氣／液交換器，氣／液交換器連通培養(yǎng)液儲液器，培養(yǎng)液儲液器出口通過輸液管道及隔離器6上的進液管4與位于內(nèi)筒18中的培養(yǎng)液流動管21相連通。
平行的兩支架15支撐培養(yǎng)器主體17，一個馬達14固定其上；16為底座，另一個馬達固連其上；培養(yǎng)液供液-排液系統(tǒng)的路徑，如圖5所示，在圖中26為鮮培養(yǎng)液儲液器，27為流量、壓力可調(diào)的液泵，28為培養(yǎng)液輸液管道，它與培養(yǎng)液進口管4相連，進入培養(yǎng)液流動室3經(jīng)代謝物出口管5流出，29為阻尼器，可采用可調(diào)節(jié)軟管松緊的夾持在輸氣管道的氣管夾子，其作用是調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室1內(nèi)的氣體壓力分布，30是培養(yǎng)液透析器，31是氣／液交換器，培養(yǎng)器主體用聚碳酸脂材料制作，交換膜用市售的半透膜，以上所用的其他部件均是普通市售的，32是代謝物收集器，供液-排液系統(tǒng)中液泵27將新鮮培養(yǎng)液從儲液器26通過輸液管道28經(jīng)進液管4輸入培養(yǎng)液流動室3，通過貼敷在培養(yǎng)液流動室3筒壁上的液／液交換膜2，為細胞培養(yǎng)室1提供養(yǎng)份，代謝物經(jīng)出口管5流出，流出培養(yǎng)器的液體中，由于含有新鮮培養(yǎng)液，為節(jié)約原料，降低成本，將流出的液體通過阻尼器29送入培養(yǎng)液透析器30進行透析，透析后，將分離出來的代謝產(chǎn)物流入代謝產(chǎn)物收集器32，經(jīng)透析的培養(yǎng)液流經(jīng)氣／液交換器31，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的氧含量和PH值，并添加營養(yǎng)和生長因子后流回培養(yǎng)液存儲器26，以供循環(huán)使用。
供氣-排氣系統(tǒng)的路徑，如圖6所示，在圖中33為氣源，為一儲有氧氣的氣瓶，34為穩(wěn)壓、調(diào)壓閥，市售的氣體穩(wěn)壓、調(diào)壓閥，35為輸氣管道，36為輸氣管道，均為普通氣管，37為余氣收集器；氣源33中的新鮮氣體經(jīng)穩(wěn)壓、調(diào)壓閥34調(diào)壓后，由輸氣管道35經(jīng)進氣口9進入氣室7，在氣室7經(jīng)氣／液交換膜8進行氣體交換，為細胞培養(yǎng)室1提供氧氣，交換后的二氧化碳氣體由氣室7的出氣口10和輸氣管道36流至余氣收集器37。
實施例2使用實施例1的培養(yǎng)器進行人胃癌細胞懸浮培養(yǎng)，微載體可用一般材料，溫度、PH值條件和常規(guī)的細胞培養(yǎng)相同。只是在必要時加入高分子dextran 2000T右旋糖酐添加物來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的粘度和密度，以利于培養(yǎng)物懸浮，并改變介質(zhì)剪應力水平。其次，為維持細胞生長化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，必須保證足夠的氧和營養(yǎng)的供應，并能及時帶走代謝產(chǎn)物。本實施例中的供氣供液系統(tǒng)對氣室供氣的供氣流量為0．4ml／min，供液-排液系統(tǒng)對細胞培養(yǎng)室供液的供液流量為0．1ml／min，在培養(yǎng)的初期，其培養(yǎng)器同步旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)／分。通過本發(fā)明的培養(yǎng)器合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的范圍內(nèi)，不致?lián)p傷細胞或?qū)е录毎Y(jié)構(gòu)，功能的質(zhì)的改變。
本實施例的培養(yǎng)條件與常規(guī)工藝的培養(yǎng)條件相同，特點是培養(yǎng)器內(nèi)應力可調(diào)控，即在細胞培養(yǎng)之初，作為細胞培養(yǎng)室的中筒及作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒軸向同步旋轉(zhuǎn)，此時，細胞培養(yǎng)室內(nèi)應力分布趨于零，隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，調(diào)控細胞培養(yǎng)室內(nèi)的剪應力由趨于零到所培養(yǎng)胃癌細胞的生理應力0．5dym／cm2。
本實施例細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控是這樣實現(xiàn)的在細胞培養(yǎng)之初，內(nèi)筒和中筒同步旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速ω1=ω2=5轉(zhuǎn)／分種，其轉(zhuǎn)速決定于不同培養(yǎng)物的尺度在培養(yǎng)介質(zhì)中的懸浮，即為胃癌細胞懸浮的最小角速度；隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，內(nèi)筒和中筒的軸向旋轉(zhuǎn)由同步變?yōu)椴顒有D(zhuǎn)，ω1≠ω2，并且可調(diào)控，ω2／ω1=0．9。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控液液可這樣實現(xiàn)通過供液-排液系統(tǒng)中阻尼器調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力和／或直接調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力改變培養(yǎng)液流動室內(nèi)的壓力5MPa，來改變細胞培養(yǎng)室內(nèi)的二次流。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控還可以這樣實現(xiàn)通過供氣-排氣系統(tǒng)改變氣室內(nèi)壓力，來調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)的壓力0．1MPa。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控又可以這樣實現(xiàn)通過在培養(yǎng)液中加入調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)粘度，改變剪應力的添加物，添加物為高分子右旋糖酐dextran2000T。
實施例3使用實施例1的培養(yǎng)器進行人軟骨細胞懸浮培養(yǎng)，微載體可用一般材料，溫度、PH值條件和常規(guī)的細胞培養(yǎng)相同。只是在必要時加入高分子dextran 2000T右旋糖酐添加物來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的粘度和密度，以利于培養(yǎng)物懸浮，并改變介質(zhì)剪應力水平。其次，為維持細胞生長化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，必須保證足夠的氧和營養(yǎng)的供應，并能及時帶走代謝產(chǎn)物。本實施例中的供氣供液系統(tǒng)對氣室供氣的供氣流量為6ml／min，供液-排液系統(tǒng)對細胞培養(yǎng)室供液的供液流量為6ml／min，在培養(yǎng)的初期，其培養(yǎng)器同步旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為20轉(zhuǎn)／分。通過本發(fā)明的培養(yǎng)器合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的范圍內(nèi)，不致?lián)p傷細胞或?qū)е录毎Y(jié)構(gòu)，功能的質(zhì)的改變。
本實施例的培養(yǎng)條件與常規(guī)工藝的培養(yǎng)條件相同，特點是培養(yǎng)器內(nèi)應力可調(diào)控，即在細胞培養(yǎng)之初，作為細胞培養(yǎng)室的中筒及作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒軸向同步旋轉(zhuǎn)，此時，細胞培養(yǎng)室內(nèi)應力分布趨于零，隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，調(diào)控細胞培養(yǎng)室內(nèi)的剪應力由趨于零到所培養(yǎng)軟骨細胞的生理應力3dym／cm2。
本實施例細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控是這樣實現(xiàn)的在細胞培養(yǎng)之初，內(nèi)筒和中筒同步旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速ω1=ω2=20轉(zhuǎn)／分種，其轉(zhuǎn)速決定于不同培養(yǎng)物的尺度在培養(yǎng)介質(zhì)中的懸浮，即為胃癌細胞懸浮的最小角速度；隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，內(nèi)筒和中筒的軸向旋轉(zhuǎn)由同步變?yōu)椴顒有D(zhuǎn)，ω1≠ω2，并且可調(diào)控，ω2／ω1=0．3。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控液液可這樣實現(xiàn)通過供液-排液系統(tǒng)中阻尼器調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力和／或直接調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力改變培養(yǎng)液流動室內(nèi)的壓力4MPa，來改變細胞培養(yǎng)室內(nèi)的二次流。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控還可以這樣實現(xiàn)通過供氣-排氣系統(tǒng)改變氣室內(nèi)壓力，來調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)的壓力00．8MPa。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控又可以這樣實現(xiàn)通過在培養(yǎng)液中加入調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)粘度，改變剪應力的添加物，添加物為高分子右旋糖酐dextran2000T。
實施例4使用實施例1的培養(yǎng)器進行人成纖細胞懸浮培養(yǎng)，微載體可用一般材料，溫度、PH值條件和常規(guī)的細胞培養(yǎng)相同。只是在必要時加入高分子dextran 2000T右旋糖酐添加物來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的粘度和密度，以利于培養(yǎng)物懸浮，并改變介質(zhì)剪應力水平。其次，為維持細胞生長化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，必須保證足夠的氧和營養(yǎng)的供應，并能及時帶走代謝產(chǎn)物。本實施例中的供氣供液系統(tǒng)對氣室供氣的供氣流量為10ml／min，供液-排液系統(tǒng)對細胞培養(yǎng)室供液的供液流量為10ml／min，在培養(yǎng)的初期，其培養(yǎng)器同步旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為40轉(zhuǎn)／分。通過本發(fā)明的培養(yǎng)器合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的范圍內(nèi)，不致?lián)p傷細胞或?qū)е录毎Y(jié)構(gòu)，功能的質(zhì)的改變。
本實施例的培養(yǎng)條件與常規(guī)工藝的培養(yǎng)條件相同，特點是培養(yǎng)器內(nèi)應力可調(diào)控，即在細胞培養(yǎng)之初，作為細胞培養(yǎng)室的中筒及作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒軸向同步旋轉(zhuǎn)，此時，細胞培養(yǎng)室內(nèi)應力分布趨于零，隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，調(diào)控細胞培養(yǎng)室內(nèi)的剪應力由趨于零到所培養(yǎng)胃癌細胞的生理應力ldym／cm2。
本實施例細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控是這樣實現(xiàn)的在細胞培養(yǎng)之初，內(nèi)筒和中筒同步旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速ω1=ω2=40轉(zhuǎn)／分種，其轉(zhuǎn)速決定于不同培養(yǎng)物的尺度在培養(yǎng)介質(zhì)中的懸浮，即為胃癌細胞懸浮的最小角速度；隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，內(nèi)筒和中筒的軸向旋轉(zhuǎn)由同步變?yōu)椴顒有D(zhuǎn)，ω1≠ω2，并且可調(diào)控，ω2／ω1=0．7。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控液液可這樣實現(xiàn)通過供液-排液系統(tǒng)中阻尼器調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力和／或直接調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力改變培養(yǎng)液流動室內(nèi)的壓力6MPa，來改變細胞培養(yǎng)室內(nèi)的二次流。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控還可以這樣實現(xiàn)通過供氣-排氣系統(tǒng)改變氣室內(nèi)壓力，來調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)的壓力0．12MPa。
本實施例所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力的調(diào)控又可以這樣實現(xiàn)通過在培養(yǎng)液中加入調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)粘度，改變剪應力的添加物，添加物為高分子右旋糖酐dextran2000T。
權(quán)利要求
1．一種應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器，包括由氣室、細胞培養(yǎng)室、培養(yǎng)液流動室三層同心圓筒套裝構(gòu)成的培養(yǎng)器主體、底座上固定的支架、由馬達和變速器組成的傳動機構(gòu)，供液-排液及供氣-排氣系統(tǒng)，其特征在于筒壁上設有簍孔的內(nèi)筒外表面上貼敷有液／液交換膜，其內(nèi)腔為培養(yǎng)液流動室，筒壁上設有簍孔的中筒外表面上貼敷有氣／液交換膜，其內(nèi)腔為細胞培養(yǎng)室，外室筒壁上設有進氣孔和出氣孔，其內(nèi)腔為氣室，作為氣室的外筒固定在支架上，不作軸向旋轉(zhuǎn)，而作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒和作為細胞培養(yǎng)室的中筒分別由各自的由馬達和變速器組成的傳動機構(gòu)驅(qū)動作軸向旋轉(zhuǎn)，其軸向旋轉(zhuǎn)的角速度相同或不同，作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒中同心地設置一根端部超出培養(yǎng)液流動室筒壁上設置的液／液交換膜軸向邊緣的細長培養(yǎng)液流動管，其進口端的內(nèi)筒上安裝一與支架固定的隔離器，隔離器為一空心圓柱體，其內(nèi)部徑向設置與其中心線垂直的培養(yǎng)液進口和代謝物出口，培養(yǎng)液進口和代謝物出口中分別安裝進液管和代謝物出液管，進液管與內(nèi)筒中設置的培養(yǎng)液流動管相連通，代謝物出液管與內(nèi)筒中培養(yǎng)液流動管管外的空腔，即代謝物環(huán)形回流通道相連通，隔離器中培養(yǎng)液進口和代謝物出口之間設置將其密封隔開的密封圈；供氣-排氣系統(tǒng)包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與外筒上的進氣口相連通；供液-排液系統(tǒng)包括培養(yǎng)液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器上的培養(yǎng)液進液管相連通。
2．按權(quán)利要求1所述的所述的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器，其特征在于氣源與氣室相連的輸氣管道上設有穩(wěn)壓、調(diào)壓閥，氣室的出氣口通過輸氣管道連接余氣收集器。
3．按權(quán)利要求1所述的所述的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器，其特征在于隔離器上的代謝物出液管通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養(yǎng)液透析器，培養(yǎng)液透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通培養(yǎng)液儲液器，儲液器出口通過輸液管道與隔離器上的進液管相連通。
4．使用權(quán)利要求1所述應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器進行細胞／組織三維培養(yǎng)的方法，按常規(guī)培養(yǎng)工藝將培養(yǎng)物、新鮮培養(yǎng)液裝入本發(fā)明的應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器內(nèi)，培養(yǎng)條件與常規(guī)工藝的培養(yǎng)條件相同，其特征在于培養(yǎng)器內(nèi)應力可調(diào)控，即在細胞培養(yǎng)之初，作為細胞培養(yǎng)室的中筒及作為培養(yǎng)液流動室的內(nèi)筒軸向同步旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速決定于不同培養(yǎng)物的尺度在培養(yǎng)介質(zhì)中的懸浮，大于或等于培養(yǎng)物懸浮的最小角速度，一般轉(zhuǎn)速為5-40轉(zhuǎn)／分，此時，細胞培養(yǎng)室內(nèi)剪應力分布趨于零，隨著細胞培養(yǎng)過程細胞聚集體的形成，內(nèi)筒和中筒的軸向旋轉(zhuǎn)由同步旋轉(zhuǎn)變?yōu)椴顒有D(zhuǎn)，并且可調(diào)控，其差動范圍為 此時細胞培養(yǎng)室內(nèi)的剪應力由趨于零到所培養(yǎng)細胞／組織的生理應力，在培養(yǎng)過程中，其供氣-排氣系統(tǒng)的氣源對氣室的供氣流量為0．4-10ml／min，供液-排液系統(tǒng)對細胞培養(yǎng)室的供液流量為0．1-10ml／min。
5．按權(quán)利要求4所述應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器進行細胞／組織三維培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的細胞培養(yǎng)室內(nèi)剪應力可調(diào)控通過供液-排液系統(tǒng)中的阻尼器調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力和／或直接調(diào)節(jié)液泵的輸出壓力改變培養(yǎng)液流動室內(nèi)的壓力分布，來改變細胞培養(yǎng)室內(nèi)的二次流。
6．按權(quán)利要求4所述應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器進行細胞／組織三維培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力可調(diào)控通過供氣-排氣系統(tǒng)中的穩(wěn)壓、調(diào)壓閥改變氣室內(nèi)壓力，以調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)的壓力。
7．按權(quán)利要求4所述應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞／組織三維培養(yǎng)器進行細胞／組織三維培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的細胞培養(yǎng)器內(nèi)剪應力可調(diào)控在培養(yǎng)液中加入調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)室內(nèi)介質(zhì)粘度，改變剪應力的無毒、有利細胞生長的粘度與培養(yǎng)液不同的添加物，所加入的添加物包括高分子右旋糖酐dextran2000T。
全文摘要
本應力可調(diào)控旋轉(zhuǎn)式細胞/組織三維培養(yǎng)器及培養(yǎng)方法,由三層同心圓筒套裝的內(nèi)、中、外筒即培養(yǎng)液流動室、細胞培養(yǎng)室、氣室,內(nèi)、中筒筒壁上分別有液/液交換膜和氣/液交換膜,并分別作軸向旋轉(zhuǎn),角速度相同或不同,與液泵相連的輸液管道與內(nèi)筒內(nèi)的流動管進口相通,與氣泵相連的輸氣管道與氣室進氣口相通;其培養(yǎng)方法:將培養(yǎng)物、培養(yǎng)液裝入培養(yǎng)器內(nèi),培養(yǎng)器內(nèi)剪應力隨著細胞聚集體的形成,從零調(diào)控至培養(yǎng)細胞/組織的生理應力。
文檔編號C12M3/00GK1290742SQ9912388
公開日2001年4月11日 申請日期1999年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月16日
發(fā)明者陶祖萊, 姚永龍, 張奕毅, 高宇欣 申請人:中國科學院力學研究所