專利名稱：整合素調(diào)節(jié)/信號(hào)傳遞的細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及整合素信號(hào)傳遞途徑所包括的蛋白質(zhì)。更確切地，本發(fā)明涉及一個(gè)蛋白家族，在本發(fā)明中稱為整合素調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)，可調(diào)節(jié)整合素的活性，本發(fā)明涉及這一蛋白家族中稱為IRP-1和IRP-2的兩個(gè)成員。
背景技術(shù)：
整合素分子是異二聚體表面分子，包括以非共價(jià)鍵形式結(jié)合的α和β亞單位。整合素均為跨膜蛋白，其細(xì)胞外的區(qū)域具有與反受體結(jié)合活性。整合素還有相對(duì)短的胞漿區(qū)，參與跨膜信號(hào)傳遞過程。整合素能與其他結(jié)合到細(xì)胞上的反受體和細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用，也能與可溶性因子相互作用。細(xì)胞外配體的結(jié)合導(dǎo)致整合素發(fā)生交聯(lián)和在局部形成簇[Miyamoto，等《科學(xué)》1995；267833]以及形成局部粘附，其中整合素胞漿區(qū)形成簇狀物與細(xì)胞骨架成分，包括，例如肌動(dòng)蛋白纖維相連。[Pavalko and Otey，《社會(huì)及實(shí)驗(yàn)生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》205卷，32767頁(yè)(1994)和Gumbiner《神經(jīng)元》，11卷，551頁(yè)(1993)]。大多有關(guān)整合素生理活性的研究都集中在鑒定特定的細(xì)胞外反受體上，而對(duì)整合素與胞漿成分的特定相互作用知之甚少。然而，突變研究已經(jīng)提示，胞漿成分的序列對(duì)于整合素與局部接觸物相連是必須的[LaFlamme，等《細(xì)胞生物學(xué)雜志》117卷，437頁(yè)(1992)]。
大量的整合素已被鑒定，其中一些亞型是白細(xì)胞特有的，每一個(gè)亞型成員都具有特定的細(xì)胞特異性表達(dá)和反受體結(jié)合特點(diǎn)。至于白細(xì)胞特異性整合素，已知至少有三種β2整合素，每種包含一個(gè)特有的α亞單位和一個(gè)β2亞單位(命名為CD18)相連[Kishimoto等，《細(xì)胞》48卷681-690頁(yè)，(1987)]。有關(guān)β2整合素有一篇詳盡的綜述，參見Springer，《細(xì)胞》76卷301-314(1994)。CD11a/CD18，也被稱為αLβ2或LFA-1，在所有白細(xì)胞均有表達(dá)，并且能與ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3結(jié)合。CD11b/CD18，也被稱為αMβ2或Mac-1，表達(dá)于多形核中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，并且顯示能與ICAM-1，補(bǔ)體因子iC3b，X因子和纖維蛋白原結(jié)合。CD11c/CD18，也被稱為αXβ2或p150/95，表達(dá)于單核細(xì)胞，多形核中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，并且顯示能與補(bǔ)體因子iC3b和纖維蛋白原結(jié)合。另外，第四種人β2整合素，稱為αdβ2，最近已被鑒定[Van der Vieren等，《免疫》第3卷，第683-690頁(yè)(1995)]。
與α4亞單位相關(guān)的β7整合素亞單位主要表達(dá)于白細(xì)胞。這種細(xì)胞表面的異二聚體識(shí)別一種稱為粘膜選址素細(xì)胞粘附分子(MadCAM)的腸歸巢反受體，在淋巴細(xì)胞與腸道組織結(jié)合過程中似乎發(fā)揮核心作用[參見Berlin等，《細(xì)胞》74卷185-195頁(yè)(1993)]。α4β7也顯示可與VCAM結(jié)合[參見Chan等，《生物與化學(xué)雜志》弟267卷，8366-8370頁(yè)，(1992)]。α4β7除以往所認(rèn)為的只與選擇素表面分子作用外，還以相似的方式參與在流體狀態(tài)下淋巴細(xì)胞貼附于炎性靜脈內(nèi)皮的過程，這種貼附為選擇素非依賴性的[Berlin等，《細(xì)胞》第80卷413-422頁(yè)(1995)]。應(yīng)用針對(duì)α4亞單位的免疫特異性抗體進(jìn)行的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提示，α4β7，或α4與β1整合素亞單位相連，可能在多種疾病狀態(tài)下發(fā)揮作用，這些疾病包括，例如，實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎[Yednock等《自然》，356卷，63-66頁(yè)(1992)；Baron等，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》第177卷，57-68頁(yè)(1993)]；接觸過敏癥[Ferguson和Kupper，《免疫學(xué)雜志》第150卷，1172-1182頁(yè)，(1993)；Chisholm等《歐洲免疫學(xué)雜志》第23卷，682-688頁(yè)(1993)]和非肥胖性糖尿病[Yang等，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展》第90卷，10494-10498(1993)；Burkly等《糖尿病》第43卷，529-534頁(yè)(1994)；Baron等，《臨床研究雜志》93卷，1700-1708頁(yè)(1994)]。
整合素是參與白細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白類型之一。白細(xì)胞在淋巴樣器官和其它組織之間進(jìn)行不斷地再循環(huán)，它們穿過血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞層從淋巴液或血液中到達(dá)其下方的組織。炎癥及自身免疫性疾病的一個(gè)特點(diǎn)即白細(xì)胞流入炎性病灶。這些部位的炎癥可以用整合素的免疫特異性單克隆抗體阻斷或抑制白細(xì)胞功能來解決。有關(guān)綜述，參見Lobb和Hemler，《臨床研究雜志》，94卷，1722-1728(1994)。調(diào)節(jié)整合素的功能是一種可能控制炎癥的方法，但對(duì)參與整合素調(diào)節(jié)和信號(hào)傳遞過程的特異性胞漿成分知之甚少。
Liu和Pohajdak，《生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)》第1132卷75-58頁(yè)(1992)報(bào)道了一個(gè)人cDNA克隆，命名為B2-1，其編碼一種與酵母SEC7蛋白、烏賊驅(qū)動(dòng)蛋白、血小板-白細(xì)胞C激酶底物蛋白和發(fā)動(dòng)蛋白有區(qū)域同源性的蛋白。該文章提出，因?yàn)锽2-1只有一小部分與酵母SEC7蛋白同源，尚無確鑿證據(jù)證明它就是這種酵母蛋白的人同源物，也未說明SEC7基序以外的不同。該文章提出，B2-1可能參與了裂解靶細(xì)胞過程中NK細(xì)胞內(nèi)高爾基/分泌顆粒的再定向。Schiller和Kolanus[參見，“人Sec7 PH區(qū)域?qū)Ζ?整合素介導(dǎo)的與ICAM-1結(jié)合的優(yōu)勢(shì)負(fù)性作用”，第三屆德國(guó)免疫協(xié)會(huì)粘附會(huì)議，Regensburg，德國(guó)，1995年3月14-15日]描述了一種具有相似基序且能與β2整合素胞漿內(nèi)區(qū)域相互作用的蛋白質(zhì)，并且報(bào)道這種蛋白PH域的過度表達(dá)導(dǎo)致對(duì)Jurkat細(xì)胞中β2整合素的激活依賴性親合力產(chǎn)生較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)負(fù)性作用。然而，Schiller和Kolanus并未發(fā)現(xiàn)(i)優(yōu)先與整合素相互作用和/或調(diào)節(jié)其活性的整合素調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)的存在，(ii)整合素調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)當(dāng)與整合素編碼DNA共轉(zhuǎn)染至COS細(xì)胞時(shí)，調(diào)節(jié)共轉(zhuǎn)染的整合素從頭表達(dá)，或(iii)在流體狀態(tài)下能調(diào)節(jié)JY細(xì)胞貼附和滾動(dòng)的IRPs。
因此在本領(lǐng)域中有必要鑒定能結(jié)合和/或調(diào)節(jié)整合素結(jié)合和/或信號(hào)傳遞活性的分子，并探索鑒定這些分子的方法。這些方法以及由此鑒定的分子將提供實(shí)用的方法，用于整合素介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的治療。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的人整合素調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)，這些蛋白是β2和/或β7整合素調(diào)節(jié)和/或信號(hào)傳遞途徑中的胞漿成分。
一方面，本發(fā)明提供了編碼IRP-1和IRP-2的純化和分離的多核苷酸(如，脫氧核糖核酸和核糖核酸，其編碼鏈和非編碼鏈)。本發(fā)明所考慮的多核苷酸包括基因組DNAs，RNAs和互補(bǔ)DNAs以及全部或部分化學(xué)合成的DNAs。本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸包括SEQ ID NO1中列出的IRP-1DNA序列；SEQ ID NO2中列出的IRP-2 DNA序列；和嚴(yán)緊條件下可與其非編碼鏈雜交的DNA序列或與遺傳密碼的非豐余部分雜交的DNA序列。嚴(yán)緊雜交條件舉例如下在5X SSPE，45％甲酰胺中42℃進(jìn)行雜交，65℃，用0.2XSSC或50℃用1XSSC漂洗。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，根據(jù)雜交的序列中GC核苷酸堿基含量及序列長(zhǎng)度不同，這些條件需要有所變化。本領(lǐng)域中用一標(biāo)準(zhǔn)公式來決定精確的雜交條件。參見Sambrook等，9.47-9.51，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)。
本發(fā)明提供的DNA序列信息使鑒定分離編碼相關(guān)分子的DNAs成為可能，DNA的獲得采用眾所周知的技術(shù)，比如DNA/DNA雜交技術(shù)已如前述，以及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆。另舉一例，了解編碼IRP的cDNA序列，就可能用DNA/DNA雜交的方法分離出編碼IRP的基因組DNA序列和表達(dá)調(diào)控序列比如，啟動(dòng)子、操縱子及其它元件。用本發(fā)明中的DNA序列在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行DNA/DNA雜交同樣也可望分離編碼IRPs等位變體的DNA、與IRPs同源的非人種屬蛋白質(zhì)的DNA、以及其它在結(jié)構(gòu)上相關(guān)蛋白的DNA，這些結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)具有一種或多種與整合素調(diào)節(jié)蛋白參與的β2和/或β7整合素調(diào)節(jié)途徑中成分或調(diào)節(jié)劑相互作用的能力。本發(fā)明的多核苷酸經(jīng)可被檢測(cè)地標(biāo)記后也用于雜交檢測(cè)細(xì)胞合成IRPs的能力。本發(fā)明提供的DNA序列信息還有可能通過同源重組或“敲除”策略[見Capecchi《科學(xué)》244卷1288-1292(1989)]產(chǎn)生不能表達(dá)功能性的IRPs或表達(dá)IRPs變體的嚙齒類動(dòng)物。這些嚙齒類作為模型用于研究體內(nèi)IRPs活性和IRPs調(diào)節(jié)劑十分有用。本發(fā)明中的多核苷酸還可以作為用于鑒定IRP基因座遺傳改變的診斷方法的基礎(chǔ)，這種改變暗示一種或多種疾病狀態(tài)。通過本發(fā)明還可以由通常表達(dá)IRPs的細(xì)胞獲得調(diào)節(jié)IRPs表達(dá)的反義多核苷酸。
本發(fā)明還提供可自主復(fù)制的構(gòu)建物，比如，包含本發(fā)明中的多核苷酸的質(zhì)粒和病毒載體，特別是在其中該多核苷酸功能性地與內(nèi)源性或異源性的DNA表達(dá)控制序列及轉(zhuǎn)錄終止子相連接的載體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，宿主細(xì)胞，特別是單細(xì)胞宿主細(xì)胞，比如原核細(xì)胞和真核細(xì)胞均為用本發(fā)明的DNAs穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并使其表達(dá)本說明書所指的IRPs。本發(fā)明中的宿主細(xì)胞在大規(guī)模制備IRPs時(shí)顯著有效。細(xì)胞培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，從細(xì)胞中或從細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中可分離出所需的蛋白。
本發(fā)明包括具有SEQ ID NO2(IRP-1)和SEQ ID NO4(IRP-2)列出的部分或全部氨基酸序列的IRP多肽產(chǎn)物。期望應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供翻譯后修飾(如，豆蔻?；?、糖基化、截短、Lapidation、及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，這可能是本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到理想的生物活性所需要的。也提供了融合多肽，其中IRP表達(dá)的氨基酸序列與其他來源的多肽氨基酸序列相鄰近。與天然多肽相比，本發(fā)明的融合多肽其生物學(xué)、生化和/或免疫學(xué)特性均有所改變。本發(fā)明也包括IRPs的多體形式。本發(fā)明中的多肽產(chǎn)物可以是全長(zhǎng)多肽、片段或變體。變體包括IRP產(chǎn)物，其中一個(gè)或多個(gè)特異性的(即、正常編碼的)氨基酸缺失或被置換，或其中有一個(gè)或多個(gè)非特異生氨基酸加入，而(1)未失去與β2或/和β7信號(hào)傳遞途徑中成分或調(diào)節(jié)劑相互作用的能力，或(2)失去與β2或/和β7信號(hào)傳遞途徑中成分或調(diào)節(jié)劑相互作用的能力。與IRPs相互作用的蛋白質(zhì)可用不同的方法進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明考慮的第一種鑒別方法是雙雜合篩選。雙雜合系統(tǒng)是在酵母中建立的[Chien等，美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)展，第88卷，9578-9582頁(yè)(1991)]，其基于激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)功能重建。具體而言，可通過以下方法來分離與IRP相互作用的蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸用包含報(bào)告基因的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，該報(bào)告基因受一個(gè)啟動(dòng)子的控制，啟動(dòng)子由具有DNA結(jié)合區(qū)域和激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；在宿主細(xì)胞中表達(dá)第一雜合DNA序列，該序列編碼的第一融合蛋白包括部分或全部IRP以及轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；在宿主細(xì)胞中表達(dá)第二雜合DNA序列文庫(kù)，其編碼的第二融合蛋白包括部分或全部推測(cè)的IRP結(jié)合蛋白以及第一融合蛋白中不存在的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；通過檢測(cè)特定的宿主細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因產(chǎn)物的量來檢測(cè)宿主細(xì)胞內(nèi)IRP相互作用蛋白與IRP的結(jié)合；從該特定的宿主細(xì)胞中分離編碼這種相互作用蛋白的第二雜合DNA序列。本發(fā)明中該方法優(yōu)選使用一種驅(qū)動(dòng)LacZ報(bào)告基因表達(dá)的GAL4上游激活序列，一種包括GAL4 DNA結(jié)合區(qū)域和GAL4反式激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子以及酵母宿主細(xì)胞。
其他用于鑒定與IRPs相互作用的蛋白的方法包括固定IRPs或一種檢測(cè)蛋白，用非固定結(jié)合的配偶體可檢測(cè)地標(biāo)記，將結(jié)合的配偶體一起孵育并檢測(cè)結(jié)合上的標(biāo)記物量。結(jié)合上的標(biāo)記物表明檢測(cè)蛋白與IRPs相互作用。
另一類鑒定IRP相互作用蛋白的方法包括固定IRPs或其片斷于熒光物質(zhì)包被(或浸滲)的固相支持物上，檢測(cè)蛋白用一種能激發(fā)熒光物質(zhì)的化合物標(biāo)記，將固定的IRPs與標(biāo)記的檢測(cè)蛋白接觸，測(cè)定熒光物質(zhì)的光發(fā)射，根據(jù)檢測(cè)蛋白引起熒光物質(zhì)的光發(fā)射即可將其鑒定為相互作用蛋白?；蛘?，本方法中推測(cè)的相互作用蛋白可以為固定的，而IRPs可以被標(biāo)記。
本發(fā)明還包含了抗體產(chǎn)物和其他結(jié)合蛋白(比如那些用上述方法鑒定的蛋白)，這些蛋白都是本發(fā)明中的IRP特異性的。本發(fā)明的抗體產(chǎn)物包括單克隆、多克隆、抗獨(dú)特型、和重組的(即人源化的、嵌合的、等)抗體及其片段。本發(fā)明包括制備本發(fā)明的抗體產(chǎn)物的細(xì)胞系(例如，雜交瘤細(xì)胞系)?？梢杂梅蛛x的天然或重組IRP多肽產(chǎn)物得到結(jié)合蛋白。反過來，結(jié)合蛋白可用于純化重組的或自然產(chǎn)生的IRP多肽產(chǎn)物及鑒定產(chǎn)生這些產(chǎn)物的細(xì)胞。用于細(xì)胞中或體液中蛋白檢測(cè)和定量的方法可以包括一種抗體物質(zhì)或多種抗體物質(zhì)，并且采取一種“三明治”的檢測(cè)形式。結(jié)合蛋白在調(diào)節(jié)(即阻斷，抑制或刺激)IRP與β2和/或β7整合素信號(hào)傳遞途徑中成分相互作用中有明顯的作用。
本發(fā)明要特別描述的單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞系200A、200B和233G產(chǎn)生的單克隆抗體。這些細(xì)胞系1997年4月2日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD.20852。200A的保藏號(hào)為HB-12331，200B為HB-12332，233G為HB-12333。
調(diào)節(jié)IRPs與其他蛋白或脂質(zhì)相互作用的化合物鑒定方法可包括用包含報(bào)告基因的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，報(bào)告基因處于一個(gè)啟動(dòng)子控制之下，啟動(dòng)子由具有DNA結(jié)合區(qū)域和激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)第一雜合DNA序列，該序列編碼第一融合蛋白，后者包括IRP的部分或全部及轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)第二雜合DNA序列，該序列編碼的融合蛋白包括與IRP相互作用的蛋白的全部或部分及第一融合蛋白中不存在的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或DNA激活區(qū)域。在檢測(cè)化合物存在或缺失的情況下，通過檢測(cè)宿主細(xì)胞中報(bào)告基因產(chǎn)物的量，來測(cè)定特定宿主細(xì)胞中相互作用蛋白與IRPs的結(jié)合，并以此估計(jì)檢測(cè)化合物對(duì)IRP與相互作用蛋白間相互作用的效果；與沒有調(diào)節(jié)化合物的情況下報(bào)告基因產(chǎn)物的量相比，檢測(cè)化合物改變報(bào)告基因產(chǎn)物的量，則其可被鑒定為調(diào)節(jié)化合物。本發(fā)明的方法優(yōu)選使用驅(qū)動(dòng)LacZ報(bào)告基因表達(dá)的GAL4上游激活序列；包含GAL4 DNA結(jié)合區(qū)域和GAL4反式激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子和酵母宿主細(xì)胞。
鑒定調(diào)節(jié)IRPs與相互作用蛋白或脂質(zhì)間相互作用的化合物的另一類方法是固定IRPs或一天然的IRP相互作用蛋白，可檢測(cè)地標(biāo)記非固定的結(jié)合配偶體，將結(jié)合配偶體一起孵育，確定檢測(cè)化合物對(duì)結(jié)合上的標(biāo)記物量的影響，其中，在有檢測(cè)化合物的情況下所結(jié)合的標(biāo)記物量較沒有檢測(cè)化合物的情況下結(jié)合的標(biāo)記物量減少就提示檢測(cè)物質(zhì)是一種IRP與相應(yīng)蛋白相互作用的抑制劑。相反，有檢測(cè)化合物的情況下所結(jié)合的標(biāo)記物量較沒有檢測(cè)化合物的情況下結(jié)合的標(biāo)記物量增加提示該推測(cè)的調(diào)節(jié)劑是IRP與相應(yīng)蛋白相互作用的激活劑。
本發(fā)明還考慮了另一種方法鑒定調(diào)節(jié)IRPs與一種相互作用蛋白或脂類之間相互結(jié)合的化合物，包括固定IRPs或其片段于一固相支持物上，后者包被(或浸滲)一種熒光物質(zhì)，將相互作用蛋白用能激發(fā)熒光物質(zhì)的化合物標(biāo)記，將固定的IRPs與標(biāo)記的蛋白在檢測(cè)化合物存在或不存在的情況下接觸，檢測(cè)熒光物質(zhì)的光發(fā)射，與不存在檢測(cè)化合物時(shí)的光發(fā)射相比，影響熒光物質(zhì)光發(fā)射的檢測(cè)化合物被鑒定為調(diào)節(jié)化合物。或者，該方法中IRP相互作用蛋白可以被固定，而IRPs可以被標(biāo)記。
IRPs的調(diào)節(jié)劑可能影響ARF，PI、β1、β2、β3和/或β7整合素調(diào)節(jié)和信導(dǎo)傳遞活性，IRP在細(xì)胞上定位和/或IRP與ARF、PI、β1、β2、β3和/或β7整合素信號(hào)傳遞途徑中成員的相互作用。采用上述方法，可以從組合文庫(kù)、肽和肽模擬物、合成化學(xué)物質(zhì)、寡核苷酸以及天然產(chǎn)物文庫(kù)中篩選調(diào)節(jié)劑。選擇性的調(diào)節(jié)劑可以包括，例如，特異地與IRPs或IRP核酸結(jié)合的多肽或肽；特異性地與IRPs或IRP核酸結(jié)合的寡核苷酸，和/或特異性地與IRPs或IRP核酸作用的其他非肽化合物(例如，分離或合成的有機(jī)分子)。本發(fā)明也提到了影響野生型IRPs細(xì)胞定位或結(jié)合活性的突變形式的IRPs。用本發(fā)明的方法鑒定的ARF、PI、β1、β2、β3或β7/IRP之間相互作用的調(diào)節(jié)劑可以體內(nèi)或體外使用在白細(xì)胞參與的炎癥過程中起作用。另外，與ARF、PI、β1、β2、β3和/或β7整合素或IRPs結(jié)合的調(diào)節(jié)化合物可用于監(jiān)測(cè)生物樣品包括體液或活檢組織中的ARF、PI、β1、β2、β3和/或β7水平。
IRP調(diào)節(jié)劑可配制成包含藥用載體的組合物。所用劑量應(yīng)足以調(diào)節(jié)體內(nèi)的IRP/β1、β2、β3或β7整合素信號(hào)傳遞或調(diào)控過程。
本發(fā)明其他優(yōu)勢(shì)和方面由以下詳述將顯而易見。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示表達(dá)所指多肽的JY細(xì)胞結(jié)合VCAM-1的能力。
圖2顯示表達(dá)所指多肽的JY細(xì)胞結(jié)合ICAM-1的能力。
圖3顯示IRP-1，IRP-2，B2-1和C.elegans的B2-1同源物的氨基酸序列對(duì)比。
發(fā)明詳述本發(fā)明用以下實(shí)例說明，其中實(shí)例1描述了編碼IRP-1和IRP-2的cDNA的分離；實(shí)例2提供了由上述cDNA編碼的IRP-1和IRP-2蛋白的區(qū)域結(jié)構(gòu)分析。實(shí)例3描述了含有IRP全長(zhǎng)cDNA以及編碼IRP區(qū)域和IRP突變體cDNA的重組表達(dá)構(gòu)建物。實(shí)例4顯示的檢測(cè)結(jié)果分析了IRPs的重組表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞粘附的影響，包括IRPs對(duì)細(xì)胞粘附于ICAM-1和VCAM-1的作用、IRPs對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)整合素的影響，以及IRP的亞細(xì)胞定位。實(shí)例5描述了能穩(wěn)定表達(dá)白細(xì)胞介素-8受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化JY細(xì)胞系(JY-8)，及其在檢測(cè)IRPs對(duì)細(xì)胞粘附于ICAM-1和VCAM-1中的應(yīng)用，這里的細(xì)胞粘附為白細(xì)胞介素-8依賴的并受美洲商陸刺激產(chǎn)生。實(shí)例5還描述了編碼綠色熒光蛋白(GFP)IRP融合蛋白的表達(dá)載體的制備。實(shí)例6描述了轉(zhuǎn)染了IRPs的JY細(xì)胞在流體狀態(tài)下的粘附。實(shí)例7描述了針對(duì)IRPs的單克隆抗體的制備過程及其特性。實(shí)例8闡述了IRPs的趨化特性。實(shí)例9所描述的實(shí)驗(yàn)顯示IRPs在不同的人體組織中的分布。實(shí)例10描述了與IRPs相互作用的蛋白質(zhì)的鑒定方法，實(shí)例11和12所描述的是鑒定IRP相互作用中調(diào)節(jié)劑的方法。
實(shí)例1用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA/DNA雜交的方法分離了兩個(gè)人IRP cDNA克隆。
用BLAST程序找到幾個(gè)cDNA部分序列與B2-1蛋白有相似性。根據(jù)ESTs(表達(dá)序列標(biāo)簽)H02055，R82669，R43994，H39073，R45477，T07442和T32215設(shè)計(jì)了共有序列寡核苷酸引物，其序列與代表血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源區(qū)域的5′及3′末端相符合。所設(shè)計(jì)的5′端(TS3.5)和3′端(TS3.3)引物的序列為
TS3.5 ATATACGCGTACCTTCTTCAACCCGGACC(SEQ ID NO5)TS3.3 ATATGTCGACTCAGGGCTGCTCCTGCTTC(SEQ ID NO6)將引物加入含有人脾cDNA模板2mg質(zhì)粒cDNA的pcDNA-1Amp(Invitrogen，San Diego，CA)]PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系為100μl。樣品在94℃變性5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增94℃1分鐘；50℃1分鐘；72℃2分鐘。約450bp的PCR產(chǎn)物用MluI和SalI酶切。將酶切片段純化并克隆至pC1-neo載體(Promega，Madison，WI)，該載體中有一編碼血凝素標(biāo)志的序列，其位置在所插入的PCR消化產(chǎn)物的5′端并緊靠該片段。插入片段的序列經(jīng)證實(shí)后，該載體被命名為5′HATS53/pC1#3。
經(jīng)MluI/SalI酶切的PCR產(chǎn)物標(biāo)記后作為探針，以在人脾cDNA文庫(kù)中篩選大于3kb的插入片段。脾文庫(kù)的構(gòu)建方法是，將用OligdT為引物所獲得的cDNA克隆至pcDNA-1Amp，并篩選約大于7.8kb的載體/插入DNA。將文庫(kù)載體轉(zhuǎn)化至超感受態(tài)細(xì)胞XL1 Blue中(StratageneLa Jolla，CA)，并鋪至15個(gè)150mm2有Hybond N+濾膜的主平板上，使每板上克隆的密度為約20000個(gè)。由每個(gè)平板得到兩個(gè)影印物用于雜交。酶切的PCR產(chǎn)物(400ng)用120μCi32PdCTP和dTTP進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記試劑盒為Boehringer Mannheim隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，操作按廠商說明。未摻入的核苷酸通過Centri-sep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)除去。將探針加至含(5X SSPE，45％甲酰胺，5XDenhardts，1％SDS)的雜交液中42℃過夜雜交。用0.2X SSC在65℃洗膜并放入暗盒進(jìn)行曝光。挑取兩張膜上均有陽(yáng)性雜交結(jié)果的克隆，經(jīng)稀釋后再鋪于有Hybond N+濾膜的LBM平板上。每板菌落再制兩張Hybond N+膜，并用第一次篩選時(shí)保留的雜交液再次雜交。挑取第二次陽(yáng)性的克隆，擴(kuò)增、提取質(zhì)粒并進(jìn)行片段的雙向測(cè)序。
其中一個(gè)鑒定的克隆包含一個(gè)全長(zhǎng)基因，稱為克隆S3，其編碼的蛋白在本發(fā)明中命名為IRP-1。該克隆的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中列出。該克隆在其起始甲硫氨酸附近有理想的Kozak共有序列，框架的甲硫氨酸的5′端有一終止密碼。該克隆大約長(zhǎng)1.6kb，具有399個(gè)氨基酸的開放閱讀框。克隆S3與ESTR82724最為相似，其中469個(gè)核苷酸的同源性大于93％。
另一個(gè)克隆長(zhǎng)約3.4kb，命名為S12，編碼一種蛋白，在本發(fā)明中稱為IRP-2，雖與IRP-1有同源性，但的確為一新基因。IRP-2克隆不是全長(zhǎng)基因，因?yàn)榘袸RP-2與IRP-1序列排列在一起作比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)其5′端位于IRP-1編碼區(qū)內(nèi)約50個(gè)氨基酸。
為獲取IRP-2的全長(zhǎng)序列，用下述兩種IRP-2探針對(duì)(上述的)脾臟cDNA文庫(kù)進(jìn)行了再次篩選。截短的IRP-2克隆分別用XbaI和XhoI進(jìn)行酶切。所得的2kb XbaI酶切片段和1kb XhoI酶切片段用上述方法進(jìn)行標(biāo)記，仍用Boehringer Mannheim隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒。用Centri-sep柱除去未摻入的核苷酸，探針加入上述雜交液與濾膜在42℃過夜雜交。最終洗膜用1XSSC/0.1％SDS在50℃進(jìn)行。挑取第一次陽(yáng)性的克隆，稀釋，重新鋪LBM平板。每板制備兩張相同的膜，用第一次雜交后保留的液體進(jìn)行雜交。挑取兩張膜上均呈現(xiàn)陽(yáng)性的克隆，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。兩個(gè)克隆，S12-41和S12-47使IRP-2的編碼區(qū)向5′方向延伸了約50個(gè)氨基酸。該克隆的5′端有一個(gè)甲硫氨酸，與IRP-1中所見的氨基酸組成一致，并且甲硫氨酸附近結(jié)構(gòu)高度符合Kozak共同序列。對(duì)S12-47克隆進(jìn)行了全長(zhǎng)序列測(cè)定，IRP-2 DNA的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中列出。
實(shí)例2通過比較IRP-1，IRP-2，B2-1(Liu等，上文)基因及推測(cè)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們有3個(gè)共同區(qū)域或基序一個(gè)氨基末端驅(qū)動(dòng)蛋白/肌球蛋白區(qū)域，一個(gè)SEC7區(qū)域和一個(gè)羧基末端血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源(PH)區(qū)域。驅(qū)動(dòng)蛋白和肌球蛋白是與微管有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[Navone等，《生物與化學(xué)雜志)》第117卷1263-1275頁(yè)(1992)]。Altschul等在《分子生物學(xué)雜志》第215卷，403-410頁(yè)(1990)描述的酵母蛋白SEC7有2008個(gè)氨基酸，能夠調(diào)節(jié)高爾基體分泌糖蛋白。盡管SEC7在酵母中的更確切的功能還未搞清，Arabidopsis中一個(gè)SEC7基因突變引起了發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞分裂及細(xì)胞粘附的改變[Shevell等《(細(xì)胞》771051-1062(1994)]。信號(hào)傳導(dǎo)過程中大量的蛋白質(zhì)都有PH區(qū)域。在一些蛋白中，該區(qū)域使其能與G蛋白βγ亞單位，肌醇三磷酸(IP3)或磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)結(jié)合。參見Ingley和Hemmings《細(xì)胞生化雜志》56卷436-443(1994)。在IRP-1和IRP-2的氨基酸序列中，驅(qū)動(dòng)蛋白/肌球蛋白區(qū)域大約從第9氨基酸殘基延伸至第60位殘基，SEC7區(qū)域位于約71至245殘基，PH區(qū)域從大約260殘基延伸到羧基末端。B2-1中，驅(qū)動(dòng)蛋白/肌球蛋白區(qū)域、SEC7區(qū)域和PH區(qū)域分別位于10～61位殘基，72～245位殘基和266位殘基至羧基端左右。IRP與B2-1不同區(qū)域氨基酸的一致性列于以下表1。
表1B2-1驅(qū)動(dòng)蛋白/肌球蛋白 SEC7區(qū)域 PH區(qū)域IRP-1 59％ 88％ 90％IRP-2 34％ 79％ 72％根據(jù)這三種蛋白質(zhì)中驅(qū)動(dòng)蛋白/肌球蛋白、SEC7和PH區(qū)域的保守性，IRP-1和IRP-2蛋白似乎能夠代表與B2-1相關(guān)的人蛋白質(zhì)家族成員。圖3顯示IRP-1，IRP-2及B2-1克隆與C.elegans同源物的對(duì)比[Wilson等， 《自然》368卷32-38(1994)]。盡管C.elegans蛋白與其它三種人類蛋白一致性百分比不高，也可以很清楚地發(fā)現(xiàn)在這四種蛋白中總的區(qū)域結(jié)構(gòu)是保守的。
大多數(shù)在三種人蛋白與C.elegans蛋白之間保守的殘基，在含同源SEC7區(qū)域的Arabidopsis蛋白[Shevell等，同上]中也是保守的，并且在酵母SEC7蛋白中更加保守。這就提示這些殘基在SEC7區(qū)域發(fā)揮功能中的重要性。實(shí)際上，Shevell等(同上)曾報(bào)道，在Arabidopsis克隆(EMB30)中由于突變?cè)斐梢粋€(gè)保守的殘基(相當(dāng)于圖3對(duì)比中的第157位)改變，使細(xì)胞分裂、延伸和粘附受到影響。
IRP中PH區(qū)域的保守殘基可能也有重要功能。Tsukada等《美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)展)》第91卷11256-11260頁(yè)(1994)報(bào)道，在許多PH區(qū)域中保守的精氨酸(相應(yīng)于圖3中的第289位)突變?yōu)榘腚装彼?，?dāng)這種突變發(fā)生于小鼠btk酪氨酸激酶的PH區(qū)域時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致X染色體連鎖的免疫缺陷表型，盡管酶仍然保持全部的btk激酶活性。作者提出，既然推測(cè)這一殘基在分子的表面，這種氨基酸的替換不大可能造成對(duì)結(jié)構(gòu)的影響，而更可能的是干擾了其與其它蛋白的特定相互作用。這一殘基在人IRP蛋白與C.elegans蛋白間也相當(dāng)保守。
最后，當(dāng)與其它的PH區(qū)域比較時(shí)，所有三種人蛋白以及C.elegans蛋白在第5和第6亞區(qū)域之間另外還有16個(gè)至18個(gè)殘基。如果以Macias等《自然》369卷，675頁(yè)(1994)提出的三維結(jié)構(gòu)的角度來估計(jì)PH區(qū)域的話，該區(qū)域?qū)?huì)形成一個(gè)由區(qū)域核伸出的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可能因此在與其他一種或多種蛋白的相互作用中起重要作用。這16至18個(gè)殘基在這4種蛋白間呈73％的一致性。
實(shí)例3為研究IRP蛋白在整合素發(fā)揮功能中的作用，將IRP-1，IRP-2及B2-1或其PH區(qū)域與β2整合素亞單位CD11a和CD18一起在COS細(xì)胞和JY細(xì)胞中表達(dá)。IRP和B2-1表達(dá)載體的構(gòu)建如下。用這些載體表達(dá)蛋白在實(shí)例4中加以描述。
對(duì)一經(jīng)過長(zhǎng)度篩選的2.5～4kb Ramos文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆了編碼人B2-1蛋白的互補(bǔ)DNA。針對(duì)編碼區(qū)5′和3′端的引物根據(jù)以前(Liu等，同上)發(fā)表的序列設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)引物對(duì)以便使擴(kuò)增的序列插入到合適的載體中。B2-1cDNA最初用5′Sc7.Nde和3′Sc7.Xho引物進(jìn)行擴(kuò)增并克隆至pET15b載體中(Novagen，Madison，WI)，引物序列為Sc7.Nde ATATCATATGGAGGAGGACGACAGCTAC(SEQ ID NO7)Sc7.Xho ATATCTCGAGTCAGTGTCGCTTCGTGGAG(SEQ ID NO8)該引物對(duì)用于在100μl PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增。樣品在94℃保持5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃30秒；55℃30秒；72℃1分鐘。最終PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化，用NdeI和XhoI酶切并克隆至pET15b。挑選克隆進(jìn)行測(cè)序，其中Sc7/PET#5和Sc7/pET#6克隆包含一個(gè)與發(fā)表的B2-1序列一致的序列。
用PCR的方法在B2-1cDNA的5′端加上一個(gè)HA標(biāo)志，然后加有標(biāo)志的基因被克隆至pC1-neo載體中。上述的3′Sc7.Xho引物在此與5′Sc.7.HAS引物一起應(yīng)用
Sc7.HAS ATATGCTAGCCACCATGGGGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCGACGCGTATGGAGGAGGACGACAGC(SEQ ID NO9)該引物中下劃線的核苷酸編碼HA標(biāo)志。在100μl反應(yīng)體系中加入上述引物對(duì)，Sc7/PET#6 DNA作為模板，按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增。樣品在94℃保持5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃2分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化、NdeI和XhoI酶解并克隆至預(yù)先經(jīng)過NdeI/XhoI酶解的pC1-neo載體。所得克隆命名為5′HASc7/pC1#29。其插入片段編碼一種HA融合蛋白在此稱為5′HAB2-1。
用PCR的方法在B2-1 cDNA的3′端加入一個(gè)HA標(biāo)志，帶有標(biāo)志的cDNA隨后克隆至pC1-neo。所用引物為Sc7.HA3和T7Sc7.HA3 ATATGTCGACTCACGCATAGTACAGGAACATCGTATGGGTACATACGCGTGTGTCGCTTCGTGGAGGA(SEQ ID NO10)T7 TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO11)采用上述引物，并用SEC7/pC1#9 DNA作為模板，在100μl體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品在94℃保持5分鐘，然后按順序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃2分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化，XhoI和SalI酶解，克隆至預(yù)先經(jīng)過XhoI和SalI酶切的pC1-neo載體。構(gòu)建物命名為3′HA B2-1PC1#29，其編碼的蛋白命名為3′HA B2-1。
B2-1 PH區(qū)域用PCR的方法進(jìn)行亞克隆，所用引物為5′Tsc7.S和3′Sc7.XbaTsc7.5 ATATACGCGTACTTTCTTCAATCCAGACCG(SEQ ID NO12)Sc7.Xba ATATTCTAGATCAGTGTCGCTTCGTGGAG(SEQ ID NO13)使用該引物對(duì)，以SEC7/pET#5 DNA為模板，在100λ體系中按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。樣品在94℃保持5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增94℃1分鐘；50℃1分鐘；72℃2分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化、MluI和XbaI酶解，并克隆至預(yù)先經(jīng)過MluI/xbaI酶切的5′HApC1-neo載體中(通過用MluI和XbaI酶切5′HA B2-1/pC1#29克隆制備)。該克隆的插入片段編碼一種HA融合蛋白，在此命名為5′HA B2-1 PH。
先在IRP-1 cDNA的5′端用PCR的方法加入一Mlu位點(diǎn)，在其3′端加入一SalI位點(diǎn)；然后將其亞克隆至5′HA pC1載體。所用引物為S3.5′HA ATATACGCGTATGGAGGACGGCGTCTATG(SEQ ID NO14)TS3.3(SEQ ID NO6)用上述引物以S3.3 DNA為模板在100μl體系中按下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品于94℃保持5分鐘、隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃45秒；50℃45秒；72℃1分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化、MluI和SalI酶解，連接至預(yù)先用Mlu和SalI酶切過的5′HA pC1載體。產(chǎn)生的克隆命名為5′HA IRP-1/pC1#15，其編碼的蛋白命名為5′HA IRP-1。
克隆5′HA TS3/pC1#3(實(shí)例1)被用于表達(dá)IRP-1PH區(qū)域。
IRP-2最初用PCR的方法克隆至pC1-neo載體時(shí)不帶有HA標(biāo)志。PCR所用的引物為S12/SR1 ATATGAATTCCACCATGGACCTGTGCCACCCAG(SEQ ID NO15)TS12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC(SEQ ID NO16)用上述引物以克隆5′HAS12/pC1為模板在100μl體系中按下列條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)94℃1分鐘；50℃1分鐘；72℃1分鐘。產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、EcoRI和SalI酶解，連接至預(yù)先用相同的限制性內(nèi)切酶酶切后的pC1-neo載體中。對(duì)所得的克隆#11全部測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其與最初的克隆序列一致。
另外，將IRP-2和IRP-2 PH區(qū)域用PCR的方法分別克隆至帶有5′HA標(biāo)志的pC1-neo，所用引物為TS12.5(SEQ ID NO17)，TS12.3(SEQ ID NO18)和S12.5(SEQ ID NO19)。
TS12.5 ATATACGCGTACCTTCTTCAATCCAGAC(SEQ ID NO17)ST12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC(SEQ ID NO18)S12.5 ATATACGCGTATGGACCTGTGCCACCCAG(SEQ ID NO19)用作擴(kuò)增反應(yīng)模板的DNA是克隆S12。樣品在94℃保持4分鐘，隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增94℃1分鐘；52℃2分鐘；72℃2分鐘。兩個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的產(chǎn)物分別用MluI和SalI酶解，純化，分別連接到預(yù)先用MluI和SalI酶切過的pC1-neo HA載體。對(duì)克隆pC1-neoIRP-2 PH#5測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們與所用相應(yīng)模板的序列一致。
實(shí)例4測(cè)定了IRPs的過度表達(dá)對(duì)β2依賴性細(xì)胞粘附(通過轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞或JY細(xì)胞結(jié)合至ICAM-1檢測(cè))和β7依賴性細(xì)胞粘附(通過轉(zhuǎn)染的JY細(xì)胞結(jié)合至VCAM-1檢測(cè))的影響。
COS細(xì)胞用編碼CD11a/CD18的載體和含有編碼5′HA B2-1，3′HAB2-1，5′HA B2-1PH，5′HA IRP-1，5′HA IRP-1PH，5′HA IRP-2，5HAIRP-2 PH其中任一插入片段的載體(實(shí)例3)或pC1-neo對(duì)照載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將COS細(xì)胞按每板(10cm2)1.2×106均勻鋪至培養(yǎng)板上。次日制備轉(zhuǎn)染混合物，每板所需的混合物包括5mlDMEM，2μl氯喹(0.25M)，30μl DEAE Dextran(50mg/ml溶于CMF-PBS)及將要轉(zhuǎn)染至細(xì)胞的載體每種10μg。當(dāng)COS細(xì)胞達(dá)將近80％滿底時(shí)移去培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染混合物，37℃孵育2.5小時(shí)。吸除轉(zhuǎn)染混合物，并加入含10％DMSO的DMEM，(室溫)保持1分鐘。隨后吸除DMSO溶液，加入10ml完全培養(yǎng)基。
用不同的抗體證明轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞表達(dá)IRPs和LFA-1。所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD18檢測(cè)呈陽(yáng)性染色。用一種HA標(biāo)志特異性單克隆抗體150B OR12CA5檢測(cè)HA表位，IRP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均呈陽(yáng)性染色。
被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)檢測(cè)其與ICAM-1結(jié)合的能力。為制備粘附試驗(yàn)的細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，加入5ml維爾烯、3分鐘后收集細(xì)胞。加入5ml DMEM完全培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。對(duì)不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行下面描述的粘附試驗(yàn)。
事先對(duì)96孔板用ICAM-1/Fc或VCAM-1/Fc進(jìn)行包被，每孔加入pH 9.6，含5μg/ml蛋白的碳酸鹽緩沖液50μl，4℃孵育過夜。培養(yǎng)板用150μl/孔的PBS洗兩遍，然后每孔內(nèi)加入以PBS溶解的1％的BSA150μl室溫封閉1小時(shí)。隨后每孔加入100μl粘附緩沖液(含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基)以及100μl懸浮于粘附緩沖液的轉(zhuǎn)染JY細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞按下列方法制備。
試驗(yàn)前一天，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉和10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基調(diào)至密度為3×105細(xì)胞/ml。使細(xì)胞倍增，一般需24小時(shí)孵育。倍增后，收獲細(xì)胞并將其重懸于粘附緩沖液中使其密度達(dá)1×106細(xì)胞/ml。每孔中約加入100μl，相當(dāng)于1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)板加蓋后室溫孵育30分鐘。
孵育后，每孔加入溶于CMF-PBS的14％的戊二醛50μl并在室溫孵育30分鐘以固定細(xì)胞。孵育后，用去離子水洗孔三次。最后一次洗滌后吸去水，加入含0.125％結(jié)晶紫(用10％乙醇/90％去離子水制備成1％的貯存液，用去離子水稀釋成0.125％的濃度并用0.22μm濾膜過濾)的染液50μl，孵育2分鐘。孵育后，按上述方法用去離子水洗三次，每孔加200μl乙醇溶液(兩份95％乙醇與一份去離子水混合)，孵育1小時(shí)，在酶標(biāo)儀上以570到590nm波長(zhǎng)讀板。
轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，與對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染B2-1 PH區(qū)域的細(xì)胞，其LFA-1依賴性粘附呈中度下降。相對(duì)于轉(zhuǎn)染pC1-neo的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了IRP-2 PH區(qū)域的細(xì)胞結(jié)合能力顯著降低，而轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)IRP的細(xì)胞克隆的粘附無明顯改變。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，四種轉(zhuǎn)染細(xì)胞(3′HA B2-1，5HA B2-1B2-1 PH，IRP-1 PH)的ICAM-1粘附與對(duì)照相比降低了50％。
JY細(xì)胞本身即表達(dá)內(nèi)生性α4β7和LFA-1。將編碼IRP-1，IRP-2，B2-1，IRP-1 PH，IRP-2 PH或B2-1 PH的載體分別轉(zhuǎn)染JY細(xì)胞。細(xì)胞用電轉(zhuǎn)化的方法按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，每次轉(zhuǎn)化需將107個(gè)細(xì)胞離心并放置冰上。細(xì)胞用DPBS洗滌然后再離心。用0.5ml DPBS重懸并移至電轉(zhuǎn)槽中，加入30ug DNA(1mg/ml溶于DPBS)于轉(zhuǎn)化混合物中。將轉(zhuǎn)化混合物輕輕混勻、置冰上10分鐘。按以下參數(shù)使用BioRad GenePulser對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化打開電容擴(kuò)大開關(guān)，設(shè)置電壓250V、電容至960μf。電轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)染混合物置冰上10分鐘，然后將細(xì)胞置于T25搖瓶，加入5ml RPMI完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后3天，向培養(yǎng)液中加入潮霉素達(dá)濃度0.5mg/ml。轉(zhuǎn)染14天后進(jìn)行粘附試驗(yàn)。
轉(zhuǎn)染IRP的JY細(xì)胞也被證實(shí)，其與ICAM-1的LFA-1依賴性粘附及VCAM-1的α4β7粘附能力降低。LFA-1和α4水平在不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間無明顯不同，因此不能解釋粘附能力的降低。
由此似乎可以證明IRP在調(diào)節(jié)β2或β7整合素依賴性粘附中具有一定的特異性。JY細(xì)胞表達(dá)的IRP-1似乎顯示優(yōu)先降低β2依賴性粘附，而IRP-2似乎顯示優(yōu)先下調(diào)β7依賴性粘附。B2-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞已被證實(shí)既能降低β2也能降低β7依賴性粘附。表達(dá)含有IRP-1，IRP-2或B2-1 PH區(qū)域的截短物顯示可以普遍降低β2和β7依賴性粘附。參見如下表2，其中“+”表示粘附性增高，“-”表示粘附降低，“NS”表示粘附性無顯著變化。
表2宿主細(xì)胞JY COS表達(dá)的蛋白 β2β7β25′HA IRP-1- NS/+ -5′HA IRP-2NS- NS5′HA B2-1 - NS/+ -5′HA IRP-1 PH - NS/- -5′HA IRP-2 PH - NS/- NS這些結(jié)果可能與IRP的氨基末端部分直接或間接地以不同親合力與β2或β7整合素相互作用而導(dǎo)致優(yōu)先調(diào)節(jié)一種或其它類型的整合素相一致。與之相反，PH區(qū)域的功能及其相互作用可能是調(diào)節(jié)不同整合素的途徑中共同的信號(hào)傳遞元件。這種元件可以是異三聚體GTP結(jié)合蛋白(例如Gαβγ)PIPn。蛋白激酶C(PKC)或一些尚未被鑒定的PH區(qū)域配體。推測(cè)一種破壞IRP PH區(qū)域結(jié)合于這種共同信號(hào)傳遞元件的拮抗劑可以廣泛調(diào)節(jié)β2、β7及可能其他的象β1和β3整合素的粘附。與之相反，一種干擾IRPs的氨基末端與整合素相互作用的拮抗劑，推測(cè)可能以更加特異的方式參與調(diào)節(jié)整合素依賴性粘附。
未被最大程度激活以參與整合素依賴性細(xì)胞粘附的白細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞系可被象佛波酯PMA這樣的PKC激動(dòng)劑所激活。PKC活性導(dǎo)致細(xì)胞粘附的機(jī)制還不清楚。PKC對(duì)親合力或親合性有一定的上調(diào)作用，對(duì)細(xì)胞伸展過程中所需的細(xì)胞骨架重新組織也有一定作用。然而，PKC激活對(duì)IRP下調(diào)整合素依賴性粘附的作用可以說明PKC是否作用于IRP的下游或上游。上述經(jīng)佛波酯刺激后的JY轉(zhuǎn)染細(xì)胞其LFA-1或α4β7依賴性粘附常常不能恢復(fù)至對(duì)照水平。因此，要么調(diào)節(jié)性PKC底物作用于IRPs調(diào)節(jié)的途徑上游，要么PKC調(diào)節(jié)整合素依賴性粘附的其他途徑或方面。另外一種可能是，IRPs調(diào)節(jié)整合素依賴性粘附過程的多個(gè)方面，而PKC刺激只影響其中的某一方面。IRPs可能通過影響整合素的親合性或親合力(成簇)(實(shí)例4)或膜的再循環(huán)來調(diào)節(jié)整合素依賴性粘附。LFA-1水平在表達(dá)IRPs的COS細(xì)胞降低，但在表達(dá)IRPPH區(qū)域的COS細(xì)胞上不降低，提示其在整合素的再循環(huán)起一定作用。
為驗(yàn)證是否IRPs對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)整合素有作用，對(duì)COS細(xì)胞用編碼全長(zhǎng)IRP-1，IRP-2或B2-1的DNA(或用對(duì)照DNA載體pC1-neo或編碼14-3-3θ的DNA)其中之一和編碼αLβ2、α4β7或ICAM-2其中之一的DNA、進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用單克隆抗體ICA4.1(針對(duì)α4具有免疫特異性)TS1/22(針對(duì)αL有免疫特異性)，3S3(針對(duì)β1有免疫特異性)，或92C12F(針對(duì)ICAM-2具有免疫特異性)對(duì)細(xì)胞染色觀察表面表達(dá)情況(熒光密度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比)。COS細(xì)胞本身即表達(dá)β1，故無須轉(zhuǎn)染編碼β1的DNA。
下面圖3所示的結(jié)果提示IRP-1可能通過下調(diào)整合素的從頭生物合成或除去或置換位于細(xì)胞表面的整合素的再循環(huán)過程來降低細(xì)胞表面表達(dá)αLβ2整合素。
表3IRP對(duì)細(xì)胞表面整合素表達(dá)的作用αLβ1α4β1ICAM-2 β1pCI-neo 760 396 317 309 509 36359％*62％ 30％ 74％ 59％ 72％IRP-1533 364 266 405 469 36151％ 66％ 32％ 74％ 59％ 77％IRP-2711 367 294 384 522 35960％ 69％ 38％ 75％ 55％ 76％B2-1 666 375 304 418 489 32959％ 70％ 36％ 72％ 54％ 73％14-3-3θ690 361 336 368 543 38660％ 72％ 43％ 74％ 60％ 75％+平均熒光強(qiáng)度*陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)正如以上討論過的，一個(gè)家族的不同成員對(duì)整合素依賴性粘附可能具有相反的作用。這些相反的作用同IRPs與信號(hào)傳遞途徑中調(diào)節(jié)整合素結(jié)合(下面討論)的不同效應(yīng)物之間相互作用相一致。這些相反的作用過多可以部分解釋這些途徑中為什么IRPs的過度表達(dá)只能造成對(duì)IL-8誘導(dǎo)的粘附的部分阻斷。另外，IRP-1過度表達(dá)而粘附性下降可能是由于IRP-1拮抗了另外的IRP的促粘附活性。B2-1(細(xì)胞粘著素-1)的促粘附活性不是JY-8細(xì)胞特有的(實(shí)例5)，在Jurkat T淋巴樣細(xì)胞也觀察到有過度表達(dá)[Kolanus等，《細(xì)胞》86卷233-242(1996)]。然而，與JY-8細(xì)胞相對(duì)照，在Jurkat細(xì)胞的表達(dá)誘導(dǎo)了αLβ2結(jié)合。因此B2-1可以誘導(dǎo)細(xì)胞類型特異性的與α4β7或αLβ2的結(jié)合。這并不奇怪，因?yàn)橐环N特定的整合素其結(jié)合能力依細(xì)胞類型不同而異[Chan等《細(xì)胞生物學(xué)雜志》120卷，第537-543頁(yè)(1993)，Kassner等《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》178卷649-660頁(yè)(1993)]。
下一步對(duì)與ICAM-1粘附的JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞(實(shí)例5)內(nèi)IRP/GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行檢測(cè)。載玻片用溶于50mM碳酸氫鹽緩沖液(βH9.6)的ICAM-1/Fc(10μg/ml)在4℃包被18小時(shí)，然后用含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基洗滌；使表達(dá)GFP/IRP融合蛋白的JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞粘附于ICAM-1包被過的載玻片上。
為檢定IRP/GFP融合蛋白的亞細(xì)胞分布以及鑒定在細(xì)胞內(nèi)定位中哪個(gè)區(qū)域能發(fā)現(xiàn)IRP-1，對(duì)JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行了熒光共聚焦顯微鏡觀察。IRP-1，IRP-2，B2-1主要分布于靠ICAM-1貼附于玻片的細(xì)胞細(xì)胞骨架皮層的前緣(參見實(shí)例8)。IRP-1的PH區(qū)域位于質(zhì)膜區(qū)，Sec7區(qū)域在細(xì)胞漿內(nèi)呈更為彌散的分布。表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)胞漿內(nèi)彌漫的熒光。這些結(jié)果提出，有助于定位于質(zhì)膜的PH區(qū)域，與其它區(qū)域一同發(fā)揮作用，使野生型IRPs定位于前緣。
為檢測(cè)板層體形成過程中IRPs的分布，用定時(shí)成像技術(shù)分析了靠ICAM-1貼附于玻片的JY-8 IRP-2/GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。選擇IRP-2過度表達(dá)的JY-8細(xì)胞來進(jìn)行能夠?qū)L-8的應(yīng)答發(fā)生移動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)定位，因?yàn)楸磉_(dá)IRP-2融合蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)于表達(dá)IRP-1或B2-1的轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有更大的趨化移動(dòng)性。發(fā)現(xiàn)在板層體形成部位及板層體形成之前，IRP-2沿著JY-8細(xì)胞的一個(gè)邊緣濃集。定時(shí)成像分析結(jié)果表明，伴隨著其發(fā)育，IRP-2再分布到板層體中。因此IRP-2出現(xiàn)非常早且在片狀偽足伸展的過程中一直存在。
IRPs可能有助于整合素在遷移細(xì)胞前緣發(fā)揮功能。細(xì)胞內(nèi)定位顯示依賴于Sec7和PH區(qū)域的相互作用，因?yàn)楫?dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí)，Sec7區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)彌散分布，而PH區(qū)域特異分布于細(xì)胞膜。PH區(qū)域相互作用可能有助于一種包括IRP和ADP核糖基化因子(ARF)的復(fù)合物在胞膜的功能性分布。在該部位，ARF可變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，因?yàn)锳RNO(一種蛋白質(zhì)，在優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)?zhí)峤缓蟛乓姅⑹?，可能是IRP-1)GTP交換因子(GEF)活性在磷脂酰肌醇結(jié)合至PH區(qū)域后被刺激增強(qiáng)[Chardin等，《自然》第384卷481-484頁(yè)(1996)]。ARFs在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用提示，它們可以介導(dǎo)整合素分布到遷移細(xì)胞的前緣，并從該部位離開。這與前緣的極化胞吐作用在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中起關(guān)鍵作用的見解相一致[Bretscher等，《細(xì)胞》87601-606(1996)]。
另外，一種ARF GTP交換的抑制劑，布雷菲爾德菌素A，可抑制傷口愈合模型中成纖維細(xì)胞的遷移和板狀偽足形成[Bershadsky，等，《美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)展》第91卷，5686-5689頁(yè)(1994)]。有報(bào)道B2-1直接與β2的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合[Kolanus，等，《細(xì)胞》86卷233-242(1996)]。因此，IRPs可以將整合素與ras超家族的成員聯(lián)系起來并使其活化，后者在趨化作用的一個(gè)或幾個(gè)步驟中起作用。
整合素親合力中的一個(gè)角色也被提及。ARF和ras超家族的另外一個(gè)成員RhoA協(xié)同作用激活磷脂酶D(PLD)[Kuribara等，《生物與化學(xué)雜志》270卷，25667-25671(1995)]。PLD可被不同細(xì)胞類型的多種激活劑活化并除去磷脂酰膽堿，產(chǎn)生膽堿和磷脂酸[Boman等《生物學(xué)化學(xué)科學(xué)進(jìn)展》20卷，147-150(1995)]。已經(jīng)證實(shí)，磷脂酸，而非其它不同種類發(fā)生不良改變的脂類，可增強(qiáng)純化的整合素GPllbllla與纖維蛋白原的結(jié)合[Smyth等，《生物與化學(xué)雜志》第267卷，15568-15577(1992)]。IRPs可以作為信號(hào)傳遞途徑中調(diào)節(jié)因子，改變整合素的膜分布或親合力。最近，據(jù)報(bào)道ARNO可誘導(dǎo)GDP/GTP交換，因而活化了ras超家族的一個(gè)成員，ARF-1[Chardin等，《自然》，384卷481-488頁(yè)(1996)]。已知的6個(gè)ARF和另外4個(gè)ARF樣蛋白質(zhì)其氨基酸有45-60％相同[Boman等《生物學(xué)化學(xué)科學(xué)進(jìn)展》20卷，147-150(1995)]。ARFs位于高爾基體，小泡和質(zhì)膜，且發(fā)現(xiàn)在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吞、胞吐中起作用[D’Souza-Schorey等，《科學(xué)》267卷，1175-1178(1995)]，Peters等《細(xì)胞生物學(xué)雜志》128卷1003-1017(1995)，Boman等《生物學(xué)科學(xué)進(jìn)展》20卷147-150(1995)]。因此IRPs可以調(diào)節(jié)局部磷脂酸增多，磷脂酸則上調(diào)整合素結(jié)合，這種結(jié)合是直接或間接地通過轉(zhuǎn)變成PKC的激活劑二酰甘油(DAG)引起的。
實(shí)例5建立了一個(gè)含有N-末端單克隆抗體表位標(biāo)志并能穩(wěn)定表達(dá)IL-8功能性受體的JY細(xì)胞系。這里將該細(xì)胞系定名為“JY-8”。為證實(shí)其在αLβ2依賴性粘附中的作用，使JY-8細(xì)胞系過度表達(dá)IRP。JY-8正常即表達(dá)一種β2整合素，αLβ2和一種α4整合素，α4β7[Chan等《生物與化學(xué)雜志》267卷8366-8370(1992)]。將綠色熒光蛋白(GFP)融合于IRP-1，IRP-2和B2-1野生型序列的氨基末端以產(chǎn)生IRP表達(dá)構(gòu)建物，下一段落描述構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建物的過程。
綠色熒光蛋白(GFP)IRP融合蛋白表達(dá)構(gòu)建物按下面的方法制備。用NheI和BamHI酶切表達(dá)載體，pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)。將從pEGFP(Clontech，Palo Alto，CA)上用NheI和BamHI酶切下的編碼GFP的DNA片段連接至Nhe1/Bam HI酶切過的pCEP4。所得質(zhì)粒pCEP4/GFP用于構(gòu)建IRP融合蛋白表達(dá)構(gòu)建物。
為將IRP DNA片段亞克隆至pCEP4/GFP，用PCR的方法在該片段兩端加上XhoI和Hind III限制性酶切位點(diǎn)，以保證隨后進(jìn)行相同框架的連接。
下列引物對(duì)用于PCRS3 GFP.Xho.5，ATATCTCGAGCTATGGAGGACGGCGTCTAT，(SEQ ID NO20)和S3.GFP.H3.3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGGGCTGCTCCTGCTTC(SEQ ID NO21)用于擴(kuò)增編碼IRP-1 GFP融合蛋白的DNA；S7.GFP.Xho.5，ATATCTCGAGCTATGGAGGAGGACGACAGCTAC，(SEQ ID NO22)和S7.GFP.H3.3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGTGTCGCTTCGTGGAGG(SEQ ID NO23)用于擴(kuò)增編碼B2-1 GFP融合蛋白的DNA；S12.GFP.Xho.5，ATATCTCGAGCTATGGACCTGTGCCACCCAG(SEQ ID NO24)和S12.GFP.H3.3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCACTGCTTGCTGGCAATCTTC，(SEQ IDNO25)用于擴(kuò)增編碼IRP-2 GFP融合蛋白的DNA，S3.GFP.5.X，ATATCTCGAGCTATGAGCGAGGTGGAGGGGCTG，(SEQ ID NO26)S3.GFP.5.H3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGAAGGTGTGGGTCAGGTC，(SEQ ID NO27)用于擴(kuò)增編碼IRP-1 Sec7區(qū)域GFP融合蛋白的DNA；S3.GFP.P.X ATATCTCGAGCTATGACCTTCTTCAACCCGG，(SEQ ID NO28)和S3.GFP.H3.3用于擴(kuò)增編碼IRP-1 PH區(qū)域GFP融合蛋白的DNA。
另外，用Muta-Gene Phagemid體外突變?cè)噭┖?Version 2，BioRad，Hercules，CA)以及下列寡核苷酸進(jìn)行氨基酸置換突變S3.E1.56A，GTCAATTTTCTGGGCCGCTCCGGGTAGGCGAAA(SEQ ID NO29)用于制備E156A；S3.R279A，TGTGAGGATAAACCAGGCCCGCTTCCACGTCTTC(SEQ ID NO30)用于制備R279A。用引物S3.GFP.Xho5和S3.GFP.H3.3對(duì)突變的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，用于GFP融合蛋白制備。
PCR產(chǎn)物連接至PCEP4/GFP的Xho I和Hind III位點(diǎn)。從大腸桿菌XLI Blue轉(zhuǎn)化子中分離的克隆經(jīng)測(cè)序證實(shí)。所有表達(dá)載體均設(shè)計(jì)成編碼IRP/GFP融合蛋白，其中GFP位于融合蛋白的氨基端。用電轉(zhuǎn)化法將表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染至JY-8細(xì)胞，并用潮霉素B(0.5mg/ml，Calbiochem，San Diego，CA)進(jìn)行篩選。
另外，還制備了Sec7或PH區(qū)域氨基酸置換的IRP-1 GFP融合蛋白。選擇出了第156位谷氨酸被丙氨酸置換的E156A，這是基于一種Arabidopsis蛋白EMB30的Sec7區(qū)域的這種突變對(duì)細(xì)胞粘附的影響而進(jìn)行的[Shevell等，《細(xì)胞》第77卷1051-1062頁(yè)(1994)]。同樣，PH區(qū)域的另一置換，R279/A，也是基于BTK PH區(qū)域的突變?cè)斐蒟-染色體連鎖性無丙種球蛋白血癥(XLA)[Yao等，《(美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)展》91卷，9175-9179頁(yè)(1994)]而選擇的，這種置換可能在PKC和[Yao等，《美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)展》91卷，9175-9179頁(yè)(1994)]和肌醇1，3，4，5-四磷酸(IP4)結(jié)合[Fukuda，等《生物與化學(xué)雜志》271卷30303-30306頁(yè)(1996)中有重要作用。本發(fā)明還構(gòu)建了IRP-1的Sec7區(qū)域或PH區(qū)域與GFP融合的截短物。
免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞均表達(dá)IRP/GFP融合蛋白，且表達(dá)水平相近。為證實(shí)融合蛋白的表達(dá)，用針對(duì)IRP-1，B2-1，IRP PH區(qū)域和GFP的特異性抗體對(duì)經(jīng)去污劑裂解的JY-8細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。所有GFP融合蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上的遷移率與預(yù)測(cè)的一致。另外，融合蛋白除與適當(dāng)?shù)腎RP-1，B2-1或PH區(qū)域特異性單克隆抗體結(jié)合外，也與GFP抗體結(jié)合。在JY裂解物上也檢測(cè)到了內(nèi)源性IRP-1和B2-1。幾項(xiàng)免疫印跡的結(jié)果提示，所有七種融合蛋白的表達(dá)水平均高于內(nèi)源性IRP-1和B2-1至少十倍。
整合素依賴性細(xì)胞粘附可由不同刺激物所誘導(dǎo)[Diamond和Springer，等《現(xiàn)代生物學(xué)觀點(diǎn)》第4卷，506-517頁(yè)(1994)]。已知誘導(dǎo)粘附的刺激物包括G蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體激活劑，比如白細(xì)胞介素-8，或PKC激活劑，比如PMA。這些刺激物以增強(qiáng)或穩(wěn)定整合素依賴性粘附的方式來活化可能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架排列和整合素成簇的信號(hào)傳遞途徑。趨化因子及激活劑，如PMA，在體外實(shí)驗(yàn)中常規(guī)用于增強(qiáng)粘附或確定粘附的最大水平。
測(cè)定IRP/GFP融合蛋白與ICAM-1或VCAM-1結(jié)合的粘附實(shí)驗(yàn)在96孔Easy Wash板(Corning)上進(jìn)行，應(yīng)用一種改良的Morla方法[Morla等，《自然》367卷193-196頁(yè)(1994)]。檢測(cè)孔用溶于50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)的50μl ICAM-1/Fc(5μg/ml)或VCAM-1/Fc(2μg/ml)包被。一些孔用一種CD18單克隆抗體(122F12C，ICOS公司)包被來進(jìn)行加入細(xì)胞結(jié)合或牛血清白蛋白封閉的100％定量，以便檢測(cè)背景結(jié)合量。檢測(cè)板用溶于PBS的1％的牛血清白蛋白在室溫封閉1小時(shí)。洗滌后加入含有或不含有PMA(20ng/ml)或IL-8(25ng/ml)的粘附緩沖液(5％胎牛血清，5mM Kcl，150mM NaCl，1mM MgCl2，1mM CaCl220mM HEPES，10mM D-葡萄糖)200μl。然后將(100μl，5×106/ml)JY-8細(xì)胞加至每孔，在37℃，5％CO2的條件下孵育5至30分鐘。粘附的細(xì)胞用加入50μl 10％戊二醛溶液的方法加以固定，并用0.5％結(jié)晶紫(SIGMA)溶液染色。洗滌后，加70％乙醇，在570nm處用SPECTRmaxTM250 Microplate SpectrophotometerSystem(Molecular-Devices)測(cè)定光吸收對(duì)粘附的細(xì)胞進(jìn)行定量。粘附細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)用下列公式計(jì)算
檢測(cè)了在無任何刺激的靜止?fàn)顟B(tài)(基礎(chǔ)水平結(jié)合)下以及在IL-8或PMA刺激狀態(tài)下JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞與固定的ICAM-1或VCAM-1的粘附。與基礎(chǔ)水平結(jié)合相比較，只表達(dá)GFP的JY-8細(xì)胞(對(duì)照)在IL-8存在的情況下，與ICAM-1的結(jié)合增高3-4倍，與VCAM-1的結(jié)合增高2倍。IL-8誘導(dǎo)的與VCAM-1的粘附在5分鐘時(shí)已很明顯，然而，5分鐘到30分鐘之間基礎(chǔ)結(jié)合水平的增高使得有刺激和無刺激之間結(jié)合的差別降低。隨后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30分鐘。PMA處理導(dǎo)致與ICAM-1和VCAM-1的粘附增加4倍以上。過度表達(dá)IRP-1的JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)于表達(dá)相同或更高水平GFP的對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其與ICAM-1的結(jié)合降低了40～50％。這種降低在基礎(chǔ)水平和IL-8刺激的粘附很明顯，而在PMA誘導(dǎo)的粘附不明顯。在IL-8刺激的條件下過度表達(dá)IRP-1的JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞與VCAM-1的結(jié)合降低了約40％，但在基礎(chǔ)或PMA刺激的條件下沒有降低。這些結(jié)果提示，IRP-1優(yōu)先對(duì)趨化因子而非PMA刺激的粘附發(fā)揮影響，并且IRP-1過度表達(dá)也不導(dǎo)致細(xì)胞全部失去粘附能力。
為明確IRP-1不同的區(qū)域?qū)φ掣降囊种谱饔?，?duì)表達(dá)氨基酸置換和缺失突變體的JY-8細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。Sec7和PH區(qū)域氨基酸的置換阻斷了IRP-1過度表達(dá)對(duì)粘附的作用。表達(dá)IRP-1 Sec7區(qū)域突變E156/A和PH區(qū)域突變R279/A的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)合ICAM-1和VCAM-1的水平相當(dāng)于表達(dá)GFP的JY-8細(xì)胞。另外，IRP-1 Sec7或PH區(qū)域各自都不能象野生型IRP-1一樣降低與ICAM-1或VCAM-1的結(jié)合。因此，Sec7和PH區(qū)域一起發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)IL-8刺激的與ICAM-1和VCAM-1的結(jié)合。
除IRP-1之外，也檢測(cè)了IRP-2和B2-1過度表達(dá)對(duì)JY-8粘附的影響。與GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，過度表達(dá)IRP-2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞與ICAM-1的基礎(chǔ)水平結(jié)合或與ICAM-1和VCAM-1的IL-8誘導(dǎo)的結(jié)合呈現(xiàn)輕微下降，約為20％。相反，過度表達(dá)B2-1的轉(zhuǎn)染細(xì)胞IL-8刺激誘導(dǎo)的與ICAM-1的結(jié)合與對(duì)照水平相當(dāng)，但與VCAM-1的結(jié)合增加了大約50％。因此，在IL-8刺激的與VCAM-1的粘附中對(duì)B2-1過度表達(dá)的作用與對(duì)IRP-1，IRP-2的作用恰好相反，并且對(duì)α4β7/VCAM-1相互作用是選擇性的。
通過IRP的過度表達(dá)調(diào)節(jié)JY-8細(xì)胞與ICAM-1和VCAM-1的粘附不能歸因于細(xì)胞表面αLβ2或α4β7水平的改變。相對(duì)于表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，過度表達(dá)IRP的不同JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間αLβ2或α4β7的表達(dá)量差別甚小。過度表達(dá)IRP-1 Sec7的JY-8細(xì)胞表達(dá)α4β7呈中度下降，但這些細(xì)胞并未顯示與VCAM-1粘附性的下降。
實(shí)例6α4β7整合素可以介導(dǎo)流體狀態(tài)下淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞配體VCAM-1和MadCAM-1的貼附及滾動(dòng)粘附[Berlin等，同上(1995)]。為明確是否IRP表達(dá)對(duì)α4β7介導(dǎo)的細(xì)胞貼附及滾動(dòng)粘附有影響，定量研究了在流體狀態(tài)下JY轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合[Berlin等，同上(1995)]。另外，在測(cè)定了靜態(tài)粘附后又測(cè)定流體狀態(tài)下的結(jié)合，以明確IRP表達(dá)所引起的α4β7親合力可能的改變。
用含有全長(zhǎng)IRP-1(JYIRP-1)、IRP-2(JYIRP-2)或B2-1(JYB2-1)編碼序列或?qū)φ蛰d體DNA(JYVEC)對(duì)表達(dá)內(nèi)源性α4β7的JY細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并將轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于包含固定化的VCAM-1/免疫球蛋白(VCAM-1/Ig)嵌合蛋白的環(huán)流系統(tǒng)(flow system loop)中[Vonderheide等，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》125卷，215-222(1994)]。初始流動(dòng)速率為3達(dá)因/cm2，維持1分鐘。隨后的5分鐘內(nèi)，流速降至1.5達(dá)因/cm2，在此期間，JYVEC轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁和滾動(dòng)粘附能力，JYB2-1也呈輕度貼壁及滾動(dòng)粘附(圖2)。轉(zhuǎn)染IRP-1或IRP-2的細(xì)胞JYIRP-1和JYIRP-2不貼壁或極少貼附。
隨后1分鐘，停止流動(dòng)，在固定的配體存在下對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行孵育，這一時(shí)間不足以使JYIRP-1/VCAM-1或JYIRP-2/VCAM-1結(jié)合。上述靜態(tài)結(jié)合期過后，流速逐漸增高，在4.5分鐘之內(nèi)由1.5達(dá)因/cm2調(diào)至9達(dá)因/cm2。當(dāng)流速達(dá)到3達(dá)因/cm2時(shí)，JYB2-1和JYVEC的結(jié)合都降低(圖2)。兩種蛋白的結(jié)合以相似程度降低說明IRP-3與VEC具有相似的結(jié)合親合力。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，IRP-1和IRP-2的表達(dá)阻斷了流體狀態(tài)及短期靜態(tài)下α4β7與VCAM-1結(jié)合的能力。然而，B2-1的表達(dá)，似乎只降低貼壁和滾動(dòng)粘附的效率。
為了明確IRP-1和IRP-2表達(dá)對(duì)內(nèi)源性LFA-1與ICAM-1結(jié)合的影響，如上所述轉(zhuǎn)染的JY細(xì)胞用于相似的試驗(yàn)，不同之處是，ICAM-1作為固定的反受體。除JYB2-1細(xì)胞以外，所有的JY轉(zhuǎn)染細(xì)胞在流速1.5達(dá)因/cm2時(shí)發(fā)生貼壁和滾動(dòng)粘附于ICAM-1。然而貼壁效率相對(duì)于α4β7/VCAM-1結(jié)合有所降低(圖3)。1分鐘靜態(tài)結(jié)合后，除JYIRP-1細(xì)胞外，所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞與ICAM-1的粘附顯著增高，JYIRP-1細(xì)胞雖也有增高，但增高程度不大。當(dāng)靜態(tài)結(jié)合后提高流速時(shí)，JYIRP-1，JYB2-1和JYVEC細(xì)胞與ICAM-1的結(jié)合降低。然而，JYIRP-2表現(xiàn)出對(duì)流速升高最能耐受，因?yàn)樵诟哌_(dá)7.5達(dá)因/cm2的流速下檢測(cè)結(jié)合。這些結(jié)果提示B2-1表達(dá)阻斷了流體狀態(tài)下LFA-1與ICAM-1的貼附；IRP-1的表達(dá)降低了靜止?fàn)顟B(tài)LFA-1/ICAM-1結(jié)合；IRP-2的表達(dá)維持了LFA-1與ICAM-1之間的高親合性結(jié)合。
實(shí)例7用在大腸桿菌中表達(dá)并純化的His標(biāo)記的IRP-1和B2-1免疫小鼠，以制備IRP-1和B2-1特異性單克隆抗體。將IRP-1和B2-1的編碼區(qū)以符合讀框的方式連接到pET15b(Novagen，Madison.WI)中編碼組氨酸標(biāo)志的C末端，所以在大腸桿菌BL211ysS菌株中表達(dá)的IRP-1和B2-1蛋白就是氨基端為組氨酸標(biāo)志的蛋白。按標(biāo)準(zhǔn)程序純化重組蛋白(Qiagen，Chatsworth，CA)。
雜交瘤按Tjoelker等在《生物與化學(xué)雜志》270卷，25481-25487(1995)描述的方法制備。為制備雜交瘤系列200，5只6～12周齡的Balb/c小鼠在第0天采血，然后用大腸桿菌表達(dá)的HisB2-167μg與完全福氏佐劑混合進(jìn)行皮下免疫。第21天，每只小鼠用25μg與不完全福氏佐劑混合的HisB2-1加強(qiáng)免疫一次。第34天采血進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。經(jīng)10％還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的100ngHisB2-1蛋白被轉(zhuǎn)至PVDF上，隨后剪成小條。印跡在室溫用溶于CMF-PBS的3％牛血清白蛋白、0.2％的Tween 20封閉1小時(shí)。免疫前和免疫血清以封閉緩沖液1∶500稀釋，與小條在室溫孵育兩小時(shí)。小條用溶于CMF-PBS的2％Tween 20洗滌三次，然后與山羊抗小鼠(Fc)-HRP孵育1小時(shí)。洗滌4次，然后用Renaissance化學(xué)發(fā)光試劑(NEN)對(duì)小條進(jìn)行曝光。#2413小鼠在45天時(shí)用25μg溶于CMF-PBS的HisB2-1蛋白腹腔內(nèi)注射進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，4天后取脾。
制備雜交瘤系列233，5只6～12周齡的Balb/c小鼠，每只在第0天取血，用大腸桿菌表達(dá)的HisIRP-130μg與完全福氏佐劑混合進(jìn)行皮下免疫。第22天，每只小鼠用10μgHisIRP-1與不完全福氏佐劑混合加強(qiáng)免疫一次，第45天，每只用5μgHisIRP-1與不完全福氏佐劑混合再加強(qiáng)免疫一次。第55天取血用Western印跡檢測(cè)抗HisIRP-1和HisIRP-2抗體。#2520小鼠再在133，134兩天每天用溶于CMF-PBS的50μgHisIRP-1腹腔注射加強(qiáng)免疫，然后第137天于無菌條件下取脾。
下面描述細(xì)胞融合過程。簡(jiǎn)而言之，將脾臟用兩個(gè)顯微鏡載玻片的毛面端進(jìn)行碾磨，以形成單細(xì)胞懸液，碾磨時(shí)玻片須浸于加有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的無血清RPMI 1640(RPMI)(Gibco，Canada)中。細(xì)胞懸液用70目的Nitex細(xì)胞濾過器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)過濾，然后200g離心5分鐘洗滌兩次，重懸于無血清RPM1中。從3只未經(jīng)免疫的Balb/c小鼠體內(nèi)取出的胸腺細(xì)胞也按類似的方法制備。
NS-1骨髓瘤細(xì)胞用含11％FetalClone血清(FBS)(HycloneLaboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI培養(yǎng)并使其在融合前3天內(nèi)保持在對(duì)數(shù)期，NS-1細(xì)胞200g離心5分鐘，接上述的方法洗滌兩遍。洗滌后，每種細(xì)胞懸液都用無血清RPMI培養(yǎng)基調(diào)至10ml體積并計(jì)數(shù)。
按5∶1將脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞混合，離心，吸去上清。振蕩1分鐘彈散細(xì)胞團(tuán)，同時(shí)加入2ml 37℃的PEG 1500(50％濃度，溶于75mMHepes，pH 8.0)(Boehringer Mannheim)。隨后在7分鐘的時(shí)間內(nèi)加入14ml無血清RPMI。另加16ml RPMI，細(xì)胞在200g離心10分鐘。棄去上清液、細(xì)胞重懸于200ml含15％FBS，100μM次黃嘌呤鈉，0.4μM氨基喋呤，16μM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)，25單位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺細(xì)胞/ml的RPMI。將這些細(xì)胞懸液分散至10個(gè)96孔平底組織培養(yǎng)板(Corning，United Kingdom)中，每孔200μl。在篩選前將板中的細(xì)胞更換培養(yǎng)液三至五次，方法是用18G針頭(Becton Dickinson)從每孔中吸去約100μl液體，加入與上述成分類似的培養(yǎng)液，所不同的是IL-6濃度為10單位/ml以及不含胸腺細(xì)胞。
對(duì)融合細(xì)胞200上清的篩選最初是對(duì)免疫原進(jìn)行ELISA，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(fc)檢測(cè)。對(duì)出現(xiàn)最高信號(hào)的30孔上清再用Western分析法對(duì)免疫原進(jìn)行再檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，9個(gè)孔被選作用于進(jìn)一步克隆。這9孔被稱為200A至200I。
融合細(xì)胞233的上清起初是用ELISA法在HisIRP-1和HisB2-1包被的板上檢測(cè)的。與HisIRP-1而非HisB2-1反應(yīng)的融合細(xì)胞孔選用來進(jìn)行進(jìn)一步克隆。
對(duì)這些融合細(xì)胞用含15％FBS，100μM次黃嘌呤鈉、16μM胸腺嘧啶及10單位/mlIL-6的RPMI成功地進(jìn)行了亞克隆。亞克隆時(shí)采用倍比稀釋或有限稀釋，按每孔0.5～1個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞加于96孔板。對(duì)亞克隆平板的孔中細(xì)胞進(jìn)行肉眼計(jì)數(shù)，記錄密度最低的孔中克隆數(shù)目。對(duì)所選孔中的每一克隆，用上述ELISA或Western法進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否有最初融合孔中觀察到的反應(yīng)性?？寺〗Y(jié)束，獲得了細(xì)胞系200A，200B，200F，200H，200G，233E，233G和233K。通過用來源于8個(gè)雜交瘤細(xì)胞系的抗體與IRP-1，IRP-2和B2-1反應(yīng)進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。用Isostrip試劑盒(Boehringer Mannheim)或采用同種型特異性試劑(ZymedLaboratories，South San Francisco，CA)進(jìn)行ELISA鑒定了來自這8個(gè)雜交瘤細(xì)胞系的單克隆抗體的同種型。除200G為IgG2a同種位外，其余抗體均為IgG1。
雜交瘤細(xì)胞系200A，200B和233G保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
233系列單克隆抗體被進(jìn)一步用Western印跡篩選雜交瘤上清來檢定。簡(jiǎn)而言之，用GFP/IRP-1，GFP/IRP-2或GFP/B2-1(參見實(shí)例5)轉(zhuǎn)染的JY-8細(xì)胞用1％CHAPS緩沖液裂解。細(xì)胞于冰上裂解30分鐘，然后12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。上清中加入樣品緩沖液，煮沸樣品4分鐘。樣品經(jīng)8％Novex凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。該膜用含3％牛血清的蛋白的TST(25mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，0.2％Tween-20)封閉1小時(shí)。移去封閉液，換為以結(jié)合緩沖液(含3％BSA的TST)1∶20稀釋的雜交瘤上清液，室溫孵育1小時(shí)。用TST充分洗膜，然后與一種結(jié)合有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠IgG Fc片段(JacksonImmuno Research)在室溫孵育30分鐘。用TST洗滌后，用Renaissance試劑盒(NEN)進(jìn)行ECL檢測(cè)，膜曝光于Hyperfilm(Kodak)。來源于233A，233D，233G，233K和233L的上清都特異性地識(shí)別GFP-Irp-1裂解物中而非GFP-IRP-2或GFP-B2-1裂解物中一個(gè)適當(dāng)大小的77 kDa帶。使用233G的信號(hào)最強(qiáng)。
應(yīng)用與上述同樣的步驟，用Wstern印跡法測(cè)試了純化的200A，200B單克隆抗體從JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物中檢測(cè)GFP-IRP融合蛋白的能力。Western印跡檢測(cè)中，兩種單克隆抗體所用濃度均為1μg/ml。單克隆抗體200A能夠同樣好地識(shí)別GFP-Irp-1，GFP-IRP-2和GFP-B2-1，而200B優(yōu)先識(shí)別GFP-B2-1，對(duì)GFP-Irp-1識(shí)別較弱(小于采用B2-1所見水平的10％)。在另一含表達(dá)IRP-1截短物GFP標(biāo)記的PH區(qū)域的JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物的Western印跡上，200A檢測(cè)到了一個(gè)相當(dāng)于GFP-IRP-1PH區(qū)域截短物的條帶，提示200A識(shí)別IRP-1，IRP-2和B2-1同源的PH區(qū)域中一個(gè)共同的表位。
用ELISA法對(duì)雜交瘤上清與重組蛋白的特異反應(yīng)性進(jìn)行了篩查。另外，特異性通過與含有大腸桿菌表達(dá)的IRP-1，IRP-2和B2-1蛋白的Western印跡的反應(yīng)性來測(cè)定。單克隆抗體200A(與IRP-1，IRP-2和B2-1PH區(qū)域反應(yīng))，233G(與IRP-1反應(yīng))及200B(與B2-1反應(yīng))被用于檢測(cè)JY-8 IRP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP-IRP融合蛋白的表達(dá)水平和大小。
為檢測(cè)JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞整合素表達(dá)水平，細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的間接免疫熒光法，應(yīng)用針對(duì)αLβ2的單克隆抗體TS1/22(ATCC)及針對(duì)α4的單克隆抗體IC/A4.1(ICOS Corporation)進(jìn)行染色。熒光強(qiáng)度用FACS掃描儀通過流式細(xì)胞熒光光度術(shù)定量。
實(shí)例8趨化作用不僅需要初始與底物的粘附和整合素通過在極化細(xì)胞上結(jié)合和脫離的循環(huán)，而且需要整合素從彌漫狀態(tài)到前緣的循環(huán)。為明確IRPs除了作用于靜態(tài)粘附外，是否也影響整合素的其他功能，用趨化細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測(cè)了IRP在趨化作用中發(fā)揮的效應(yīng)。本試驗(yàn)中，JY-8細(xì)胞以整合素和CAM依賴性方式移向有IL-8的部位。
本方法是Schreiner等在《免疫》88卷89-96(1980)所描述的瓊脂糖下細(xì)胞遷移程序的改良。簡(jiǎn)單地說，將6孔板(Falcon)用溶于碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)的ICAM-1/Fc(25μg/ml)或VCAM-1/Fc(10μg/ml)(ICOS Corporation)進(jìn)行包被。用溶于含0.5％BSA(Intergen)的RPMI的1％瓊脂糖鋪板，4℃孵育30分鐘。細(xì)胞用RPMI洗滌，重懸于含0.5％BSA的RPMI，濃度為5×107/ml。用2.5mm凝膠鑿孔器(Pharmacia)在瓊脂糖上打孔，立即加入10μl IL-8(2.5μg/ml)(PeproTech)或細(xì)胞懸液。培養(yǎng)板于37℃，5％CO2下孵育8小時(shí)。加入2％戊二醛固定細(xì)胞。移去瓊脂糖后，用蒸餾水洗滌孔并待其干燥。細(xì)胞移動(dòng)的定量測(cè)定應(yīng)用視頻顯微觀察工作站，后者包括一個(gè)Diaphot顯微鏡(Nikon，Tokyo Japan)，一個(gè)CCD-72視頻攝像機(jī)，和DSP2000數(shù)字處理器(Dage，Michigan City，IN)，及一個(gè)MacintoshNIH成像程序(由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院設(shè)計(jì)，可通過匿名文件傳輸從互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)zippy-nimh.nih.gov網(wǎng)址獲取，或從NationalTechnical Information Service，Springfield，Virginia獲取磁盤，編號(hào)為PB95-500195GEI)。
上面描述了表達(dá)GFP/IRP融合蛋白的JY-8細(xì)胞趨化性的測(cè)定。IRP-1，IRP-2和B2-1過度表達(dá)的JY-8細(xì)胞相對(duì)于表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其依賴ICAM-1和VCAM-1的趨化作用降低。表達(dá)IRP-1 PH區(qū)域氨基酸置換突變體R279/A的轉(zhuǎn)染細(xì)胞趨化作用也降低。然而表達(dá)R279/A較表達(dá)野生型IRP-1降低趨化性的效率低得多。表達(dá)IRP-1 PH區(qū)域也降低其依賴ICAM-1和VCAM-1的趨化性。這些結(jié)果表明，IRP-1PH區(qū)域在IRP-1介導(dǎo)的趨化性降低中發(fā)揮主要的作用。IRP-1 Sec7區(qū)域置換E156A也造成趨化性下降，但較觀察到的過度表達(dá)野生型IRP-1的趨化性降低程度小。IRP-1 Sec7區(qū)域的過度表達(dá)引起依賴ICAM-1的趨化性增高，但依賴VCAM-1的趨化性沒有變化。這些結(jié)果說明，Sec7區(qū)域也有助于趨化作用。因此，IRP-1 Sec7和PH區(qū)域都在α4β7和αLβ2依賴性趨化性遷移中起作用。
正如上面討論的，IRP-1過度表達(dá)對(duì)趨化性的抑制作用通過Sec7(E156/A)和PH(R279/A)區(qū)域的置換被降低，提示象對(duì)粘附一樣，兩個(gè)區(qū)域都參與IRP-1對(duì)趨化作用的調(diào)節(jié)。相對(duì)于野生型，表達(dá)IRP-1R279/A的JY-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞趨化性遷移的增強(qiáng)，以及表達(dá)IRP-1 PH區(qū)域近乎完全阻斷遷移，說明PH區(qū)域在趨化作用中起主要作用。因此IRP-1 PH區(qū)域與磷脂酰肌醇[Harlan等，《生物化學(xué)》34卷，9859-9864頁(yè)，(1995)；Pitcher等，《生物與化學(xué)雜志》270卷，11707-11710(1995)]或異三聚體G蛋白βγ亞單位[Nahadeven等，《生物化學(xué)》，34卷9111-9117頁(yè)(1995)，Touhara等《生物與化學(xué)雜志》269卷，10217-10220(1994)，Pitcher等《生物與化學(xué)雜志》270卷，11707-11710(1995)]之間的相互作用看來是IRPs在趨化作用中發(fā)揮作用至關(guān)重要的。
實(shí)例9用單克隆抗體200B和233G檢測(cè)了IRPs的組織分布。抗體200B優(yōu)先識(shí)別B2-1，而抗體233G特異性識(shí)別IRP-1。
兩種單克隆抗體均以10μg/ml濃度用于免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)人扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)的冰凍切片。6微米厚的切片鋪在Superfrost Plus玻片(VWR)上存于-70℃。用前將玻片從-70℃取出，置于55℃5分鐘。用冰冷的4％對(duì)甲醛固定切片兩分鐘，然后于冷丙酮內(nèi)放置5分鐘，風(fēng)干。切片在含1％BSA，30％正常人血清和5％正常大鼠血清的溶液中室溫封閉30分鐘?？贵w200B或233G加于切片上室溫放置1小時(shí)。用TBS緩沖液洗滌玻片三次除去未結(jié)合的抗體，每次洗滌5分鐘。然后，加入生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠抗體至TBS緩沖液中的各個(gè)切片，室溫孵育30分鐘。用一種ABC-elite試劑盒(Vector labs)檢測(cè)第二抗體，加至所有切片上室溫保持30分鐘。加入DAB底物(Vectorlabs)，浸入水中終止顯色。應(yīng)用1％鋨酸作用5-10秒使顯色增強(qiáng)。玻片放入水中使顯色增強(qiáng)終止。切片用Hematoxylin Gill’s No.2復(fù)染，脫水前用水、酸性乙醇、碳酸鋰洗滌，最后浸入Permount(VWR)。扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)中檢測(cè)到200B和233G染色，但用對(duì)照IgG1抗體未見染色。
兩種抗體在扁桃體的粉膜上皮上顯示很強(qiáng)的標(biāo)記?？磥韮煞N抗體都能標(biāo)記一群成層排列的鱗狀細(xì)胞。200B和233G在扁桃體結(jié)合的不同在于用233G可見次級(jí)濾泡內(nèi)的標(biāo)記。用200B未發(fā)現(xiàn)這種標(biāo)記。在脾臟，兩種抗體看上去在結(jié)合、標(biāo)記紅髓區(qū)個(gè)別細(xì)胞都非常相似。在淋巴結(jié)深皮質(zhì)區(qū)發(fā)現(xiàn)200B抗體與個(gè)別細(xì)胞的結(jié)合，而在深皮質(zhì)區(qū)和近髓的皮質(zhì)區(qū)發(fā)現(xiàn)233G抗體與個(gè)別細(xì)胞結(jié)合。200B的標(biāo)記方式呈點(diǎn)狀，這種標(biāo)記方式雖也可在用233G時(shí)見到，但非常細(xì)微。
實(shí)例10PH區(qū)域存在于70多種功能各異的蛋白中，包括激酶和接頭蛋白。據(jù)報(bào)道PH區(qū)域賦予與G蛋白βγ亞單位、PIP2和PKC結(jié)合的能力。IRP的SEC7基序也存在于除SEC7基序外相互之間無同源性的其他蛋白中，可能有助于分子內(nèi)的相互作用。另外，也可以同樣推測(cè)，IRP的激動(dòng)蛋白/肌球蛋白氨基末端的同源性可能維持其與其他蛋白間的相互作用。與IRP相互作用的蛋白質(zhì)可用下述不同的方法加以鑒定。
本發(fā)明考慮的第一種鑒別方法是雙雜合篩選。雙雜合系統(tǒng)是在酵母中建立的[Chien等，美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)展，第88卷，9578-9582頁(yè)(1991)]，其基于激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)功能重建。具體而言，可通過以下方法來分離與IRP相互作用的蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸用包含報(bào)告基因的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，該報(bào)告基因受一個(gè)啟動(dòng)子的控制，啟動(dòng)子由具有DNA結(jié)合區(qū)域和激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；在宿主細(xì)胞中表達(dá)第一雜合DNA序列，該序列編碼的第一融合蛋白包括部分或全部IRP以及轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；在宿主細(xì)胞中表達(dá)第二雜合DNA序列文庫(kù)，其編碼的第二融合蛋白包括部分或全部推測(cè)的IRP結(jié)合蛋白以及第一融合蛋白中不存在的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；通過檢測(cè)特定的宿主細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因產(chǎn)物的量來檢測(cè)宿主細(xì)胞內(nèi)IRP相互作用蛋白與IRP的結(jié)合；從該特定的宿主細(xì)胞中分離編碼這種相互作用蛋白的第二雜合DNA序列。本方法中優(yōu)選使用一種驅(qū)動(dòng)LacZ報(bào)告基因表達(dá)的LexA啟動(dòng)子，一種包含LexA DNA結(jié)合區(qū)域和GAL4反式激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子以及酵母宿主細(xì)胞。
其他用于鑒定與IRPs相互作用的蛋白的方法包括固定IRPs或一種檢測(cè)蛋白，用非固定結(jié)合的配偶體可檢測(cè)地標(biāo)記，將結(jié)合的配偶體一起孵育并檢測(cè)結(jié)合上的標(biāo)記物量。結(jié)合上的標(biāo)記物表明檢測(cè)蛋白與IRPs相互作用。
另一類鑒定IRP相互作用蛋白的方法包括固定IRPs或其片斷于熒光物質(zhì)包被(或浸滲)的固相支持物上，檢測(cè)蛋白用一種能激發(fā)熒光物質(zhì)的化合物標(biāo)記，將固定的IRPs與標(biāo)記的檢測(cè)蛋白接觸，測(cè)定熒光物質(zhì)的光發(fā)射，根據(jù)檢測(cè)蛋白引起熒光物質(zhì)的光發(fā)射即可將其鑒定為相互作用蛋白。或者，本方法中推測(cè)的相互作用蛋白可以為固定的，而IRPs可以被標(biāo)記。
實(shí)例11本發(fā)明考慮到IRP相互作用的調(diào)節(jié)劑用于降低整合素，特別是β2和/或β7整合素，與細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)配體間的粘附，導(dǎo)致由整合素參與維持的功能的下調(diào)，特別是細(xì)胞生長(zhǎng)、刺激和炎癥過程中的定位。具體而言，考慮到這些調(diào)節(jié)劑在治療炎癥性疾病或自身免疫性疾病中有治療價(jià)值，它們通過減少細(xì)胞，例如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或NK細(xì)胞向炎癥部位的內(nèi)流和降低已經(jīng)存在于這些部位的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性發(fā)揮作用。調(diào)節(jié)劑可能既下調(diào)整合素依賴性粘附，又拮抗整合素的刺激與共刺激活性。因?yàn)檎纤氐膮⑴c具有活化效應(yīng)并且促進(jìn)炎癥，所以整合素調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)劑可能優(yōu)于影響整合素與細(xì)胞外配體(即，封閉抗體或細(xì)胞外配體拮抗劑)結(jié)合的化合物。IRP結(jié)合的調(diào)節(jié)劑可以直接或間接地干擾整合素信號(hào)傳遞途徑。因?yàn)檫^度表達(dá)IRPs的羧基末端PH區(qū)域看來不能引起整合素特異性細(xì)胞粘附下降，這種特異性可能是與激動(dòng)蛋白或SEC7同源的氨基末端序列的功能。因此與這些氨基末端序列結(jié)合的調(diào)節(jié)劑可以以整合素特異性方式作用于細(xì)胞粘附。鑒定調(diào)節(jié)IRP與其他蛋白相互作用的化合物的方法如下。
第一種方法包括用包含報(bào)告基因的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，報(bào)告基因處于一個(gè)啟動(dòng)子控制之下，啟動(dòng)子由具有DNA結(jié)合區(qū)域和激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)第一雜合DNA序列，該序列編碼第一融合蛋白，后者包括IRP的部分或全部及轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)或激活區(qū)域；在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)第二雜合DNA序列，該序列編碼的融合蛋白包括與IRP相互作用的蛋白的全部或部分及第一融合蛋白中不存在的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或DNA激活區(qū)域。在檢測(cè)化合物存在或缺失的情況下，通過檢測(cè)宿主細(xì)胞中報(bào)告基因產(chǎn)物的量，來測(cè)定特定宿主細(xì)胞中相互作用蛋白與IRPs的結(jié)合，并以此估計(jì)檢測(cè)化合物對(duì)IRP與相互作用蛋白間相互作用的效果；與沒有調(diào)節(jié)化合物的情況下報(bào)告基因產(chǎn)物的量相比，檢測(cè)化合物改變報(bào)告基因產(chǎn)物的量，則其可被鑒定為調(diào)節(jié)化合物。本發(fā)明的方法優(yōu)選使用驅(qū)動(dòng)LacZ報(bào)告基因表達(dá)的LexA啟動(dòng)子；包含LexA DNA結(jié)合區(qū)域和GAL4反式激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子和酵母宿主細(xì)胞。
鑒定調(diào)節(jié)IRPs與相互作用蛋白間相互作用的化合物的另一類方法是固定IRPs或一天然的IRP相互作用蛋白，可檢測(cè)地標(biāo)記非固定的結(jié)合配偶體，將結(jié)合配偶體一起孵育，確定檢測(cè)化合物對(duì)結(jié)合上的標(biāo)記物量的影響，其中，在有檢測(cè)化合物的情況下所結(jié)合的標(biāo)記物量較沒有檢測(cè)化合物的情況下結(jié)合的標(biāo)記物量減少就提示檢測(cè)物質(zhì)是一種IRP與相應(yīng)蛋白相互作用的抑制劑。相反，有檢測(cè)化合物的情況下所結(jié)合的標(biāo)記物量較沒有檢測(cè)化合物的情況下結(jié)合的標(biāo)記物量增加提示該推測(cè)的調(diào)節(jié)劑是IRP與相應(yīng)蛋白相互作用的激活劑。
特別地，IRP蛋白是以組氨酸-標(biāo)記的或組氨酸-肯普肽-標(biāo)記的重組蛋白的形式表達(dá)，經(jīng)對(duì)pET15b-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌裂解物用金屬螯合層析樹脂純化。
眾所周知的一種放射性標(biāo)記重組蛋白的方法是將這段肽用一個(gè)肯普肽標(biāo)志對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記?？掀针臉?biāo)志是一段7個(gè)氨基酸的多肽片段，含有一蛋白激酶A(PKA)的磷酸化位點(diǎn)。對(duì)肯普肽標(biāo)記的重組蛋白，就可以通過PKA的作用在肯普肽標(biāo)志部位進(jìn)行放射性標(biāo)記[Mohanraj等，《蛋白表達(dá)與純化》8卷，第2期，175-182頁(yè)(1996)]。
IRPs(非肯普肽標(biāo)記的)用游離125I通過Iodobead方法(Pierce)或用改良的乳酸過氧化物酶/過氧化氫法[《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Harlow和Lane，第9章，第319-358頁(yè)(1988)]進(jìn)行標(biāo)記。放射性標(biāo)記的蛋白脫鹽并貯存于結(jié)合試驗(yàn)緩沖液中，緩沖液為20mMHEPES或20mM pH7.5的磷酸鈉緩沖液，含有150mM或300mM的NaCl，加有或不加有0.05％去污劑(NP-40或Triton-X-100)，以及2mM疊氮化合物作為防腐劑。最終特異放射活性在3～10μCi[125I]/nmolIRP之間。
β2整合素的胞漿蛋白尾(C-尾)作為重組His3E9-標(biāo)記的蛋白在pET15b轉(zhuǎn)化的大腸桿菌或轉(zhuǎn)化的酵母中表達(dá)和純化，或獲得未標(biāo)記的合成肽制劑(Anaspec，Inc.San Jose，CA，Macromolecular Resources，F(xiàn)ort Collins，CO)。
整合素的C-尾溶于pH9.6的碳酸氫鹽緩沖液，濃度為1～100μg/ml，向96孔微量滴定ScintistripTM(Wallac)板每孔加入50～100μl上述溶液使整合素的C-尾固定于板上，4℃過夜孵育。使板干燥，每孔加入350μl溶于結(jié)合試驗(yàn)緩沖液并過濾除菌的1～2％牛血清白蛋白(BSA)，室溫孵育1～2小時(shí)。臨加入IRPs之前用結(jié)合試驗(yàn)緩沖液洗滌板孔3次。
結(jié)合試驗(yàn)的形式既可以是一種競(jìng)爭(zhēng)/抑制結(jié)合試驗(yàn)，也可以是一種飽和結(jié)合試驗(yàn)。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中，放射性標(biāo)記的IRPs用結(jié)合試驗(yàn)緩沖液稀釋至25～100nM，其中還包含一種可能的結(jié)合調(diào)節(jié)劑(未標(biāo)記的IRPs，可溶性C-尾或非特異性對(duì)照多肽，如BSA)。實(shí)驗(yàn)開始，加入100μl標(biāo)記的IRPs/可能的調(diào)節(jié)劑溶液至封閉過的ScintistripTM板孔中(50,000-200,000cpm/孔)，然后室溫(22-24℃)孵育1小時(shí)，用結(jié)合試驗(yàn)緩沖液快速洗滌3-5次終止。飽和結(jié)合試驗(yàn)按相似的方法進(jìn)行，不同的是需對(duì)0.01-0.30μM的總濃度范圍進(jìn)行檢測(cè)，其中放射標(biāo)記的未標(biāo)記的IRP保持1∶20不變。板干后在已校正的Wallac Model1450液閃計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行測(cè)定。用-ScintistripTM檢測(cè)板(包含在G11內(nèi))對(duì)孔間交叉影響進(jìn)行校正，100μl 25-100nM放射性標(biāo)記的IRP被孔中包被的抗-IRP單克隆抗體200A所捕獲，后者以20μg/ml的碳酸氫鹽溶液加至孔中。檢測(cè)板的孵育時(shí)間和條件與上述的結(jié)合試驗(yàn)相同。
用C-尾-包被的孔中放射性標(biāo)記的IRPs計(jì)數(shù)高于BSA包被的孔中的計(jì)數(shù)來測(cè)定結(jié)合。特異性結(jié)合以加入未標(biāo)記的IRP或可溶性C-尾后C-尾包被的孔中的計(jì)數(shù)來測(cè)定。
應(yīng)用碘標(biāo)記的IRP-1所進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)顯示，可能的調(diào)節(jié)劑IRP-1，IRP-1 Sec7區(qū)域，B2-1抑制碘標(biāo)記的IRP-1與固定的His3E9-標(biāo)記的β2C-尾之間的結(jié)合。當(dāng)IRP-1，IRP-1 Sec7區(qū)域，B2-1的濃度在0.001-4μM范圍內(nèi)時(shí)，使碘標(biāo)記的IRP-1與β2C-尾的結(jié)合降低75％。加入對(duì)照肽(BSA)未能降低IRP-1與固定的β2C-尾間的結(jié)合。另外，另一對(duì)照未將β2C-尾固定于BSA封閉過的微量滴度板，只顯示基礎(chǔ)水平的放射性標(biāo)記的IRP-1結(jié)合。
可以改良結(jié)合試驗(yàn)，應(yīng)用其它整合素的IRPs和C-尾，包括但不限于β1，β3和β7。IRPs或C-尾可用[3H]-硼酸氫化鈉，[125I]-Botton-Hunter試劑標(biāo)記，也可以用[35S]代謝標(biāo)記法，蛋白激酶[32P]-標(biāo)記法或其它合適的放射性標(biāo)記交聯(lián)方法。蛋白和肽可以被固定至微量滴度板(Nunc Covalink，Pierce Reactibind，Costar Labcoat，等)或小珠上(SPA或其它)。也可以由熟練的技術(shù)人員調(diào)整孵育時(shí)間及改良緩沖液條件對(duì)結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行改良。另外，試驗(yàn)中所用的多肽可以包括多種合成肽片段，可以用本專業(yè)的技術(shù)人員知道的多種方法制備這些多肽，其中包括cDNA構(gòu)建物的表達(dá)、從自然物中分離和化學(xué)合成。鑒定一種檢測(cè)化合物是調(diào)節(jié)劑要通過將檢測(cè)化合物加至結(jié)合試驗(yàn)體系中來完成。正如上述討論，結(jié)合量的增加或降低提示檢測(cè)化合物是一種IRP調(diào)節(jié)劑。
被認(rèn)為有助于鑒定IRP活性的調(diào)節(jié)劑的其他結(jié)合試驗(yàn)包括測(cè)定IRPs結(jié)合至結(jié)合配偶體(ARFs，磷脂酰肌醇或其它相關(guān)化合物)的檢測(cè)方法。這些試驗(yàn)中，IRPs或其配偶體被固定至微量滴度板或小珠上。在適當(dāng)?shù)臈l件下檢測(cè)有無檢測(cè)化合物時(shí)可檢測(cè)地標(biāo)記的IRP或其結(jié)合配偶體的結(jié)合量。IRP活性的調(diào)節(jié)劑就是能夠增強(qiáng)或降低IRP與其結(jié)合配偶體結(jié)合的化合物。
為測(cè)定IRP與磷脂酰肌醇的結(jié)合，將His-標(biāo)記的IRP-1 PH區(qū)域(5′HA IRP-1 PH)固定于微量滴度板上，方法是，將100μl濃度為20μg/ml溶于pH 9.6的碳酸氫鹽緩沖液的5′HA IRP-1 PH加至板上，4℃孵育約16小時(shí)。然后倒掉，用1-2％人IgG于22℃左右封閉1小時(shí)。用試驗(yàn)緩沖液(25mM Tris pH 7.4，100μM NaCl，0.25％NP-40，0.1％脫氧膽酸鈉，1mM MgCl2，0.5％DTT)洗板3次。向100μl試驗(yàn)緩沖液中加入10納摩爾的3H-肌醇磷酸(IPn)(Du Pont，NEN)以及0-100微摩爾的冷IPn，22℃孵育2小時(shí)。微量滴度板洗滌四次，加入閃爍液。在閃爍計(jì)數(shù)儀中測(cè)定結(jié)合的放射活性以檢測(cè)結(jié)合量。結(jié)果提示，His-標(biāo)記的IRP-1 PH區(qū)域與肌醇(1，3，4，5)四磷酸和肌醇六磷酸(IP6)的結(jié)合高出對(duì)照10倍。IRP與肌醇磷酸之間結(jié)合的調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)可以用將檢測(cè)化合物加至試驗(yàn)體系并檢測(cè)有無檢測(cè)化合物的情況下結(jié)合量的差別的方法來進(jìn)行。
本發(fā)明還考慮了另一種鑒定能調(diào)節(jié)IRP與相互作用的蛋白間結(jié)合的化合物的方法，包括將IRP或其片段固定在包被(或浸滲)了一種熒光物質(zhì)的固相支持物上，用能激發(fā)熒光物質(zhì)的化合物標(biāo)記這種相互作用蛋白，將標(biāo)記的相互作用蛋白在有或無檢測(cè)化合物的情況下與固定化的IRP結(jié)合，測(cè)定熒光物質(zhì)的光發(fā)射，與沒有檢測(cè)化合物的情況下熒光物質(zhì)的光發(fā)射相比，影響熒光物質(zhì)光發(fā)射的檢測(cè)化合物就可被鑒定為調(diào)節(jié)化合物。另外，還可以將IRP相互作用蛋白固定，將IRPs標(biāo)記用于檢測(cè)。
組合文庫(kù)、肽及肽模擬物、合成化學(xué)物質(zhì)、寡核苷酸和天然產(chǎn)物文庫(kù)可用上面提到的方法從中篩選調(diào)節(jié)劑。
實(shí)例12明確確定結(jié)合過程中必需的蛋白部分有助于對(duì)IRPs相互作用調(diào)節(jié)劑的鑒定。通過標(biāo)準(zhǔn)突變技術(shù)進(jìn)行氨基酸置換也用于鑒定這些蛋白的結(jié)合區(qū)域。缺失分析也有助于鑒定結(jié)合區(qū)域，其中可采用PCR方法產(chǎn)生截短形式的蛋白質(zhì)，并且這種缺失對(duì)蛋白的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞不影響其反受體對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。
對(duì)結(jié)合過程中重要蛋白區(qū)域的鑒定使我們能夠?qū)Y(jié)合活性的可能調(diào)節(jié)劑作更為精確和有效的篩選。本發(fā)明設(shè)想到一種高產(chǎn)量的篩選方法用于分析含小分子或肽的巨大文庫(kù)，以及針對(duì)其中一種或全部?jī)煞N結(jié)合配偶物的免疫特異性抗體的文庫(kù)，分析其調(diào)節(jié)β2、β7、β1和/或β3整合素與IRPs之間相互作用的能力以及IRPs與其它一些相互作用蛋白間相互作用的能力。因?yàn)楸景l(fā)明中公開的雙雜合篩選，閃爍值近似測(cè)定(SPA)和免疫學(xué)方法[例如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)]本身不是HTS方法，故可以進(jìn)行調(diào)整用于檢測(cè)所列多種化合物調(diào)節(jié)結(jié)合的能力。SPA和ELISA在這種鑒定過程中特別有用，并可對(duì)其進(jìn)行改良以允許對(duì)所描述的檢測(cè)化合物進(jìn)行高產(chǎn)量的篩選。
盡管本發(fā)明已就具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行調(diào)整或改進(jìn)。因而，本發(fā)明僅由權(quán)利要求書進(jìn)行限定。
序列表(1)總體信息(i)申請(qǐng)人ICOS公司(ii)發(fā)明名稱整合素結(jié)合/信號(hào)傳遞的細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)劑(iii)序列數(shù)目30(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Marshall，O′Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道233 South Wacker，6300 Sears Tower(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵政編碼60606(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名Young J.Suh(B)注冊(cè)號(hào)P-41，377(C)參考/摘要號(hào)27866/33886(ix)電訊信息(A)電話312-474-6300(B)傳真312-474-0448(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1700堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置238…1482(xi)序列描述SEQ ID NO1TCCTAGATGA TCTCGAGAGG CGCAGTGTGC TCTAAAGGCG AGGGCGGTGA GGACGACAGC 60GCCCACTGTG GATTGGACAG TGTCAAAAAG AGGGGCGGTC CCTACTGAAG GGGCGGTTGG 120GCGACGAAGG GAAGAGTCTT TTCAGCGCTG AGGACTGGCG CTGAGGAGGC GGCGGTGGCT 180CCCGGGGCGT TTGAGCGGGC TCACCCGAGC CCGCGGGCCA ACGCGGATCC AGGCCCGACTGGCGGGACCG CCCCGGATTC CCCGCGGGCC TTCCTAGCCG CC ATG GAG GAC GGC294Met Glu Asp Gly1GTC TAT GAA CCC CCA GAC CTG ACT CCG GAG GAG CGG ATG GAG CTG GAG 342Val Tyr Glu Pro Pro Asp Leu Thr Pro Glu Glu Arg Met Glu Leu Glu5 10 15 20AAC ATC CGG CGG CGG AAG CAG GAG CTG CTG GTG 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(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8ATATCTCGAG TCAGTGTCGC TTCGTGGAG29(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9ATATGCTAGC CACCATGGGG TACCCATACG ATGTTCCTGA CTATGCGACG CGTATGGAGG 60AGGACGACAG C71(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度68堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10ATATGTCGAC TCACGCATAG TACAGGAACA TCGTATGGGT ACATACGCGT GTGTCGCTTC 60GTGGAGGA68(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TAATACGACT CACTATAGGG20(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12ATATACGCGT ACTTTCTTCA ATCCAGACCG 30(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13ATATTCTAGA TCAGTGTCGC TTCGTGGAG 29(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14ATATACGCGT ATGGAGGACG GCGTCTATG 29(2)SEQ IDNO15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15ATATGAATTC CACCATGGAC CTGTGCCACC CAG 33(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC 29(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO17ATATACGCGT ACCTTCTTCA ATCCAGAC 28(2)SEQ IDNO18信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO18ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC29(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19ATATACGCGT ATGGACCTGT GCCACCCAG 29(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO20ATATCTCGAG CTATGGAGGA CGGCGTCTAT 30(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝引物”(xi)序列描述SEQ ID NO21ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGGGCTGCTC CTGCTTC 37(2)SEQ IDNO22信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO22ATATCTCGAG CTATGGAGGA GGACGACAGC TAC 33(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO23ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGTGTCGCTT CGTGGAGG 38(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO24ATATCTCGAG CTATGGACCT GTGCCACCCA G 31(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO25ATATAAGCTT GCGGCCGCTC ACTGCTTGCT GGCAATCTTC 40(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO26ATATCTCGAG CTATGAGCGA GGTGGAGGGG CTG 33(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO27ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGAAGGTGTG GGTCAGGTC 39(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO28ATATCTCGAG CTATGACCTT CTTCAACCCG G 31(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO29GTCAATTTTC TGGGCCGCTC CGGGTAGGCG AAA 33(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO30TGTGAGGATA AACCAGGCCC GCTTCCACGT CTTC3權(quán)利要求
1.一種編碼SEQ ID NO2中列出的人IRP-1氨基酸序列的純化和分離的多核苷酸。
2.一種編碼SEQ ID NO4中列出的人IRP-2氨基酸序列的純化和分離的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1或2的多核苷酸，其為DNA分子。
4.權(quán)利要求3的DNA，其選自cDNA、基因組DNA、部分合成DNA和合成DNA。
5.一種包括SEQ ID NO1中列出的人IRP-1多肽編碼區(qū)序列的DNA分子。
6.一種包括SEQ ID NO3中列出的人IRP-2多肽編碼區(qū)序列的DNA分子。
7.一種編碼IRP多肽的DNA分子，選自a)SEQ ID NO1中列出的人IRP-1 DNA；b)SEQ ID NO3中列出的人IRP-2 DNA；c)在嚴(yán)緊條件下與(a)中蛋白編碼區(qū)的非編碼鏈雜交的DNA分子；及d)在嚴(yán)緊條件下與(b)中蛋白編碼區(qū)的非編碼鏈雜交的DNA分子。
8一種包括權(quán)利要求1、2或7的DNA的DNA表達(dá)構(gòu)建物。
9.一種以權(quán)利要求1、2或7的DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
10.一種制備IRP多肽的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞并由宿主細(xì)胞或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離IRP多肽。
11.一種包括SEQ ID NO2中列出的人IRP-1氨基酸序列的純化和分離的多肽。
12.一種包括SEQ ID NO4中列出的人IRP-2氨基酸序列的純化和分離的多肽。
13.一種特異性與IRP-1結(jié)合的抗體。
14.一種特異性與IRP-2結(jié)合的抗體。
15.權(quán)利要求13或14的抗體，其為單克隆抗體。
16.一種抗獨(dú)特型抗體，其特異性與權(quán)利要求13或14的單克隆抗體結(jié)合。
17.一種產(chǎn)生權(quán)利要求13或14的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
18.雜交瘤細(xì)胞系200A(ATCC HB-12331)。
19.一種由權(quán)利要求18的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
20.雜交瘤細(xì)胞系200B(ATCC HB-12332)。
21.一種由權(quán)利要求20的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
22.雜交瘤細(xì)胞系233G(ATCC HB-12333)。
23.一種由權(quán)利要求22的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
24.一種鑒定調(diào)節(jié)IRP-1和β整合素亞單位間結(jié)合的化合物的方法，包括步驟a)讓IRP-1或其片段與β整合素亞單位或其片段接觸；b)測(cè)定IRP-1或其片段與β整合素亞單位或其片段間結(jié)合；c)在存在檢測(cè)化合物時(shí)測(cè)定IRP-1或其片段與β整合素亞單位或其片段間結(jié)合；d)比較步驟(b)中測(cè)量值與步驟(c)中測(cè)量值，其中步驟(c)中結(jié)合下降表明檢測(cè)化合物為結(jié)合抑制劑，而步驟(c)中結(jié)合升高表明檢測(cè)化合物為結(jié)合激活劑。
25.一種鑒定調(diào)節(jié)IRP-2和β整合素亞單位間結(jié)合的化合物的方法，包括步驟a)讓IRP-2或其片段與β整合素亞單位或其片段接觸；b)測(cè)定IRP-2或其片段與β整合素亞單位或其片段間結(jié)合；c)在存在檢測(cè)化合物時(shí)測(cè)定IRP-2或其片段與β整合素亞單位或其片段間結(jié)合；d)比較步驟(b)中測(cè)量值與步驟(c)中測(cè)量值，其中步驟(c)中結(jié)合下降表明檢測(cè)化合物為結(jié)合抑制劑，而步驟(c)中結(jié)合升高表明檢測(cè)化合物為結(jié)合激活劑。
26.一種鑒定調(diào)節(jié)IRP-1和ADP核糖基化因子(ARF)間結(jié)合的化合物的方法，包括步驟a)讓IRP-1或其片段與ARF或其片段接觸；b)測(cè)定IRP-1或其片段與ARF或其片段間結(jié)合；c)在存在檢測(cè)化合物時(shí)測(cè)定IRP-1或其片段與ARF或其片段間結(jié)合；d)比較步驟(b)中測(cè)量值與步驟(c)中測(cè)量值，其中步驟(c)中結(jié)合下降表明檢測(cè)化合物為結(jié)合抑制劑，而步驟(c)中結(jié)合升高表明檢測(cè)化合物為結(jié)合激活劑。
27.一種鑒定調(diào)節(jié)IRP-2和ADP核糖基化因子(ARF)間結(jié)合的化合物的方法，包括步驟a)讓IRP-2或其片段與ARF或其片段接觸；b)測(cè)定IRP-2或其片段與ARF或其片段間結(jié)合；c)在存在檢測(cè)化合物時(shí)測(cè)定IRP-2或其片段與ARF或其片段間結(jié)合；d)比較步驟(b)中測(cè)量值與步驟(c)中測(cè)量值，其中步驟(c)中結(jié)合下降表明檢測(cè)化合物為結(jié)合抑制劑，而步驟(c)中結(jié)合升高表明檢測(cè)化合物為結(jié)合激活劑。
28.一種鑒定調(diào)節(jié)IRP-1和磷脂酰肌醇(PI)間結(jié)合的化合物的方法，包括步驟a)讓IRP-1或其片段與PI接觸；b)測(cè)定IRP-1或其片段與PI間結(jié)合；c)在存在檢測(cè)化合物時(shí)測(cè)定IRP-1或其片段與PI間結(jié)合；d)比較步驟(b)中測(cè)量值與步驟(c)中測(cè)量值，其中步驟(c)中結(jié)合下降表明檢測(cè)化合物為結(jié)合抑制劑，而步驟(c)中結(jié)合升高表明檢測(cè)化合物為結(jié)合激活劑。
29.一種鑒定調(diào)節(jié)IRP-2和磷脂酰肌醇(PI)間結(jié)合的化合物的方法，包括步驟a)讓IRP-2或其片段與PI接觸；b)測(cè)定IRP-2或其片段與PI間結(jié)合；c)在存在檢測(cè)化合物時(shí)測(cè)定IRP-2或其片段與PI間結(jié)合；d)比較步驟(b)中測(cè)量值與步驟(c)中測(cè)量值，其中步驟(c)中結(jié)合下降表明檢測(cè)化合物為結(jié)合抑制劑，而步驟(c)中結(jié)合升高表明檢測(cè)化合物為結(jié)合激活劑。
30.一種分離編碼與IRP-1結(jié)合的蛋白的多核苷酸的方法，包括步驟a)以含有一個(gè)報(bào)告基因的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，該報(bào)告基因處于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子由具有DNA結(jié)合區(qū)域和激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；b)在該宿主細(xì)胞中表達(dá)第一雜合DNA序列，其編碼第一融合蛋白，該蛋白包括部分或全部IRP-1及所說轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；c)在該宿主細(xì)胞中表達(dá)第二雜合DNA序列文庫(kù)，其中序列編碼第二融合蛋白，該蛋白包括部分或全部推定的IRP-1結(jié)合蛋白及第一融合蛋白中不存在的所說轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；d)通過測(cè)定所說的宿主細(xì)胞中報(bào)告基因產(chǎn)物的量來測(cè)定特定宿主細(xì)胞中IRP-1結(jié)合蛋白與IRP-1的結(jié)合；及e)由所說的特定宿主細(xì)胞中分離編碼IRP-1結(jié)合蛋白的第二雜合DNA序列。
31.一種分離編碼與IRP-2結(jié)合的蛋白的多核苷酸的方法，包括步驟a)以含有一個(gè)報(bào)告基因的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，該報(bào)告基因處于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子由具有DNA結(jié)合區(qū)域和激活區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；b)在該宿主細(xì)胞中表達(dá)第一雜合DNA序列，其編碼第一融合蛋白，該蛋白包括部分或全部IRP-2及所說轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；c)在該宿主細(xì)胞中表達(dá)第二雜合DNA序列文庫(kù)，其中序列編碼第二融合蛋白，該蛋白包括部分或全部推定的IRP-2結(jié)合蛋白及第一融合蛋白中不存在的所說轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域；d)通過測(cè)定所說的宿主細(xì)胞中報(bào)告基因產(chǎn)物的量來測(cè)定特定宿主細(xì)胞中IRP-2結(jié)合蛋白與IRP-2的結(jié)合；及e)由所說的特定宿主細(xì)胞中分離編碼IRP-2結(jié)合蛋白的第二雜合DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼整合素調(diào)節(jié)蛋白多肽的純化的和分離的多核苷酸,這些多肽調(diào)節(jié)β
文檔編號(hào)C12R1/91GK1195374SQ97190719
公開日1998年10月7日 申請(qǐng)日期1997年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月15日
發(fā)明者D·E·斯套頓, B·P·利普斯基 申請(qǐng)人:艾科斯有限公司