專利名稱：用于定量測(cè)定1,5－失水葡糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于酶促測(cè)定1，5-失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法、在這種方法中所用的試劑、適宜用于1，5-失水葡糖醇酶促測(cè)定方法的新海藻糖酶以及產(chǎn)生新海藻糖酶的方法。1，5-失水葡糖醇濃度的測(cè)定在糖尿病的診斷中是有用的。
背景技術(shù)：
已知1，5-失水葡糖醇存在于人腦脊髓液和血漿中，在患某些疾病(尤其是糖尿病)的患者中1，5-失水葡糖醇的水平有變化，因此它作為糖尿病的一個(gè)診斷標(biāo)志是重要的。先前用于1，5-失水葡糖醇定量測(cè)定的方法是包括使用特定的分析儀器(如氣相色譜)的方法、使用特異性地氧化1，5-失水葡糖醇的酶的方法(日本出版的未審查的專利申請(qǐng)79780/87)以及一種包括下列步驟的方法通過使用各種酶把在樣品中的物質(zhì)(如葡萄糖)轉(zhuǎn)化成為其它物質(zhì)，然后通過使用吡喃糖氧化酶或L-山梨糖氧化酶測(cè)定留在樣品中1，5-失水葡糖醇的量(日本出版的未審查的專利申請(qǐng)185397/88)。
通常，儀器分析(如液相色譜和氣相色譜)要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，并需要昂貴的特定儀器，同時(shí)是非常耗時(shí)的；因此，這種方法不適合于大量樣品的分析。在使用特異性地作用于1，5-失水葡糖醇的酶的方法中，不易于制備酶并將其用于適當(dāng)?shù)臋z測(cè)系統(tǒng)。使用吡喃糖氧化酶的方法的缺陷在于吡喃糖氧化酶的底物特異性較低。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及下列方面一種用于定量測(cè)定樣品中1，5-失水葡糖醇的方法，該方法包括使樣品與活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然后測(cè)定所說酶的活性；定量測(cè)定1，5-失水葡糖醇的試劑，該試劑包括活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測(cè)定由所說酶活性形成的物質(zhì)的試劑；對(duì)1，5-失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值的新海藻糖酶，該海藻糖酶具有下列理化性質(zhì)(1)作用它催化如通式(I)所示的反應(yīng)，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖海藻糖+水—————→2D-葡萄糖 (I)(2)底物特異性它特異性地作用于海藻糖，(3)底物親和對(duì)海藻糖的Km值是6.7mM，(4)最適pH和穩(wěn)定pH值酶的最適pH是5-6，在50℃處理30分鐘時(shí)，酶在5-10的pH范圍中是穩(wěn)定的，(5)最適溫度和耐熱性最適溫度在45℃左右，在pH5.0下處理30分鐘時(shí)，酶在達(dá)到50℃時(shí)是穩(wěn)定的，(6)抑制劑可被金屬螯合劑(如，1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸(下文中稱為EDTA)和2，2-二吡啶)、SH封閉劑(如p-汞苯甲酸和碘乙酰胺、羥胺、硫酸鎳等)抑制，(7)分子量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得的酶的亞單位的分子量是大約90,000，通過凝膠過濾方法測(cè)得的酶的分子量是大約400,000；和一種產(chǎn)生具有上述理化性質(zhì)的新海藻糖酶的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于諾卡氏菌屬并具有產(chǎn)生所說海藻糖酶能力的微生物，并從培養(yǎng)物回收所說海藻糖酶。
本發(fā)明可用于測(cè)定任何包含1，5-失水葡糖醇的樣品，例如，生物樣品如腦脊髓液、血清、血漿和尿樣以及這些樣品的處理液體。
作為活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶，任何來源于昆蟲、動(dòng)物、植物、微生物等的酶都可使用，只要其活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制。優(yōu)選的實(shí)例是催化作為底物的海藻糖的酶，如海藻糖酶和海藻糖磷酸化酶。這些酶可作為商業(yè)產(chǎn)品獲得，或可通過培養(yǎng)微生物制備。
產(chǎn)生海藻糖酶的微生物包括屬于鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬或紅球菌屬的微生物。
屬于鏈霉菌屬的微生物的例子是金霉素鏈霉菌ATCC 10762和色褐鏈霉菌ATCC 23896。屬于諾卡氏菌屬是微生物的例子是南非諾卡氏菌ATCC6865。屬于紅球菌屬的微生物的例子是圓紅球菌ATCC 14898、圓紅球菌ATCC 15076和玫瑰色紅球菌ATCC 17895。
產(chǎn)生海藻糖磷酸化酶的微生物包括屬于鏈孢菌屬或動(dòng)孢囊菌屬的微生物。
屬于鏈孢菌屬的微生物的例子是銹色鏈孢菌FERM BP-4329。屬于動(dòng)孢囊菌屬的微生物的例子是桔橙動(dòng)孢囊菌ATCC 29727。
在下列文獻(xiàn)中描述了以上微生物所屬的種的菌學(xué)性質(zhì)。金霉素鏈霉菌Bergeys細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)，vol.4，P.2478(1989)色褐鏈霉菌Bergey s細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)，vol.4，P.2472(1989)南非諾卡氏菌Bergey s細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)，vol.2，P.1469(1986)和vol.4，P.2359(1989)圓紅球菌Bergeys細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)，vol.2，P.1479(1986)和vol.4，P.2369(1989)玫瑰色紅球菌Bergeys細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)，vol.4，P.2365-2367(1989)銹色鏈孢菌Int.J.Sys t.Bacteriol.，36，512-517(1986)桔橙動(dòng)孢囊菌Bergeys細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)，vol.4，P.2504-2506(1989)用于培養(yǎng)上述微生物的方法和純化由它們產(chǎn)生的酶的方法描述如下。
對(duì)于產(chǎn)生海藻糖酶的微生物(例如，屬于鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬或紅球菌屬的微生物)和產(chǎn)生海藻糖磷酸化酶的微生物(例如，屬于鏈孢菌屬或動(dòng)孢囊菌屬的微生物)的培養(yǎng)，使用培養(yǎng)放線菌、細(xì)菌等的常規(guī)方法。
作為培養(yǎng)基，可以使用天然或合成培養(yǎng)基，只要它包含碳源、氮源、無機(jī)鹽等。
作為碳源，可以使用碳水化合物、糖醇、有機(jī)酸等。碳水化物的例子是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、淀粉和糖蜜。糖醇的例子是甘油、山梨醇和甘露醇。有機(jī)酸的例子是醋酸、乳酸、乙酰甲酸和檸檬酸。
作為氮源，可以使用無機(jī)或有機(jī)銨鹽、含氮有機(jī)物質(zhì)等。無機(jī)或有機(jī)銨鹽的例子是氨、氯化銨、碳酸銨、磷酸銨和乙酸銨。含氮有機(jī)物質(zhì)的例子是尿素、氨基酸、胨、NZ-胺、肉膏、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物和酵母抽提物。
作為無機(jī)鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵等。
作為培養(yǎng)方法，優(yōu)選地使用液體培養(yǎng)，具體來說是浸沒攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)通過靜態(tài)培養(yǎng)或充氣和攪拌在pH值6.0至8.0于25至37℃的溫度下進(jìn)行1至7天。
通過按照上述的方式培養(yǎng)微生物，形成了主要在微生物細(xì)胞中的海藻糖酶或海藻糖磷酸化酶。從培養(yǎng)物中回收海藻糖酶或海藻糖磷酸化酶可以，例如，按下列方式進(jìn)行。
在完成培養(yǎng)之后，通過離心或過濾從培養(yǎng)物中收集微生物細(xì)胞，然后通過超聲處理或類似的方法破壞細(xì)胞以獲得粗制酶提取物。按照通常用于酶純化的方法(如鹽析、用有機(jī)溶劑沉淀、透析、離子交換色譜法、凝膠過濾和凍干法)處理粗制酶提取物，由此可獲得純化的海藻糖酶或純化的海藻糖磷酸化酶。
本發(fā)明的新海藻糖酶的理化性質(zhì)如下。
(1)作用本發(fā)明的酶催化如通式(I)所示的反應(yīng)，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖海藻糖+水—————→2D-葡萄糖 (I)(2)底物特異性和抑制特異性對(duì)100mM磷酸緩沖液(pH5.5)中的1.75mM的底物濃度測(cè)定了酶對(duì)各種底物的活性。結(jié)果作為相對(duì)活性在表1中顯示，把對(duì)海藻糖的活性定義為100。
表1糖 相對(duì)活性(％)海藻糖 100海藻糖胺 0.5曲二糖0Nigerose 0麥芽糖0乳糖 0蔗糖 0從表1中可明顯地看出，所述酶特異性地作用于海藻糖。本發(fā)明也使用海藻糖作為底物測(cè)定了所述酶對(duì)1.75mM各種糖的抑制特異性。結(jié)果在表2中顯示。
表2糖 抑制率(％)1，5-失水葡糖醇80.7曲二糖 0Nigerose 0麥芽糖 0乳糖 0蔗糖 0(3)底物親和性在pH5.5時(shí)通過Lineweaver-Burk圖[J.Am.Chem.、Sec.，56，658(1934)]測(cè)定的所述酶對(duì)海藻糖的Km值是6.7mM。
(4)抑制親和性在pH5.5時(shí)通過Lineweaver-Burk圖測(cè)定的所述酶對(duì)1，5-失水葡糖醇的Ki值是0.33mM。
(5)最適pH使用pH5.0-8.0的磷酸緩沖液測(cè)定酶活性以確定最適pH值。獲得了如

圖1所示的pH-活性曲線。酶的最適pH是5-6。
(6)pH穩(wěn)定性在50℃下于pH2.6-12.0的通用緩沖液中(Johnson-Lindsay緩沖液，生物化學(xué)基本方法，vol.6，Maruzen)處理30分鐘之后，測(cè)定了殘留的酶活性。如圖2所示，酶在5-10的pH值范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。
(7)耐熱性通過把酶于不同的溫度下在pH5.0的磷酸緩沖液中保持30分鐘并測(cè)定剩余的活性來研究酶的耐熱性。如圖3所示，酶在達(dá)50℃時(shí)是穩(wěn)定的。
(8)最適溫度使用pH5.5的磷酸緩沖液測(cè)定酶的最適溫度。如圖4所示，最適溫度在45℃左右。
(9)抑制劑和金屬離子的影響在1mM的濃度下研究各種金屬螯合劑、酶抑制劑和金屬離子對(duì)酶的影響。結(jié)果如表3中所示。
表3化合物 抑制率(％)二乙基二硫代氨基甲酸 51.02，2-二吡啶 60.0EDTA 67.61，10-菲繞啉 88.5p-汞苯甲酸94.7N-乙基馬來酰亞胺21.9碘乙酰胺83.6N-溴代琥珀酰亞胺23.4羥胺 81.2疊氮化鈉22.8CoCl220.4NiSO462.1
ZnSO453.4BaCl240.7酶可被金屬螯合劑(如，1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸和2，2-二吡啶)、SH封閉劑(如p-汞苯甲酸和碘乙酰胺、羥胺、硫酸鎳等)抑制。
(10)分子量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得的酶的亞單位的分子量是大約90,000，通過使用高效液相色譜的凝膠過濾方法測(cè)得的酶的分子量是大約400,000。
(11)均一性通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳酶作為單一的帶分離。也就是說，蛋白質(zhì)的單一帶通過在Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)中電泳60分鐘、其后通過以考馬斯染色液染色觀察到。
(12)酶活性的測(cè)定方式酶活性以下列方式測(cè)定。
1)試劑(i)底物溶液把海藻糖溶解在100mM磷酸緩沖液(pH5.5)中以形成12.5mM的濃度。
(ii)生色劑把葡糖氧化酶(Toyobo有限公司，等級(jí)II)、過氧物酶(Toyobo有限公司，等級(jí)III)、4-氨安替比林和酚溶解在水中以形成分別為0.04mg/ml、1.2mM和21mM的最終濃度。
2)步驟向1ml的底物溶液添加0.02ml的酶溶液，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行30分鐘。反應(yīng)通過在100℃下加熱3分鐘停止。向反應(yīng)混合物添加1ml生色劑，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行20分鐘，其后測(cè)定在500nm的吸光度。通過在上述步驟中使用水代替酶溶波制備對(duì)照溶液。
3)活性計(jì)算海藻糖酶活性以單位表達(dá)，一個(gè)單位定義為在37℃下1分鐘內(nèi)水解1μmol海藻糖的酶的量?？砂凑障铝械仁綇奈舛葍舨?酶溶液-對(duì)照溶液)計(jì)算每毫升酶溶液的活性(U/ml)。

產(chǎn)生本發(fā)明的新海藻糖酶的方法描述如下。在該方法中，使用以上所述的屬于諾卡氏菌屬并具有產(chǎn)生新海藻糖酶能力的微生物。適合的菌株典型的例子是Nocardia sp.NK-2067，這是由本發(fā)明的發(fā)明者從土壤中分離的菌株。菌株的菌學(xué)性質(zhì)如下所示。研究菌學(xué)性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)主要按照TakejiHasegawa微生物的分類和鑒定，東京大學(xué)出版社(1975)中的說明進(jìn)行。菌株的分類和鑒定參考Bergeys細(xì)菌分類學(xué)手冊(cè)，vol.1-4(1986-1989)等進(jìn)行。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)新從土壤中分離的屬于諾卡氏菌屬的放線菌NK-2067能產(chǎn)生對(duì)1，5-失水葡糖醇高度敏感的海藻糖酶。
上述放線菌NK-2067的形態(tài)、培養(yǎng)和生理學(xué)特征描述如下。1.形態(tài)特征1)菌絲氣生菌絲的形成單分枝氣生菌絲的裂殖可觀察到底部菌絲的裂殖可觀察到2)孢子孢子的形成和位置在氣生菌絲上的形成孢子囊的形成和定位未觀察到在孢梗的末端形成的鏈狀孢子數(shù)目10或10個(gè)以上孢子的特征表面結(jié)構(gòu)光滑形狀和大小桿狀，ca.0.7-1.0μm×0.7-2.0μm孢子的游動(dòng)性和鞭毛的存在未觀察到3)其它厚垣孢子未觀察到菌絲束未觀察到假孢子囊未觀察到菌絲分枝方式單分枝2.培養(yǎng)特征NK-2067菌株在通常使用的合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基上顯示出適中或良好的生長。底物菌絲的顏色是白到淺粉紅色。可溶性棕色色素的形成可在一些培養(yǎng)基上觀察到。
培養(yǎng)特征(如在28℃培養(yǎng)14天之后在各種培養(yǎng)基上觀察到的NK-2067菌株的生長和顏色)如下所示。顏色名字按照顏色調(diào)和手冊(cè)[美國Container公司，第4版(1958)]給定。1)蔗糖-硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基生長不良底部菌絲的顏色白(a)氣生菌絲的形成和顏色；不形成可溶性色素?zé)o2)葡萄糖-天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基生長良好底部菌絲的顏色肉粉紅色(4ca)-類桃色(dusty peach)(5ec)氣生菌絲的形成和顏色適中，白色(a)可溶性色素?zé)o3)甘油-天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基生長良好底部菌絲的顏色肉粉紅色(5ca)-淺玫瑰褐色(4ec)氣生菌絲的形成和顏色淺白色(a)可溶性色素?zé)o4)淀粉-無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基生長不良底部菌絲的顏色燕麥色(2ec)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素?zé)o5)酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基生長良好底部菌絲的顏色nude茶色(4gc)-木栓茶色(4ie)氣生菌絲的形成和顏色淺白色(a)可溶性色素；形成(微紅的棕色)6)瓊脂培養(yǎng)基生長良好底部菌絲的顏色淺芥茶色(2ie)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素?zé)o7)瓊脂培養(yǎng)基生長良好底部菌絲的顏色樟色(31e)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素少量形成(ocher)8)燕麥瓊脂培養(yǎng)基生長不良底部菌絲的顏色燕麥色(2ec)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素?zé)o3.生理特征NK-2067菌株的生理特征如下所示。在28℃下培養(yǎng)14天之后測(cè)定生長溫度范圍，培養(yǎng)2至3周后獲得其它結(jié)果。1)生長溫度范圍6-36℃2)明膠液化陽性3)淀粉水解陰性4)脫脂奶粉的聚沉和胨化陰性5)類黑色素的色素的產(chǎn)生(i)胨-酵母-鐵瓊脂培養(yǎng)基陽性(ii)酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基陽性6)碳源的可同化性作為基本培養(yǎng)基，使用了Pridham Gottlieb瓊脂培養(yǎng)基在下面，+表明菌株可使用該碳源，-表明菌株不使用該碳源。
L-阿拉伯糖-D-木糖-D-葡萄糖+蔗糖+棉子糖-D-果糖+鼠李糖-肌醇+D-甘露醇-7)降解能力作為基本培養(yǎng)基，使用了瓊脂培養(yǎng)基。在下面，+表明菌株降解該物質(zhì)，-表明菌株不降解該物質(zhì)。
酪氨酸-腺嘌呤-黃嘌呤+次黃嘌呤+尿素+8)酸的可產(chǎn)生性作為基本培養(yǎng)基，使用胨液體培養(yǎng)基(使用溴麝香草酚藍(lán)作為指示劑)。在下面，+表明菌株產(chǎn)生酸，-表明菌株不產(chǎn)生酸。
葡萄糖+
半乳糖-肌醇-甘露糖-鼠李糖-山梨醇-阿拉伯糖-福壽草醇-9)NaCl抗性作為基本培養(yǎng)基，使用了瓊脂培養(yǎng)基。在下面，+表明菌株生長，-表明菌株不生長。
0％NaCl+1％NaCl+2％NaCl+4％NaCl-6％NaCl-10％NaCl-4.化學(xué)分類學(xué)特征1)菌株中的二氨基庚二酸的旋光異構(gòu)體內(nèi)消旋形式2)細(xì)胞脂類的主要的醌組分MK(甲基萘醌類)-8(II，III-H4，ω-環(huán))3)細(xì)胞脂類中的霉菌酸包含4)整個(gè)細(xì)胞的主要糖組分阿拉伯糖和半乳糖通過形態(tài)特征(這些特征是可觀察到底部菌絲的裂殖，在氣生菌絲上形成孢子鏈)和化學(xué)分類學(xué)特征(可在細(xì)胞壁中檢測(cè)到內(nèi)消旋的二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖，不能檢測(cè)到甘氨酸，主要的醌組分是四氫化甲萘醌-8，ω環(huán)[MK-8(II，III-H4，ω-環(huán))]，而且在其中包含霉菌酸)確認(rèn)所述菌株屬于放線菌中的諾卡氏菌屬。
該菌株命名為Nocardia sp.NK-2067，在1996年1月11日保藏在國際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局，國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305日本)，保藏號(hào)為FERM BP-5359。
為了使用上述的諾卡氏菌屬的微生物產(chǎn)生新海藻糖酶，使用類似于以前所述的方法的方法培養(yǎng)微生物并純化所形成的酶。
用于定量測(cè)定樣品中1，5-失水葡糖醇的方法(該方法包括使樣品與活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然后測(cè)定所說酶的活性)描述如下。
通過使用預(yù)先從在已知濃度的1，5～失水葡糖醇存在下測(cè)得的所說酶的活性和1，5-失水葡糖醇濃度所制備的校準(zhǔn)曲線，可以從活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶的活性確定在樣品中1，5-失水葡糖醇的濃度。
另外，在無1，5-失水葡糖醇存在時(shí)(A)和有1，5-失水葡糖醇存在時(shí)(B)所說酶的活性之間的差別或按照下列等式計(jì)算的抑制率用于校準(zhǔn)曲線，替代在1，5-失水葡糖醇存在時(shí)測(cè)定的所說酶的活性。
抑制率(％)＝[(A-B)/A×100]A在無1，5-失水葡糖醇存在時(shí)的酶活性B在1，5-失水葡糖醇存在時(shí)的酶活性可通過測(cè)定酶活性的通常方法測(cè)定活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶活性。酶反應(yīng)在通過把酶、酶的底物和酶活性慢化劑(如果需要)添加到含水的培養(yǎng)基中制備的反應(yīng)混合物中于10-50℃下進(jìn)行1-60分鐘，優(yōu)選地是1-20分鐘，更優(yōu)選地是在25-40℃下進(jìn)行5-15分鐘。通過測(cè)定在一定的條件下形成的產(chǎn)物或作為酶反應(yīng)的結(jié)果留下的底物的濃度進(jìn)行酶活性的測(cè)定；或通過轉(zhuǎn)化形成的產(chǎn)物或留在其它物質(zhì)中的底物，然后測(cè)定其濃度進(jìn)行酶活性的測(cè)定。
作為含水的培養(yǎng)基，可以使用含水液體如緩沖液和生理鹽水。優(yōu)選地使用緩沖液。
緩沖液的例子是乳酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、琥珀酸緩沖液、鄰苯二甲酸鹽緩沖液、磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、二乙醇胺緩沖液、賴氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液、咪唑緩沖液、蘋果酸緩沖液、草酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液以及Good s緩沖液。
酶活性慢化劑的例子是金屬螯合劑，如EDTA和1，10-菲繞啉、糖醇(如甘露醇和甘油)、金屬離子(如鋅和銅)以及甾類激素封閉劑(如碘乙酸和碘乙酰胺)。
測(cè)定1，5～失水葡糖醇的方法(其中海藻糖酶用作活性受1，5-失水葡糖醇抑制的酶)描述如下。
海藻糖酶催化由式(I)代表的反應(yīng)，其中2分子D-葡萄糖從1分子海藻糖和1分子水形成。
海藻糖酶+H2O—————→2D-葡萄糖 (I)酶反應(yīng)在通過把海藻糖、海藻糖酶和酶活性慢化劑(如果需要)添加到上述的含水的培養(yǎng)基中所制備的反應(yīng)混合物中于10-50℃下進(jìn)行1-20分鐘，優(yōu)選地是在25-40℃下進(jìn)行5-15分鐘。
可通過用于D-葡萄糖測(cè)定的化學(xué)或生物化學(xué)方法測(cè)定酶活性。所增加的D-葡萄糖的量可通過直接方法(通過化學(xué)方法測(cè)定還原力的增加等)或其中D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為另一種測(cè)定物質(zhì)的方法測(cè)定。尤其優(yōu)選的是使用對(duì)D-葡萄糖具有高度特異性和可用于廣泛使用的自動(dòng)生化分析儀的酶的方法。
這樣的方法的例子是1)其中D-葡萄糖由葡萄糖氧化酶氧化，反應(yīng)形成的過氧化氫由比色測(cè)定的方法；2)其中D-葡萄糖由吡喃糖氧化酶氧化，反應(yīng)形成的過氧化氫由比色測(cè)定的方法；3)一種這樣的方法，其中D-葡萄糖通過在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文中作為NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文作為NADP)存在下使用葡萄糖脫氫酶脫氫，反應(yīng)形成的還原型的兩種輔酶(NADH或NADPH)的吸光度通過分光光度計(jì)測(cè)定；4)一種這樣的方法，其中D-葡萄糖通過在腺苷三磷酸存在下使用己糖激酶或葡糖激酶磷酸化，所形成的D-葡萄糖-6-磷酸通過在輔酶NADP存在下使用6-磷酸脫氫酶脫氫，反應(yīng)形成的NADPH的吸光度以分光光度計(jì)測(cè)定。
如上所述，可通過把D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化成易于測(cè)定的中間體，如過氧化氫和輔酶(例如，上述的NADH和NADPH)并測(cè)定中間體的量進(jìn)行D-葡萄糖的測(cè)定?？赏ㄟ^方法如比色、X線測(cè)量法、化學(xué)發(fā)光分析和電極方法測(cè)定過氧化氫，可通過，例如，比色測(cè)定NADP和NADPH。
可通過在酶(如過氧物酶)的存在下過氧化氫與生色劑反應(yīng)以顯色進(jìn)行比色，其后用分光光度計(jì)測(cè)定。作為生色劑，可以使用Trinder s試劑和leuco試劑。
Trinder s試劑的例子是4-氨基安替比林和酚化合物(如酚)以及3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸的組合、4-氨基安替比林和苯胺化合物(如N-乙基-N-(2-羥基-3-硫代丙基)-間甲苯胺，N-乙基-N-(2-羥基-3-硫代丙基)-3，5-甲氧苯胺，N-(2-羥基-3-硫代丙基)-3，5-甲氧苯胺鈉，N-乙基-N-(3-甲苯基)-N-琥珀酰次乙基二胺(下文作為EMSE)的組合。
leuco試劑的例子是10-N-羰甲基氨基甲?；?3，7-二(二甲胺)-10N-吩噻嗪，10-N-甲基氨基甲?；?3，7-3，7-二(二甲胺)-10N-吩噻嗪，N-(羰甲基氨基氨基甲?；?-4，4-(二甲氨基)二苯胺、4，4-二(二甲氨基)二苯胺以2及二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨苯基]胺。
可通過在酶(如過氧物酶)的存在下過氧化氫和熒光試劑反應(yīng)以形成熒光物質(zhì)，其后用熒光光度分析測(cè)定進(jìn)行X線測(cè)量法。作為熒光試劑，可以使用p-羥苯乙酸、p-羥苯丙酸、香豆素等。
可通過在酶(如過氧物酶)的存在下過氧化氫和發(fā)光試劑反應(yīng)以顯色，其后用發(fā)光計(jì)測(cè)定進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析法。作為發(fā)光試劑，可以使用魯米諾、異構(gòu)魯米諾、lucigenin、吖啶酸酯等。
可通過吸光度直接測(cè)定輔酶如NADH和HADPH。另外，它們可在轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)之后測(cè)定。例如，可通過使NADPH和四唑鹽反應(yīng)并通過使用分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)所形成的甲惚(formazan)色素的量測(cè)定NADPH。
按照上述方法1)測(cè)定酶活性的步驟如下所述。通過進(jìn)行式(II)所示的反應(yīng)以形成醌亞胺色素并用分光光度計(jì)測(cè)定色素的濃度測(cè)定海藻糖酶的酶活性。
(II)按照這種方法通過把海藻糖酶、葡糖氧化酶、過氧物酶、海藻糖、4-氨基安替比林、EMSE等添加到緩沖液(如磷酸緩沖液)中制備用于測(cè)定的反應(yīng)混合物。磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選地是5.0-8.0，更優(yōu)選地是6.0-7.0，其濃度優(yōu)選地是10-500mM，更優(yōu)選地是50-250mM。
添加至緩沖液中的物質(zhì)的濃度如下海藻糖酶，優(yōu)選地是0.001-10U/ml，更優(yōu)選地是0.01-1U/ml；葡糖氧化酶，優(yōu)選地是1-100U/ml，更優(yōu)選地是10-50U/ml；過氧物酶，優(yōu)選地是1-50U/ml，更優(yōu)選地5-20U/ml；海藻糖，優(yōu)選地是1-100mM，更優(yōu)選地是10-50mM；4-氨基安替比林，優(yōu)選地是0.5-50mM，更優(yōu)選地是1-10mM；EMSE，優(yōu)選地是0.5-50mM，更優(yōu)選地是1-10mM。
向上述反應(yīng)混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的樣品，反應(yīng)在10-50℃下進(jìn)行1-20分鐘，優(yōu)選地是在25-40℃下進(jìn)行5-15分鐘?？赏ㄟ^反應(yīng)所形成的醌亞胺色素的濃度測(cè)定酶活性，而在550nm下測(cè)定吸光度來測(cè)定醌亞胺色素的濃度。
在D-葡萄糖存在于樣品中的情況下，優(yōu)選地是以下列方式提前除去樣品中的D-葡萄糖。包含D-葡萄糖的樣品的例子是血液、血清和血漿。
可通過物理方法(其中吸附D-葡萄糖并使用層析柱等除去)和化學(xué)或生物化學(xué)方法(其中把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì))進(jìn)行樣品中D-葡萄糖的除去。使用酶的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選地用于使用自動(dòng)生物化學(xué)分析儀的測(cè)定中。
D-葡萄糖可通過上述的用于D-葡萄糖測(cè)定的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)。這樣的方法的例子是1)一種其中使用葡糖氧化酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯的方法；2)一種其中使用吡喃糖氧化酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成2-脫氫-D-葡萄糖的方法；3)一種其中使用葡萄糖脫氫酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯的方法；4)一種其中使用己糖激酶或葡糖激酶以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯-6-磷酸的方法。
包含D-葡萄糖的樣品的測(cè)定可以按照下列方式進(jìn)行。例如，通過上述1)或2)的方法把樣品中的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)，通過在日本出版的未審查的專利申請(qǐng)83287/82中描述的方法除去所形成的過氧化氫，進(jìn)行使用海藻糖酶作用的反應(yīng)，測(cè)定通過反應(yīng)形成的D-葡萄糖的量。另外，通過上述3)或4)的方法把樣品中的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)，通過使用NADH氧化酶、NADPH氧化酶等把形成的NADH或NADPH轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)。在使用方法4的情況下，通過使用心肌黃酶、腺苷三磷酸酶等把留在反應(yīng)混合物中的腺苷三磷酸轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)。然后，進(jìn)行使用海藻糖酶作用的反應(yīng)，通過，例如，上述1或2的方法測(cè)定由反應(yīng)形成的D-葡萄糖的量。
測(cè)定作用于除去樣品中D-葡萄糖的1，5-失水葡糖醇的代表性的方法包括以下步驟通過使用葡糖氧化酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)脂和過氧化氫；通過在過氧物酶的存在下和除過氧化氫化合物(如EMSE)反應(yīng)除去形成的過氧化氫；按照上述式(II)所示的方法測(cè)定海藻糖酶活性。
在這個(gè)方法中，使通過把葡糖氧化酶、過氧物酶、EMSE等添加到緩沖液(如磷酸緩沖液)中制備的反應(yīng)混合物和樣品在10-50℃下反應(yīng)1-20分鐘，優(yōu)選地是在25-40℃下反應(yīng)5-15分鐘以除去樣品中的D-葡萄糖。向反應(yīng)混合物中添加包含海藻糖、海藻糖酶、4-氨基安替比林等的試劑，通過上述方法測(cè)定海藻糖酶活性。試劑的組分濃度同上。
另一個(gè)代表性的方法包括以下步驟在腺苷三磷酸存在下使用葡糖激酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖-6-磷酸；使用6-磷酸脫氫酶把D-葡萄糖-6-磷酸鹽和NADP轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯-6-磷酸和NADPH；使用腺苷三磷酸酶分解腺苷三磷酸；按照上述式(II)所示的方法測(cè)定海藻糖酶活性。
在這個(gè)方法中，使通過把葡糖激酶、ATP、6-磷酸脫氫酶和NADH添加到緩沖液(如磷酸緩沖液)中制備的反應(yīng)混合物和樣品在10-50℃下反應(yīng)1-20分鐘，優(yōu)選地是在25-40℃下反應(yīng)5-15分鐘以除去樣品中的D-葡萄糖。在留在反應(yīng)混合物中的腺苷三磷酸通過添加腺苷三磷酸酶分解后，向反應(yīng)混合物中添加包含海藻糖、海藻糖酶、過氧物酶、4-氨基安替比林、EMSE等的試劑，通過上述的方法測(cè)定海藻糖酶活性。包含在反應(yīng)混合物中的物質(zhì)的濃度如下葡糖激酶，優(yōu)選地是0.1-100U/ml，更優(yōu)選地是1-10U/ml；6-磷酸鹽脫氫酶，優(yōu)選地是0.1-100U/ml，更優(yōu)選地是1-10U/ml；腺苷三磷酸酶，優(yōu)選地是0.1-100U/ml，更優(yōu)選地是1-10U/ml；NADP，優(yōu)選地是1-100mM，更優(yōu)選地是10-50mM；腺苷三磷酸，優(yōu)選地是1-100mM，更優(yōu)選地是10-50mM。其它化合物與酶以與上述濃度相同的濃度使用。
接著，關(guān)于海藻糖磷酸化酶描述如下。海藻糖磷酸化酶催化式(III)所示的可逆反應(yīng)。
海藻糖+磷酸_D-葡萄糖+β-D-葡萄糖-1-磷酸 (III)可通過直接方法(其中通過已知方法測(cè)定D-葡萄糖、β-D-葡萄糖-1-磷酸、海藻糖或磷酸的濃度變化)或通過其中物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可測(cè)定的其它物質(zhì)的方法測(cè)定海藻糖磷酸化酶的酶活性。例如，在式(III)的反應(yīng)中向右的酶活性可通過進(jìn)行式(IV)的反應(yīng)并選擇性地測(cè)定反應(yīng)形成的NADPH濃度測(cè)定。D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯-6-磷酸+NADPH(IV)通過把海藻糖脫氫酶、海藻糖、NADP等添加至緩沖液(如磷酸緩沖液)中制備用于測(cè)定這種酶活性的反應(yīng)混合物。磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選地是5.0-8.0，更優(yōu)選地是6.0-7.0，其濃度優(yōu)選地是10-500mM，更優(yōu)選地是50-250mM。
添加至緩沖液的物質(zhì)的濃度如下海藻糖磷酸化酶，優(yōu)選地是0.001-10U/ml，更優(yōu)選地是0.01-1U/ml；磷酸葡糖變位酶，優(yōu)選地是0.1-50U/ml，更優(yōu)選地是1-10U/ml；6-磷酸鹽脫氫酶，優(yōu)選地是0.1-50U/ml，更優(yōu)選地是1-10U/ml；海藻糖，優(yōu)選地是1-100mM，更優(yōu)選地是10-50mM；NADP，優(yōu)選地是1-50mM，更優(yōu)選地是5-20mM。
向上述反應(yīng)混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的樣品，反應(yīng)在10-50℃下進(jìn)行1-20分鐘，優(yōu)選地是在25-40℃下進(jìn)行5-15分鐘?？赏ㄟ^反應(yīng)所形成的NADPH的濃度測(cè)定酶活性，而在340nm下測(cè)定吸光度來測(cè)定NADPH的濃度。
可通過，例如，進(jìn)行式(V)的反應(yīng)并選擇性地測(cè)定反應(yīng)形成的醌亞胺色素濃度測(cè)定在式(III)的反應(yīng)中向左的酶活性。
(V)通過把嘌呤-核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧物酶、葡萄糖、β-葡萄糖-1-磷酸、次黃苷、4-氨基安替比林、EMSE等添加至緩沖液(如咪唑緩沖液)中制備用于測(cè)定這種酶活性的反應(yīng)混合物。咪唑緩沖液的pH值優(yōu)選地是5.0-8.0，更優(yōu)選地是6.0-7.0，其濃度優(yōu)選地是10-200mM，更優(yōu)選地是50-100mM。
添加至緩沖液中的物質(zhì)的濃度如下嘌呤-核苷磷酸化酶，優(yōu)選地是0.1-10U/ml，更優(yōu)選地是1-5U/ml；黃嘌呤氧化酶，優(yōu)選地是1-50U/ml，更優(yōu)選地是5-20U/ml；過氧物酶，優(yōu)選地是U/ml，更優(yōu)選地是1-50U/ml；葡萄糖，優(yōu)選地5-200mM，更優(yōu)選地是20-100mM；葡萄糖-1-磷酸，優(yōu)選地是5-200mM，更優(yōu)選地是20-100mM；次黃苷，優(yōu)選地是0.5-50mM，更優(yōu)選地是1-10mM；4-氨基安替比林，優(yōu)選地是0.5-50mM，更優(yōu)選地是1-10mM；EMSE，優(yōu)選地是0.5-50mM，更優(yōu)選地是1-10mM。
向上述反應(yīng)混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的樣品，反應(yīng)在10-50℃下進(jìn)行1-20分鐘，優(yōu)選地是在25-40℃下進(jìn)行5-15分鐘。可通過反應(yīng)所形成的醌亞胺色素的濃度測(cè)定酶活性，而在550nm下測(cè)定吸光度來測(cè)定醌亞胺色素的濃度。
定量測(cè)定本發(fā)明的1，5-失水葡糖醇的試劑(包括活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測(cè)定通過酶活性形成的物質(zhì)的試劑)描述如下。
當(dāng)海藻糖酶用作活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶時(shí)，底物是海藻糖，用于測(cè)定形成的物質(zhì)的試劑是測(cè)定D-葡萄糖的試劑。
當(dāng)海藻糖磷酸化酶用作活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶時(shí)，底物是海藻糖和磷酸，或D-葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸。在每個(gè)反應(yīng)中形成的物質(zhì)分別是D-葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸，或海藻糖和磷酸。也就是說，測(cè)定形成的物質(zhì)的試劑是測(cè)定海藻糖、磷酸、D-葡萄糖或β-葡萄糖-1-磷酸的試劑。
用于海藻糖酶活性測(cè)定的試劑包括海藻糖和測(cè)定D-葡萄糖的試劑。它還可包含緩沖液、其它酶、其底物和輔酶(如果需要)。用于海藻糖磷酸化酶活性測(cè)定的試劑包括海藻糖、磷酸和測(cè)定D-葡萄糖的試劑或測(cè)定β-葡萄糖-1-磷酸的試劑；或D-葡萄糖，β-葡萄糖-1-磷酸和測(cè)定海藻糖的試劑或測(cè)定磷酸的試劑。它還可包含緩沖液、其它酶、其底物和輔酶(如果需要)。
分別測(cè)定D-葡萄糖、β-葡萄糖-1-磷酸、海藻糖和磷酸的試劑包括例如那些用于測(cè)定這些物質(zhì)的上述方法的物質(zhì)。
用于除去D-葡萄糖的試劑包括例如那些用于通過使用酶把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成為其它物質(zhì)的上述方法的物質(zhì)。
例如，按照上述方法1)除去D-葡萄糖的試劑可包括葡糖氧化酶、過氧物酶、EMSE，如果需要，還包括上述緩沖液、其它酶、其底物和輔酶。按照上述方法4)除去D-葡萄糖的試劑可包括葡糖激酶、6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸酶、腺苷三磷酸、NADP，如果需要，還包括上述緩沖液、其它酶、其底物和輔酶。用于除去D-葡萄糖的試劑可與上述測(cè)定1，5-失水葡糖醇的試劑混合以形成試劑盒。
要使用的酶(如葡糖氧化酶、葡糖脫氫酶、吡喃糖氧化酶、葡糖激酶、己糖激酶、β-磷酸葡糖變位酶、嘌呤-核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧物酶和腺苷三磷酸酶)可作為商業(yè)產(chǎn)物獲得，或可以通過培養(yǎng)能產(chǎn)生這些酶的微生物制備。就緩沖液、底物、輔酶、酶的底物、生色劑、熒光劑和發(fā)光劑而言，都可以使用市售的試劑。
下列試驗(yàn)實(shí)施例通過使用得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶顯示了1，5-失水葡糖醇對(duì)酶活性抑制的例子。
試驗(yàn)實(shí)施例1(由1，5-失水葡糖醇抑制的特異性)通過把在參考實(shí)施例3制備的10mU/ml海藻糖酶、0.81mg/ml4-氨基安替比林、1mg/ml EMSE、30U/ml葡糖氧化酶、10U/ml過氧物酶和表4中所示的1mM試驗(yàn)糖添加到100mM磷酸緩沖液(pH7.0)中制備反應(yīng)混合物。在向反應(yīng)混合物中添加10mg/ml海藻糖并攪拌之后，用分光光度計(jì)測(cè)定在550nm時(shí)的吸光度變化。
在反應(yīng)開始之后測(cè)定10分鐘的吸光度的增加，按照下列等式從無試驗(yàn)糖(A)和1mM試驗(yàn)糖存在下(B)的吸光度增量計(jì)算抑制率(％)[(A-B)/A×100]。結(jié)果如表4所示。
表4試驗(yàn)糖(1mM) 抑制率(％)1，5-失水葡糖醇 45.0D-葡糖胺 0N-乙酰-D-葡糖胺 0D-甘露糖0.5D-半乳糖0.2D-果糖 0D-墨角藻糖0L-墨角藻糖0D-木糖 0麥芽糖 0蔗糖 0得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶活性特異性地受1，5-失水葡糖醇抑制。
附圖簡述圖1顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的pH-活性曲線。
圖2顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的pH穩(wěn)定性曲線。
圖3顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的熱穩(wěn)定性曲線。
圖4顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的溫度-活性曲線。
圖5顯示了由使用作為指示(index)的得自銹色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶的分解活性獲得的校準(zhǔn)曲線。縱坐標(biāo)的數(shù)表示酶活性抑制率(％)，橫坐標(biāo)上是數(shù)表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖6顯示了由使用作為指示的得自銹色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶的合成活性獲得的校準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)的數(shù)表示酶活性抑制率(％)，橫坐標(biāo)上是數(shù)表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖7顯示了由使用作為試驗(yàn)酶的得自金霉素鏈霉菌ATCC 10762的海藻糖酶獲得的校準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)的數(shù)表示酶活性抑制率(％)，橫坐標(biāo)上是數(shù)表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖8顯示了由使用作為試驗(yàn)酶的得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶獲得的校準(zhǔn)曲線。縱坐標(biāo)的數(shù)表示酶活性抑制率(％)，橫坐標(biāo)上是數(shù)表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖9顯示了由使用作為試驗(yàn)酶的得自Nocardia sp.NK-2 067的海藻糖酶獲得的校準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)的數(shù)表示酶活性抑制率(％)，橫坐標(biāo)上是數(shù)表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖10顯示了由使用作為指示的抗得自Nocardia sp.NK-2067海藻糖酶的抑制率獲得的在葡萄糖存在下的1，5-失水葡糖醇的校準(zhǔn)曲線。在縱坐標(biāo)上的數(shù)表示在無1，5-失水葡糖醇和1，5-失水葡糖醇存在的情況下吸光度之間的差，在橫坐標(biāo)上的數(shù)表示1，5-失水葡糖醇濃度(μg/ml)。
在下列的實(shí)施例中說明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式實(shí)施例1使用得自銹色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶測(cè)定1，5-失水葡糖醇通過把10mU/ml在參考實(shí)施例1中制備的得自銹色鏈孢菌的海藻糖磷酸化酶、2.5U/ml β-磷酸葡糖變位酶(Beekman儀器公司)、5U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Sigma化學(xué)公司)、10mM NADP以及包含不同濃度的1，5-失水葡糖醇樣品添加到100mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中制備反應(yīng)混合物，在把10mg/ml海藻糖添加至反應(yīng)混合物中并攪拌之后，以分光光度計(jì)測(cè)定在340nm下的吸光度增量。
在反應(yīng)開始之后測(cè)定10分鐘的吸光度增量，按照下列等式從在每種濃度的無1，5-失水葡糖醇(A)和1，5-失水葡糖醇存在下(B)的吸光度增量計(jì)算抑制率(％)[(A-B)/A×100]。如圖5所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關(guān)關(guān)系，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例2使用得自銹色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶測(cè)定1，5-失水葡糖醇通過把10mU/ml在參考實(shí)施例1中制備的海藻糖磷酸化酶、50mM葡萄糖、2ml測(cè)定無機(jī)磷的試劑盒(Kyowa Medex有限公司)、包含不同濃度的1，5-失水葡糖醇1，5-失水葡糖醇樣品添加到50mM的咪唑緩沖液(pH7.0)中。在把50mM的β-葡萄糖-1-磷酸添加至反應(yīng)混合物中并攪拌之后，以分光光度計(jì)測(cè)定在550nm下的吸光度增量。
在反應(yīng)開始之后測(cè)定10分鐘的吸光度增量，按照與實(shí)施例1的方法相同的方法計(jì)算抑制率(％)。如圖6所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關(guān)關(guān)系，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例3使用得自金霉素鏈霉菌ATCC 10762的海藻糖酶測(cè)定1，5-失水葡糖醇通過把10mU/ml參考實(shí)施例2制備的海藻糖酶、0.81mg/ml 4-氨基安替比林、1mg/ml EMSE、30U/ml葡糖氧化酶、10U/ml過氧物酶以及包含不同濃度的1，5-失水葡糖醇樣品添加到100mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中制備反應(yīng)混合物，在把10mg/ml海藻糖添加至反應(yīng)混合物中并攪拌之后，以分光光度計(jì)測(cè)定在550nm下的吸光度增量。
在反應(yīng)開始之后測(cè)定10分鐘的吸光度增量，按照與實(shí)施例1的方法相同的方法計(jì)算抑制率(％)。如圖7所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關(guān)關(guān)系，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例4使用得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶測(cè)定1，5-失水葡糖醇除了使用參考實(shí)施例3中制備的得自圓紅球菌的海藻糖酶之外，重復(fù)與實(shí)施例3相同的步驟。如圖8所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關(guān)關(guān)系，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例5使用Nocardia sp.NK-2067產(chǎn)生海藻糖酶把Nocardia sp.NK-2067接種進(jìn)在1-1錐形培養(yǎng)瓶中的包含1g/dl蔗糖、0.5g/dl NZ-胺、0.2g/dl胨，0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的125ml培養(yǎng)基(pH7.2)中并在30℃下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。把形成的培養(yǎng)物接種在5-1的發(fā)酵罐中的具有與上述相同組合物的2375ml培養(yǎng)基中并在通氣和攪拌的同時(shí)在30℃下培養(yǎng)2天。
離心(12,000×g，20分鐘)形成的培養(yǎng)物(2.51)以收集細(xì)胞。把細(xì)胞懸浮在包含10％甘油的500ml 50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)(在下文作為GP緩沖液)中并使用Dynomill(W.A.Bachofen)破壞，然后再離心(12,000×g，20分鐘)。向獲得的上清液添加硫酸銨，收集通過70％飽和硫酸銨沉淀的組份并將其溶解在少量的GP緩沖液(大約100ml)中。形成的溶液對(duì)5lGP緩沖液透析24小時(shí)。將透析的溶液通過用GP緩沖液預(yù)平衡的DEAE-Cellulofine柱(Seikagaku Kogyo有限公司)中(1L，直徑5cm)，由此把海藻糖酶吸附在柱上。在用相同的緩沖液洗脫柱以除去沾染的蛋白質(zhì)后，使用包含0-1M氯化鈉的GP緩沖液用氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。合并用ca.0.4-0.6M氯化鈉洗脫的活性組份，向其中添加硫酸銨。通過離心(12,000×g，20分鐘)收集用70％硫酸銨飽和液沉淀的組份并溶解在50ml的GP緩沖液中。形成的溶液對(duì)21GP緩沖液透析24小時(shí)以獲得純化的海藻糖酶制劑。
酶制劑的比活是21mU/mg。
實(shí)施例6使用得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶測(cè)定1，5-失水葡糖醇除了使用實(shí)施例5制備的得自Nocardia sp.的海藻糖酶之外，重復(fù)與實(shí)施例3相同的步驟。如圖9所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關(guān)關(guān)系，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例7制備了由下列試劑1、2和3組成的測(cè)定1，5-失水葡糖醇的試劑盒。
試劑1葡糖氧化酶 30U/ml(得自黑曲霉，Toyobo有限公司)過氧物酶 10U/ml(得自辣根，Toyobo有限公司)EMSE 1mg/ml磷酸緩沖液(pH5.5) 100mM試劑2海藻糖酶(在實(shí)施例5中制備) 1U/ml4-氨基安替比林 0.8mg/ml磷酸緩沖液(pH5.5) 100mM試劑3海藻糖 2mM實(shí)施例8制備包含從0到500μg/ml濃度的1，5-失水葡糖醇和1mg/ml濃度的D-葡萄糖的樣品。向10ml的每個(gè)樣品添加300μl在實(shí)施例7中制備的試劑1，把混合物在30℃下溫育10分鐘以把D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)脂并同時(shí)除去形成的過氧化氫。然后，添加100μl在實(shí)施例7中制備的試劑2，然后添加10μl在實(shí)施例7中制備的試劑3。以自動(dòng)分析儀(Hitachi 7070)測(cè)定吸光度增量。
從無1，5-失水葡糖醇時(shí)的吸光度減去在每種濃度的1，5-失水葡糖醇存在下的吸光度。如圖10所示，在獲得的絕對(duì)值(吸光度差)和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的相關(guān)關(guān)系。這說明可以測(cè)定在包含葡萄糖的樣品中1，5-失水葡糖醇的濃度。
實(shí)施例9制備了由下列試劑4、5、6和7組成的測(cè)定1，5-失水葡糖醇的試劑盒。試劑4葡糖激酶 5U/ml
(得自嗜熱脂肪芽孢桿菌，Sigma化學(xué)公司)腺苷三磷酸 10mMMgCl220mM葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 10U/ml(得自面包酵母，Sigma化學(xué)公司)NADP 10mM磷酸緩沖液(pH7.0)100mM試劑5腺苷三磷酸酶 3U/ml(得自豬腦，Sigma化學(xué)公司)試劑6海藻糖酶 1U/ml葡糖氧化酶 30U/ml過氧物酶 10U/ml4-氨基安替比林 0.8mg/mlEMSE 1mg/ml磷酸緩沖液(pH7.0)100mM試劑7海藻糖 2mM實(shí)施例10制備包含500μg/ml濃度的1，5-失水葡糖醇和從1到10mg/ml濃度的D-葡萄糖的樣品。向10ml的每個(gè)樣品添加300μl在實(shí)施例9中制備的試劑4，把混合物在30℃下溫育10分鐘。然后，添加100μl在實(shí)施例9中制備的試劑5，溫育混合物5分鐘以分解腺苷三磷酸。由此停止葡糖激酶反應(yīng)。通過這些步驟經(jīng)葡萄糖6-磷酸把葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯-6-磷酸。
向反應(yīng)混合物添加100μl在實(shí)施例9中制備的試劑6。然后添加10μl在實(shí)施例9中制備的試劑7，反應(yīng)在30℃下進(jìn)行10分鐘，以自動(dòng)分析儀(Hitachi 7070)測(cè)定吸光度增量。
以與實(shí)施例8中的方式相同的方式計(jì)算吸光度差，研究獲得的值和在樣品中1，5-失水葡糖醇的濃度之間的關(guān)系。如表5所示，無論樣品中葡萄糖濃度的大小，吸光度的差是常量。這說明，可以測(cè)定在葡萄糖存在下的1，5-失水葡糖醇濃度。
表5添加的葡萄糖的濃度(mg/ml)吸光度差(mAbs)0 551.0 552.5 565.0 557.5 5410.0 56實(shí)施例11使用正常的人血清和通過把從0至500μg/ml濃度的1，5-失水葡糖醇添加至正常血清中制備的添加1，5-失水葡糖醇的血清作為樣品。向20μl的每個(gè)樣品添加300μl在實(shí)施例9中制備的試劑4，把混合物在30℃下溫育10分鐘。然后，添加10μl在實(shí)施例9中制備的試劑5，然后溫育5分鐘。向形成的溶液添加100μl在實(shí)施例9中制備的試劑6。然后添加10μl在實(shí)施例9中制備的試劑7，反應(yīng)在30℃下進(jìn)行10分鐘，以自動(dòng)分析儀(Hitachi7070)測(cè)定吸光度增量。對(duì)上述包含0-500mg/ml 1，5-失水葡糖醇的樣品進(jìn)行如上所述的相同步驟以制備校準(zhǔn)曲線。在血清樣品中1，5-失水葡糖醇濃度基于校準(zhǔn)曲線計(jì)算。結(jié)果如表6所示。
表6添加的1，5-失水葡糖醇實(shí)測(cè)值(μg/ml) 回收率(％)(μg/ml)025-100 124 96200 224 96300 325 100400 426 104
500 526 104所測(cè)定的正常人血清中的1，5-失水葡糖醇濃度和文獻(xiàn)中的值十分一致。測(cè)得的添加1，5-失水葡糖醇的血清的值顯示出回收率和理論值很接近。這說明，在血清中的1，5-失水葡糖醇濃度可通過按照本發(fā)明的方法測(cè)定。
參考實(shí)施例1使用銹色鏈孢菌FERM BP-4329產(chǎn)生海藻糖磷酸化酶把銹色鏈孢菌接種于在2-1錐形培養(yǎng)瓶中的包含3g/dl蔗糖、0.5g/dlNZ-胺、0.2g/dl胨、0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的300ml培養(yǎng)基(pH7.0)中并在30℃下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。把形成的培養(yǎng)物(600ml)接種于在30-1發(fā)酵罐中的具有與上述相同組合物的151培養(yǎng)基中并在通氣和攪拌的同時(shí)在30℃下培養(yǎng)3天。
離心(12,000×g，20分鐘)形成的培養(yǎng)物(151)以收集細(xì)胞。把細(xì)胞懸浮在1000ml 200mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中并使用Dynomill(W.A.Bachofen)破壞，然后再離心(12,000×g，20分鐘)。向獲得的上清液添加硫酸銨至50％飽和度，收集形成的沉淀并將其溶解在少量的200mM的磷酸緩沖液(大約200ml)中。形成的溶液對(duì)5l相同的緩沖液透析24小時(shí)。透析的溶液在65℃下加熱15分鐘，然后離心(12,000×g，20分鐘)。將獲得的上清液通過用同樣緩沖液預(yù)平衡的凝膠過濾介質(zhì)的柱(Toyopearl HW65F，Tosoh公司)中(1L，直徑5cm)。合并洗脫的活性組份，向其中添加50％飽和度的硫酸銨。通過離心(12,000r.p.m.，20分鐘)收集形成的沉淀并將其溶解在20ml 200mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中。形成的溶液對(duì)21相同緩沖液透析24小時(shí)以獲得海藻糖磷酸化酶制劑。
酶制劑的比活是100mU/mg。
參考實(shí)施例2使用金霉素鏈霉菌ATCC 10762產(chǎn)生海藻糖酶把金霉素鏈霉菌ATCC 10762接種于在1-1錐形培養(yǎng)瓶中的包含1g/dl蔗糖、0.5g/dl NZ-胺、0.2g/dl胨、0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的125ml培養(yǎng)基(pH7.0)中并在30℃下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。把形成的培養(yǎng)物(600ml)接種于在5-1發(fā)酵罐中的具有與上述相同組合物的2375ml培養(yǎng)基中并在通氣和攪拌的同時(shí)在30℃下培養(yǎng)2天。
離心(12,000×g，20分鐘)形成的培養(yǎng)物(151)以收集細(xì)胞。把細(xì)胞懸浮在包含10％甘油的500ml 50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)(在下文作為GP緩沖液)中并使用Dynomill(W.A.Bachofen)破壞，然后再離心(12,000×g，20分鐘)。向獲得的上清液添加硫酸銨，收集通過70％飽和硫酸銨沉淀的組份并將其溶解在少量的GP緩沖液(大約100ml)中。形成的溶液對(duì)51 GP緩沖液透析24小時(shí)。將透析的溶液通過用GP緩沖液預(yù)平衡的DEAE-Cellulofine柱(Seikagaku Kogyo有限公司)中(1L，直徑5cm)，由此把海藻糖酶吸附在柱上。在用相同的緩沖液洗脫柱以除去沾染的蛋白質(zhì)后，使用包含0-1M氯化鈉的GP緩沖液用氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。合并用ca.0.4-0.6M氯化鈉洗脫的活性組份，向其中添加硫酸銨。通過離心(12,000×g，20分鐘)收集用70％硫酸銨飽和液沉淀的組份并溶解在50ml的GP緩沖液中。形成的溶液對(duì)21 GP緩沖液透析24小時(shí)以獲得純化的海藻糖酶制劑。
酶制劑的比活是21mU/mg。
參考實(shí)施例3使用圓紅球菌ATCC 14898產(chǎn)生海藻糖酶除了使用圓紅球菌ATCC 14898之外，重復(fù)在參考實(shí)施例2中相同的步驟，由此獲得純化的海藻糖酶制劑。
酶制劑的比活是15mU/mg。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供了酶促測(cè)定1，5-失水葡糖醇的方法、該方法所用的試劑、適用于酶促測(cè)定1，5-失水葡糖醇之方法的新海藻糖酶以及產(chǎn)生新海藻糖酶的方法。測(cè)定1，5-失水葡糖醇濃度在糖尿病診斷中是有用的。按照本發(fā)明，可快速而精確地測(cè)定1，5-失水葡糖醇。
權(quán)利要求
1.一種用于定量測(cè)定樣品中1，5-失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法，該方法包括使樣品與活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然后測(cè)定所說酶的活性。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖酶。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖磷酸化酶。
4.對(duì)1，5-失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值并具有下列理化性質(zhì)的海藻糖酶(1)作用它催化如通式(I)所示的反應(yīng)，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖海藻糖+水—————→2D-葡萄糖 (I)(2)底物特異性它特異性地作用于海藻糖，(3)底物親和性對(duì)海藻糖的Km值是6.7mM，(4)最適pH和穩(wěn)定pH4值酶的最適pH是5-6，在50℃處理30分鐘時(shí)，酶在5-10的pH范圍中是穩(wěn)定的，(5)最適溫度和耐熱性最適溫度在45℃左右，在pH5.0下處理30分鐘時(shí)，酶在達(dá)到50℃時(shí)是穩(wěn)定的，(6)抑制劑可被金屬螯合劑如，1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸和2，2-二吡啶；SH封閉劑如p-汞苯甲酸和碘乙酰胺、羥胺、硫酸鎳等抑制，(7)分子量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得的酶的亞單位的分子量是大約90,000，通過凝膠過濾方法測(cè)得的酶的分子量是大約400,000。
5.一種產(chǎn)生按照權(quán)利要求4的海藻糖酶的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于諾卡氏菌屬并具有產(chǎn)生所說海藻糖酶能力的微生物，并從培養(yǎng)物回收所說海藻糖酶。
6.一種定量測(cè)定1，5-失水葡糖醇的試劑，該試劑包括其活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測(cè)定由所說酶活性形成的物質(zhì)的試劑。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是按照權(quán)利要求4的酶。
8.按照權(quán)利要求6的試劑，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖酶。
9.按照權(quán)利要求6的試劑，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖磷酸化酶。
10.按照權(quán)利要求6的試劑，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是按照權(quán)利要求4的酶。
11.按照權(quán)利要求2或7的方法，其中所說的樣品是包含D-葡萄糖和1，5-失水葡糖醇的樣品，該樣品已進(jìn)行過除去D-葡萄糖的預(yù)處理。
12.按照權(quán)利要求8或10的試劑，該試劑還包含除去D-葡萄糖的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于定量測(cè)定樣品中1,5－失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法,該方法包括使樣品與活性以濃度—依賴性方式受1,5－失水葡糖醇抑制的酶共存,然后測(cè)定該酶的活性;本發(fā)明也涉及定量測(cè)定1,5－失水葡糖醇的試劑,該試劑包括活性以濃度－依賴性方式受1,5－失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測(cè)定由所說酶活性形成的物質(zhì)的試劑。本發(fā)明還涉及對(duì)1,5－失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值的新海藻糖酶以及產(chǎn)生具有上述理化性質(zhì)的新海藻糖酶的方法,該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于諾卡氏菌屬并具有產(chǎn)生所說海藻糖酶能力的微生物,并從培養(yǎng)物回收所說海藻糖酶。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK1180378SQ97190096
公開日1998年4月29日 申請(qǐng)日期1997年2月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月19日
發(fā)明者相阪和夫, 田添榮, 安藤勝彥, 落合惠子 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社