專利名稱：對鞘翅類昆蟲和櫛頭蚤屬種昆蟲有毒的蘇云金芽孢桿菌CryET29組合物的制作方法
1.本發(fā)明的背景本發(fā)明是一個基于1996年9月26日提交的美國專利流水號08/721,259的部分繼續(xù)申請，在此特將其全部內(nèi)容整個引入作為參考。1.1 發(fā)明領(lǐng)域一般地說，本發(fā)明是屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，某些實施方案是關(guān)于包含來自某些細菌的DNA區(qū)段和蛋白質(zhì)的方法和組合物。再具體地說，是關(guān)于一種來自蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的新型cryET29基因，它能編碼對鞘翅目昆蟲和貓蚤毒性的結(jié)晶蛋白。公開了制備和應(yīng)用這些DNA區(qū)段，這些編碼人工修飾CryET29蛋白的DNA區(qū)段，以及天然和合成結(jié)晶蛋白的多種方法，例如，將DNA區(qū)段用作診斷探針和生成蛋白質(zhì)的模板，以及在多種免疫學(xué)和診斷應(yīng)用中蛋白質(zhì)、融合蛋白載體和肽的用途。還公開了在培育含有在此公開的DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)基因植物細胞的過程中，制備和應(yīng)用核酸區(qū)段的方法。1.2 對相關(guān)技術(shù)的說明1.2.1 蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白蘇云金芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，它產(chǎn)生被稱為結(jié)晶蛋白的δ-內(nèi)毒素，對某些昆蟲目和種特別有毒。已發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的多種不同菌株能產(chǎn)生殺蟲結(jié)晶蛋白。包括產(chǎn)生殺蟲蛋白的蘇云金芽孢桿菌株組合物已可以購得，并且已經(jīng)用作環(huán)境可接受的殺蟲劑，因為它們對特定的靶標昆蟲非常有毒，但對植物和其它非靶標生物是無害的。
蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白只有在被攝食后，當(dāng)昆蟲中腸內(nèi)的堿性pH和蛋白水解酶溶解此結(jié)晶蛋白并釋放出毒性成分時，才對昆蟲有毒。這些成分使中腸細胞破裂，導(dǎo)致昆蟲停止吃食而最后死亡。實際上，在處理多種害蟲中已證明蘇云金芽孢桿菌是一種有效的，環(huán)境安全的殺蟲劑。
如Hofte et al(1989)曾指出，大多數(shù)殺蟲的蘇云金芽孢桿菌株具有抗鱗翅目昆蟲即毛蟲的活性。另一些蘇云金芽孢桿菌株具有抗雙翅目昆蟲即蠅和蚊的殺蟲活性，或者具有抗鱗翅類和雙翅類二種昆蟲的殺蟲活性。最近幾年，還報導(dǎo)了幾種蘇云金芽孢桿菌株能產(chǎn)生對鞘翅目昆蟲即甲蟲有毒的結(jié)晶蛋白。至今尚無蘇云金芽孢桿菌株對蚤目櫛頭蚤屬(Ctenocephalides)具有殺蟲活性的報導(dǎo)。
雙翅目活性的胞嘧啶毒素(Cyt toxins)不同于絕大多數(shù)其它的蘇云金芽孢桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白，它們比較小，并且不共有序列同源性的保守部分。這些蛋白質(zhì)在體外顯示有廣泛的溶細胞活性，而在體內(nèi)，對雙翅目昆蟲的幼蟲特別有毒。對于這些特點已另有論述(Chilcott andEllar，1988)。1.2.2 結(jié)晶蛋白的遺傳學(xué)已經(jīng)從幾株蘇云金芽孢桿菌克隆出多種編碼結(jié)晶蛋白的基因。Hofet et al(1989)的述評論述了，關(guān)于已被鑒定對鱗翅目昆蟲即毛蟲具有對抗活性的大多數(shù)殺蟲蘇云金芽孢桿菌株的一般技術(shù)狀況。此論文還論述了對雙翅目昆蟲(即蠅和蚊)及鞘翅目昆蟲(即甲蟲)具有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌株。多種編碼結(jié)晶蛋白的基因已經(jīng)從幾株蘇云金芽孢桿菌被克隆產(chǎn)生。Hofte et al(1989)對1990年以前在蘇云金芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白質(zhì)進行了研討，并制定了已按慣例用于蘇云金芽孢桿菌基因和蛋白的術(shù)語和分類模式。cry1基因編碼鱗翅類毒性的Cry1蛋白。cry2基因編碼對鱗翅類和雙翅類都具有毒性的Cry2蛋白。cry3基因編碼鞘翅類毒性的Cry3蛋白，而cry4基因編碼雙翅類毒性的Cry4蛋白，等等。
最近，基于氨基酸序列的同源性，而不是基于其靶標昆蟲特異性，已提出了對Cry蛋白系統(tǒng)分類的新術(shù)語。這種分類模式被概括在表1中。
表 1經(jīng)修改的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素術(shù)語a新名稱 舊名稱基因文庫檢索號Cry1Aa CryIA(a) M11250Cry1Ab CryIA(b) M13898Cry1Ac CryIA(c) M11068Cry1Ad CryIA(d) M73250Cry1Ae CryIA(e) M65252Cry1Ba CryIBX06711Cry1Bb ET5 L32020Cry1Bc PEG5 Z46442Cry1Bd CryE1U70726Cry1Ca CryICX07518Cry1Cb CryIC(b) M97880Cry1Da CryIDX54160Cry1Db PrtB Z22511Cry1Ea CryIEX53985Cry1Eb CryIE(b) M73253Cry1Fa CryIFM63897Cry1Fb PrtD Z22512Cry1Ga PrtA Z22510Cry1Gb CryH2U70725Cry1Ha PrtC Z22513Cry1Hb U35780Cry1Ia CryV X62821Cry1Ib CryV U07642Cry1Ja ET4 L32019Cry1Jb ET1 U31527Cry1K U28801Cry2Aa CryIIA M31738Cry2Ab CryIIB M23724Cry2Ac CryIIC X57252Cry3A CryIIIA M22472Cry3Ba CryIIIB X17123Cry3Bb CryIIIB2 M89794Cry3C CryIIID X59797Cry4A CryIVA Y00423Cry4B CryIVB X07423Cry5Aa CryVA(a) L07025Cry5Ab CryVA(b) L07026Cry5B U19725新名稱 舊名稱 基因文庫檢索號Cry6A CryVIAL07022Cry6B CryVIBL07024Cry7Aa CryIIIC M64478Cry7Ab CryIIICb U04367Cry8A CryIIIE U04364Cry8B CryIIIG U04365Cry8C CryIIIF U04366Cry9A CryIG X58120Cry9B CryIX X75019Cry9C CryIH Z37527Cry10A CryIVCM12662Cry11A CryIVDM31737Cry11B Jeg80 X86902Cry12A CryVB L07027Cry13A CryVC L07023Cry14A CryVD U13955Cry15A 34kDa M76442Cry16A cbm71 X94146Cry17A cbm71 X99478Cry18A CryBP1X99049Cry19A Jeg65 Y08920Cyt1Aa CytA X03182Cyt1Ab CytM X98793Cyt1BU37196Cyt2A CytB Z14147Cyt2B CytB U52043a來自http//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html1.2.3 鑒定對鞘翅類昆蟲具毒性的結(jié)晶蛋白對于來自雙翅類活性蘇云金芽孢桿菌以色列變種的26-kDa殺蚊毒素，對其編碼基因的克隆和表達已有論述(Ward et al，1984)，并且已報道了這種基因的核苷酸序列(Ward and Ellar，1986)。根據(jù)從推導(dǎo)出的氨基酸序列的計算，這種毒素蛋白CytA的分子量被確定為27340 Da。
對于從蘇云金芽孢桿菌莫氏變種PG14菌株分離出的27-kDa殺蚊Cyt蛋白，其基因的核苷酸序列已被公開(Earp and Ellar，1987)。發(fā)現(xiàn)這種毒素蛋白的序列，僅一個氨基酸殘基不同于蘇云金芽孢桿菌以色列變種的CytIA蛋白。
較早對25-kDa蛋白的鑒定已有論述(Knowles et al，1992)，這種蛋白在體外當(dāng)被來自殺蚊蘇云金芽孢桿菌九州變種的蛋白水解作用激活時，表現(xiàn)出溶細胞活性，并且已報導(dǎo)了這種蛋白CytB的基因的核苷酸序列(Koni and Ellar，1993)，雖然它與蘇云金芽孢桿菌以色列變種的CytA蛋白的確共有顯著序列相似性，但是預(yù)測的CytB蛋白分子量是29236Da，推導(dǎo)出的氨基酸序列也完全不同。
對于對鞘翅類和雙翅類昆蟲具有活性的30-kDa毒素蛋白，對其基因的克隆和特征鑒定也有描述(Intl.Pat.Appl.Pub.No.WO95/02693，1995)。從蘇云金芽孢桿菌PS201T6分離出的這種基因編碼一個29906 Da的蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)顯示與蘇云金芽孢桿菌以色列變種的CytA毒素有64％序列相似性。2.發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種新穎的蘇云金芽孢桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白(被定名為CryET29)，以及編碼此蛋白的基因(被定名為cryET29)，它們分別包含的氨基酸序列和核酸序列，顯示同現(xiàn)有技術(shù)下的δ-內(nèi)毒素蛋白和基因很少有同源性。令人驚奇的是，本發(fā)明的CryET29蛋白證明不但對鞘翅目昆蟲，而且對蚤類，特別是貓蚤，貓櫛頭蚤具有驚人的殺蟲活性。
在一個重要的實施方案中，本發(fā)明提供了含有蘇云金芽孢桿菌CryET29殺蟲結(jié)晶蛋白的被分離和純化的氨基酸區(qū)段(SEQ ID NO2)，它包含圖解顯示在

圖1A和圖1B中的氨基酸序列。對CryET29蛋白的編碼區(qū)是SEQ ID NO1中核苷酸29-721，CryET29蛋白顯示對如下鞘翅類昆蟲具有殺蟲活性南方玉米食根蟲，西部玉米食根蟲，Colorado土豆甲蟲、日本甲蟲，和紅粉甲蟲。在相關(guān)的實施方案中，還公開了制備和應(yīng)用這種蛋白，其衍生物和突變體，以及針對這些蛋白的抗體的方法。
在另一個重要的實施方案中，本發(fā)明提供了被分離和純化的核酸區(qū)段，它包含編碼在此公開的CryET29結(jié)晶蛋白的cryET29基因。在SEQID NO1中給出了cryET29基因的核苷酸序列，并圖解顯示在圖1A和圖1B中。在相關(guān)的實施方案中，還公開了制備，應(yīng)用，改造，誘變，測定和定量分析這些核酸片段的方法。還公開了以多種體外和體內(nèi)的方法，用于鑒定和檢測相關(guān)cry基因序列的診斷方法和檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一方面是產(chǎn)生CryET29結(jié)晶蛋白的蘇云金芽孢桿菌細胞。在優(yōu)選的實施方案中，該細胞是被命名為蘇云金芽孢桿菌EG4096的蘇云金芽孢桿菌株，該菌株已于1996年5月30日保存在農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NRRL)，保藏號NRRL B-21582。蘇云金芽孢桿菌EG4096是天然存在的菌株，它包含本發(fā)明的cryET29基因(SEQ IDNO1)，在實施例1、2和3中將對此菌株作進一步描述。EG4096產(chǎn)生一種大約26-kDa的新型殺蟲結(jié)晶蛋白，本發(fā)明人已將其命名為CryET29(SEQ ID NO2)。具有NRRL保藏號NRRL B-21582的蘇云金芽孢桿菌細胞是最優(yōu)選的。
本發(fā)明更進一步的內(nèi)容是包含全部或一部分cryET29基因(SEQID NO1)的核酸序列的質(zhì)粒，粘?；蜉d體，含有天然或重組cryET29基因的轉(zhuǎn)化宿主細胞，以這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組菌培養(yǎng)物，優(yōu)選的蘇云金芽孢桿菌株是例如在實施例7中所述的重組菌株EG11494和EG11502，而最優(yōu)選的是這種菌株的生物純培養(yǎng)物。根據(jù)布達佩斯條約的條款，已于1996年5月30日將EG11494保存于NRRL，保藏號NRRLB-21583。按另一種選擇，含有新型cryET29基因的大腸桿菌重組株EG11513和EG11514，也是表達CryET29蛋白的優(yōu)選宿主。2.1 cryET29 DNA區(qū)段本發(fā)明還涉及幾種DNA區(qū)段，包括實際上可從任何來源分離的DNA區(qū)段，不含有全基因組DNA的DNA區(qū)段，以及編碼全部或部分在此公開的新型蛋白的DNA區(qū)段。cryET29基因(SEQ ID NO1，圖1A和圖1B)編碼26-kDa CryET29蛋白，此蛋白具有在圖1A和圖1B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。編碼這幾種肽的DNA區(qū)段，還可能證明是編碼結(jié)晶蛋白相關(guān)的，或其它非相關(guān)性基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，多肽，亞單位，和功能區(qū)等的DNA區(qū)段。此外，這些DNA區(qū)段，還可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，在體外完全人工合成。
在此使用的名詞“DNA區(qū)段”指的是，已被分離不含特定種類全基因組DNA的DNA分子。因此，編碼結(jié)晶蛋白或肽的DNA區(qū)段指的是，包含結(jié)晶蛋白編碼序列的DNA區(qū)段，但是，此編碼序列已從某種菌的全基因組DNA中分離出，或者是從其中純化出，該DNA區(qū)段就是來自這種菌，在本發(fā)明的情況下，該區(qū)段是革蘭氏陽性菌屬，芽孢桿菌屬，特別是被稱為蘇云金芽孢桿菌的基因組。包括在此名詞“DNA區(qū)段”中的有DNA區(qū)段和這種區(qū)段的小片段，還有重組載體，包括例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌粒，噬菌體，病毒等。
類似地，包含分離或純化結(jié)晶蛋白編碼基因的DNA區(qū)段指的是，此DNA區(qū)段還可能包括除了肽編碼序列的某些其它成分，例如基本上從其它天然存在的基因或蛋白質(zhì)編碼序列分離的調(diào)節(jié)序列。在這方面，為簡便起見，名詞“基因”被用于表示功能性的蛋白、多肽或肽編碼單位。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，此功能性術(shù)語不僅包括包含染色體外DNA序列的基因組序列，而且包括操縱子序列和/或工程基因區(qū)段，這些區(qū)段能表達，或者可能是被裝配能表達蛋白質(zhì)、多肽或肽。
“基本上從其它編碼序列分離的”意指所研究的基因構(gòu)成了該DNA區(qū)段編碼區(qū)的重要部分，在此，該基因是編碼細菌結(jié)晶蛋白的基因，此措辭還意指該DNA區(qū)段不包含大部分天然存在的編碼DNA，如大染色體片段或者其它的功能性基因或操縱子編碼區(qū)。當(dāng)然，這指的是原來已被分離的DNA區(qū)段，并且不排除通過人工后來加入此區(qū)段的基因，重組基因，合成接頭，或編碼區(qū)。
在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及一些分離的DNA區(qū)段和重組載體，它們摻入了編碼一種Cry蛋白或肽的DNA序列，這種Cry蛋白或肽，在其氨基酸序列中包括基本上如在SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列。更優(yōu)選的是，此DNA序列包含編碼一種Cry蛋白或肽的核酸序列，這種Cry蛋白或肽在其氨基酸序列中，包括SEQ ID NO2的至少10個緊連的氨基酸序列。
名詞“基本上如在SEQ ID NO2中列出的序列”意指此序列基本上與SEQ ID NO2序列的一部分相對應(yīng)，并有相對少數(shù)氨基酸不同于任何這些序列的氨基酸，或者是生物學(xué)功能等價的氨基酸。名詞“生物學(xué)功能等價的”是本領(lǐng)域熟知的，在此將進一步作詳細規(guī)定(例如見例證性實施方案)。相應(yīng)地，具有約70％-80％的，或更優(yōu)選地具有約81％-90％的，或者更加優(yōu)選地具有約91％-99％的氨基酸序列，與SEQ ID NO2的氨基酸相同或功能等價的序列，將是“基本上如SEQ ID NO2中列出的”序列。
還應(yīng)理解的是，氨基酸或核酸序列都可能包括附加殘基，例如附加的N-端或C-端氨基酸，或者5′或3′序列，但仍然基本上是如在此公開的序列之一，只要此序列滿足上面列舉的標準，包括在涉及蛋白質(zhì)表達時，保持蛋白質(zhì)的生物活性。附加末端序列的情況特別適合于核酸序列，例如它可能包括在編碼區(qū)5′或3′部分側(cè)翼的各種非編碼序列，或者可能包括各種內(nèi)部序列即內(nèi)含子，已知這些在基因中都存在。
本發(fā)明的核酸區(qū)段，不論編碼序列本身的長度，都可能與其它DNA序列組合，如啟動子，聚腺苷酸化信號，附加的限制性酶切位點，多克隆位點，其它的編碼區(qū)段等，這樣使它們的總長度可能非?？捎^。因此可以設(shè)想，幾乎任何長度的核酸片段都可使用，其總長度優(yōu)選取決于制備和在計劃的重組DNA方案中的應(yīng)用的便利。例如，可以制備包括短而緊連的一段核酸片段，此片段編碼SEQ ID NO2中所公開的全部或部分肽序列，或者還可以制備與編碼SEQ ID NO2中所公開肽的DNA序列，特別是與SEQ ID NO1中所公開的DNA區(qū)段相同或互補的核酸片段。例如，還可預(yù)期如下各種長度的DNA序列都是有用的如約14個核苷酸的DNA序列，以及相當(dāng)于大約10000，5000，3000，2000，1000，500，200，100，50和14個堿基對長度(包括全部中等長度)的DNA序列。
應(yīng)該容易理解的是，“中等長度”就此而言意指所標示范圍之間的任何長度，例如14、15、16、17、18、19、20等等，21、22、23等等，30、31、32等等，50、51、52、53等等，100、101、102、103等等，150、151、152、153等等，包括從200-500，500-1000，1000-2000，2000-3000，3000-5000的全部整數(shù)，以及直至并包括大約10000個核苷酸的序列等等。
還應(yīng)理解到，本發(fā)明并不局限于編碼本發(fā)明肽的特定核酸序列，或者是編碼SEQ ID NO2氨基酸序列的核酸序列，包括在SEQ IDNO1中特別公開的DNA序列。因此，重組載體和分離的DNA區(qū)段可能廣泛地包括這種肽編碼區(qū)本身，在基礎(chǔ)編碼區(qū)內(nèi)帶有選擇性改變或修飾的編碼區(qū)，或者它們雖然包括這些肽編碼區(qū)，但還可以編碼較大的多肽，或者可以編碼具有不同氨基酸序列的，生物功能等價的蛋白質(zhì)或肽。
本發(fā)明的DNA區(qū)段包括生物功能性等效的肽。這些序列可能由于密碼子豐余性和功能等效性的結(jié)果而產(chǎn)生，已知在核酸序列和這樣編碼的蛋白質(zhì)中天然存在這種特性。另一方面，功能等效的蛋白質(zhì)或肽可通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，其中，根據(jù)被交換氨基酸的特性，可設(shè)計改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^應(yīng)用定點誘變技術(shù)導(dǎo)入人工設(shè)計的改變，例如，以改進蛋白質(zhì)的抗原性或檢測突變體，以便在分子水平測定其活性。
如果需要，還可以制備融合蛋白和肽，例如其中在相同的表達單位內(nèi)，這些肽編碼區(qū)與具有所需功能的其它蛋白質(zhì)或肽相匹配，如為了純化或免疫檢測的目的(例如，分別通過親和層析，和酶標編碼區(qū)可純化的蛋白)。
重組載體構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。預(yù)期特別有用的載體，是那些其中不論是編碼全長度蛋白質(zhì)或者是較小肽的DNA區(qū)段編碼區(qū)，是處于啟動子控制之下的載體。這種啟動子可能以同編碼本發(fā)明肽的基因自然結(jié)合的形式存在，因為它可以通過分離位于編碼區(qū)段或外顯子上游的5′非編碼序列獲得，例如應(yīng)用與在此公開的組合物有關(guān)的重組克隆技術(shù)和/或PCRTM技術(shù)。2.2 以DNA區(qū)段作為雜交探針和引物除了將它們用于定向表達本發(fā)明的結(jié)晶蛋白或肽之外，在此設(shè)計的核酸序列還有多種其它用處。例如，在核酸雜交實施方案中，它們還可以用作探針或引物。因此可以設(shè)想，將會發(fā)現(xiàn)這樣一種核酸區(qū)段特別有用，它包括由至少14個核苷酸長度的緊連序列組成的序列區(qū)，并且此緊連序列具有與SEQ ID NO1的14個核苷酸長度的緊連DNA區(qū)段相同或互補的序列。在某些實施方案中，較長且緊連的相同或互補序列也是有用的，例如那些大約20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000等的序列(包括所有中等長度的，以及直至包括全長度的序列)。
這種核酸探針與結(jié)晶蛋白編碼序列特異性雜交的能力，將使它們能用于檢測給定樣品中互補序列的存在。但是，還可設(shè)想其它的用途包括將此序列信息用于制備突變種的引物，或者制備用于構(gòu)建其它基因的引物。
特別設(shè)計了具有如下特征的核酸分子作為雜交探針用于例如DNA和RNA印跡試驗，此核酸分子含有由大約10-14，15-20，30，50，或者甚至100-200個核苷酸緊連的一段核苷酸組成的序列區(qū)，而這緊連的一段核苷酸是與SEQ ID NO1的DNA序列相同或互補的。發(fā)現(xiàn)較小的片段一般用于雜交實施方案，其中緊連互補區(qū)的長度可能改變，例如大約10-14，以及約100或200個核苷酸，但是根據(jù)所要檢測的互補序列的長度，也可以使用較長的緊連互補片段。
使用長度約14個核苷酸的雜交探針，便于形成既穩(wěn)定又具選擇性的雙螺旋分子。但是，為了增加雜交的穩(wěn)定性和選擇性，并因此改進所得的特異性雜交分子的質(zhì)量和水平，通常優(yōu)選的是具有長度多于14個堿基的較長的一段緊連互補序列的分子。一般愿意設(shè)計具有一段15-20個緊連核苷酸的基因互補序列的核酸分子，或者需要時甚至可以更長些。
當(dāng)然，還可以通過其它技術(shù)獲得這些片段，例如通過機械剪切或限制性酶切消化。小核酸片段或片段易于制備，可借助于例如用化學(xué)方法直接合成這種片段，通常是用自動化的寡核苷酸合成儀來實現(xiàn)。還可以通過如下手段獲得這些片段通過應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)如美國專利4,683,195和4,683,202(均被引入作為參考)的PCRTM技術(shù)，通過將選擇的序列導(dǎo)入重組載體來重組產(chǎn)生，以及通過分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常熟知的其它重組DNA技術(shù)。
因此，本發(fā)明的核苷酸序列可被利用，是因為它們能與DNA片段的互補鏈選擇性地形成雙螺旋分子。取決于預(yù)期的應(yīng)用，要求采用不同的雜交條件，以便達到探針對靶標序列不同程度的選擇性。對于需要高選擇性的應(yīng)用，一般要求采用相對嚴格的形成雜交體的條件，例如可選擇較低濃度的鹽和/或高溫度條件，如在大約50℃-70℃的溫度下，提供約0.02M-0.15M NaCl。這些選擇性條件只允許在探針和模板或靶標單鏈之間有很少的錯配，并且特別適合用于分離編碼結(jié)晶蛋白的DNA序列。通過雜交檢測DNA區(qū)段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，美國專利4,965,188和5,176,995(均被引入作為參考)的說明，是雜交分析法的示范性論述。如在Maloy et al，1994；Segal，176；Prokop，1991和Kuby，1994的教科書中可找到的論述特別適用。
當(dāng)然，對于某些應(yīng)用，例如當(dāng)要求制備采用與初始模板雜交的突變引物單鏈的突變體時，或者當(dāng)試圖從相關(guān)種類分離結(jié)晶蛋白編碼序列，或分離功能等效序列時，為了能形成異源雙鏈，通常只需要較低嚴格的雜交條件。在這些情況下，可能需要采用如約0.15M-0.9M的鹽，約20°-55℃溫度范圍內(nèi)的條件。作為相對于對照雜交的陽性雜交信號，因此交叉雜交種可以容易地被鑒定。總之，一般認為，通過加入增加量的甲酰胺，可以使條件變得更嚴格，此甲酰胺象提高溫度一樣起作用，以某種方式使雜交雙鏈不穩(wěn)定。這樣，雜交條件可以被容易地控制，并且因此，一般是一種由所要求的結(jié)果來決定的選擇方法。
在某些實施方案中，使用本發(fā)明的核酸序列與適當(dāng)?shù)募夹g(shù)如標記法相結(jié)合，用于雜交測定是便利的。本領(lǐng)域已知廣泛多種適合的能給出可檢測信號的標記手段，包括熒光標記，放射性標記，酶標記或其它配體如親和素/生物素標記。在優(yōu)選的實施方案中，人們很可能希望采用熒光標記或酶標記，如用脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶，而不用放射性標記或其它環(huán)境污染試劑。在酶標記的情況下，已知顯色指示底物可用于提供人眼或分光光度法可識別的信號，來鑒別與樣品所含互補核酸的特異性雜交。
一般可以設(shè)想，在此所述的雜交探針既可作為試劑在雜交液中使用，又可在采用固相法的實施方案中使用。在包括固相法的實施方案中，待測DNA(或RNA)是被吸附或者被固定在所選用的基質(zhì)或表面上。然后使這種被固定的單鏈核酸，在要求的條件下與選用的探針進行特異性雜交。所選擇的條件將取決于基于所要求的特定標準的特定環(huán)境(取決于例如G+C含量，靶核酸的類型，核酸的來源，雜交探針的大小等)。在漂洗雜交表面，以便除去非特異性結(jié)合的探針分子之后，可借助于標記法對特異性雜交進行檢測，或者甚至可以定量測定。2.3 重組載體和蛋白質(zhì)表達本發(fā)明還公開了一個包含CryET29結(jié)晶蛋白的組合物，并對它要求專利保護。此組合物可能包含表達CryET29結(jié)晶蛋白的細菌宿主細胞，含有CryET29蛋白的包涵體或結(jié)晶，培養(yǎng)物上清液，破碎的細胞，細胞提取液，溶胞產(chǎn)物，和勻漿等等。此組合物可能以含水的形式存在，或者以干燥，半濕或其它類似形式存在，如細胞漿，細胞沉淀塊，或者以冰凍干燥，制成粉末，真空冷凍干燥、蒸發(fā)，或其它類似的方法制成干燥形式。這些制備結(jié)晶蛋白的方法，是從事細胞蛋白分離和純化的技術(shù)人員所熟知的。在某些實施方案中，該結(jié)晶蛋白還可以被純化，濃縮，與其它藥劑混合，或者被加工成所需要的最后形式。此組合物將優(yōu)選地包含按重量計1％-90％的該結(jié)晶蛋白，更優(yōu)選的是包含按重量計5％-50％的結(jié)晶蛋白。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)晶蛋白組合物可按如下方法制備，它包括在能夠有效地產(chǎn)生這種蛋白的條件下培養(yǎng)表達CryET29結(jié)晶蛋白的蘇云金芽孢桿菌細胞，然后從此細胞中獲得這種蛋白的步驟。為了獲得這種結(jié)晶蛋白，還可能進一步包括純化、濃縮、加工，或者將此蛋白同一種或幾種藥劑混合的步驟。此CryET29結(jié)晶蛋白優(yōu)選地是以大約1％-90％的重量含量獲得，更優(yōu)選的是按重量含量約5％-50％。
本發(fā)明還涉及制備CryET29結(jié)晶蛋白組合物的方法。這種方法通常包括在能有效地產(chǎn)生這種蛋白的條件下，培養(yǎng)表達CryET29結(jié)晶蛋白的蘇云金芽孢桿菌細胞，然后獲得如此產(chǎn)生的這種蛋白質(zhì)的步驟。在優(yōu)選的實施方案中，蘇云金芽孢桿菌細胞是NRRL B-21582細胞，或者是含有cryET29基因區(qū)段的其它任何蘇云金芽孢桿菌細胞。另一種方法是，可用本發(fā)明的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化其它適合的細菌或真核細胞，來產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)晶蛋白。原核宿主細胞包括革蘭氏陰菌如大腸桿菌，假單胞菌屬種，和相關(guān)的腸菌科菌，或者革蘭氏陽性菌如芽孢桿菌屬種(包括巨大芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌)等，都被預(yù)期可用于制備本發(fā)明的結(jié)晶蛋白。
在這類實施方案中，預(yù)期通過將DNA編碼區(qū)段安排在重組的，或異源性啟動子的控制之下，將可獲得某些優(yōu)勢。如在此使用的重組的或異源性啟動子，意指在其天然環(huán)境下，不是正常與編碼結(jié)晶蛋白或肽的DNA區(qū)段結(jié)合的啟動子。這類啟動子可能包括與其它基因正常結(jié)合的啟動子，和/或從任何細菌、病毒、真核細胞，或植物細胞分離出的啟動子。當(dāng)然，重要的是采用能在被選擇用于表達的細胞類型、微生物、或者甚至動物內(nèi)，有效地引導(dǎo)DNA區(qū)段表達的啟動子。將啟動子和細胞類型組合用于蛋白質(zhì)表達，是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員一般熟知的，例如可參見Sambrook et al，1989。所采用的啟動子可以是組成型的，或者是誘導(dǎo)的，并且可以在合適的條件下引導(dǎo)被導(dǎo)入的DNA區(qū)段進行高水平表達，例如有利于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白或肽的條件。計劃用于高水平表達的適合的啟動子系統(tǒng)包括，但不限于，畢赤酵母表達載體系統(tǒng)(Pharmacia LKB Biotechnology)。
在有關(guān)為了制備重組蛋白和肽的表達實施方案中，預(yù)期將最常使用較長的DNA區(qū)段，而編碼全肽序列的DNA區(qū)段是最優(yōu)選的。但是顯然，將較短的DNA區(qū)段引導(dǎo)表達結(jié)晶蛋白或抗原表位核心區(qū)的用途，例如可用于產(chǎn)生抗-結(jié)晶蛋白抗體，也屬于本發(fā)明的范圍。設(shè)想編碼如下長度肽抗原的DNA區(qū)段特別有用大約8-50個氨基酸，或較優(yōu)選的是大約8-30個氨基酸，或者更加優(yōu)選的是大約8-20個氨基酸。這種肽抗原表位可以是包含來自SEQ ID NO2緊連氨基酸序列的氨基酸序列。2.4 結(jié)晶蛋白轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因宿主細胞還有另一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞的方法，特別是表達編碼本發(fā)明新型CryET29結(jié)晶蛋白的核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)基因植物或動物細胞。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。概括地說，此方法包括以含有一種啟動子的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎藛幼右延行У剡B接于編碼蘇云金芽孢桿菌CryET29結(jié)晶蛋白的編碼區(qū)。此編碼區(qū)通常有效地連接于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，從而使此啟動子能驅(qū)動細胞中編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄，并因此賦予細胞在體內(nèi)產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的能力。另一方面，在要求控制，調(diào)節(jié)或減少在特定轉(zhuǎn)基因細胞中表達的特定重組結(jié)晶蛋白含量的情況下，本發(fā)明還為結(jié)晶蛋白反義mRNA的表達創(chuàng)造了條件。用反義mRNA作為控制或減少細胞中某種已知待研究蛋白質(zhì)含量的手段，是本領(lǐng)域熟知的方法。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種已用本發(fā)明的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)化的植物細胞，并且這種植物細胞能表達編碼在此所公開的一種或幾種新型多肽組合物的基因或基因區(qū)段。如在此使用的名詞“轉(zhuǎn)基因植物細胞”，意指一種已摻入某種DNA序列的植物細胞，此DNA序列包括但不局限于也許是正常不存在的基因，正常不被轉(zhuǎn)錄成RNA或翻譯成蛋白質(zhì)(“表達”)的DNA序列，或者是希望導(dǎo)入非轉(zhuǎn)化植物的其它任何基因或DNA序列，例如可能是正常存在于非轉(zhuǎn)化植物的，但希望對它作基因工程處理或希望改變其表達的基因。
預(yù)期在某些情況下，通過穩(wěn)定地導(dǎo)入cryET29轉(zhuǎn)基因，天然的cryET29，或者人工修飾或突變的cryET29，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的基因組將被擴大。在某些情況下，將把一個以上轉(zhuǎn)基因摻入被轉(zhuǎn)化宿主植物細胞的基因組。將一個以上結(jié)晶蛋白編碼DNA序列摻入這種植物基因組時的情形就是這樣。在某些情況下，理想的可能是有一個、二個、三個、四個，或者甚至更多的蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白(天然的或基因工程重組的)被摻入轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中，并被穩(wěn)定地表達。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锛毎幕蚪M，可導(dǎo)致穩(wěn)定的整合作用，使這些植物后代的基因組中也含有轉(zhuǎn)基因拷貝。最初已導(dǎo)入此基因的植物子代，對這種遺傳成分的遺傳性正是本發(fā)明的優(yōu)勢所在。
可被導(dǎo)入的優(yōu)選基因包括例如，細菌來源的編碼結(jié)晶蛋白DNA序列，特別是一個或幾個在此所述的，從芽孢桿菌屬種獲得的這種DNA序列。最優(yōu)選的核酸序列是從蘇云金芽孢桿菌獲得的核酸序列，或者是那些已經(jīng)基因工程改造，以便降低或增加這種被轉(zhuǎn)化宿主細胞內(nèi)此結(jié)晶蛋白殺蟲活性的任何一種序列。
轉(zhuǎn)化植物細胞并制備轉(zhuǎn)基因細胞株的方法，是本領(lǐng)域熟知的(如在美國專利5,550,318；5,508,468；5,482,852；5,384,253；5,276,269和5,225,341中已有例證性說明，特將所有這些專利引入作為參考)，在此僅作簡單論述。當(dāng)然，用于轉(zhuǎn)化這類細胞的載體，質(zhì)粒，粘粒，YAC(酵母人工染色體)和DNA區(qū)段，通常都包含有本發(fā)明的操縱子，基因或基因衍生序列，天然的或人工合成的衍生序列，特別是編碼所公開結(jié)晶蛋白的序列。這些DNA構(gòu)建物還可進一步包括如下結(jié)構(gòu)，如啟動子，增強子，多接頭，或者甚至是對所需要的待研究特定基因具有正向或負向調(diào)節(jié)活性的基因序列。此DNA區(qū)段或基因可編碼天然的或被修飾的結(jié)晶蛋白，它們將在形成的重組細胞中表達，并且/或者將對再生的植物賦予改良的表型。
通過將編碼對鞘翅類昆蟲有害的CryET29結(jié)晶蛋白的轉(zhuǎn)基因DNA區(qū)段摻入一種植物，對于增加單子葉或雙子葉植物的殺蟲抗性，這種轉(zhuǎn)基因植物可能是理想的。特別優(yōu)選的植物包括玉米、小麥、大豆、草皮草、觀賞植物、果樹、灌木、蔬菜、谷物、豆科植物等等，或者需要將結(jié)晶蛋白轉(zhuǎn)基因?qū)氲娜魏我环N植物。
與本發(fā)明有關(guān)的還包括由轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子，從這種種子產(chǎn)生的后代，以及由根據(jù)上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)基因植物的后代產(chǎn)生的種子。這些后代和種子將具有被穩(wěn)定摻入其基因組的結(jié)晶蛋白轉(zhuǎn)基因，并且，這些后代植物將按孟德爾方式遺傳由導(dǎo)入穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因所賦予的品質(zhì)。所有這些已將編碼CryET29結(jié)晶蛋白或肽的轉(zhuǎn)基因DNA區(qū)段摻入其基因組的轉(zhuǎn)基因植物，都是本發(fā)明的內(nèi)容。2.5 位點特異性誘變位點特異性誘變，是一種通過對初始DNA特異性誘變，在各種肽，或者生物功能等效的蛋白質(zhì)或肽的制備過程中有用的技術(shù)。此技術(shù)還進一步具有快速制備和測定序列變異體的能力，例如結(jié)合上述的一種或幾種情況，通過將一個或幾個核苷酸序列改變導(dǎo)入此DNA。位點特異性誘變使有可能通過使用編碼需要突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列，產(chǎn)生突變體，以及足夠數(shù)量的連續(xù)核苷酸，以便為在被切斷的缺失接點的二側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈，提供有足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列。一般情況下，約17-75個核苷酸或更長一點的引物是優(yōu)選的，并且在接點兩側(cè)，有大約10-25個或更多一點殘基被改變。
一般說來，位點特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，已有多種論著進行了例證性說明。應(yīng)該了解的是，該技術(shù)一般是使用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點誘變的典型載體包括如M13噬菌體載體。這些噬菌體容易購得，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員對它們的使用通常是熟知的。在定點誘變中，雙鏈質(zhì)粒也被常規(guī)地采用，它可省去將所需的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至噬菌體的步驟。
概括地說，在此的定點誘變是通過首先獲得單鏈載體或融開雙鏈載體的二條鏈來進行，在此載體的序列中包含有編碼所需肽的DNA序列。并且制備具有所需突變序列的寡核苷酸引物，通常是人工合成。然后以單鏈載體將此引物退火，并受DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶IKlenow片段的作用，以便完成帶有突變單鏈的合成。這樣就形成了異源性二聚體，其中一條鏈編碼原來未突變的序列，另一條鏈帶有所需的突變。然后用這種異源性二聚體載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)募毎?，如大腸桿菌細胞，并選擇出包含帶有突變序列結(jié)構(gòu)重組載體的克隆。為了富集摻入誘變寡核苷酸的克隆，Kunkel et al(1987)設(shè)計了一種基因選擇方案。另一種方法是采用PCRTM，以可購得的熱穩(wěn)定酶如Taq聚合酶，可用于將誘變寡核苷酸引物摻入被擴增的DNA片段，然后可將此DNA片段克隆進入適當(dāng)?shù)目寺』虮磉_載體。Tomic et al(1990)和Upender et al(1995)的PCRTM一介導(dǎo)誘變程序，為此方案提供了二個范例。除熱穩(wěn)定聚合酶外，采用熱穩(wěn)定連接酶的PCRTM法也可用于將磷酸化的誘變寡核苷酸摻入被擴增的DNA片段，然后也可將此DNA片段克隆進入適當(dāng)?shù)目寺』虮磉_載體。Micheel(1994)所述的誘變程序，為這樣一種方案提供了范例。
應(yīng)用定點誘變制備所選擇肽的編碼DNA區(qū)段的序列變異體，被提供作為產(chǎn)生潛在有用品種的手段，這并不意味著被限制，因為還有其它途徑可以得到肽序列變異體和編碼它們的DNA序列。例如，為了獲得序列變異體，可用誘變劑如羥胺處理編碼所需肽序列的重組載體。
在此使用的名詞“寡核苷酸定向誘變程序”指的是模板依賴性過程和載體介導(dǎo)的增殖過程，它們可導(dǎo)致增加相對于其起始濃度的特異性核酸分子的濃度，或者增加可檢測信號的強度，如放大作用。在此使用的名詞“寡核苷酸定向誘變程序”還意指一個包括引物分子模板依賴性延伸的過程。名詞“模板依賴性過程”指的是RNA或DNA分子的核酸合成過程，其中新合成核酸鏈的序列，由熟知的互補堿基配對法則確定(見例如Watson，1987)。通常，載體介導(dǎo)的方法包括將此核酸片段導(dǎo)入DNA或RNA載體，此載體的克隆擴增，以及回收擴增的核酸片段，美國專利No.4,237,224提供了此方法的范例，將此全部被引入作為參考。
多種模板依賴性過程可用于擴增樣品中存在的所需靶序列。最著名的擴增方法之一是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCRTM)，在美國專利No.4,683,195；4,683,202和4,800,159中對此方法有詳述，在此均被全部引入作為參考。簡單地說，PCRTM中需制備二個與靶序列的相對互補鏈上一些區(qū)域互補的引物序列。將過量的三磷酸脫氧核苷隨同DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一道加到反應(yīng)混合物中。如果樣品中存在靶序列，引物將與靶序列結(jié)合，聚合酶將通過加上核苷酸，使引物沿靶序列延伸。通過升高或降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物將與靶序列解離，形成反應(yīng)產(chǎn)物，剩余的引物將與靶序列和此反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合，過程重復(fù)進行。為了定量測定被擴增的mRNA量，優(yōu)選地可進行逆轉(zhuǎn)錄酶PCRTM擴增程序。聚合酶鏈式反應(yīng)法是本領(lǐng)域熟知的。另一個用于擴增的方法是連接酶鏈式反應(yīng)(被稱為LCR)，公布于歐洲專利申請
發(fā)明者M·J·魯帕, W·P·多諾范, Y·P·譚, A·C·斯萊尼 申請人:艾可根公司