專利名稱：新的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)重組領(lǐng)域。更具體地，涉及對(duì)人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的重組改造。此外，本發(fā)明還涉及有關(guān)的表達(dá)載體、生產(chǎn)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的工程菌和含有該重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥物組合物等方面。
集落刺激因子(CSF)是一類生物體內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，它們能刺激體內(nèi)造血細(xì)胞的增殖分化，提高造血功能和免疫功能。已發(fā)現(xiàn)有多種類型的CSF，主要包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等。
人粒細(xì)胞集落刺激因子(Human Granulocyte Colony Stimulating Factor,hG-CSF)是由人體的內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等所分泌的一種糖蛋白。它由174個(gè)氨基酸組成，并在133位氨基酸上連有一糖鏈。其主要功能是促進(jìn)造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化、成熟，并增強(qiáng)其吞噬功能。
在中國(guó)專利申請(qǐng)CN86106234(申請(qǐng)人為柯瑞英-艾格公司，又譯為安進(jìn)(Amgen)公司)中，公開(kāi)了粒細(xì)胞集落刺激因子的核苷酸序列和氨基酸序列，以及有關(guān)的載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和多肽。該申請(qǐng)還對(duì)G-CSF的17、36、42、64和74位上的半胱氨酸殘基進(jìn)行置換，公開(kāi)了突變體[Ala1]G-CSF、[Ser17]G-CSF、[Ser36]G-CSF、[Ser42]G-CSF、[Ser64]G-CSF、[Ser74]G-CSF等突變形式。該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
此外，在中國(guó)專利申請(qǐng)CN86106815(申請(qǐng)人為日本中外制藥株式會(huì)社)中，公開(kāi)了具有人G-CSF活性多肽的基因、插入該基因的重組載體、含該載體的轉(zhuǎn)化體、由轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的具有G-CSF活性的多肽和糖蛋白，以及生產(chǎn)具有人G-CSF活性的多肽和糖蛋白的方法。該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
在安進(jìn)公司的中國(guó)專利申請(qǐng)CN94191031中，發(fā)明名稱為“G-CSF類似物組合物及其制備方法”，公開(kāi)了編碼多種G-CSF類似物的核酸序列、宿主細(xì)胞、載體。還公開(kāi)了設(shè)計(jì)G-CSF類似物及相關(guān)組合物的方法。該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
自發(fā)現(xiàn)G-CSF以來(lái)，安進(jìn)公司和日本中外制藥株式會(huì)社等公司分別利用重組技術(shù)，開(kāi)發(fā)出了多種G-CSF產(chǎn)品。其產(chǎn)品具有與天然G-CSF相同的生物活性，已廣泛應(yīng)用于治療各種原因尤其是腫瘤化療和放療引起的中性粒細(xì)胞減少、再生障礙性貧血等癥狀，并在提高骨髓移植及外周血干細(xì)胞移植成功率等方面起到了極其重要的作用。
但是，已有技術(shù)中的G-CSF的生物活性較低，或者雖然生物活性有所提高，但仍難以滿足要求。因此迫切需要一種活性高的G-CSF重組蛋白。
此外，已有技術(shù)中的G-CSF穩(wěn)定性較差。因?yàn)镚-CSF樣品的藥效不穩(wěn)定，所以目前只有水劑型，其運(yùn)輸、儲(chǔ)存都要求在4℃進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)中上述缺點(diǎn)，提供一種生物活性高和/或穩(wěn)定性好的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的G-CSF突變體，其活性更高。
本發(fā)明的目的之二是提供一種新的G-CSF突變體，它不僅活性更高，而且穩(wěn)定性更好，從而可以被制成凍干粉劑。
本發(fā)明的目的之三是提供一種含有編碼該G-CSF突變體的核酸序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明的目的之四是提供一種產(chǎn)生新型G-CSF突變體的宿主細(xì)胞，它所產(chǎn)生的G-CSF具有更高的活性和/或更高的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的目的之五是提供一種含有該新型G-CSF的藥物組合物。


圖1是本發(fā)明的G-CSF突變體以及天然G-CSF的cDNA序列。其中上行是與天然G-CSF不同的、突變體的cDNA序列；下行是與天然G-CSF相同的cDNA序列。其中在天然G-CSF核苷酸序列5′端ATG前添加了ATG AGA GGA TCC。
圖2是本發(fā)明的一種G-CSF突變體的氨基酸序列以及天然G-CSF的氨基酸序列。其中在上行粗體部分是與天然G-CSF不同的、突變體的氨基酸序列；下行是與天然G-CSF相同的氨基酸序列。其中在天然G-CSF氨基酸序列N端添加了Met Arg Gly Ser和/或在17位用Ala替換Cys。
圖3是重組G-CSFa的PCR克隆及表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程的示意圖。
圖4是本發(fā)明的一種重組蛋白G-CSFa與國(guó)外產(chǎn)品的活性比較圖本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在G-CSF的N端添加包含精氨酸在內(nèi)的氨基酸殘基，可以提高重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的活性和/或穩(wěn)定性。這是因?yàn)榫彼崾菐в姓姾傻陌被?，將其添加在G-CSF的N端，可提高重組G-CSF與細(xì)胞上相關(guān)受體(或細(xì)胞因子)的結(jié)合。
在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
因而，本發(fā)明提供了一種重組的人粒細(xì)胞集落刺激因子，它在序列的N端添加了3-6個(gè)氨基酸殘基，且其中至少一個(gè)氨基酸殘基是精氨酸。更佳地，在序列N端添加4-6個(gè)氨基酸，且該4-6個(gè)氨基酸含有序列甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-絲氨酸。
在本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施例中，所提供的重組重組人粒細(xì)胞集落刺激因子在N端添加甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-絲氨酸，和/或第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
本發(fā)明還提供了含有編碼上述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的核酸序列的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包括有效量的上述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。更佳地，該組合物是凍干粉劑或水劑；最佳地，該組合物是凍干粉劑。
經(jīng)本發(fā)明人的研究表明，盡管確切的機(jī)制還不清楚，但是通過(guò)在G-CSF的N端添加帶正電荷的精氨酸殘基，可以提高重組G-CSF與相關(guān)的細(xì)胞受體的結(jié)合和/或作用，從而提高重組G-CSF的藥效。
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明對(duì)天然和或重組的G-CSF的N端進(jìn)行了修飾，即在G-CSF序列的N端添加了3-6個(gè)氨基酸殘基，且其中至少一個(gè)氨基酸殘基是精氨酸。更佳地，在序列N端添加4-6個(gè)氨基酸，且該序列含有甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-絲氨酸。
又根據(jù)本發(fā)明人及本領(lǐng)域其他研究人員的研究表明，G-CSF的穩(wěn)定性與半胱氨酸殘基有關(guān)系。對(duì)于原序列中不參與形成二硫鍵的半胱氨酸，如17位的半胱氨酸，用其他氨基酸加以替換，尤其是用丙氨酸加以替換，可進(jìn)一步提供重組G-CSF的穩(wěn)定性。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施例中，所提供的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，它在N端添加了甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-絲氨酸，而且第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
除了在N端進(jìn)行上述的氨基酸添加和/或17位氨基酸的替換之外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，還可對(duì)其他位置的氨基酸進(jìn)行修飾，如取代、插入或缺失。對(duì)于取代，可用性質(zhì)相近的氨基酸加以取代。較佳地，這種氨基酸取代是在下表1中同一組別(代表性的取代)中進(jìn)行，最佳地這種取代是下表1中優(yōu)選的取代。
表1
對(duì)DNA進(jìn)行遺傳修飾的技術(shù)總結(jié)于誘變一種實(shí)用方法(Mutagenesis:aPractical Approach)，M.J.McPherson,Ed.,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)，例如包括定點(diǎn)誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)誘變。該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
可以通過(guò)PCR法等方法，獲得天然的和/或重組的G-CSF核苷酸序列，然后用各種本領(lǐng)域中熟知的誘變方法進(jìn)行本發(fā)明所述的突變。本發(fā)明的一種G-CSF突變體的DNA序列在圖1中列出。但是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所以可以制備許多種核苷酸，它們都是能夠指導(dǎo)合成本發(fā)明的重組G-CSF。因此，功能上與上述序列等價(jià)的DNA序列，或者功能上與指導(dǎo)合成本發(fā)明重組G-CSF蛋白質(zhì)類似物(按照氨基酸序列產(chǎn)生的)的序列相等價(jià)的序列，都被包括在本發(fā)明之內(nèi)。
對(duì)于本發(fā)明的編碼新型重組G-CSF的核酸，通過(guò)限制性酶切，然后與質(zhì)粒片段連接，可以被克隆人合適的載體如質(zhì)粒中。對(duì)于選用的質(zhì)粒，沒(méi)有特別的限制，只要它能在選用的宿主細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)重組的G-CSF。
當(dāng)然，該重組蛋白的編碼序列也可整合如宿主細(xì)胞的基因組中。
含有編碼新型重組G-CSF的核酸的質(zhì)粒，一般含有合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件，以及合適的選擇基因(如抗生素抗性基因，比如氨芐青霉素抗性基因；或營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因)，這些都是本領(lǐng)域中熟知的?？蓞⒁?jiàn)Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
攜帶本發(fā)明的重組G-CSF編碼序列的表達(dá)載體，可用本領(lǐng)域熟知的方法，如電穿孔、共轉(zhuǎn)染法等，轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核生物或真核生物，如大腸桿菌、枯草桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。但是較佳地是大腸桿菌。
在轉(zhuǎn)化之后，用常規(guī)方法篩選出轉(zhuǎn)化子。并根據(jù)所用的宿主細(xì)胞和表達(dá)載體，用本領(lǐng)域常規(guī)使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來(lái)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而表達(dá)重組的G-CSF。
在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的重組G-CSF之后，如果重組蛋白被分泌入培養(yǎng)基中，可以直接從培養(yǎng)基中分離純化出重組蛋白。如果重組蛋白是以包涵體形式被表達(dá)，那么可從培養(yǎng)物中，通過(guò)裂解細(xì)胞、分離、提純等步驟獲得所需的重組蛋白。這些步驟和方法都是本領(lǐng)域中熟知的，可參見(jiàn)例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包括有效量的本發(fā)明的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。至于載體和/或賦形劑，可以在制備G-CSF藥品中所采用的常規(guī)載體和/或賦形劑中加以選擇。例如與水等制成水劑。
但是，如上所述，本發(fā)明的重組G-CSF不僅藥效顯著提高，而且穩(wěn)定性也有明顯提高，因此本發(fā)明的藥物組合物除了被制成本領(lǐng)域中常見(jiàn)的水劑之外，還可被制成凍干粉劑，從而便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。在本申請(qǐng)中，所用的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員通用的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)。
實(shí)施例1G-CSF突變體cDNA的制備從中國(guó)人體單核細(xì)胞中提取mRNA，用標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR技術(shù)制備G-CSF的cDNA。PCR中所用引物為上游引物5′TGG ATC CAT GAC CCC CCT GGG CCC 3′下游引物5′TAA GAT CTC AAG CTT TCA GGG CTG CGC AAG GTG GCGTA 3′這對(duì)引物有如下特點(diǎn)上游引物含BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)(GGATCC)，下游引物含有HindⅢ位點(diǎn)(AAGCTT)和BglⅡ位點(diǎn)(AGA TCT)。引入這些內(nèi)切酶位點(diǎn)(粗體部分)是為了便于隨后的克隆操作。
擴(kuò)增出的序列與原序列相比，在5′端增加了ATG AGA GGA TTC 12個(gè)堿基，而3′端序列中以TGA為終止密碼子。再利用誘變技術(shù)將原序列第49-51位堿基由TGC改為GCC。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)化大腸桿菌將560bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用Genclean System洗脫。然后用BamHⅠ和HindⅢ在37℃消化2小時(shí)。消化產(chǎn)物用苯酚/氯仿抽提，用100％酒精沉淀，沉淀物用70％酒精洗滌一次。然后將此消化產(chǎn)物與事先用BamHⅠ和HindⅢ消化的pQE3載體在16℃進(jìn)行連接反應(yīng)過(guò)夜。將連接產(chǎn)物pQE3-G-CSF轉(zhuǎn)染大腸桿菌M15和JM109感受菌。然后接種于含抗生素的LB平板上。M15大腸桿菌宿主細(xì)胞用于rhG-CSF的高表達(dá)，而JM109宿主細(xì)胞用于對(duì)克隆的G-CSF cDNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行特征鑒定。
通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化后JM109宿主細(xì)胞中G-CSF序列的鑒定，證實(shí)與設(shè)計(jì)是一致的。
同時(shí)，從轉(zhuǎn)化的M15大腸桿菌中篩選出一種轉(zhuǎn)化的大腸桿菌E.coli M15(G-CSFa)，該菌株于1997年10月18日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)武漢市)，保藏號(hào)為No.M97022。
實(shí)施例3重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(G-CSFa)的生產(chǎn)1、生產(chǎn)菌程(工業(yè)菌株)的制備檢定從菌種庫(kù)(-80℃的超低溫冰箱內(nèi))中取G-CSFa生產(chǎn)菌種E.coli M15(G-CSFa)，劃LB平板(在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行)二塊。接種后在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)，挑選4個(gè)菌落，分別接種在含有3ml LB培養(yǎng)液的試管里，在自動(dòng)搖床(G-25KC,New Brunswick Scientific,Inc.U.S.A)搖動(dòng)培養(yǎng)14個(gè)小時(shí)(37℃)。此時(shí)測(cè)得該菌液在600nm吸收峰為0.8，然后每試管中加IPTG，使最終濃度為0.5mM繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，從每試管中取等量1ml菌液離心，用15％SDS-PAGE檢測(cè)G-CSFa的表達(dá)量。
2、種子液的準(zhǔn)備選上述G-CSF表達(dá)最高的為種子液培養(yǎng)。培養(yǎng)基選用TYP，該配方是每升含16克Bacto-胨，16克Bacto-酵母提取物、5克氯化鈉、2.5克磷酸氫二鉀和5克葡萄糖。在250毫升的TYP接種上述單一菌落的G-CSFa菌種，250轉(zhuǎn)/分鐘，37℃培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)，該種子液共500毫升作進(jìn)一步發(fā)酵使用。
3、工業(yè)化發(fā)酵供工業(yè)發(fā)酵的發(fā)酵裝置購(gòu)自美國(guó)New Brunswick Scientific公司，型號(hào)Bio-Fol5000,40升。
工業(yè)發(fā)酵液上述的種子液是進(jìn)一步工業(yè)發(fā)酵液的母液。配制35升TYP培養(yǎng)液于Bio-Flo5000的發(fā)酵罐內(nèi)，同時(shí)加入20ml的消泡劑(anti-foam M-10,HodagChemical Corp Skokie,Illinois,U.S.A.)，然后進(jìn)行自身高溫(121℃和1.2kg/cm2的壓力下)滅菌30分鐘。當(dāng)冷卻到37℃后，在37℃中過(guò)夜，第二天檢查培養(yǎng)液為澄清，無(wú)污染。
將準(zhǔn)備好的500毫升G-CSFa種子液接種到35升的培養(yǎng)液中，發(fā)酵條件溫度為37℃，轉(zhuǎn)速500rpm,pH7.0，空壓0.14kg/cm2，通氧量15L/min，溶氧100％。4小時(shí)后加入7克IPTG，再加入10毫升消泡劑，pH值用氨水調(diào)節(jié)。
4、收菌用工業(yè)化連續(xù)性自動(dòng)離心機(jī)(CEPA A14/)收集菌體，10,000g,4℃，測(cè)定菌體重量。
5、G-CSFa包涵體的提取與粗純化(1)細(xì)胞的裂解將約40克的菌體懸浮在0.8升的提取液A(50mM T-HCl 5mM EDTA pH8.0)中，然后再加200毫升含有250毫克的裂解酶(Lysozyme)的提取液A，在室溫下攪拌10分鐘，此時(shí)，提取液的粘度大大增加，表明細(xì)菌已裂解。
(2)離心和清洗裂解液離心條件為10,000g×10分鐘，4℃，收取沉淀的包涵體，均勻地懸浮于50mM的磷酸緩沖液(含0.15M的氯化鈉和4M尿素，pH7.0)，離心后的沉淀加10ml上述緩沖液(W/V=1/10)，收集包涵體，計(jì)算回收率。
用不同濃度的尿素洗滌包涵體。使包涵體濾液浮于尿素中，離心10分鐘，結(jié)果表明用4M尿素洗滌可最大提高包涵體樣品中G-CSFa的純度，而且包涵體丟失少。
此外，優(yōu)選采用的裂介酶是水溶性的，因?yàn)榘w是不溶性的。這樣，用此方法得到G-CSFa包涵體及以后在精制過(guò)程中G-CSFa便可最大限度地降低該酶造成殘余污染的可能性。
6、G-CSFa蛋白的復(fù)性、粗純與精純化(1)G-CSFa蛋白的復(fù)性經(jīng)過(guò)上述純化的G-CSFa是一種無(wú)生物學(xué)活性和非水溶性的蛋白。該蛋白需要經(jīng)過(guò)一系列構(gòu)象轉(zhuǎn)化的處理，使之成為溶性且具有生物活性的G-CSFa蛋白，這一過(guò)程為GCSFa蛋白復(fù)性。
具體方法步驟為取上述純化的包涵體10克，溶于2000毫升含有6M鹽酸胍，20ml DTT,20mm EDTA的0.1M Tris-HCl的緩沖液，pH7.5，在室溫中攪拌1小時(shí)，然后離心30分鐘(10,000g)。取上清液，超濾濃縮，將含有G-CSFa的上清液通往直徑4cm，柱長(zhǎng)1.2米(床體積1.5升)的Sephadex G-25層析柱。該柱用鹽酸胍，20mM EDTA(pH7.0)溶液平衡。整個(gè)層析過(guò)程在Bio-Pilot純化系統(tǒng)(Pharmacia Biotech,INC,U.S.A.)上進(jìn)行，流速為40毫升/小時(shí)，用UV-280NM分光光度計(jì)和SDS-PAGF(15％)檢測(cè)G-CSF蛋白峰，收集G-CSFa蛋白。然后將該溶液用1M的鹽酸胍稀釋到蛋白濃度為0.3mg/ml，并透析于含0.5M鹽酸胍、20mM EDTA、0.01％吐溫80和40mM醋酸鈉(pH5.4)緩沖溶液中，每隔8小時(shí)換一次新配的磷酸鈉緩沖液，總共清換三次，上述透析過(guò)程都在4℃的活動(dòng)冷庫(kù)中進(jìn)行。
將透析后的G-CSFa粗純?nèi)芤?℃離心30分鐘(10,000g)并取上清液。檢測(cè)復(fù)性蛋白，并計(jì)算復(fù)性率，復(fù)性率=復(fù)性蛋白/包涵體濕重。
(2)濃縮與精純化在活動(dòng)冷庫(kù)(4℃)中，用濃縮超濾器(Minnitan,Millipore Corp.MA,U.S.A.)將上述的G-CSFa上清液進(jìn)行濃縮，濃縮到300ml，濃縮的G-CSFa進(jìn)一步用60毫升CM-Sephadex的正離子交換樹(shù)脂純化。該柱在20mM的醋酸鈉(pH5.4)緩沖液中平衡，然后用0.125M的氯化鈉溶液洗脫G-CSFa，濃縮后上樣于柱直徑6厘米。柱長(zhǎng)1.0米(床體積約1.7升)的Superdex75層析柱。該柱在10mM的醋酸鈉，pH4.00.004％吐溫的溶液中平衡。整個(gè)柱層析純化過(guò)程在Pharmacia Biotech的Biopilot純化裝置上進(jìn)行，流速500ml/小時(shí)。用UV-280nm分光光度計(jì)檢測(cè)G-CSFa的峰值，并結(jié)合SDS-PAGE(15％)分析法測(cè)定每管的G-CSFa的純度。
實(shí)施例4含G-CSFa的藥物組合物(1)去內(nèi)毒素與除菌將實(shí)施例4中獲得的G-CSFa精制品通過(guò)20ml的polymyxin柱(Bio-Rad)，緩沖液為10mM NaAc,pH4.0,收集過(guò)濾液，在pH4的10mM NaAc緩沖液中透析，然后用0.22u濾膜除菌。
(2)成品制劑的配制與分裝(ⅰ)水劑每75ug G-CSFa蛋白與10mM乙酸鈉、0.004％吐溫80、5％D-甘露醇混合，配制成注射用成品，每支安瓿分裝0.3ml。
(ⅱ)凍干粉劑按常規(guī)方法，將G-CSFa制成凍干粉劑，劑量為100微克/劑。
實(shí)施例5G-CSFa的藥效和穩(wěn)定性測(cè)定對(duì)于實(shí)施例4中獲得的G-CSFa，委托美國(guó)哈佛大學(xué)及辛辛那提醫(yī)學(xué)院，用G-CSF鑒定細(xì)胞株NFS60，對(duì)該變異體進(jìn)行鑒定。結(jié)果示于圖4，圖中ED50是半數(shù)有效濃度，即50％細(xì)胞增長(zhǎng)的藥物濃度。ED50數(shù)值越小，則藥物作用越強(qiáng)。結(jié)果表明，本發(fā)明的突變體G-CSFa，與市售的國(guó)外產(chǎn)品G-CSF(惠爾血)相比，藥效提高10倍以上(即本發(fā)明的突變體的ED50是惠爾血的1/10)。
根據(jù)中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所和上海醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心完成的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)及急性毒理等鑒定結(jié)果表明本發(fā)明的G-CSFa水劑和市場(chǎng)上的標(biāo)準(zhǔn)水劑型(惠爾血)相比，對(duì)人體骨髓細(xì)胞和小鼠粒細(xì)胞的提升分別提高8倍和6倍。對(duì)于化療后的猴子試驗(yàn)中所采用的3個(gè)濃度(2、10和50微克/千克)，本發(fā)明的G-CSFa水劑比標(biāo)準(zhǔn)樣品(惠爾血)高得多。
在小鼠身上，使用600倍正常劑量的本發(fā)明G-CSFa，結(jié)果無(wú)一小鼠發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)或死亡。
因此，這些結(jié)果表明，本發(fā)的G-CSFa比已有技術(shù)中的相同產(chǎn)品具有更顯著的療效。
此外，本發(fā)明的G-CSFa的穩(wěn)定性也有進(jìn)一步顯著提高。由于G-CSF藥品的藥效不穩(wěn)定，所以目前國(guó)際市場(chǎng)上只有水劑型，且運(yùn)輸和儲(chǔ)存均要求在4℃進(jìn)行。而本發(fā)明的G-CSFa可制成凍干粉劑，從而大大有利于G-CSF藥物組合物的運(yùn)輸和儲(chǔ)存，并延長(zhǎng)了藥物的保質(zhì)有效期。
用細(xì)胞株上進(jìn)行鑒定，該凍干粉劑的藥效比標(biāo)準(zhǔn)G-CSF的水劑型高4倍，在猴子身上的藥效與標(biāo)準(zhǔn)G-CSF相當(dāng)。
盡管本發(fā)明是結(jié)合本發(fā)明的最佳施例進(jìn)行描述的，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，可在所附權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落于本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種重組的人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于，它在序列的N端添加了3-6個(gè)氨基酸殘基，且其中至少一個(gè)氨基酸殘基是精氨酸。
2．如權(quán)利要求1所述的的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于，在序列N端添加4-6個(gè)氨基酸，且該4-6個(gè)氨基酸包含序列甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-絲氨酸。
3．如權(quán)利要求1或2所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于，該因子在N端添加的氨基酸序列是甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-絲氨酸。
4．如權(quán)利要求1或2所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于，該因子第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
5．如權(quán)利要求3所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于，該因子第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
6．一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的核酸序列。
7．一種表達(dá)如權(quán)利要求1所述的人粒細(xì)胞集落刺激因子的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌。
8．如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是E.coli M15(G-CSFa),CCTCC No.M97022。
9．一種藥物組合物，其特征在于，它包括有效量的權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10．如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，它是凍干粉劑或水劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了新的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG－CSF),它在序列的N端添加了3－6個(gè)氨基酸殘基,且其中至少一個(gè)氨基酸殘基是精氨酸;更佳地,在N端添加包含序列為甲硫氨酸－精氨酸－谷氨酸－絲氨酸在內(nèi)的4－6個(gè)氨基酸;最佳地,在N端添加序列為甲硫氨酸－精氨酸－谷氨酸－絲氨酸的4個(gè)氨基酸。本發(fā)明的新型重組蛋白的活性有顯著提高,而且穩(wěn)定性明顯提高。還提供了有關(guān)序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和藥物組合物。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1217342SQ9712316
公開(kāi)日1999年5月26日 申請(qǐng)日期1997年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月19日
發(fā)明者蔣永平, 戴衛(wèi) 申請(qǐng)人:蔣永平, 戴衛(wèi)