專利名稱：：減數(shù)分裂的刺激的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在生殖細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)減數(shù)分裂的方法，并涉及一些化合物和包括這些化合物的藥物的應(yīng)用，以在活體內(nèi)、來自體內(nèi)和體外刺激減數(shù)分裂。減數(shù)分裂是生殖細(xì)胞的獨(dú)特而基本的現(xiàn)象，有性生殖就基于減數(shù)分裂。減數(shù)分裂包括兩次成熟分裂。在第一次分裂期間，在成對的染色體分離成兩個子細(xì)胞之前，發(fā)生母本基因和父本基因之間的交換，子細(xì)胞中只含有半數(shù)(1n)染色體和2cDNA。第二次成熟分裂進(jìn)行時(shí)沒有DNA合成，因此這次分裂導(dǎo)致形成只有1cDNA的單倍體生殖細(xì)胞。雄性和雌性細(xì)胞中的減數(shù)分裂現(xiàn)象相類似，但是時(shí)間程序和產(chǎn)生卵細(xì)胞和精細(xì)胞的分化過程完全不同。在生命早期，通常是在出生前，所有的雌性生殖細(xì)胞就進(jìn)入第一次成熟分裂的前期，但后來在前期全以卵母細(xì)胞形式停止發(fā)育(dictyatestate)直到青春期后排卵。因此，從生命早期開始雌性體中貯存有卵母細(xì)胞，它不斷被利用直至貯存的全部消耗。直到受精后，雌性體中才完成減數(shù)分裂，且每個生殖細(xì)胞只生成一個卵子和兩個發(fā)育不全的極體。反之，從青春期開始只有部分雄性生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，且一生中都保持母體生殖細(xì)胞數(shù)。一旦開始，雄性細(xì)胞中減數(shù)分裂的進(jìn)行沒有明顯的中斷且產(chǎn)生4個精子。有關(guān)控制雄性體和雌性體中開始進(jìn)行減數(shù)分裂的機(jī)理尚少為人知。至于卵母細(xì)胞，新近的研究表明，卵泡的嘌呤、次黃嘌呤或腺苷可能阻礙減數(shù)分裂(Downs，S.M.etal.Dev.Biol.82(1985)454-458；Eppig，J.J.etal.Dev.Biol119(1986)313-321；andDowns，S.M.Mol.Reprod.Dev.35(1993)82-94).Byskovetal.首先報(bào)道了可擴(kuò)散的減數(shù)分裂調(diào)節(jié)物質(zhì)存在于胎鼠性腺的培養(yǎng)體系中(Byskov，A.G.etal.Dev.Biol.52(1976)193-200)。從進(jìn)行減數(shù)分裂的胎鼠卵巢分泌出一種減數(shù)分裂激活物質(zhì)(MAS)，而減數(shù)分裂的抑制物質(zhì)(MPS)則是從結(jié)構(gòu)不同的、帶有非減數(shù)分裂的靜息生殖細(xì)胞的睪丸中釋放出來的。于是認(rèn)為MAS和MPS的相對濃度調(diào)節(jié)雄性和雌性生殖細(xì)胞中減數(shù)分裂的開始、停止和恢復(fù)(Byskov，A.G.etal.見ThePhysiologyofReproduction(eds.Knobil，E.andNeill，J.D.，RavenPress，Newyork(1994))。顯然，如果可以調(diào)節(jié)減數(shù)分裂，則可以控制生殖。因此，如果需要刺激卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂，可設(shè)想通過促使卵母細(xì)胞環(huán)境中MAS的量超過MPS的量以達(dá)此目的。大體上可這樣做通過施藥MAS，通過刺激MAS的分泌或者通過阻止已有MAS的生物轉(zhuǎn)化。早就有人發(fā)現(xiàn)，施用被稱為膽固醇生物合成中的中間體的某些固醇可刺激減數(shù)分裂。現(xiàn)已意外地證實(shí)，施用可干擾膽固醇的生物合成的某些化合物也可刺激減數(shù)分裂。盡管尚未充分弄清楚其根本機(jī)理(或作用過程)，但可預(yù)測，至少在某些情況下該干擾作用包括對一種或多種酶的抑制作用，該酶參與膽固醇的一種或多種前體的生物轉(zhuǎn)換。由于抑制作用的結(jié)果，將會使在已被抑制的步驟之前的過程中所形成的前體濃度增大。這些前體的一種或多種可能直接或間接地刺激減數(shù)分裂。因此，在其最寬的范圍內(nèi)，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，該方法包括在活體內(nèi)、來自活體或體外施藥有效量的化合物至所述細(xì)胞，該化合物引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累至誘發(fā)減數(shù)分裂的程度。依一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激哺乳動物的生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激人的生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激雄性生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及用于雌性的避孕方法。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及通過刺激形成減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞而治療不育癥的方法，使得當(dāng)出現(xiàn)促性腺激素的排卵高峰時(shí)，可獲得數(shù)量增多的減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及通過刺激雄性生殖細(xì)胞形成精子而治療雄性不育癥的方法。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥一種化合物，該化合物在按本說明書的實(shí)施例中所述的至少一種方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)表現(xiàn)出減數(shù)分裂激活性能。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥兩性霉素B。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥氨基胍。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥3β，5α，6β-三羥基膽甾烷。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥褪黑激素。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥褪黑激素衍生物。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥6-氯褪黑激素。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥5-甲氧色胺。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥褪黑激素拮抗劑。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括施藥選自下列物質(zhì)的任意化合物4α-氰甲基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-硝基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-氨基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-甲酰-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-氨甲基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-(2-氰基)乙炔基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-丙二烯基(allenyl)-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-環(huán)氧乙烷-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-(3，3-二氯)乙烯基-5α-膽甾烷-3α-醇；4α-(3，3-二溴)乙烯基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-(二氟甲基)-5α-膽甾烷-3β-醇；4-環(huán)十二烷基-2，6-二甲基嗎啉；4-三癸基-2，6-二甲基嗎啉；4-十二烷基-2，6-二甲基嗎啉；4-〔3-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基〕-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉；4-〔3-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基〕-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉-N-氧化物；順-4-〔3-[4-(1，1-二甲基丙基)苯基〕-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉；1-〔3-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基〕-2-甲基丙基]哌啶；8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-芐基-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-芐基-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇-N-氧化物；N-(1，5，9-三甲基癸基)-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-(1-甲基十二烷基)-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-〔6-(4-叔丁基苯基)-1，5-二甲基〕己基-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；15-氮雜-24-亞甲基-D-高膽甾(homocholesta)-8，14-二烯-3β-醇；4-氯-α-〔4-[2-(二乙氨基)乙氧基〕苯基]-α-(4-甲基苯基)苯乙醇；1，4-二(2-氯芐基氨甲基)環(huán)己烷；6-氨基-2-戊基(penthyl)硫代苯并噻唑；24，25-亞氨基羊毛甾醇；氨基三唑；制霉菌素；25-氮雜膽固醇；25-氮雜-24，25-二氫酵母甾醇；25-氮雜膽甾烷醇；(20R)-22，25-二氮雜膽固醇；(20S)-22，25-二氮雜膽固醇；24-氮雜膽固醇；25-氮雜-24，25-二氫羊毛甾醇；和23-氮雜膽固醇。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及化合物在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用，該化合物引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累至誘發(fā)減數(shù)分裂的程度。依另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及化合物在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用，該化合物在按本說明書的實(shí)施例中所述的至少一種方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，表現(xiàn)出減數(shù)分裂激活性能。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及兩性霉素B在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及氨基胍在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及3β，5α，6β-三羥基膽甾烷在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及褪黑激素在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及褪黑激素衍生物在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及6-氯褪黑激素在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及5-甲氧色胺在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及褪黑激素拮抗劑在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用。依進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及選自下列物質(zhì)的化合物在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用4α-氰甲基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-硝基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-氨基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-甲酰-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-氨甲基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-(2-氰基)乙炔基-5α-膽甾烷-3β-醇；4-丙二烯基(allenyl)-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-環(huán)氧乙烷-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-(3，3-二氯)乙烯基-5α-膽甾烷-3α-醇；4α-(3，3-二溴)乙烯基-5α-膽甾烷-3β-醇；4α-(二氟甲基)-5α-膽甾烷-3β-醇；4-環(huán)十二烷基-2，6-二甲基嗎啉；4-三癸基-2，6-二甲基嗎啉；4-十二烷基-2，6-二甲基嗎啉；4-〔3-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基〕-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉；4-〔3-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基〕-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉-N-氧化物；順-4-〔3-[4-(1，1-二甲基丙基)苯基〕-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉；1-〔3-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基〕-2-甲基丙基]哌啶；8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-芐基-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-芐基-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇-N-氧化物；N-(1，5，9-三甲基癸基)-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-(1-甲基十二烷基)-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；N-〔6-(4-叔丁基苯基)-1，5-二甲基〕己基-8-氮雜-4α，10-二甲基-反-萘烷-3β-醇；15-氮雜-24-亞甲基-D-高膽甾-8，14-二烯-3β-醇；4-氯-α-4-〔2-(二乙氨基)乙氧基〕苯基]-α-(4-甲基苯基)苯乙醇；1，4-二(2-氯芐基氨甲基)環(huán)己烷；6-氨基-2-戊基硫代苯并噻唑；24，25-亞氨基羊毛甾醇；氨基三唑；制霉菌素；25-氮雜膽固醇；25-氮雜-24，25-二氫酵母甾醇；25-氮雜膽甾烷醇；(20R)-22，25-二氮雜膽固醇；(20S)-22，25-二氮雜膽固醇；24-氮雜膽固醇；25-氮雜-24，25-二氫羊毛甾醇；和23-氮雜膽固醇。減數(shù)分裂激活物質(zhì)或刺激物質(zhì)的存在為人所知已有一段時(shí)間了。然而，不久前，人們還不了解減數(shù)分裂激活物質(zhì)的特性?？赏绊憸p數(shù)分裂的因素有好幾個。依本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所選擇的化合物被用于刺激減數(shù)分裂。依本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所選擇的化合物被用于刺激人體內(nèi)的減數(shù)分裂。因此，所選擇的化合物有望用作生育力調(diào)節(jié)劑?？梢灶A(yù)計(jì)，迄今所用的、基于雌性激素和/或促孕激素的激素避孕藥對體細(xì)胞產(chǎn)生的常見副作用在本發(fā)明中將不會有。至于用作雌性體中的避孕藥劑，在出現(xiàn)促性腺激素的排卵高峰之前，當(dāng)卵母細(xì)胞仍處于生長著的卵泡中時(shí)，可以誘發(fā)減數(shù)分裂以過早地誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中恢復(fù)減數(shù)分裂。在婦女中，例如可以在上次月經(jīng)停止一周后誘導(dǎo)減數(shù)分裂的恢復(fù)。排卵時(shí)，形成的過分成熟的卵母細(xì)胞最有可能不受精。正常的月經(jīng)周期不會受影響。在這方面，重要的是要注意，在培養(yǎng)的人體粒膜細(xì)胞(卵泡的體細(xì)胞)中黃體酮的合成不會受減數(shù)分裂誘發(fā)物質(zhì)的存在的影響，而迄今所用的激素避孕藥中用到的雌性激素和促孕激素卻對黃體酮的合成有不利作用。還闡述了雄性生殖細(xì)胞中減數(shù)分裂的刺激作用。于是，本發(fā)明也可適用于治療雄性不育癥。沒有任何減數(shù)分裂激活性能的羊毛甾-8，24-二烯-3β-醇(羊毛甾醇)，是哺乳動物細(xì)胞中固醇合成中的初級環(huán)化產(chǎn)物。膽固醇的后續(xù)生物合成通過如下系列步驟而進(jìn)行，如脫甲基作用、氧化、還原和雙鍵的移位，所有這些步驟都是酶促控制的?？刂七@些步驟的酶中只有部分曾被分離出并被鑒定。構(gòu)成有膽甾烷骨架的第一個產(chǎn)物是4，4-二甲基膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇，它與從人卵泡液中分離的減數(shù)分裂激活化合物完全相同(AGByskovetal.Nature374(1995)559-562)。隨后的在14位中雙鍵被還原而生成4，4-二甲基膽甾-8，24-二烯-3β-醇，它與從公牛睪丸中分離的減數(shù)分裂激活化合物完全相同(AGByskovetal.Nature374(1995)559-562)。逐步除去4位中的甲基生成4-甲基膽甾-8，24-二烯-3β-醇和膽甾-8，24-二烯-3β-醇(酵母甾醇)，這二者都有減數(shù)分裂激活性能。隨后使雙鍵從8位移到5位生成膽甾-5-烯-3β-醇(膽固醇)，它沒有減數(shù)分裂激活性能。對于上述系列反應(yīng)中有活性的任何酶的抑制作用，將會導(dǎo)致具有減數(shù)分裂激活性能的前一個中間體積累，因而誘發(fā)現(xiàn)有生殖細(xì)胞中的減數(shù)分裂。從文獻(xiàn)中得知的一些化合物已被描述成一種或多種酶的抑制劑，所述酶參與在活體內(nèi)轉(zhuǎn)化羊毛甾-8，24-二烯-3β-醇為膽固醇，且近期有綜述報(bào)道了該領(lǐng)域(Mercer，E.I.Prog.LipidRes.32(1993)357-416)。已知兩性霉素可干擾真菌中麥角固醇合成的最后幾步(Coulon，J.etal.Can.J.Microbiol.32(1986)738-742)并在臨床上被用作抗真菌劑。在體外的大鼠肝中，業(yè)已發(fā)現(xiàn)膽甾烷三醇干擾膽固醇生物合成中的中間體的4位上的脫甲基作用，于是導(dǎo)致4，4-二甲基膽甾-8-烯-3-醇和4-甲基膽甾-8-烯-3-醇的積累(Scallen，T.J.etal.J.Biol.Chem.246(1971)3168-3174)。本發(fā)明的活性劑的施藥量由領(lǐng)域技術(shù)人員依治療目的而定。該用量將取決于使用的具體藥劑、施藥的特定方式(例如活體內(nèi)、來自體內(nèi)或體外)和其它因素?；钚詣┦┧幱玫谋景l(fā)明組合物可以是片劑、膠囊、粉劑、溶液或懸浮體的形式。在這些組合物中，活性劑可與本技術(shù)中常用的載體、佐劑和賦形劑結(jié)合。在活動物中的全身效果可通過口服、注射或灌注本發(fā)明的活性劑的無菌溶液而達(dá)到，其中的溶液按已知技術(shù)配制。全身效果也可通過吸入或經(jīng)鼻施藥含該活性劑的粉狀物或氣溶膠而達(dá)到。施藥本發(fā)明的活性劑至離體的細(xì)胞如卵母細(xì)胞或雄性生殖細(xì)胞可這樣做將該細(xì)胞保存于保存相關(guān)類型細(xì)胞常用的培養(yǎng)基中，再往該培養(yǎng)基中加入活性劑?？赏ㄟ^下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不能認(rèn)為這些實(shí)施例是限制保護(hù)范圍。前述說明書中和下述實(shí)施例中揭示的特點(diǎn)，可單獨(dú)地或以其任意的組合作為以各種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。實(shí)施例原料和方法在卵母細(xì)胞試驗(yàn)中測試減數(shù)分裂激活物質(zhì)動物將發(fā)育未全的雌性小鼠(B6D2-F1，品系C57B1/6J)于控制的光線(14小時(shí)亮、10小時(shí)暗)和溫度下保持，任意供給食物和水。當(dāng)動物重達(dá)13-16克(相當(dāng)于產(chǎn)后20～22天大小)時(shí)，將它們一次注射(腹膜內(nèi))含有約20IUFSH和20IULH(Ziebe，S.etal.Hum.Reprod.8(1993)385-88)的人絕經(jīng)期促性腺激素(Humegon，Organon，TheNetherlands)。48小時(shí)后，以頸部離位方式殺死動物。卵母細(xì)胞的收集和培養(yǎng)取出卵巢，置于HX-培養(yǎng)基中(見下文)并除去體外組織。收集-和培養(yǎng)基由Eagles極限必需培養(yǎng)基(Flow，USA)構(gòu)成，它含有4mM次黃嘌呤(HX)、3mg/ml牛血清白蛋白、0.23mM丙酮酸鈉、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(均得自Sigma，USA)。該培養(yǎng)基被稱為HX-培養(yǎng)基。不含HX的同樣的培養(yǎng)基用作對照培養(yǎng)基。在丘封卵母細(xì)胞(cumulusenclosedoocytes)(CEO，試驗(yàn)A)和裸露的卵母細(xì)胞(DO，試驗(yàn)B)中，研究了待測化合物對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響。CEO是通過在解剖顯微鏡下用27號針穿刺卵巢的卵泡腔而得到的。選擇大小一致的丘封卵母細(xì)胞(CEO)，并在試驗(yàn)A中使用之前將它們用新鮮的HX-培養(yǎng)基漂洗三次。用于試驗(yàn)B中、不含丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，即裸露的卵母細(xì)胞(DO)，是通過用可調(diào)的細(xì)口徑吸量管輕輕地沖洗CEO而得到的。試驗(yàn)A中的CEO和試驗(yàn)B中的DO均培養(yǎng)于4孔多盤(Nunclon，Denmark)中，在0.5mlHX-培養(yǎng)基中含有表中給出的濃度下的待測化合物，但對照物培養(yǎng)于對照培養(yǎng)基中。每個孔含35-50個卵母細(xì)胞。如表中所示，試驗(yàn)培養(yǎng)物由不同濃度的待測化合物制備。培養(yǎng)物均于37℃和100％濕度下，在含5％CO2的空氣中存放24小時(shí)。卵母細(xì)胞的引導(dǎo)(priming)，試驗(yàn)C(A)和C(B)分別如試驗(yàn)A和試驗(yàn)B那樣進(jìn)行試驗(yàn)C(A)和C(B)，但是在試驗(yàn)開始時(shí)，卵母細(xì)胞只保存于含待測化合物的培養(yǎng)基中達(dá)一段時(shí)間(引導(dǎo)期)，5分鐘～3小時(shí)。引導(dǎo)期后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入對照培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直到試驗(yàn)開始后22小時(shí)為止。卵母細(xì)胞的檢查在24小時(shí)培養(yǎng)期末，在帶微分干涉相差儀的倒置顯微鏡中對具有胚泡(GV)或胚泡破裂(GVBD)的卵母細(xì)胞數(shù)和具有極體(PB)的卵母細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算單位總量的卵母細(xì)胞中具有GVBD的卵母細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及每GVBD中具有PB的卵母細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。按MAS活性單位計(jì)算的試驗(yàn)A、B、C(A)和C(B)的結(jié)果，示于每個實(shí)施例的表中。一個MAS活性單位(MASU)被定義為MAS活性單位(MASU)數(shù)可按下式計(jì)算實(shí)施例1用膽甾烷-3β，5α，6β-三醇激活卵母細(xì)胞中的減數(shù)分裂依前述方法進(jìn)行試驗(yàn)A和試驗(yàn)B，利用膽甾烷-3β，5α，6β-三醇作待測化合物。結(jié)果示于下表</tables>所用的膽甾烷-3β，5α，6β-三醇得自Sigma(St.Louis，USA)。上表顯示，膽甾烷-3β，5α，6β-三醇以劑量相關(guān)的方式誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂的恢復(fù)。實(shí)施例2用氨基胍碳酸氫鹽激活卵母細(xì)胞中的減數(shù)分裂如前述方法進(jìn)行試驗(yàn)A和試驗(yàn)B，利用氨基胍碳酸氫鹽作待測化合物。結(jié)果示于下表</tables>所用的氨基胍碳酸氫鹽得自AldrichChemicalCo.，Inc.(Milwaukee，Wisconsin)。上表顯示，氨基胍碳酸氫鹽以劑量相關(guān)的方式誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂的恢復(fù)。實(shí)施例3用兩性霉素B激活卵母細(xì)胞中的減數(shù)分裂如前述方法進(jìn)行試驗(yàn)A和試驗(yàn)B，利用兩性霉素B作待測化合物。結(jié)果示于下表所用的兩性霉素B得自Bristol-MyersSquibb。上表顯示，兩性霉素B以劑量相關(guān)的方式誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂的恢復(fù)。兩性霉素在1.25μg/ml以上的濃度下有毒。試驗(yàn)了高達(dá)50μg/ml的濃度。用兩性霉素B引導(dǎo)卵母細(xì)胞結(jié)果示于下表上表顯示，暴露于兩性霉素B中甚至只持續(xù)5分鐘，就足以引起DO和CEO中減數(shù)分裂的恢復(fù)。實(shí)施例4利用兩性霉素B在雄性生殖細(xì)胞中激活減數(shù)分裂試驗(yàn)系統(tǒng)包括第11.5天進(jìn)食后胎鼠的性腺。每只胎鼠的一個性腺用作對照性腺，而另一個用作試驗(yàn)性腺。將在培養(yǎng)期間分化了的這些性腺置于已知化學(xué)成分的培養(yǎng)基中、在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6天，參見Westergaardetal.Fertil.Steril.41(1984)377。往培養(yǎng)試驗(yàn)性腺的培養(yǎng)基中，加入如表中所示的不同量的兩性霉素B。培養(yǎng)期后，對照性腺只含非減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞。試驗(yàn)性腺在染色后由顯微鏡觀察到的半定量計(jì)數(shù)結(jié)果示于下表，其中“-”表示無響應(yīng)，而“+”、“++”和“+++”表示逐漸增大的響應(yīng)。所用的兩性霉素B得自Bristol-MyersSquibb。如表中所示，兩性霉素B以劑量相關(guān)的方式激活雄性生殖細(xì)胞中的減數(shù)分裂。權(quán)利要求1.一種刺激生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的方法，它包括在活體內(nèi)、來自體內(nèi)或體外施藥有效量的化合物至所述細(xì)胞，該化合物引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累至誘發(fā)減數(shù)分裂的程度。2.權(quán)利要求1的方法，其中的生殖細(xì)胞是哺乳動物的生殖細(xì)胞。3.權(quán)利要求1的方法，其中的生殖細(xì)胞是人的生殖細(xì)胞。4.權(quán)利要求1的方法，其中的生殖細(xì)胞是卵母細(xì)胞。5.權(quán)利要求1的方法，其中的生殖細(xì)胞是雄性生殖細(xì)胞。6.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物是這種化合物當(dāng)按本說明書的實(shí)施例中所述的至少一種方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，該化合物表現(xiàn)出減數(shù)分裂激活性能。7.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物選自兩性霉素B、氨基胍和3β，5α，6β-三羥基膽甾烷。8.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物是褪黑激素。9.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物是6-氯褪黑激素。10.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物是5-甲氧色胺。11.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物是褪黑激素衍生物。12.權(quán)利要求1的方法，其中引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累的化合物是褪黑激素拮抗劑。13.化合物在制備誘發(fā)減數(shù)分裂的藥物方面的應(yīng)用，該化合物引起內(nèi)源性減數(shù)分裂激活物質(zhì)積累至誘發(fā)減數(shù)分裂的程度。14.按權(quán)利要求13的化合物應(yīng)用，該化合物在按本說明書的實(shí)施例中所述的至少一種方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)表現(xiàn)出減數(shù)分裂激活性能。15.按權(quán)利要求13的化合物應(yīng)用，該化合物選自兩性霉素B、氨基胍和3β、5α，6β-三羥基膽甾烷。16.按權(quán)利要求13的褪黑激素應(yīng)用。17.按權(quán)利要求13的6-氯褪黑激素應(yīng)用。18.按權(quán)利要求13的5-甲氧色胺應(yīng)用。19.按權(quán)利要求13的褪黑激素衍生物應(yīng)用。20.按權(quán)利要求13的褪黑激素拮抗劑應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一些干擾膽固醇的生物合成的化合物和包括這些化合物的藥物的應(yīng)用,以在活體內(nèi)、來自體內(nèi)和體外刺激卵母細(xì)胞和雄性生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂。文檔編號C12N5/08GK1177978SQ9619238公開日1998年4月1日申請日期1996年3月6日優(yōu)先權(quán)日1996年3月6日發(fā)明者E·古德爾,A·G·比斯科夫,F·C·格羅恩瓦爾德,L·諾德霍姆申請人:諾沃挪第克公司