專利名稱：馬傳染性貧血病驢白細(xì)胞弱毒株及其培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于防制馬傳染性貧血病的弱毒株及其培育方法。
馬傳貧是由逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科的馬傳貧病毒引起的一種馬屬動物的傳染病，它嚴(yán)重危害馬、騾、驢等馬屬動物，主要表現(xiàn)高熱稽留或間歇熱、貧血、出血、黃疸、心臟衰弱、浮胂和消瘦等癥狀。病畜終生帶毒，傳染快，死亡多，世界各國廣泛流行此病，給養(yǎng)馬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前世界上防制馬傳貧主要靠檢疫后進(jìn)行撲殺的措施，這種方法達(dá)不到控制和消滅此病的目的，必須采用安全有效的疫苗接種馬匹來預(yù)防。世界各國還沒有人工免疫預(yù)防馬傳貧的疫苗。
本發(fā)明的目的是研制一種人工免疫預(yù)防馬傳貧的疫苗。并能有效地控制和預(yù)防馬傳染性貧血病。
馬傳貧弱毒疫苗的種毒培育。在收集和查閱了國內(nèi)外有關(guān)馬傳貧方面的資料后，在實驗室進(jìn)行了病馬的再接毒試驗，證明馬傳貧病馬再接毒后，有短期保護(hù)作用，取得了馬傳貧病毒具有較好免疫原性的科學(xué)數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上，我們用在我國分離到的馬傳貧強(qiáng)毒，并通過本動物馴化，培育成對馬、驢能引起典型發(fā)病死亡的馬傳貧強(qiáng)毒接種到體外培養(yǎng)的驢白細(xì)胞上，進(jìn)行培養(yǎng)繼代，改變病毒的生存條件，使之遺傳基因發(fā)生改變。經(jīng)過118代-135代的培育、馴化獲得了一株毒力弱、免疫原性好、可以用于制造馬傳貧疫苗的驢白細(xì)胞弱毒株。
一種馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株，其特征在于是把中國遼系馬傳貧強(qiáng)毒通過驢體多次繼代后獲得對驢敏感的驢傳貧強(qiáng)毒株再用驢白細(xì)胞在體外培育，馴化而成馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株，DLVF121DLVF120DLVF123DLVF124DLVF125，這毒株的五代已于1996年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC№0250。
一種馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株的培育方法其特征在于由下列步驟實現(xiàn)(1)、供試動物從非馬傳貧疫區(qū)采購馬、驢，使用前至少健康觀察3個月，經(jīng)多次血清學(xué)和臨床檢查無傳貧病毒感染者。
(2)、驢傳貧強(qiáng)毒株的培育系用中國遼系馬傳貧強(qiáng)毒通過驢體多次繼代而培育出驢傳貧強(qiáng)毒株，用發(fā)病驢血清毒(毒價10-6×1毫升)可使驢和馬典型發(fā)病或死亡。
(3)、驢傳貧強(qiáng)毒株通過驢白細(xì)胞培養(yǎng)繼代(a)驢白細(xì)胞培養(yǎng)每頭驢在采血的同時，用增菌培養(yǎng)進(jìn)行檢查，要求驢血無菌。無菌采血收集在盛有抗凝劑的瓶中，置室溫20～30分鐘，析出的上層血漿以虹吸方法吸至離心瓶，以每分鐘1000～1200轉(zhuǎn)離心十分鐘，然后收集沉淀于瓶底的細(xì)胞并加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃靜止培養(yǎng)。具有代表性的藥品配方健康牛無菌血清和賽氏液(氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉、無離子水以及檸檬酸三鈉等)。
(b)接種病毒在驢白細(xì)胞培養(yǎng)24～48小時后，選擇生長良好的細(xì)胞，吸出舊培養(yǎng)液，換以新培養(yǎng)液，按5％量接種毒，繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察并登記，凡細(xì)胞生長異常、污染的瓶應(yīng)廢棄。
(c)收獲凡接毒的細(xì)胞在接毒后第4～5天有80％左右發(fā)生明顯老化，變圓、脫落，與對照差異明顯的培養(yǎng)瓶即可收獲，并放-20℃～-25℃低溫凍結(jié)后放室溫融化如此反復(fù)凍融兩次后收獲。以繼續(xù)作為弱毒株繼代的毒種。
(4)、驢白細(xì)胞弱毒株對驢白細(xì)胞毒力的滴定用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50/ml)等試驗方法對驢白細(xì)胞進(jìn)行毒力滴定，其對驢白細(xì)胞的TCID50/ml為7.0。
(5)、驢白細(xì)胞弱毒株對馬屬動物的安全穩(wěn)定性弱毒株接種馬、驢后無任何馬傳貧反應(yīng)，剖檢也無任何病理學(xué)變化，弱毒株免疫馬的含毒材料對馬進(jìn)行多次返祖試驗不能恢復(fù)原來的毒力；不引起健康馬的同居感染；接種母馬所生幼駒進(jìn)行生物學(xué)試驗證明不帶毒傳染。
(6)、驢白細(xì)胞弱毒株對馬屬動物的免疫性弱毒株接種馬、驢后出現(xiàn)明顯的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。出現(xiàn)血清抗體陽轉(zhuǎn)率一般可達(dá)90％以上，在接種后第21天大部分出現(xiàn)補(bǔ)反、瓊擴(kuò)抗體，在2個月達(dá)到高峰后陽轉(zhuǎn)率逐漸下降。中和抗體在接種后第60天開始出現(xiàn)，第180天陽轉(zhuǎn)率為100％，能長期持續(xù)很少變動。接種馬、驢用同源強(qiáng)毒攻擊，馬可保護(hù)80％以上，驢為100％，對異源性強(qiáng)毒攻擊，也具有同樣的保護(hù)力，但免疫產(chǎn)生時間較晚，驢為3個月，馬為6個月較好，對馬的免疫持續(xù)期長達(dá)三年以上。
(7)驢白細(xì)胞弱毒疫苗株的保存性凍于的弱毒株在15℃～28℃可保存3個月，在0～4℃可保存6個月；在-15℃～-20℃可保存2個月。
本發(fā)明的優(yōu)點是利用本發(fā)明培育的疫苗注射馬屬動物后安全性好并能產(chǎn)生良好的免疫效果。能夠控制和預(yù)防馬傳染性貧血病。
附圖
為疫苗的制造和檢驗圖。
以下結(jié)合附圖對發(fā)明作進(jìn)一步描述。
1、原材料檢測包括以下內(nèi)容(1)胎牛血清的檢驗檢驗項目 被檢因子 檢驗方法 檢驗結(jié)果牛粘膜病 抗體免疫熒光試驗 陰性地方流行性牛白血病抗體瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗 陰性布氏桿菌病抗體試管凝集試驗 陰性補(bǔ)體結(jié)合試驗 陰性牛傳染性鼻氣管炎 抗體血清中和試驗 陰性口蹄疫抗體補(bǔ)體結(jié)合試驗 陰性牛暫時熱 抗體免疫熒光試驗 陰性補(bǔ)體結(jié)合試驗 陰性支原體菌體(1)牛心湯、馬丁湯培養(yǎng)陰性(2)雞胚接種后轉(zhuǎn)牛心湯、 陰性馬丁湯培養(yǎng)抗體平板凝集試驗 陰性(2)、驢白細(xì)胞供體驢的檢測檢驗項目 被檢因子檢驗方法檢驗結(jié)果鼻疽 變態(tài)反應(yīng) 陰性馬副傷寒流產(chǎn) 試管凝集試驗 陰性馬傳貧 抗體(1)瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散 陰性(2)補(bǔ)體結(jié)合試驗 陰性
(3)ELISA間接法陰性血液學(xué) 常規(guī) 正常臨床常規(guī) 正常(3)、驢白細(xì)胞組織培養(yǎng)物的檢驗檢驗項目 檢驗方法 檢驗結(jié)果病毒粒子 電子顯微鏡觀察(1)未按毒對照細(xì)胞無病毒粒子(2)接馬傳貧弱毒細(xì)胞無非馬傳貧病毒粒子皰疹病毒 兔腎細(xì)胞培養(yǎng) 無皰疹病毒生長2、種毒3、培養(yǎng)細(xì)胞驢白細(xì)胞培養(yǎng)，每頭驢在采血的同時，用增菌培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)菌檢查，要求驢血無菌。將驢放倒用水洗凈全身，從動脈全放血，將血液放入裝有抗凝劑(肝素或檸檬酸鈉溶液)的大瓶中，隨放隨搖動，然后將采血瓶放在室溫20-30分鐘后，析出的上層血漿，以虹吸方法移至離心瓶中，第一次以原液離心，第二次加賽氏液混合均勻離心，每次約以每分鐘800-1000轉(zhuǎn)離心10分鐘，然后收集沉淀于瓶底部的細(xì)胞，加培養(yǎng)液(賽氏液與牛血清1∶1)制成細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)37℃靜止或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。大量制苗時，可將多頭驢的細(xì)胞混合培養(yǎng)。
4、疫苗制造培養(yǎng)24-48小時后，吸出舊培養(yǎng)液，換以新鮮培養(yǎng)液。選擇細(xì)胞生長良好者按3％量接種病毒，然后加牛血清放回原處，繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察并登記，凡細(xì)胞生長異常、污染的瓶應(yīng)廢棄。
凡接毒組的細(xì)胞，在接種后第5-7天有80％左右發(fā)生明顯變圓老化、脫落，與對照組差異明顯的培養(yǎng)瓶放入-20～-25℃低溫條件下，反復(fù)凍融二次，即可收獲。
為了防止大批疫苗混入雜菌，先按每10～20瓶混合一組進(jìn)行無菌檢驗，無菌者再將同一代次，同一培養(yǎng)條件的疫苗充分混合組成一批(20,000--30,000毫升)。
5、分裝混合的疫苗在無菌條件下分裝小瓶，裝量40-l00毫升。放-20～-25℃凍結(jié)保存。每瓶疫苗應(yīng)貼標(biāo)簽，注明名稱、批準(zhǔn)文號、批號、裝量、用法、制造日期、保存方法、有效期、檢驗號碼及廠名。
6、檢驗每批疫苗按l％瓶數(shù)抽檢(不夠100瓶抽檢3瓶)。以改良沙氏培養(yǎng)基或不滴定PH普通瓊脂2管，每管接種原苗0.2ml，放20-30℃培養(yǎng)。另以馬丁肉湯及厭氣肉肝湯各1瓶，分別接種原苗0.5-1ml，放37℃培養(yǎng)3日后，自厭氣肉肝湯小瓶中吸取0.1-0.3ml培養(yǎng)物，移植于血瓊脂斜面和厭氣肉肝湯各1管自馬丁肉湯小瓶中吸取0.1-0.3ml培養(yǎng)物，移植于血瓊脂斜面和馬丁肉湯各1管，共培養(yǎng)觀察7-10日應(yīng)無菌生長。每批混合苗均需做補(bǔ)反抗原性檢查，其效價應(yīng)不低于2.0。每批疫苗需用培養(yǎng)的驢白細(xì)胞進(jìn)行毒力測定，其毒價應(yīng)不低于105TCID/ml。
7、冷凍干燥-40℃凍結(jié)，慢升溫至28℃，保溫16小時。
8、安全效力檢查檢驗用馬須來自非傳貧疫區(qū)，經(jīng)3個月的定時測溫，3次以上血清學(xué)檢查陰性，無傳貧臨床癥狀，營養(yǎng)良好的2-3歲健康馬。疫苗混批20,000毫升以上的用4匹馬，20,000毫升以下的用3匹馬，每匹馬一律皮下注射5毫升。在接種后觀察3個月，每天測溫2次，每20天做血清學(xué)檢查一次，當(dāng)體溫升溫高達(dá)39℃以上或出現(xiàn)臨床異常癥狀時做血清學(xué)檢查。被檢馬無傳貧癥狀或其它疫病者，認(rèn)為疫苗安檢合格，血清學(xué)陽轉(zhuǎn)達(dá)2/3～3/4者，認(rèn)為效價合格。在被檢馬中如個別馬匹出現(xiàn)傳貧發(fā)病或其他疫病，難以判定者，對同批疫苗可做重檢，再有同樣結(jié)果，則該批疫苗廢棄。
馬匹患馬傳染性貧血病后，傳染快、死亡率高，給養(yǎng)馬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。利用本發(fā)明的疫苗免疫馬匹，能夠預(yù)防馬傳染性貧血病，安全有效，減少了經(jīng)濟(jì)損失。
馬傳貧毒種的特性用該毒種制造的疫苗注射馬屬動物的反應(yīng)特性為1、一般無任何臨床反應(yīng)，過敏反應(yīng)為百萬分之5～7；2、無任何病理組織學(xué)變化；3、十四天后出現(xiàn)沉淀抗體反應(yīng)，2個月達(dá)到高峰，此后下降。一年后僅有10～20％的馬匹保持抗體陽性。注苗馬產(chǎn)生的抗體與病馬的不同，可以鑒別開4、疫苗弱毒在動物體內(nèi)可持續(xù)6個月，6個月后動物臟器和外周血內(nèi)均無弱毒存在；5、注苗后3個月開始對強(qiáng)毒的攻擊保護(hù)作用，6個月后達(dá)到最佳狀態(tài)；6、對馬的保護(hù)率達(dá)85％，對驢的保護(hù)率100％；7、馬的保護(hù)性免疫持續(xù)期測到3年零9個月，仍不降低。
8、在馬傳貧流行區(qū)的健康馬注苗后，經(jīng)三年觀察無馬傳貧病發(fā)生。疫苗的保存性為-20℃～50℃暗處保存一年，0～4℃暗處保存不超過兩周。本疫苗的使用時間選在非蚊虻活動季，用稀釋液將疫苗稀釋后立即使用，在頸部皮下注射2ml，注苗動物在監(jiān)視下觀察4小時后無過敏反應(yīng)可即進(jìn)行使疫或比賽。
權(quán)利要求
1.一種馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株，其特征在于是把中國遼系馬傳貧強(qiáng)毒通過驢體多次繼代后獲得對驢敏感的驢傳貧強(qiáng)毒株再用驢白細(xì)胞在體外培育，馴化而成馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株，DLVF121DLVF120DLVF123DLVF124DLVF125，這毒株的五代已于1996年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC№0250。
2.一種馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株的培育方法其特征在于由下列步驟實現(xiàn)(1)、供試動物從非馬傳貧疫區(qū)采購馬、驢，使用前至少健康觀察3個月，經(jīng)多次血清學(xué)和臨床檢查無傳貧病毒感染者；(2)、驢傳貧強(qiáng)毒株的培育系用中國遼系馬傳貧強(qiáng)毒通過驢體多次繼代而培育出驢傳貧強(qiáng)毒株，用發(fā)病驢血清毒(毒價10-6×1毫升)可使驢和馬典型發(fā)病或死亡；(3)、驢傳貧強(qiáng)毒株通過驢白細(xì)胞培養(yǎng)繼代(a)驢白細(xì)胞培養(yǎng)每頭驢在采血的同時，用增菌培養(yǎng)進(jìn)行檢查，要求驢血無菌；無菌采血收集在盛有抗凝劑的瓶中，置室溫20～30分鐘，析出的上層血聚以虹吸方法吸至離心瓶，以每分鐘1000～1200轉(zhuǎn)離心十分鐘，然后收集沉淀于瓶底的細(xì)胞并加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃靜止培養(yǎng)；具有代表性的藥品配方健康牛無菌血清和賽氏液(氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉、無離子水以及檸檬酸三鈉等)；(b)接種病毒在驢白細(xì)胞培養(yǎng)24～48小時后，選擇生長良好的細(xì)胞，吸出舊培養(yǎng)液，換以新培養(yǎng)液，按5％量接種毒，繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察并登記，凡細(xì)胞生長異常、污染的瓶應(yīng)廢棄；(c)收獲凡接毒的細(xì)胞在接毒后第4～5天有80％左右發(fā)生明顯老化，變圓、脫落，與對照差異明顯的培養(yǎng)瓶即可收獲，并放-20℃～-25℃低溫凍結(jié)后放室溫融化如此反復(fù)凍融兩次后收獲，以繼續(xù)作為弱毒株繼代的毒種；(4)、驢白細(xì)胞弱毒株對驢白細(xì)胞毒力的滴定用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50/ml)等試驗方法對驢白細(xì)胞進(jìn)行毒力滴定，其對驢白細(xì)胞的TCID50/ml為7.0；(5)、驢白細(xì)胞弱毒株對馬屬動物的安全穩(wěn)定性弱毒株接種馬、驢后無任何馬傳貧反應(yīng)，剖檢也無任何病理學(xué)變化，弱毒株免疫馬的含毒材料對馬進(jìn)行多次返祖試驗不能恢復(fù)原來的毒力；不引起健康馬的同居感染；接種母馬所生幼駒進(jìn)行生物學(xué)試驗證明不帶毒傳染；(6)、驢白細(xì)胞弱毒株對馬屬動物的免疫性弱毒株接種馬、驢后出現(xiàn)明顯的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，出現(xiàn)血清抗體陽轉(zhuǎn)率一般可達(dá)90％以上，在接種后第21天大部分出現(xiàn)補(bǔ)反、瓊擴(kuò)抗體，在2個月達(dá)到高峰后陽轉(zhuǎn)率逐漸下降，中和抗體在接種后第60天開始出現(xiàn)，第180天陽轉(zhuǎn)率為100％，能長期持續(xù)很少變動；接種馬、驢用同源強(qiáng)毒攻擊，馬可保護(hù)80％以上，驢為100％，對異源性強(qiáng)毒攻擊，也具有同樣的保護(hù)力，但免疫產(chǎn)生時間較晚，驢為3個月，馬為6個月較好，對馬的免疫持續(xù)期長達(dá)三年以上；(7)、驢白細(xì)胞弱毒疫苗株的保存性凍干的弱毒株在15℃～28℃可保存3個月，在0～4℃可保存6個月；在-15℃～-20℃可保存2個月。
全文摘要
本發(fā)明是一種制造馬傳貧弱毒株及其培育方法，是把中國遼系馬傳貧強(qiáng)毒在驢體上多次繼代后，從而獲得對驢敏感的驢傳貧強(qiáng)毒株，再用驢白細(xì)胞在體外培養(yǎng)，馴化而成馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株。利用本方法制造的疫苗能夠預(yù)防馬傳染性貧血病，在制造疫苗的過程中，把馬傳貧毒種接種在驢白細(xì)胞上培養(yǎng)，在接種后第5—7天有80％左右發(fā)生明顯變圓老化、脫落，與對照組差異明顯的情況下放入-20～-25℃低溫反復(fù)凍融二次，即可收獲。
文檔編號C12N1/36GK1134458SQ9610332
公開日1996年10月30日 申請日期1996年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月3日
發(fā)明者沈榮顯, 徐振東, 何云生, 張盛興, 董君平, 王振漪, 吳文芳, 戴玉坤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所