專利名稱：：瓜爾豆的轉化的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種瓜爾豆屬豆科植物的轉化、再生和選擇的方法。具體地說，涉及土壤桿菌介導的瓜爾豆(Cyamopsistetragonoloba)的轉化，涉及用該方法產(chǎn)生的遺傳修飾的植物，還涉及例如β-內(nèi)酰胺酶抑制物舒巴坦(sulbactam)的物質協(xié)助瓜爾豆和其它植物轉化的應用。
背景技術：
：豆科植物的轉化蝶形花科(豆科)是世界上最重要的雙子葉植物科。由于其巨大的經(jīng)濟價值，人們已投入巨大的力量用遺傳工程改善其農(nóng)業(yè)性狀。土壤桿菌介導的轉化是一種常用的將基因轉移到植物中的方法。迄今已用土壤桿菌成功轉化的植物物種無一例外的是雙子葉植物(與單子葉植物相反)，不過不是所有的雙子葉植物都容易轉化。一些植物科，例如茄科，已經(jīng)證明特別適合于土壤桿菌介導的基因轉移，而其它科，例如蝶形花科，則因其極難被轉化而聞名。已用多種途徑嘗試生產(chǎn)轉基因大豆(Glycinemax)。葉子和原生質體被用做外植體來源，但這樣做未能再生出轉化植物。用根癌土壤桿菌注射大豆子葉得到轉基因植物，但是在許多試驗過的基因型中僅有一種用這種方法成功地轉化，(Hinchee等，生物/技術6915，1988)。WO94/02620描述了一種方法，用胚軸或子葉節(jié)及一系列為大豆轉化專門設計的步驟，包括特定溫度、pH值和土壤桿菌濃度生產(chǎn)轉基因大豆?？墒牵米尤~做外植體并不普遍適用于豆科植物的轉化。在大多數(shù)情況下外植體采用其它來源。例如，對豌豆(Pisumsativum)轉化，采用來自芽培養(yǎng)物和發(fā)芽的上胚軸的外植體作外植體，這樣得到的轉基因愈傷組織6個月后再生出植物(Pounti-Kaerlas等，植物細胞報導，8321，1989)。對白色三葉草(Trifoliumrepens)轉化，用土壤桿菌注射苗尖得到轉基因植物(Voisey等，植物細胞報導，13309，1994)。曾經(jīng)嘗試過轉化其它一些豆科植物。例如，用根癌土壤桿菌注射菜豆(Phaseolusvulgaris)的子葉節(jié)和胚軸得到轉基因的愈傷組織，但沒有得到轉基因植物(McClean等，植物細胞、組織和器官培養(yǎng)，24131，1991)。豇豆屬也一樣(Garcia等，植物科學4849，1986)。盡管有相當多的努力，尚未見報導花生(Arachishypogaea)的轉基因植物。本發(fā)明人試圖用Hinchee等描述的大豆子葉操作流程轉化瓜爾豆，但未獲成功。加上其它研究者報導的結果，這表明豆科植物轉化方法的選擇是實證性的，不能得到有科學基礎的一般原則。因此，要根據(jù)所研究的屬、種，甚至是基因型的具體要求來研制轉化一種豆科植物的轉化操作流程和外植體來源。大量的見于報導的有關獲得各種不同豆科植物的轉基因植物的嘗試清楚地表明，豆科植物的轉化非常困難，甚至對本領域的專業(yè)人員也是如此。在約100種有經(jīng)濟價值的豆科植物物種中，只有不到5種已被轉化，這個事實也進一步說明了這一點。因此，一種先前沒有轉化的豆科植物屬或種的成功轉化決非例行操作。瓜爾豆瓜爾豆(Cyamopsistetragonoloba)是一種由于其種子中高含量的半乳甘露聚糖(galactomannan)而具有很高經(jīng)濟價值的豆科植物。瓜爾豆半乳甘露聚糖又叫瓜爾豆膠，作為粘性增強劑用于食品或非食品用途。半乳甘露聚糖存在于胚乳中，胚乳占種子干重的約35％，其中80-90％是純的半乳甘露聚糖。大胚乳在蝶形花科中是一種不尋常的特征，通常蝶形花科中種子的胚乳部分幾乎沒有或僅存遺跡，而豆科植物的供萌芽的營養(yǎng)儲備大多貯于增大的子葉中。具有含半乳甘露聚糖的大子葉的豆科植物物種還無一例見于報導說已經(jīng)被遺傳轉化。舒巴坦土壤桿菌介導的基因轉移的一個內(nèi)在缺陷是細菌在轉化后繼續(xù)生長。為了防止植物材料的過度生長，必須有效地消滅細菌，通常是加入青霉素類的抗生素(β-內(nèi)酰胺)如羧芐青霉素、頭孢噻肟等。選用青霉素類物質是因為它們原則上對植物組織無毒。然而在實踐中，這些化合物經(jīng)常對外植體表現(xiàn)相當?shù)亩拘?。這種植物毒性除去直接毒性效應之外的一個可能原因是，抗生素在細菌和植物組織同時存在的情況下在長的溫育時間內(nèi)逐漸降解。不合需要的降解產(chǎn)物的一個例子是來自十分常用的抗生素羧芐青霉素，它被降解成苯乙酸。苯乙酸有類似生長素的性質，故引起外植體上愈傷組織生長加強，因而有損于再生。因此，最好能夠小劑量地使用抗生素和/或使用沒有這種不良副效應的抗生素。在轉化瓜爾豆的工作過程中，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺酶抑制物舒巴坦大幅度降低了青霉素類物質的必需濃度，因而極大地提高了轉化效率和降低了成本。由于這種新方法涉及的是常常必須從轉化過程中清除的細菌，因而該方法控制土壤桿菌生長可普遍應用于植物的轉化，而不限于某種特定的植物物種。發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明涉及一種瓜爾豆屬的遺傳修飾植物或其一部分，所述植物或植物部分在基因組中包含至少一段重組DNA序列。本發(fā)明另一方面涉及一種生產(chǎn)瓜爾豆屬的遺傳修飾植物或其一部分的方法，其包括下列步驟將一段重組DNA序列引入至少一個細胞或原生質體，用至少一種選擇培養(yǎng)基或生芽培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基至少包含一種選自生長素抑制物，β-內(nèi)酰胺酶抑制物和乙烯抑制物的化合物，來生成遺傳修飾的外植體，以此得到一種在其基因組中包含至少一段重組DNA序列的遺傳修飾植物或其一部分。本發(fā)明另一方面涉及一種生產(chǎn)遺傳修飾植物的方法，其中至少一種用于細胞、原生質體、愈傷組織或植物部分的選擇和生長的培養(yǎng)基包含至少一種物質，它抑制細菌生長或者增強細菌生長抑制物的效應而沒有任何顯著的植物生長調(diào)節(jié)效應或植物毒性效應。另一方面，本發(fā)明涉及一種嵌合植物，它能夠生產(chǎn)轉基因種子并通過將體外培養(yǎng)的遺傳修飾芽嫁接到非體外培養(yǎng)的植物上而獲得。發(fā)明詳述在本應用中，術語“遺傳修飾植物”和“轉基因植物”指的是本領域中通常所理解的意義，即經(jīng)改變后其基因組包含至少一段重組DNA序列的植物。“重組DNA序列”典型地是能夠在植物中表達或影響基因表達的序列，但也可以是，例如，一段可用作標記的序列，它并不一定表達或影響基因表達。表達的或影響基因表達的序列通常對天然形式的所研究植物來說是外來基因，但也可能是例如天然基因稍加改變的形式或例如一段啟動子或調(diào)節(jié)子序列，它可以導致天然基因表達發(fā)生改變。此處公開的生產(chǎn)遺傳修飾植物的方法的目的在于一般意義的遺傳轉化，而不限于任何特定種類的DNA序列的引入。術語“植物部分”一般指任何植物部分，例如組織或器官，而非完整植物，包括未分化的愈傷組織和分化的植物部分如枝、葉、根、果實、種子等。如上所述，本發(fā)明特別涉及瓜爾豆屬的遺傳修飾植物，具體地說，是指植物物種瓜爾豆。遺傳修飾的瓜爾豆植物可以由上述方法產(chǎn)生，其中第一步是將一段重組DNA序列引入至少一個細胞或原生質體，重組DNA的引入可以用生產(chǎn)遺傳修飾的植物常用的方法來完成，包括土壤桿菌介導的轉移，例如用根癌土壤桿菌Ti質粒或發(fā)根病土壤桿菌Ri質粒作載體，也可以用例如微注射、電穿孔或粒子轟擊。優(yōu)選的方法(在下面的實施例中描述)是土壤桿菌介導的基因轉移。如下所述，用根癌土壤桿菌轉化子葉得到良好結果，盡管所用子葉來自萌發(fā)了相當長的時間，例如11～12天的種子。將所需重組DNA引入選定的植物材料(例如組織、細胞或原生質體)后，用至少一種選擇培養(yǎng)基或生芽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含至少一種選自生長素抑制物、β-內(nèi)酰胺酶抑制物和乙烯抑制物的化合物，來生成遺傳修飾的外植體。因為已發(fā)現(xiàn)這些化合物的一種或幾種在選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基中會使愈傷組織減小而再生和轉化的芽的頻率增大。優(yōu)選地，選擇培養(yǎng)基包含至少一種生長素抑制物和一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物，生芽培養(yǎng)基包含至少一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物。更優(yōu)選地，選擇培養(yǎng)基包含一種生長素抑制物，一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物和一種乙烯抑制物，生芽培養(yǎng)基包含一種生長素抑制物和一種乙烯抑制物。抑制物(生長素抑制物，β-內(nèi)酰胺酶抑制物，乙烯抑制物)可以通過消除或降低相應化合物的量(即通過抑制這些化合物的生物合成或通過降解這些化合物)或者通過抑制這些化合物的作用而發(fā)揮作用。盡管不希望受到任何特定理論的束縛，我們認為這些抑制物的效應至少在一部分上涉及抗生素效應或抑制“類生長素”效應，因為生長素存在會導致愈傷組織生長增強，因而使芽再生和轉化芽分離的頻率降低。那些直接作為生長素抑制物而起作用的化合物顯然如此。對于β-內(nèi)酰胺酶抑制物，上面用例子解釋了舒巴坦的一種可能效應是消除降解產(chǎn)物苯乙酸(來自抗生素羧芐青霉素)，苯乙酸具有不需要的類生長素性質，導致愈傷組織生長增強。類似地，乙烯抑制物，除了它對乙烯的直接作用，從而可能阻止發(fā)育的芽過早衰老之外，據(jù)信也因為乙烯與生長素反應有關而具有有益的作用。應用生長素抑制物和乙烯抑制物無論采用任何類型的基因轉移都是有利的，例如細菌介導的轉移，如土壤桿菌介導的轉移，以及其它方法如微注射。電穿孔和微粒轟擊，而應用β-內(nèi)酰胺酶抑制物特別適合于用土壤桿菌或其它生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細菌株進行基因轉化的操作流程。優(yōu)選的生長素抑制物是2-對氯苯氧基-2-甲基丙酸(PCIB)，可用于選擇培養(yǎng)基，可選地用于生芽培養(yǎng)基，濃度約0.01～10mg/l，典型地約0.05-5mg/l例如0.1-2mg/l。其它可用的生長素抑制物是例如2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)、N-萘基鄰氨甲酰苯甲酸(NPA)、整形素、2，4，6-三氯苯氧基乙酸和7-氯吲哚乙酸。優(yōu)選的β-內(nèi)酰胺酶抑制物是舒巴坦(可得自Pfizer，商品名Betamaze)，舒巴坦可用于選擇培養(yǎng)基或生芽培養(yǎng)基，濃度約10-100mg/l，典型地約20-500mg/l，例如約50-200mg/l。優(yōu)選的乙烯抑制物是硫代硫酸銀，典型地用于選擇培養(yǎng)基或生芽培養(yǎng)基，濃度最高為50μM，典型地約0.1-10μM，例如約0.5-5μM。其它可用的乙烯抑制物有例如氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)，鈷和降冰片。除上述化合物外，發(fā)現(xiàn)某些其它化合物用于選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基時也有良好效果。例如，發(fā)現(xiàn)將鎳鹽加入選擇培養(yǎng)基后轉化頻率得到提高。因此，選擇培養(yǎng)基優(yōu)選地含有鎳鹽，如NiCl2·6H2O，例如濃度為約0.1-10mg/l，如0.5-5mg/l。發(fā)現(xiàn)苯基腺嘌呤(BAP)也導致較好結果。因此選擇培養(yǎng)基優(yōu)選地含有BAP，例如濃度約0.1-10mg/l，諸如1-5mg/l。BAP也可用于生芽培養(yǎng)基，濃度類似。當插入DNA序列包含一個卡那霉素抗性基因時，則卡那霉素，例如以卡那霉素硫酸鹽形式，濃度約50-300mg/l，典型地約100-200mg/l，例如約130-160mg/l存在于選擇培養(yǎng)基中也表明出良好效果。也發(fā)現(xiàn)當外植體(典型地是從中收獲芽的外植體)轉移到第二選擇培養(yǎng)基時，該培養(yǎng)基中的卡那霉素濃度比第一選擇培養(yǎng)基要低，優(yōu)選地不超過125mg/l，典型地20-100mg/l，例如30-70mg/l，此時也得到良好的結果。相似地，其它氨基糖苷抗生素諸如濕霉素、新霉素、鏈霉素和慶大霉素也可以與含有相關抗生素抗性基因的插入DNA序列一起用于選擇培養(yǎng)基。其它選擇試劑，例如除草劑或正選擇試劑諸如甘露糖或木糖也可采用。再生芽經(jīng)選擇與收獲，可用多種方法確定遺傳轉化芽的存在。其中之一(除上述應用抗生素及插入抗生素抗性基因外)是應用報告基因β-葡糖苷酸酶，其應用見下述及WO93/05l63。得到的轉基因瓜爾豆芽再利用已知方法再生成整個植株，即用芽直接生根或將轉基因芽嫁接到移植生長的已生根植株。后一種方法將轉基因芽嫁接到移植生長的植株(它們本身是轉基因的或者不是)的莖上，是很適用的，能得到生產(chǎn)轉基因種子的嵌合植株。進一步發(fā)現(xiàn)，將轉基因芽嫁接到幼苗上，例如7-28天的幼苗，典型地為12-21天的幼苗上，將得到特別好的結果。如上所述，本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)遺傳修飾植物的方法，其中用于選擇或生長細胞、原生質體、愈傷組織或植物部分的至少一種培養(yǎng)基包含至少一種物質，該物質能抑制細菌生長或者增強細菌生長抑制物的效應而沒有任何顯著的植物生長調(diào)節(jié)效應或植物毒性效應，例如β-內(nèi)酰胺酶抑制物。這一方面涉及到這一事實，即應用例如β-內(nèi)酰胺酶抑制物諸如舒巴坦的優(yōu)勢效應不僅限于瓜爾豆的轉化和選擇，而且普遍適用于任何植物中土壤桿菌介導的基因轉化(或者是在其它生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細菌菌株存在下)，其目的在于消除轉化后所不需要的細菌生長。該方法顯著的實用性和經(jīng)濟效益在于，選擇培養(yǎng)基和生芽培養(yǎng)基中青霉素類抗生素的用量大大降低，例如降至沒有β-內(nèi)酰胺酶抑制物時必需量的10％的水平。β-內(nèi)酰胺酶抑制物是舒巴坦時，其用量在上面給出。本發(fā)明進一步由下面的非限制性的實施例說明。實施例瓜爾豆轉化的一般操作流程幼苗瓜爾豆種子在亞氯酸鈉溶液中消毒，溶液含有2.5％自由氯，pH7.0，每100ml溶液加2滴Tween80。種子(約10g每100ml)被攪拌25分鐘，用無菌水洗5次，在濾紙上過夜干燥。然后將種子播種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，置于暗處25℃4天。然后以12小時/72小時日/夜規(guī)律繼續(xù)萌發(fā)7天。用富含營養(yǎng)的萌發(fā)培養(yǎng)基得到高質量的瓜爾豆幼苗。萌發(fā)培養(yǎng)基4.43g/lMSMO(SigmaM6899)20g/l蔗糖8.0g/l瓊脂pH5.8(用KOH調(diào))根癌土壤桿菌懸液LB-培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(溫育17～18小時)以制備土壤桿菌懸液，細菌培養(yǎng)物中不加乙酰丁香酮。LB培養(yǎng)基10g/l細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10g/lNaCl5.0g/l酵母提取物pH7.4(用NaOH調(diào))轉化和共培養(yǎng)大多數(shù)情況下細菌懸液用LB培養(yǎng)基稀釋劑OD0.1(660nm)，不過OD約為1時也得到好的結果。從12天的幼苗上切下帶約2mm長的下胚軸的子葉。用鑷子將子葉弄碎得到傷口表面，置于土壤桿菌懸浮液30分鐘。共培養(yǎng)的優(yōu)選操作流程是所謂三明治法，即將外植體置于濾紙上，濾紙再置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上。用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基浸透的濾紙蓋在外植體上以防外植體干燥。共培養(yǎng)培養(yǎng)基0.43g/lMS基本鹽混合物(SigmaM5524)20g/l蔗糖100mg/l肌肉肌醇0.1mg/l硫胺素HCl0.5mg/l吡咯醇HCl0.5mg/l煙酸1.0μM硫代硫酸銀8.0g/l瓊脂pH5.1共培養(yǎng)以12小時/12小時日/夜規(guī)律25℃進行3天。共培養(yǎng)后，外植體用加了100mg/l羧芐青霉素、100mg/l頭孢噻肟和1000mg/l溶菌酶的1/10MS-培養(yǎng)基沖洗2-3次，共45分鐘，同時以100rpm攪拌。選擇外植體轉移到選擇培養(yǎng)基中，如上(25℃，12小時日/12小時夜)溫育。選擇培養(yǎng)基3.2g/lGamborgB5(SigmaG5893)20g/l蔗糖1.0mg/l芐氨基嘌呤0.05mg/l赤霉酸(GA3)1.0μM硫代硫酸銀1.0mg/lNiCl2·6H2O0.5mg/l2-對氯苯氧基-2-甲基丙酸(PCIB)50mg/l頭孢噻肟50mg/l羧芐青霉素100mg/l舒巴坦(Betamaze)145mg/l卡那霉素硫酸鹽pH5.7轉基因芽的收獲初次收獲4星期后，收獲大于3mm的芽，轉移到芽培養(yǎng)基上。10-14天后檢查芽的指示基因β葡糖苷酸酶(GUS)活性，見下述。GUS-陽性的芽轉移到新鮮芽培養(yǎng)基上，而將GUS-陰性的芽棄去。芽培養(yǎng)基3.2g/lGamborgB5(SigmaG5893)20g/l蔗糖0.1mg/l芐基氨基嘌呤1.0μM硫代硫酸銀0.1mg/l赤霉酸(GA3)100mg/l頭孢噻肟100mg/l舒巴坦(Betamaze)8.0g/l瓊脂pH5.7二次收獲初次收獲后，外植體(從中收獲了芽)轉到卡那霉素濃度較低(50mg/l)的第二選擇培養(yǎng)基中。再過4個星期，收獲芽，做GUS檢測，陽性芽轉移到新鮮培養(yǎng)基上，將陰性芽棄去。轉基因芽的分析切下幼葉葉尖，轉移到含有200μlX-Gluc溶液的多孔培養(yǎng)皿(multidishwell)中。35℃溫育16小時后，葉尖用96％乙醇脫色，顯微鏡下確定顯藍色染色程度。X-gluc溶液(50ml)0.2MNa2HPO415.5ml0.2MNaH2PO49.5mlH2O19.5ml0.1MK3(Fe(CN)6)0.25ml0.1MK4(Fe(CN)6)·3H2O0.25ml0.1MNa2-EDTA5.0mlX-gluc(環(huán)己基銨5-溴-4-氯-3-吲哚基50mg-β-D-葡糖醛酸)嫁接轉基因芽的生根通過嫁接來實現(xiàn)。長0.5-1.0cm，選出表現(xiàn)健康的綠色的芽嫁接到以32℃/25℃14小時/10小時日/夜規(guī)律生長的1.5-2月大的瓜爾豆植株上。嫁接前，除去最上面的兩片葉子外所有的葉子都被除掉，在莖上節(jié)的部位幾乎垂直的切口處嫁接轉基因芽。嫁接的植株移至濕度培養(yǎng)箱5-6天。轉基因植物轉基因植物然后移到生長培養(yǎng)箱中，讓轉基團芽進一步生長。生長條件如上。約2個月后收獲含有大量轉基團種子的成熟莢果。實施例1不同品種瓜爾豆的轉化本實施例給出利用上述方法對幾個瓜爾豆品種的轉化。</tables>GUS+(GUS陽性，即轉化的)芽數(shù)目按每1000個用nopaline土壤桿菌菌株C58轉化的外植體計算得來。美國品種Lewis給出最高數(shù)目的含有GUS基因帶成功轉化的標記的轉基因芽，該品種用于下面的實施例中。實施例2土壤桿菌檢驗了一些去除有害作用的根癌土壤桿菌菌株對瓜爾豆的轉化，發(fā)現(xiàn)它們都適用。例如，對四種不同菌株(冠癭堿菌株LBA4404，Ditta等，美國國家科學院院刊777347，1980和來自C58的三種菌株)每種菌株處理500個瓜爾豆外植體。每種菌株均產(chǎn)生11-26個再生芽，其中1-3個是GUS陽性芽。相似地，另一土壤桿菌菌株(L，L-succinamopine菌株EHA101)，用來處理2500個外植體，得到25個再生芽，其中8個GUS陽性。LBA4404也用來處理2500個外植體，得到67個再生芽，其中17個GUS陽性。所用的根癌土壤桿菌菌株在T-DNA區(qū)含有編碼β-葡糖苷酸酶(用于GUS檢測)和新霉素磷酸轉移酶(用于含卡那霉素培養(yǎng)基上的選擇)的基因。實施例3卡那霉素選擇本實施例中，選擇培養(yǎng)基中卡那霉素硫酸鹽最適濃度為145mg/l，不過用125-145mg/l范圍內(nèi)濃度也得到有效的轉化。用100mg/l或更低濃度的卡那霉素得到接近100％的轉化頻率，盡管只得到少數(shù)幾個轉基因芽</tables>每種處理中用土壤桿菌菌株EHA101轉化總共1600個外植體。二次收獲，其中卡那霉素濃度降低，得到約50％的轉基因芽。若卡那霉素濃度保持在125-145mg/l，二次收獲僅得到幾個轉基因芽。實施例4BAP和NiCl2本實施例顯示了在選擇培養(yǎng)基中加入芐基腺嘌呤(BAP)和NiCl2的良好效果。每種處理中，用土壤桿菌菌株EHA101轉化總共1200個外植體。加入5mg/lBAP既增加了轉化體數(shù)目又增加了再生芽的總數(shù)。再生芽總數(shù)在5mg/lBAP時為1mg/lBAP時的約兩倍。加入1mg/lNiCl2·6H2O，轉化頻率高2-4倍，可能是由于所用的MS和GamborgB5培養(yǎng)基缺鎳。實施例5硫代硫酸銀本實施例顯示硫代硫酸銀(STS)大大提高了轉化頻率。GUS+芽數(shù)目按每1000個用EHA101轉化的外植體計算。硫代硫酸銀濃度為2.5μM時得到的轉化體比0、5.0或10.0μM硫代硫酸根時多得多。STS導致的轉化頻率提高是由于芽質量極大提高。缺乏STS，轉基因芽矮小呈病黃色，而STS的存在維持了芽的生長。由于已知銀離子抑制乙烯的作用，STS的良好效果可能是由于容器中乙烯效用的降低，從而防止過早衰老。實施例6PCIBPCIB(2-對-氯苯氧基-2-甲基丙酸)有抗生長素效果，能抑制愈傷組織形成。缺少PCIB時，選擇操作流程中形成大量愈傷組織，有損于再生。加0.1-2mg/lPCIB大大降低了愈傷組織的量，增加了再生和轉基因芽的數(shù)目。實施例7舒巴坦本實施例顯示β-內(nèi)酰胺酶抑制物舒巴坦極大降低了選擇所需的羧芐青霉素和頭孢噻肟的量并增大轉化頻率。<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="843">羧芐青霉素(mg/l)頭孢噻肟(mg/l)舒巴坦(mg/l)GUS+芽數(shù)800002100100100550501009</table></tables>每種處理中用EHA101轉化總共800個外植體。所有3種處理均消除土壤桿菌。用800mg/l羧芐青霉素時轉基因生芽狀況差，呈病黃色。轉移到芽培養(yǎng)基上后也不能恢復，許多轉基因芽最后死亡。在50或100mg/l羧芐青霉素及200mg/l舒巴坦上選擇的轉基團芽長勢良好，呈正常綠色，在體外(invitro)可保持相當長時間。實施例8苯基噻二唑基脲(Thidiazuron)加入細胞激動素苯基噻二唑基脲(TDZ)極大地增加轉化頻率。如下表顯示，選擇培養(yǎng)基中最適TDZ濃度在0.3-30mg/l范圍內(nèi)。轉化頻率增至1.5-1.8倍。除了增大轉化頻率，苯基噻二唑基脲也有利于后續(xù)的轉基因芽的克隆。實施例9嫁接轉基因芽的生根通過嫁接來實現(xiàn)。盡管如上述，嫁接到發(fā)育成熟的植株(1.5-2月大)上是可以的，嫁接到12-21天大的幼苗上成功率更高。將消毒的瓜爾豆種子置于萌發(fā)培養(yǎng)基上(見上)，然后按13小時/11小時日/夜規(guī)律25℃培養(yǎng)12-21天，得到幼苗。剪下子葉，胚軸豎直下切0.5-1cm深。轉基因芽置于切口上，用一小段消毒繩縛緊。5-10天后去掉繩子，嫁接的小植株移至土壤中。在嫁接到這樣的幼苗上的49個轉基因芽中，有42個存活(89％)并得到具有正常表現(xiàn)型的可育植株。實施例10Southern印跡分析為了確證轉基因的存在和轉基因瓜爾豆株系中基因拷貝數(shù)，從葉子樣本中提取基因組DNA用HindIII消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。用HybondN+(Amersham)進行Southern印跡，在生產(chǎn)商推薦的緩沖液中68℃進行預雜交和雜交。DNA探針是用“Readytogo”試劑盒(Pharmacia)隨機活化標記的PMI基因或GUS基因。在雜交緩沖液中加入1×106CPM/ml的標記引物。圖1給出用PMI基因作探針的Southem印跡分析。除泳道1外，每一泳道均有2.1kb的深帶，2.1kb是用HindIII消化得到的預期的DNA片段大小。泳道1顯示相似大小的一種淺帶。泳道8是非轉基因瓜爾豆株系(line)。圖2給出用GUS基因作探針的Southem印跡分析，大多數(shù)泳道顯示一種深帶，表明這些株系含有一份GUS基因，泳道7中DNA消化得到4條帶，表示該株系含4份GUS基因。泳道8是非轉基因瓜爾豆株系。圖1給出轉基因瓜爾豆株系的基因組Southern分析。不同轉基因瓜爾豆株系的10μg基因組DNA用HindIII消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。DNA印到HybondN+上，與含有〔32P〕dCTP標記的PMI基因的探針雜交?！?5S〕DNA標記物(Amersham)用作分子量標記物(MW)。圖2給出轉基因瓜爾豆株系的基因組Southern分析。不同轉基因瓜爾豆株系的10μg基因組DNA用HindIII消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。DNA印到HybondN+上，與含有〔32P〕dCTP標記的GUS基因的探針雜交。〔35S〕DNA標記物(Amersham)用作分子量標記物(MW)。實施例11轉基因后代的分析在一些獨立的瓜爾豆轉化體中研究了轉基因的遺傳和分離。初級轉化體自交，播下一定量種子(10-20個)。GUS檢測(見上)顯示出第二代植株中GUS基因的存在。<tablesid="table7"num="007"><tablewidth="844">轉化體序號播種數(shù)GUS陽性數(shù)目GUS陰性數(shù)目GUS陽性百分比％P162011955％P182012860％P31107370％</table></tables>該表顯示GUS基因穩(wěn)定遺傳，近似單個顯性基因分離。另外，GUS基因保持其活性。權利要求1.一種瓜爾豆屬的遺傳修飾植物或植物部分，該植物或植物部分在其基因組中含有至少一段重組DNA序列。2.權利要求1的瓜爾豆的遺傳修飾植物或植物部分，該植物為瓜爾豆。3.得自權利要求1或2的植物的種子、幼苗或植物部分。4.一種生產(chǎn)瓜爾豆屬的遺傳修飾植物或其部分的方法，其包括下列步驟將一段重組DNA序列導入至少一個細胞或原生質體，用至少一種選擇培養(yǎng)基或生芽培養(yǎng)基，生成遺傳修飾的外植體，以得到在基因組中含有至少一段重組DNA序列的遺傳修飾植物或其部分，所述培養(yǎng)基中包含至少一種選自生長素抑制物、β-內(nèi)酰胺酶抑制物和乙烯抑制物的化合物。5.權利要求4的方法，其中用含有至少一種生長素抑制物和一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物的選擇培養(yǎng)基和含有至少一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物的生芽培養(yǎng)基，生成遺傳修飾的芽。6.權利要求5的方法，其中選擇培養(yǎng)基含有一種生長素抑制物、一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物和一種乙烯抑制物，生芽培養(yǎng)基含有一種生長素抑制物和一種乙烯抑制物。7.權利要求4-6中任一權項的方法，其中生長素抑制物是2-對氯苯氧基-2-甲基丙酸(PCIB)，β-內(nèi)酰胺酶抑制物是舒巴坦。8.權利要求4-7中任一權項的方法，其中選擇培養(yǎng)基中含有作為生長素抑制物的PCIB，濃度為0.01-10mg/l，作為β-內(nèi)酰胺酶抑制物的舒巴坦，濃度為10-1000mg/l，生芽培養(yǎng)基中含有作為β-內(nèi)酰胺酶抑制物的舒巴坦，濃度為10-1000mg/l。9.權利要求8的方法，其中選擇培養(yǎng)基含有PCIB，濃度為0.05-5mg/l，例如0.1-2mg/l。10.權利要求8或9的方法，其中選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基含有舒巴坦，濃度為20-500mg/l，例如50-200mg/l。11.權利要求4-10中任一權項的方法，其中選擇培養(yǎng)基進一步含有卡那霉素。12.權利要求11的方法，其中選擇培養(yǎng)基含有卡那霉素硫酸鹽，濃度50-300mg/l，典型地為100-200mg/l，例如130-160mg/l。13.權利要求12的方法，其中外植體從選擇培養(yǎng)基轉移到第二選擇培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有的卡那霉素硫酸鹽濃度比第一選擇培養(yǎng)基中的低，優(yōu)選地不超過125mg/l，典型地為20-100mg/l，例如30-70mg/l。14.權利要求4-13中任一權項的方法，其中選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基含有作為乙烯抑制物的硫代硫酸銀，濃度最高為50μM。15.權利要求14的方法，其中選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基含有硫代硫酸銀，濃度為0.1-10μM，例如0.5-5μM。16.權利要求4-15中任一權項的方法，其中選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基進一步含有鎳鹽。17.權利要求4-16中任一權項的方法，其中選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基進一步含有赤霉素。18.權利要求4-17中任一權項的方法，其中選擇培養(yǎng)基和/或生芽培養(yǎng)基進一步含有青霉素類的抗生素，如羧芐青霉素或頭孢噻肟。19.權利要求4-18中任一權項的方法，其中轉化在子葉上進行。20.權利要求19的方法，其中子葉來自萌發(fā)至少4天的種子，典型地為至少7天，例如至少10天。21.權利要求4-20中任一權項的方法，該方法用于生產(chǎn)瓜爾豆的遺傳修飾植株。22.權利要求4-21中任一權項的方法，其中遺傳修飾的芽嫁接到幼苗或移植生長的生根植株上。23.一種生產(chǎn)遺傳修飾植物的方法，其中至少一種用于細胞、原生質體、愈傷組織或植物部分的選擇或生長的培養(yǎng)基含有至少一種下述物質，該物質可抑制細菌生長或者增強細菌生長抑制物的作用而沒有任何顯著的植物生長調(diào)節(jié)作用或植物毒性作用。24.權利要求23的方法，其中所述物質是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制物。25.權利要求24的方法，其中β-內(nèi)酰胺酶抑制物是舒巴坦。26.權利要求25的方法，其中舒巴坦存在于至少一種選擇培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基中，濃度為10-1000mg/l，典型地是20-500mg/l，例如50-200mg/l。27.權利要求24-26中任一權項的方法，其中在生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株的存在下，β-內(nèi)酰胺酶抑制物與減量的抗生素一起使用。28.權利要求23-27中任一權項的方法，其中所述物質用于土壤桿菌介導的基因轉移。29.權利要求23-28中任一權項的方法，其中細菌生長抑制物被用于生產(chǎn)瓜爾豆的遺傳修飾植株。30.能夠生產(chǎn)轉基因種子的嵌合植物，它是通過將體外培養(yǎng)的遺傳修飾芽嫁接到非體外培養(yǎng)的植株上而獲得的。31.權利要求30的嵌合轉基因植物，它屬于蝶形花科。32.權利要求31的嵌合轉基因植物，它屬于瓜爾豆屬。33.權利要求32的嵌合轉基因植物，它是瓜爾豆。全文摘要本發(fā)明涉及一種瓜爾豆屬豆科植物的轉化和再生的方法，特別是土壤桿菌介導的瓜爾豆的轉化，轉化是通過下述方法完成的將一段重組DNA序列引入至少一個細胞或原生質體，利用至少一種選擇培養(yǎng)基或生芽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含至少一種選自生長素抑制物(例如2-對氯苯氧基)-2-甲基丙酸(PCIB))、β-內(nèi)酰胺酶抑制物(如舒巴坦)和乙烯抑制物(如硫代硫酸銀)的化合物，產(chǎn)生遺傳修飾的外植體，以得到一種在其基因組中包含至少一段重組DNA序列的遺傳修飾的植物或其一部分；涉及用該方法產(chǎn)生的遺傳修飾的植物；涉及例如β-內(nèi)酰胺酶抑制物舒巴坦的物質協(xié)助瓜爾豆或其它植物轉化的應用。文檔編號C12N15/82GK1155907SQ95194469公開日1997年7月30日申請日期1995年6月6日優(yōu)先權日1995年6月6日發(fā)明者M·約斯波,F·T·奧凱利斯申請人:丹尼斯科有限公司