專利名稱：紫杉屬植物體細胞胚胎發(fā)生的誘導，以及由它生產(chǎn)含有紫杉烷環(huán)的生物堿的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物細胞培養(yǎng)和藥理學領域，尤其是涉及在紫杉屬，特別是短葉紅豆杉(T.brevifolia)的植物組織培養(yǎng)和初級外植體中誘導體細胞胚胎發(fā)生。
本發(fā)明還涉及一個驚人的發(fā)現(xiàn)由短葉紅豆杉的外植體誘導形成的體細胞胚能產(chǎn)生含有紫杉烷環(huán)(taxane-ring)的生物堿。利用這一發(fā)現(xiàn)，描述了由體細胞胚的體外繁殖培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉酚(taxol)或紫杉酚前體的方法。
A.紫杉酚和通過體外繁殖生產(chǎn)次級植物代謝物紫杉酚在1964年首次被證實為一種二萜，隨后又證明它具有抗癌作用，能抗卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌、黑素瘤和結腸癌。紫杉酚和兩種含有紫杉烷環(huán)的生物堿前體的結構如下
10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ
紫杉酚主要產(chǎn)生于短葉紅豆杉(T.brevifolia)的樹皮和形成層組織。利用現(xiàn)有方法，生產(chǎn)1公斤紫杉酚需要約10，000公斤的樹皮，這相當于2000-4000株六十年至七十年樹齡的樹木的樹皮。最新的估計是，每年需要大約250公斤紫杉酚純藥。這相當于二千五百萬公斤干樹皮或是約750，000株樹的產(chǎn)量。由于短葉紅豆杉的缺乏，目前正在尋找其它的紫杉酚資源。
經(jīng)過考證的一個紫杉酚的潛在資源是體外培養(yǎng)的細胞和組織。美國專利US-5，019，504描述了短時紅豆杉外植體的愈傷組織細胞培養(yǎng)物的發(fā)生和增殖。由該方法所形成的愈傷組織細胞被證實能產(chǎn)生紫杉酚。
利用愈傷組織或是未分化的細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)次級代謝物，如紫杉酚，還有一些障礙。通常，次級代謝物由異化的或分化的組織產(chǎn)生;最突出的是，樹皮產(chǎn)生紫杉酚或是樹葉產(chǎn)生諸如漿果赤霉素之類的其他紫杉烷。未分化的或愈傷組織培養(yǎng)物通常缺乏組建象紫杉烷這么復雜的分子的必要的生物合成能力，或者是缺乏一旦合成之后分離這些分子所需要的細胞分化程度。所以，其結果一直是，在愈傷組織培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)次級代謝物，而且，即使偶爾在愈傷組織中測到次級代謝物，其濃度通常也是遠低于植株中的。
雖然如此，對于用愈傷組織培養(yǎng)物生產(chǎn)次級代謝物的問題還是做了廣泛的研究，因為這種愈傷組織易于建立和操作，并且生長速度快。通常，為了進行體外研究，快速生長的愈傷組織培養(yǎng)物是產(chǎn)生用于檢測次級代謝物比如這種低濃度的紫杉酚所需的大量組織的最簡便的方法。愈傷組織培養(yǎng)物快速生長的速度突出了它們的另一個缺陷即，組成該培養(yǎng)物的細胞傾向于遺傳上不穩(wěn)定，表現(xiàn)出高度的遺傳重組和不穩(wěn)定的倍性水平。這種遺傳學上的不穩(wěn)性能最終會導致具有極低的紫杉酚生產(chǎn)能力的培養(yǎng)物的產(chǎn)生。為了避免這一問題的出現(xiàn)，就需要由一個遺傳庫連續(xù)地重建愈傷組織培養(yǎng)物。
為了大規(guī)模體外產(chǎn)生次級植物產(chǎn)品，將快的生長速度與具有分化的細胞或組織所固有的產(chǎn)生次級代謝物的能力的未分化的細胞培養(yǎng)物體的高生物量濃度的能力結合在一起是有利的。研究者已經(jīng)認識到，以與未分化的細胞培養(yǎng)物(即愈傷組織或細胞懸浮液)同原型的方式繁殖的、但是由分化的細胞或組織組成的培養(yǎng)物具有產(chǎn)生次級代謝物的潛力。例如，已經(jīng)對幼芽培養(yǎng)物(由大量快速增殖的幼芽組成的組織培養(yǎng)物)作為在葉片或莖桿組織中發(fā)現(xiàn)的香精油和生物堿的來源進行了研究(Heble，inPrimaryandSecondaryMetabolisminPlantCellCultures，Neumann等(ed.)，Springer-Verlag，BerlinHeidelberg，PP.281-289(1985))。在幼芽培養(yǎng)中，讓能夠產(chǎn)生并分離出香精葉子油的特異組織類型增殖，而且，芽的形態(tài)發(fā)生所要求的嚴格的發(fā)育程序也降低了遺傳上的不穩(wěn)定性。這樣，已證實組織培養(yǎng)能綜合未分化和已分化體系的誘人前景。
盡管在未分化的細胞培養(yǎng)中檢測到了紫杉酚的存在，但尚未在組織培養(yǎng)體系中描述過其產(chǎn)生過程。胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物就是這樣的體系之一。
從生物化學、組織學和宏觀性狀來看，胚發(fā)生的針葉樹組織培養(yǎng)物顯著不同于針葉樹的愈傷組織培養(yǎng)物。盡管術語“愈傷組織”是用于描述細胞和組織培養(yǎng)物的一種普通術語，但是，針葉樹體胚胎發(fā)生領域的許多研究人員都反對用“愈傷組織”來描述胚發(fā)生的針葉樹組織(例如參見Gupta和Durzan的論文，Bio/Tech.5∶147-151(1987);Rohr等，Amer.J.Bot.76∶1460-1467(1988);Tautorous等，Can.J.bot.69∶1873-1899(1991))。反對使用“愈傷組織”一詞的理由是，胚發(fā)生的針葉樹組織培養(yǎng)物不是由未分化的細胞組成，而是由分化的細胞(類胚柄細胞)組成，且其結構類似于處于發(fā)育狀態(tài)的種子的早期胚。因此，胚發(fā)生的針葉樹組織培養(yǎng)物不適于愈傷組織或其液體對應物、細胞懸浮培養(yǎng)物的定義，它表示一種通過使具有組織培養(yǎng)體系的次級代謝物產(chǎn)生能力的細胞培養(yǎng)體系的有利的生長特性具體化來生產(chǎn)紫杉酚的改良途徑。
B.針葉樹的體細胞胚胎發(fā)生盡管本領域中誘導體細胞胚胎發(fā)生的方法已公開了一段時間(Tisserat)等，Hort.Rev.1∶1-78(1979))，但直到最近才在具有松果的樹種上成功地得到驗證(見Hakman等，PlantSci.38∶53-59(1985))。自從首次報導在針葉樹的細胞培養(yǎng)物中成功地誘導了體細胞胚胎發(fā)生一來，已證實了來自松屬、云杉屬、冷杉屬、落葉松屬、黃杉屬的18個樹種具有產(chǎn)生體細胞胚的能力(Tautorous等，Can.J.Bot.69∶1873-1899(1991))。
由針葉樹生產(chǎn)體細胞胚并不是普遍的。一些重要的品種，如紫杉屬的樹種尚未培養(yǎng)成功。
C.轉基因植物重組DNA和遺傳技術方面的最新進展使得在受體植物上理想基因序列的導入和表達成為可能。通過采用這種方法，經(jīng)過遺傳工程處理過的植物可以表達在天然植物中不是正常存在或者不是天然存在的基因序列。利用重組技術產(chǎn)生的植物被稱為“轉基因”植物。
轉基因植物通常是通過轉化單個的植物細胞，然后再通過體細胞胚胎發(fā)生由該細胞再生出全植株而產(chǎn)生的。由于從單細胞可以再生許多種屬的植物(Friedt，W.等，Prog.Botany49∶192-215(1987));Brunold，C.等，Molec.GenGenet.208∶469-473(1987);Durand，J.等.PlantSci.62∶263-272(1989);Attree等，Can.J.bot.67∶1790-1795(1989)，所以要從一個廣泛的植物種群中成功地產(chǎn)生轉基因植物從理論上講是可行的。
一些向植物細胞中導入外源基因并使之表達的方法已經(jīng)發(fā)展起來。其中包括來自根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)的遺傳工程的Ti質粒(Czako，M.等，PlantMol.Biol.6∶101-109(1986);Feirer等，Proceedings20thSouthernForestTreeImprovementConference，1989年6月26日-30日，Charleston，SouthCarolinaPg.381;Jones，J.D，G.等，EMBOJ.4∶2411-2418(1985));遺傳工程的植物病毒，如花椰菜花葉病毒(Shah，D.M.等，Science233∶478-481(1986));Shewmaker，C.K.等，Virol.140∶281-288(1985));將基因序列顯微注射到植物細胞法(Crossnay，A.等，Molec.Gen.Genet.202∶179-185(1986);Potrykus，I.等，Molec.Gen.Genet.199∶169-177(1985));電激法(Fromm，M.E.等，Nature319∶791-793(1986);Tautorus等，Theon.Appl.Genet.78∶531-536(1989))，以及DNA包覆粒子加速法(Bolik，M.等，Protoplasma162∶61-68(1991))。上述方法中的幾種已成功地用于體外轉化針葉樹組織(Ellis等，InternationolSocietyofPlantMolecularBiology，1991年10月6-11日會議，Tucson;Arizona)。
為了生產(chǎn)紫杉酚以及相關的紫杉烷，針葉樹(即紫杉屬)的胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物綜合了快速生長和具有分化細胞所固有的次級代謝物積累能力的愈傷組織培養(yǎng)物的生物量生產(chǎn)能力。盡管在短葉紅豆杉(T.brevifolia)的愈傷組織培養(yǎng)物中檢測到了紫杉酚的存在(Christen等，US-5，019，504)，但未報導其產(chǎn)量。紫杉屬的胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物與常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)物的生長相似，并能以相同的方式處理。但是，由于它含有能產(chǎn)生和分離紫杉烷的組織，所以這種組織培養(yǎng)物具有產(chǎn)生更多紫杉烷的能力。
胚發(fā)生的針葉樹組織即使對體細胞胚胎發(fā)生領域來說也是一種獨特的組織，這種組織在植物繁殖和次級代謝物生產(chǎn)方面的潛力尚未進行鑒定。因此，本發(fā)明描述了如何利用紫杉屬胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物的獨特能力來生產(chǎn)紫杉酚及相關的紫杉烷。
本發(fā)明是基于這樣的觀察結果由紫杉屬植物經(jīng)體外培養(yǎng)所獲得的初級外植體能產(chǎn)生并分泌出抑制體細胞胚胎發(fā)生的化合物。根據(jù)這一觀察結果，本發(fā)明提供了從紫杉屬植物的培養(yǎng)物和初級外植體誘導體細胞胚胎發(fā)生的方法。具體地說，通過首先在一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)紫杉屬植物的外植體，隨后又在培養(yǎng)過程中不斷將外植體轉移到新的培養(yǎng)基上以獲得早期體細胞胚的辦法，可以由紫杉屬植物的外植體得到胚發(fā)生的組織。
本發(fā)明還涉及到培養(yǎng)的紫杉屬的胚胎發(fā)生的組織。
本發(fā)明還提供了無性繁殖紫杉屬植物的方法。具體地說，紫杉屬的植物可以這樣無性繁殖(1)在一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)紫杉屬植物的外植體，(2)在培養(yǎng)過程中將該外植體不斷轉移到新的培養(yǎng)基上，以獲得胚發(fā)生的組織，(3)將胚發(fā)生的組織轉移到能將其內(nèi)所含的體細胞胚誘導成植株的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)遺傳上變異了的紫杉屬植物的方法。利用本發(fā)明的誘導體細胞胚發(fā)生的方法，現(xiàn)在可以由遺傳上變異了的單個的紫杉屬植物細胞再生出全植株。以這種方式產(chǎn)生的植株，可以選擇其產(chǎn)生較多紫杉酚或含紫杉烷環(huán)的生物堿的能力，或是選擇其在特殊生理狀態(tài)下生長的能力。具體地說，本發(fā)明涉及一種繁殖能大量生產(chǎn)含紫杉烷環(huán)的生物堿的紫杉屬變種植株的方法。這些變種可以是從在體外繁殖過程中出現(xiàn)的自然發(fā)生的變種中篩選出來的，或是通過化學或物理誘變產(chǎn)生的，還可以是用外源DNA轉化所獲得的結果。
本發(fā)明還基于這樣的驚人發(fā)現(xiàn)體外繁殖的紫杉屬植物的體細胞胚能產(chǎn)生含紫杉烷環(huán)的生物堿。這一結果之所以驚人，是因為從未見過在胚中發(fā)現(xiàn)紫杉酚的報道。而且，更沒料到的是體細胞胚可以產(chǎn)生象含紫杉烷環(huán)的生物堿這樣的次級代謝物，因為據(jù)信這種胚缺乏產(chǎn)生這些次級代謝物所必需的生物化學結構。
利用胚發(fā)生的組織的體外培養(yǎng)物，現(xiàn)在可以生產(chǎn)大量的含有紫杉烷環(huán)的生物堿。胚發(fā)生的組織具備愈傷組織培養(yǎng)物所有的快速生長的優(yōu)點，可以產(chǎn)生大量的組織，同時，還能激增能分離紫杉烷的結構(體細胞胚)。來自紫杉屬植物的體細胞胚培養(yǎng)物的含紫杉烷環(huán)的生物堿可以這樣獲得首先在一種培養(yǎng)基上，在能夠產(chǎn)生體細胞胚的條件下培養(yǎng)來自紫杉屬植物的外植體，然后，從體細胞胚或其培養(yǎng)基中分離含紫杉烷環(huán)的生物堿。
附圖的簡要說明

圖1表示松柏目胚胎發(fā)育的幾個典型時期;
圖2a和2b表示生產(chǎn)體細胞胚的連續(xù)流體系統(tǒng)(a)和生產(chǎn)含紫杉烷環(huán)的生物堿的連續(xù)流體系統(tǒng);
圖3是從若干紫杉屬品種誘導體細胞胚發(fā)生的總結;
圖4表示系列的三條HPLC曲線，其中，曲線1是表示通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)短葉紅豆杉所獲得的提取物的成份分離的HPLC曲線。曲線2是短葉紅豆杉提取物與紫杉酚標準樣品混合物的HPLC曲線(3∶1;參見20.000分鐘時的峰值)。曲線3是上述提取物與紫杉酚標準樣品1∶1混合物的HPLC曲線。
下面詳述本發(fā)明。
Ⅰ.在來自紫杉屬植物的外植體中誘導體細胞胚的發(fā)生本發(fā)明基于這樣的觀察結果來自紫杉屬植物，尤其是短葉紅豆杉的初級外植體和體外細胞培養(yǎng)物，能產(chǎn)生抑制體細胞胚發(fā)生的化合物。根據(jù)這一觀察結果，可以推判，那是產(chǎn)生了含紫杉烷環(huán)的生物堿。因此，本發(fā)明提供了由紫杉屬品種，尤其是短葉紅豆杉的初級外植體誘導體細胞胚發(fā)生的方法(圖3)。
具體地說，該方法包括以下步驟在一種能促進體細胞胚發(fā)生的誘導的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來自紫杉屬植物的外植體;在培養(yǎng)期間將外植體轉移到新的培養(yǎng)基上以除去培養(yǎng)的細胞上所產(chǎn)生的抑制劑;分離培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的體細胞胚。
這里所用的“體細胞胚”是由具有沿著模擬種子內(nèi)的合子胚胎的發(fā)育路線發(fā)育成植株的潛力的細胞或細胞群組成的。針葉樹與大多數(shù)植物一樣，其體細胞胚發(fā)生的細胞可以分成兩個階段(見圖1)。第一階段包括胚發(fā)生前的團塊和早期成形的體細胞胚(見圖1中第一階段)，第二階段包括早期成形的胚進一步分化和發(fā)育成胚(階段3-6)。胚發(fā)生前的團塊是一種具有成為胚的潛力但缺乏明顯的分生組織器官原基的細胞群。正是這些胚發(fā)育的不成熟的階段，才使得只要將培養(yǎng)物保持在含有2，4-D和BA的培養(yǎng)基上即可進行增殖。
通過將胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物轉移到支持胚成熟的培養(yǎng)基上，使胚的發(fā)育沿與種子胚的類似的途徑進行。該發(fā)育途徑的各個階段如圖1所示。
在胚發(fā)生的最后階段(階段7)，形成了成熟的子葉狀的胚，它具有發(fā)育完好的伸長的雙極結構，在一端包含潛在的分生組織和子葉原基，另一端則包含潛在的基團。這種胚里的細胞通常具有如下特征含有儲存蛋白質和脂類，而且細胞質濃稠。
胚發(fā)生的針葉樹組織明顯有別于愈傷組織細胞培養(yǎng)物，因此很多人認為不能稱之為愈傷組織培養(yǎng)物。愈傷組織培養(yǎng)物被認為是一種未分化的細胞的無組織的生長體，這些細胞是不相邊連接的或是松散連結的，且通常可以由培養(yǎng)各種外植體而產(chǎn)生。與胚發(fā)生的培養(yǎng)物中的細胞不同，愈傷組織細胞傾向于圓形、等徑、高度液泡化，以及具有不稠的細胞質。愈傷組織細胞被認為是晚分化的或未分化的細胞，因為它是通過分化的植物外植體的快速細胞分裂而產(chǎn)生的。
另一方面，胚發(fā)生的組織是由(1)非常早期的胚的，(2)正處于產(chǎn)生早期胚狀態(tài)的細胞(即，胚發(fā)生前的團塊)的或(3)從早期的胚上脫落下來的胚柄細胞的團塊組成。因此，該培養(yǎng)物具有自己的組織特點，而且在低倍顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，它是由明顯不同的類型的細胞和組織組成。
除了物理特性的不同之外，愈傷組織細胞與胚發(fā)生的細胞在生物化學和組織學水平上也不相同，上述不同可以由如下生化標記的差異看出如乙烯增長速度、谷胱甘肽濃度、還原鐵離子的能力，蛋白質合成速度以及質體結構(Wann等，PlantCellReports6∶39-42(1987);Wann等，Tree3∶173-178(1989))。
在這里，“初級外植體”是指從植物上獲得的任何組織或細胞。它包括但并不限于合子胚組織、根或芽的分生組織、以及形成層組織。最好的組織是從未成熟的假種皮獲得的和由合子胚細胞、子葉細胞以及下胚軸細胞組成的組織。
任何紫杉屬的品種均可用作外植體的來源。包括短葉紅豆杉(T.brevifolina)、歐紫杉(T.baccata)、T.xmedia和硬尖紅豆杉(T.cuspidata)，但不局限于比。
培養(yǎng)之前，對外植體進行表面消毒，以殺滅可能存在于外植體表面的污染物，如細菌或真菌。最常采用的方法是將外植體浸入漂白粉和濕潤劑(如Tween-20TM)的溶液中。這樣浸泡一下既可以消毒外植體的表面，又不致于影響內(nèi)在的細胞。為了幫助消毒劑滲入外植體表面可以在浸泡時抽真空。一旦得到外植體并經(jīng)過消毒處理以后，就立即將其放入液體培養(yǎng)基中或放在固體培養(yǎng)基上。
一般，大多數(shù)經(jīng)過證實的能有效誘導其它針葉樹體細胞胚發(fā)生的植物生長培養(yǎng)基都可以用來由紫杉屬的品種產(chǎn)生體細胞胚。這些培養(yǎng)基包括BLG(Wann等，Trees3∶173-178(1989)，在這里作為參考)、MS(Gupta等，Bio/Technology5∶141(1987)，在這里作為參考)、BMI(Krogstrup，Can.J.For.Res.16∶664-668(1986)，在這里作為參考)、以及DCR(Gupta等，PlantCell.Rep.4∶177(1985)，這里作為參考)，但不局限于此。最理想的是含有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、芐腺嘌呤(BA)和酪蛋白水解物的培養(yǎng)基。本領域熟練技術人員無須過多的實驗即可輕易地改變這些培養(yǎng)基將其用于本發(fā)明。在下面所舉的一個例子中，采用了BLG培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)初級外植體時可以采用各種條件。根據(jù)植物品種的不同以及組織來源的不同，其溫度和光照等條件也稍有不同。對短葉紅豆杉來說，培養(yǎng)最好在黑暗中進行，溫度在20-25℃之間。本領域技術人員可輕易地改變培養(yǎng)條件，以使細胞繁殖和胚胎發(fā)生同時達到最佳狀態(tài)。
外植體在被誘導體細胞發(fā)生之前所需要培養(yǎng)的時間取決于外植體的來源、培養(yǎng)條件和轉移頻率。對于短葉紅豆杉的未成熟的外植物體來說，以22℃、無光照的條件下于BLG-酪蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2-4周轉移一次，大約6周之后便可誘導胚發(fā)生的組織。
在這里，“轉移外植體”是指為外植體提供新鮮培養(yǎng)基的過程。轉移可以有效地除去外植體上抑制胚發(fā)生的抑制劑，多種紫杉屬的外植體都可分泌這種抑制劑。為了誘導和維持體細胞胚發(fā)生而要進行的這種轉移，在針葉樹中是獨一無二的。
轉移被培養(yǎng)的組織的方法要根據(jù)所用的培養(yǎng)基的類型而變化。當外植體保持在固體培養(yǎng)基上時，轉移時是將外植體從老培養(yǎng)基上取出再放到新鮮培養(yǎng)基上。由生長中的紫杉屬培養(yǎng)物產(chǎn)生的胚胎發(fā)生抑制劑不會在固體培養(yǎng)基中迅速擴散。因此，只需將培養(yǎng)的外植體轉放到培養(yǎng)皿的新鮮表面上即可除去外植體上分泌的抑制劑。
從紫杉屬的液體培養(yǎng)物中也可誘導體細胞胚的發(fā)生。通過過濾或沉淀可以從液體培養(yǎng)基中分離出胚發(fā)生的組織，以便為其更換新鮮培養(yǎng)基。或者采用連續(xù)流動系統(tǒng)給培養(yǎng)的組織提供新鮮培養(yǎng)基。在這種系統(tǒng)中，是將組織保持在這樣的環(huán)境中即，允許培養(yǎng)基在環(huán)境中流動，但限制培養(yǎng)的細胞流動(見圖2a)。
轉移的間隔時間根據(jù)外植體的來源、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)物中細胞濃度而變化。通常，當采用固體培養(yǎng)基時，每隔2-3周需做一次轉移。本領域熟練技術人員僅通過肉眼觀察體細胞胚的發(fā)生速率即可確定轉移間隔時間。
一旦獲得了發(fā)生體細胞胚的培養(yǎng)物，這種胚就能夠成熟、分離并發(fā)芽生成幼苗?？梢圆捎帽绢I域任何已知的胚成熟方法。通常包括將胚發(fā)生的組織轉移到滲透性提高了的且含脫落酸(ABA)的培養(yǎng)基上(Becwnar等，TappiJournal70(4)∶155-160(1987))。
本發(fā)明還提供了培養(yǎng)的紫杉屬胚發(fā)生的組織，這種組織是通過上述方法獲得的。任何紫杉屬胚品種都能用，其中包括短葉紅豆杉、歐紫杉(T.baccata).T.xmedia和硬尖紅豆杉(T.cuspidata)，但不局限于這些。
采用上述技術，可以用體細胞胚無性繁殖紫杉屬植物。
如果需要某種植物的無性繁殖后代，那么就將這種植物用作初級外植體的來源。如上文所述，通過不斷地培養(yǎng)轉移，可以誘導初級外殖體體細胞胚的發(fā)生，由此所產(chǎn)生的胚可順利地再生出全植株，而由此產(chǎn)生的植株就是由外殖體無性繁殖的后代(見Becwar等，TappJournal70(4)∶155-160(1987);Durzan等，PlantScience52∶229-235(1987);Krogstrup.等，PlantCellReports7∶594-597(1988)，這里引作參考)。
此外，上述方法還可用于繁殖該外植體源的變種的植物。
在這里，“變種”是指含有產(chǎn)生外植體的植物中所不具備的遺傳變化的任何植物或組織。這種變化包括倍性水平的變化，特定DNA片段的序列的變化或外源DNA的導入。變種可以是組織培養(yǎng)過程中自然產(chǎn)生的，或者通過生化、物理或分子技術產(chǎn)生。
由于植物培養(yǎng)物傾向于遺傳上不穩(wěn)定，因此在延長培養(yǎng)中可產(chǎn)生自然發(fā)生的變種?？梢詫@種變種的生理學特征的變化進行試驗，如加速了的生長，產(chǎn)生植物代謝或生物堿的能力，成倍性的變化。這種變種表現(xiàn)出較高的產(chǎn)生紫杉酚或紫杉酚前體的能力是理想的。一旦得到證實，即可分離這種變種的細胞，并將其用于生產(chǎn)無性繁殖的植株，這種植株具有較高含量的紫杉酚或紫杉酚前體(如前所述)。
除了自然出現(xiàn)的變種外，也可以通過本領域已知的多種方法產(chǎn)生變種。其中包括物理或化學誘變、原生質體融合或是直接用外源DNA轉化，但不局限于這些方法。在體細胞胚發(fā)生開始之前可用以上方法在初級外植體中誘導變種，或是在用本發(fā)明方法所產(chǎn)生的體細胞胚中誘導變種。
物理或化學誘變需要在減數(shù)分裂和有絲分裂期間讓培養(yǎng)的細胞或初級外植體接觸能誘發(fā)DNA損壞或抑制染色體分離的媒體。這些媒體包括紫外線、甲基磺酸乙酯、氧化亞氮、吖淀橙、秋水仙素和亞硝基胍。這些媒體已被用于各種系統(tǒng)中使生物的DNA發(fā)生隨機的變化，從而產(chǎn)生變種(Chaleff，R.S.Science219∶676-682(1983))。
盡管突變位點和所產(chǎn)生的變種無法預先確定，但本領域熟練技術人員可以順利地將已知的誘變和選擇方法用于本發(fā)明的外植體和胚發(fā)生的培養(yǎng)物。
被誘變的細胞，可以就其在產(chǎn)生次級代謝物，如本發(fā)明中的含紫杉烷環(huán)的生物堿方面的變異進行篩選。這種突變型最好能大量產(chǎn)生含紫杉烷環(huán)的生物堿。檢測含紫杉烷環(huán)化合物含量的方法包括HPLC(參見實施例)，以及讓培養(yǎng)基樣品與對含紫杉烷環(huán)的生物堿有專一性的抗體發(fā)生免疫反應。參見StephenM.Edington，Bio/Technology9∶993-938(1991)。
原生質體融合可用于產(chǎn)生倍性增加的變種以及產(chǎn)生含有來自其它品種染色體的植物。例如，通過融合產(chǎn)生紫杉酚或紫杉酚前體的紫杉屬品種和不產(chǎn)生上述物質的品種的原生質體，就可以產(chǎn)生出兼具兩個品種特性的變種。
還可由導入外源DNA產(chǎn)生變種(Ellis等，InternationalSocietyofplantMolecularBiology，1991年10月6-11日會議，Tuscon，Arizona)。如前文所述，已有多種將DNA導入植物細胞的方法。其中包括來自根癌土壤桿菌(A.Tumefaciens)的遺傳工程Ti質粒(Czako，M.等，PlantMol.Biol.6∶101-109(1986);Jones，J.D.G.等，EMBOJ.4∶2411-2418(1985);Feirer等，Proceedings20thSonthernForestTreeImprovementConference，1989年，6月26-30日，Charlestown，SouthCarolina，P381);遺傳工程的植物病毒，如花椰菜花葉病毒(Shah，D.M.等，Science233∶478-481(1986);Shewmaker，C.K.等，Virol.140∶281-288(1985));將基因片段顯微注射到植物細胞(Crossway，A.等，Molec.Gen.Genet.202∶179-185(1986);Potrykus，I.等，Molec.Gen.Genet.199∶169-177(1985));電激法(Fromm，M.E.等Nature319∶791-793(1986);Tautorus，T.E.等，TheorAppl.Genet.78∶531-536(1989));和DNA包覆粒子加速法(Bolik，M.等，Protoplasma162∶61-68(1991))，但并不局限于上述方法。
利用上述方法中的一種，本領域技術人員就能順利生產(chǎn)出含有外源基因結構的變種。通過這種方式，就可以生產(chǎn)出具有預定特性，如抗菌能力的變種。本領域普通技術人員無須太多實驗便可順順當當?shù)睾Y選出這一特征。
Ⅱ.由胚發(fā)生的組織產(chǎn)生含紫杉烷環(huán)的生物堿本發(fā)明的另一個實施例基于這樣的觀察結果體外繁殖的紫杉屬體細胞胚能產(chǎn)生含紫杉烷環(huán)的生物堿。這一發(fā)現(xiàn)是驚人的，因為紫杉酚通常存在于液泡中，而體細胞胚并無發(fā)達的液泡。而且也沒料到能從這些生化上未成熟的細胞中獲得象含紫杉烷環(huán)的生物堿這樣的次級代謝物。利用這種體外培養(yǎng)物，現(xiàn)在可以大量生產(chǎn)含紫杉烷環(huán)的生物堿。另外，現(xiàn)在還可以大規(guī)模生產(chǎn)紫杉屬幼苗并從中分離含紫杉烷環(huán)的生物堿。這一點之所以顯得突出是因為幼苗是僅次于樹皮的一個紫杉酚及其前體的來源(Vidensek，N.等，J.NaturalProd.53∶1609-1610(1990))。
具體地說，可以從由紫杉屬的外植體生成的體細胞胚的培養(yǎng)物中獲得含紫杉烷環(huán)的生物堿，外植體的來源包括短葉紅豆杉(T.brevifolia)、歐紫杉(T.baccata)、T.xmedia和硬尖紅豆杉(T.cuspidata)。
詳細地說，外植體是由能產(chǎn)生所需的含紫杉烷環(huán)的生物堿的紫杉屬品種獲得。用前面所述的方法由該外植體生成含有體細胞胚的培養(yǎng)物。采用本領域眾所周知的技術，如柱色譜法，可以從培養(yǎng)基或組織中分離出含紫杉烷環(huán)的生物堿(Wani等，J.Am.Chem.Soc.93∶2325(1971);M.Boyd，PersonalCommunication(1991年8月);Witherup，K.M.等，J.Liq.Chromatgr.12∶2117-2132(1989))。圖2b表示這樣一個系統(tǒng)。
最好將經(jīng)過高壓滅菌的真菌細胞或提取物添加到培養(yǎng)基中，以促進含紫杉烷環(huán)的生物堿的產(chǎn)生。當把這種真菌細胞提取物添加到培養(yǎng)基中時，胚發(fā)生的組織活動，通過生成紫杉烷化合物以抵御假設的感染。
用來分離含紫杉烷環(huán)的生物堿的最佳的胚是第7階段至發(fā)芽期的胚(圖1)。處于第1和第2階段的胚，雖然也可能含有含紫杉烷環(huán)的生物堿，但是難于將其從非胚發(fā)生的組織中分開或分離。而第7階段的胚易于同非胚發(fā)生的組織分離，因而是理想的。本領域技術人員可利用已知方法順利地分離胚，以便獲得任何特定時期的胚用于生產(chǎn)含紫杉烷環(huán)的生物堿。
另一方面，由胚發(fā)生的培養(yǎng)物產(chǎn)生的充分發(fā)育的幼苗也可用作含紫杉烷環(huán)生物堿的來源。
可以從分批或連續(xù)更換下來的培養(yǎng)基中提取含紫杉烷環(huán)的生物堿。胚發(fā)生的培養(yǎng)物可以在自由的懸浮液中生長，或是固定在載體，如空心纖維上。Durzan等在PlantScience52∶229-235(1987)中提到了這樣一些載體。
前面對本發(fā)明了做了概括性說明，參照下面的實施例將能更好理解本發(fā)明。這些實例是用于說明本發(fā)明的，并非用于限定保護范圍。除非另有說明。本文所引用的全部專利和出版物在這里作為參考之用。
實施例產(chǎn)生和保持紫杉屬的胚發(fā)生的組織的方法以及隨后的分析紫杉酚的方法胚發(fā)生的紫杉屬組織的產(chǎn)生和保持在夏季(最好是7月)采集紫杉屬樹種的未成熟的假種皮，并通過與20%的家用漂白粉溶液(1.1%次氯酸鈉)攪和30分鐘來達到消毒，(每100ml消毒液)加幾滴Tween20TM作為濕潤劑。經(jīng)用無菌水漂洗3次后，在無菌條件下將未成熟的胚從假種上切下來并水平地擺放在表1所示的培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)物在22℃、黑暗中培養(yǎng)4周。在這一時期結束時，將外植體轉移到新鮮培養(yǎng)基上，其實，只需將培養(yǎng)物轉移到原培養(yǎng)皿上的新位點即可。再過2周(總共6周)之后，清點產(chǎn)生了胚發(fā)生的組織的培養(yǎng)物的數(shù)。胚發(fā)生的組織表現(xiàn)出胚發(fā)生的針葉樹組織所具備的表型特征半透明至白色、粘液狀。
最常見的是，胚發(fā)生的組織發(fā)生于未成熟胚外植體的子葉或下胚軸區(qū)。將胚發(fā)生的組織用鑷子從原始外植體上剔除，隨后便可將其作為純粹的胚發(fā)生的組織在與開始時相同的條件下，在相同的培養(yǎng)基上保持。通過每3周轉移1次的方式將胚發(fā)生的組織連續(xù)保持下來。
由未成熟的紫杉屬的胚產(chǎn)生胚發(fā)生的組織的頻率以未成熟的短葉紅豆杉(T.brevifolia)和種子群體作為特例(Corvalis，DR)進行說明(見表2)。正處于子葉形成期的胚產(chǎn)生胚發(fā)生的愈傷組織的頻率比尚未發(fā)育到子葉期的幼胚的頻率高(見圖1)。包含有酪蛋白水解物(500ml/L)的培養(yǎng)基，不僅能提高子葉期胚胎的發(fā)生頻率，而且使從幼胚產(chǎn)生胚發(fā)生的組織成為可能。
除短葉紅豆杉以外的其它品種的培養(yǎng)物的胚發(fā)生的組織的發(fā)生頻率示于表3中。這些品種包括歐紫杉(T.baccata)、T.xmedia和硬尖紅豆杉(T.cuspidata)。
從胚發(fā)生的組織中提取和測定含紫杉烷環(huán)的生物堿用一個改進的已知的方法(M.Boyd，PersonalCommunication(1991年8月)分析胚發(fā)生的組織里的紫杉酚(Witherup，K.M.等，J.Liq.Chromotgr.12∶2117-2132，(1989))。簡爾言之，將胚發(fā)生的紫杉屬組織在TenBreock組織研磨器中用己烷勻漿。除去己烷，殘留的植物組織用1∶1的二氯甲烷/甲醇抽提，室溫下過夜。次日，將混合物過濾，并在氮氣流中蒸發(fā)干燥。殘余物用微量甲醇溶解，并分配于1∶1的二氯甲烷/水之間。棄掉水層，并將有機層蒸干。殘余物用甲醇收集，并對其進行HPLC分析。
HPLC分析是用苯基鍵合的硅膠柱進行的，在異氰酸鹽條件下實施，移動相是由甲醇∶乙腈∶50mM硫酸銨水溶液(20∶32∶48)組成的鍰沖液，用乙酸將PH調至4.4。液速為1ml/min，流出物用波長228nm的光檢測。
沒有發(fā)現(xiàn)含有胚發(fā)生前團塊的胚發(fā)生的組織和第一階段的體細胞胚中產(chǎn)生紫杉酚。然而，觀察到了幾個吸收峰，峰的遷移證實它們是含紫杉烷的生物堿而不是紫杉酚。
這些結果通過多克隆抗體間接競爭抑制酶免疫測定得到了證實(CIEIA，HawaiiBiotechnologyGroup.Inc.)。
表1用于胚發(fā)生的紫杉屬組織培養(yǎng)物的培養(yǎng)基配方成分濃度(mg/L)KNO3100MgSO4.7H2O 320KH2PO4170CaCl2.2H2O 440KCl745KI0.83H3BO36.2MnSO4.H2O 16.9ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025FeSO4.7H2O 27.8Na2EDTA 37.3肌醇100煙酸0.5吡哆醇0.1硫胺.HCL0.1蔗糖20,000谷酰胺1,450天門冬酰胺1002,4-D2芐腺嘌呤1細菌用瓊酯8,000
PH＝5.8BLG2/1培養(yǎng)基＝上述配方BLCG2/1培養(yǎng)基＝上述配方+500mg/L酪蛋白水鮮物表2短葉紅豆杉(T.brevifolia)的未成熟胚發(fā)育階段體細胞胚發(fā)生的發(fā)生頻率6周)
由液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的紫杉屬的胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉酚從保持在由瓊脂固化的上面剛敘述的BLG-酪蛋白培養(yǎng)基上的紫杉屬物種的胚發(fā)生的培養(yǎng)物中未檢測到紫杉酚。但是，當胚發(fā)生的組織在搖動(110轉/分)的三角瓶中用相同配方的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，在用過的培養(yǎng)基中測到了紫杉酚。胚發(fā)生的紫杉屬組織的液體培養(yǎng)物是通過將生長在瓊脂固化的培養(yǎng)基上的胚發(fā)生的組織的團塊分散在少量的液體BLG-酪蛋白保持培養(yǎng)基中而產(chǎn)生的。在22℃、110轉/分、在暗淡的熒光下(80英尺燭光)給以8小時光照的條件下，1-2月之后可得到由大小一致的組織團塊構成的培養(yǎng)物。在獲得由大小一致的組織團塊構成的培養(yǎng)物之前，液體培養(yǎng)基要每10-21天換一次，所謂更換是潷去用過的培養(yǎng)基并添加等體積的新鮮培養(yǎng)基。
一旦得到分散良好的液體培養(yǎng)物，便可以下述方法生產(chǎn)紫杉酚。將培養(yǎng)物接種到新的培養(yǎng)基上，即用移液管把一定體積的培養(yǎng)物移至新鮮培養(yǎng)基中，接種濃度為1份母液培養(yǎng)物接10份新鮮培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在上述條件下振蕩培養(yǎng)，21天后收集用過的培養(yǎng)基。將用過的培養(yǎng)基在真空條件下濃縮、干燥，提取紫杉酚并進行HPLC檢測(圖4)。
如圖4所示，曲線1顯示紫杉屬提取物含有若干個在與紫杉酚標準試樣大致相同的地方洗脫的峰值。曲線2是表示紫杉屬提取物與紫杉酚標準樣品的3∶1混合物的分離的HPLC。可以看出，接近20.00分鐘時洗脫的肩峰在尺寸上增大了。當分離1∶1的紫杉屬提取物和紫杉酚標準樣品混合物時，該肩峰進一步增大，從而證實了紫杉酚的存在。還證實了其它含紫杉烷環(huán)的化合物，如cephalomannine的存在。
至此已對本發(fā)明做了全面的說明，本領域技術人員可以想到，用很大范圍內(nèi)的任何等同的操作方式和不影響本發(fā)明或其實施例的其它參數(shù)均可實施本發(fā)明。
權利要求
1.一種由紫杉屬的外植休生產(chǎn)含有體細胞胚的胚發(fā)生的組織的方法，包括以下步驟在一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)紫杉屬外植體；在培養(yǎng)期間，不斷將外植體轉移到新鮮培養(yǎng)基上；以獲得早期體細胞胚。
2.一種由紫杉屬無性繁殖植株的方法，包括以下步驟在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫杉屬外殖體;在培養(yǎng)期間，不斷將外植體轉移到新鮮培養(yǎng)基上以獲得早期胚;以及將早期胚轉移到一種能誘導小植株形成的培養(yǎng)基上。
3.一種由紫杉屬胚發(fā)生的組織培養(yǎng)物生產(chǎn)含紫杉烷環(huán)的生物堿化合物的方法，包括以下步驟在一種培養(yǎng)基中，在能產(chǎn)生體細胞胚或體細胞幼苗的條件下培養(yǎng)紫杉屬的外植體;從所述胚或培養(yǎng)基中分離含紫杉烷環(huán)的生物堿化合物。
4.一種生產(chǎn)遺傳上變異的紫杉屬植物的方法，包括如下步驟在一種培養(yǎng)基中，在能產(chǎn)生體細胞胚的條件下培養(yǎng)紫杉屬的外植體;將DNA導入上述的胚中，以產(chǎn)生遺傳上變異的胚;以及由變異的胚再生植株。
5.一種生產(chǎn)遺傳上變異的紫杉屬植物的方法，包括以下步驟從紫杉屬獲取外植體;將DNA導入外植體;在一種培養(yǎng)基中，在能產(chǎn)生體細胞胚的條件下培養(yǎng)帶有上述DNA的外植體，以及由體細胞胚再生植株。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于外植體得自未成熟的假種皮。
7.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于培養(yǎng)在黑暗中進行，而轉移大約每2-3周進行一次。
8.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是通過顯微注射導入胚中的。
9.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是由Ti質?；蚱湫揎楏w導入胚中的。
10.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是通過電激法導入胚中的。
11.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是通過粒子加速導入胚中的。
12.培養(yǎng)的紫杉屬胚發(fā)生的組織。
13.如權利要求12所述的培養(yǎng)的胚發(fā)生的組織，其特征在于上述組織是從選自短葉紅豆杉(T.brevifolia)、歐紫杉(T.baccata)、T.x media和硬尖紅豆杉(T.cuspidata)的植物上得到的。
14.一種生產(chǎn)紫杉屬植物的、能產(chǎn)生較高含量的含紫杉烷環(huán)的生物堿的變種的方法，包括以下步驟在一種培養(yǎng)基中，在能產(chǎn)生體細胞胚的條件下培養(yǎng)紫杉屬的外植體;用一種可行的誘變劑誘導外植體發(fā)生突變;篩選能產(chǎn)生較高含量的含紫杉烷環(huán)的生物堿的胚;以及由選出的胚再生植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了在紫杉屬品種的組織培養(yǎng)物中誘導體細胞胚發(fā)生的方法。另外，本發(fā)明還提供了利用體外繁殖的體細胞胚組織獲得紫杉酚及其前體的方法。
文檔編號C12N5/04GK1079000SQ93104538
公開日1993年12月1日 申請日期1993年4月1日 優(yōu)先權日1992年4月1日
發(fā)明者S·R·沃思, W·R·戈德納 申請人:友聯(lián)坎普公司