專利名稱：生產(chǎn)納他霉素的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)納他霉素(natamycin)的方法，特征在于制備接種物，在pH大約為5.0至6.5的液體培養(yǎng)基中繁殖并發(fā)酵接種物。
納他霉素是多烯家族抗真菌劑的一個成員。化合物納他霉素是分子量約為666，經(jīng)驗結(jié)構(gòu)式相當于C33H47NO13的四烯，且該化合物含有葡糖苷連接的碳水化合物部分，即放線菌糖胺。納他霉素的等電點約為pH6.5，其結(jié)構(gòu)上存在兩種典型構(gòu)型烯醇結(jié)構(gòu)和酮結(jié)構(gòu)。
多年前即已知道生產(chǎn)納他霉素。美國人Cyanamid的英國專利846，933(1960)中公開了發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的常規(guī)方法(該專利列為本文參考文獻)。
盡管納他霉素具有抗生素和抗真菌劑價值，但該產(chǎn)品幾乎還沒有商業(yè)用途。限制其使用的一個主要原因是它的生產(chǎn)成本太高。
本發(fā)明的一個目的是克服常規(guī)方法的無效性，并提供一種通過在控制pH的預(yù)定培養(yǎng)基中增殖并發(fā)酵接種物，以合理成本生產(chǎn)納他霉素的方法。
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素。特別是涉及制備(如孢子形成)并增殖含有鏈霉菌屬微生物的接種物，以在發(fā)酵期間產(chǎn)生納他霉素?？墒规溍咕鷮倬N暴露于一系列能改善納他霉素之產(chǎn)生速率的預(yù)定環(huán)境和/或培養(yǎng)基。已發(fā)現(xiàn)通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入足夠量的堿性pH控制劑，使pH保持在大約5.0至6.5之間，即可提高納他霉素發(fā)酵的速率及其產(chǎn)率。
適于接種物增殖的液體培養(yǎng)基包含a)含量約為2-16g/l，一般為大約8g/l的蛋白質(zhì)氮源;
b)含量一般為5-30g/l，較好為大約15g/l，足以避免總氮耗竭的可代謝之碳源。
發(fā)酵期間用于誘導(dǎo)接種物產(chǎn)生納他霉素的適當液體培養(yǎng)基包含a)大約80-250g/l的可代謝碳源;
b)含高比例蛋白質(zhì)和微量成分的蛋白質(zhì)氮源。蛋白質(zhì)氮源一般包含非酵母蛋白氮成分和酵母蛋白氮成分。這兩類蛋白氮成分的比例范圍一般分別為大約5∶1至11∶1(基于蛋白質(zhì)含量)，且最好是大約8∶1。


圖1是顯示用于本發(fā)明接種物增殖之方法的流程方塊圖。
圖2是圖解顯示發(fā)酵期間發(fā)生之三個典型階段。
圖3是按照實施例4至6所述方法生產(chǎn)納他霉素時以時間對納他霉素生產(chǎn)率作圖。
根據(jù)本發(fā)明，將能夠產(chǎn)生納他霉素的生物體放入預(yù)定的培養(yǎng)基中與之接觸，以產(chǎn)生接種物，然后放入預(yù)定的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基中，用以支持生物體在進一步增殖和納他霉素生產(chǎn)發(fā)酵期間發(fā)揮最大代謝活性。在發(fā)酵期間，生物體至少將一部分預(yù)定的生產(chǎn)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化成納他霉素。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入足夠量的堿性pH控制劑以維持pH在大約5.0和6.5之間，從而可提高納他霉素的生產(chǎn)速率并改善納他霉素產(chǎn)率。
任何包含能產(chǎn)納他霉素之鏈霉菌的生物體均可用于本發(fā)明。優(yōu)選的鏈霉菌包括Streptomycesgilvosporeus，該菌種已保藏在AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，Rockville，Maryland，U.S.A.，保藏登記號為13326。
從適當孢子的孢子懸浮液制備接種物。然后發(fā)酵適當鏈霉素菌種的接種物，當將其加入本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中時即可產(chǎn)生高產(chǎn)率的納他霉素。接種物一般要經(jīng)歷一系列的增殖步驟，其中每個步驟都能增加生產(chǎn)納他霉素之鏈霉菌細胞的量。當鏈霉菌細胞的量達到足夠之后，即可使鏈霉菌與鏈霉菌菌種發(fā)酵時能提高納他霉素生產(chǎn)量的環(huán)境和/或培養(yǎng)基接觸。
孢子懸浮液收集得自American Type Culture Collection之納他霉素生產(chǎn)鏈霉菌菌種的孢子，以開始制備接種物。孢子發(fā)芽產(chǎn)生鏈霉菌菌種的活性生長培養(yǎng)物。用鏈霉菌菌種(即S.gilvosporeus或其他的納他霉素生產(chǎn)菌種)的活性生長培養(yǎng)物培養(yǎng)滅菌(如高壓滅菌)的瓊脂斜面，并保溫直到該斜面基本上完全被孢子復(fù)蓋為止。將瓊脂斜面上的孢子刮入小量水(如蒸餾水)或營養(yǎng)培養(yǎng)基等液體中，以產(chǎn)生孢子的水懸浮液，以得到用于發(fā)酵生產(chǎn)(即納他霉素生產(chǎn))過程的接種物。為獲得最佳結(jié)果，用于制備接種物的孢子懸浮液所含孢子濃度應(yīng)為大約105-1010CFU/ml，一般至少為大約108CFU/ml。
許多瓊脂斜面培養(yǎng)基均可用于促進鏈霉菌菌種(如S.gilvosporeus)之培養(yǎng)物的孢子形成，進而用于形成孢子懸浮液。適當?shù)沫傊泵媾囵B(yǎng)基一般至少包括下列的一種成分酵母麥芽瓊脂、Hickey-Turner瓊脂、GYA瓊脂、Pridham瓊脂、馬鈴薯右旋糖、Bennett氏瓊脂等。
孢子懸浮液內(nèi)存在高濃度(如108CFU/ml)活孢子是本發(fā)明的一個重要特征。首先，如果孢子的濃度太低，為通過接種物增殖獲得足可以較低成本發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素之鏈霉素孢子數(shù)所花費的時間就要長。第二，減低懸浮液內(nèi)孢子的數(shù)量會延長接種物增殖的時間，并增加污染的機會(例如污染不需要的生物體)，再者，懸浮液內(nèi)的低孢子濃度可促進大的、緊密壓積之菌絲體餅的形成。由于存在與氧及營養(yǎng)素不便于向沉淀餅內(nèi)轉(zhuǎn)遞有關(guān)的問題，故這些餅對于得到高產(chǎn)率納他霉素是不適宜的。如果菌絲體沉淀餅達到不適當?shù)拇笮?，就?yīng)用物理方法如使用剪切力(如混合器)打碎之。
接種物增殖使上面討論的孢子懸浮液(如S.gilvosporeus)萌發(fā)并進行多次細胞復(fù)制，直到生物體的數(shù)目足可適于用作發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的含水接種物為止。適宜的接種物細胞密度應(yīng)為大約1-5g細胞干重/l，并以大約0.1-10%納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基的體積使用之。
用于接種物增殖的液體培養(yǎng)基決定了細胞密度和接種物的代謝狀態(tài)(如需要有足夠密度的健康細胞)。為使接種物具有所需的細胞密度和代謝狀態(tài)，需要有足夠量的蛋白氮，和通常包括于蛋白質(zhì)氮源中的復(fù)合生產(chǎn)長因子(如維生素)、無機元素(如鉀、鈉、鈣等)，及微量元素(如硼、鈷、鐵、銅、鋅等)。蛋白質(zhì)氮源可以是使孢子懸浮液增殖成接種物，進而使之產(chǎn)生高產(chǎn)率納他霉素的任何氮源。
還必須向接種物液體培養(yǎng)基內(nèi)提供可代謝的碳源，加入量應(yīng)可以使接種物達到所需的細胞密度。為得到最好結(jié)果，在接種物增殖期間不應(yīng)使碳源完全耗竭。碳源耗竭將可能對接種物的代謝狀態(tài)造成不利影響，導(dǎo)致發(fā)酵期間納他霉素產(chǎn)率降低。
盡管可按照本發(fā)明有效地使用多種液體接種物培養(yǎng)基，但為了獲得高產(chǎn)率納他霉素，最好使用預(yù)定量的培養(yǎng)基成分。
可在水(如含低礦物質(zhì)的水及蒸餾水等)中制備適于接種物增殖的培養(yǎng)基，其中包含a)含量約為2-16g/l，一般為大約8g/l的蛋白質(zhì)氮源;
b)含量一般約為5-30g/l培養(yǎng)基，正常為大約15g/l的，且足可防止總碳耗竭的可代謝碳源。
適于接種物增殖之培養(yǎng)基的兩種特定組分如下組分1量Difco"Bacto"胨5g/l玉米漿液3g/l氯化鈉10g/l葡萄糖15g/l組分2量Hormel胨PSR58g/l氯化鈉10g/l葡萄糖15g/l可采用常規(guī)技術(shù)(例如可在大約120-140℃的溫度下分別或同時對碳和氮源進行消毒滅菌處理)制備可提供適于提高鏈霉菌細胞之生產(chǎn)率的接種物培養(yǎng)基。滅菌后的接種物培養(yǎng)基可望有大約為7的pH。將孢子懸浮液引入接種物培養(yǎng)基中并將接種物培養(yǎng)基加熱到大約25-40℃，一般約28-35℃的溫度。
為了得到大體積適于發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的液體接種物，需進行幾次接種物增殖步驟，每次均以大于前一步驟的體積進行。例如，可按使鏈霉菌細胞的量呈指數(shù)增加的方式進行接種物增殖。具體地說，可通過有效地增加各增殖步驟期間接種物的體積使培養(yǎng)物在增殖期間保持對數(shù)生長方式。此可通過減少各步驟的周期或減少步驟的數(shù)目達到。例如，一旦達到了接種物的預(yù)定細胞密度即可將接種物轉(zhuǎn)移到一個大的環(huán)境(如容器)內(nèi)，使之進一步增殖。由于有效地控制接種物增殖，使這一過程花費最少時間和成本，從而可增加發(fā)酵期間經(jīng)濟上合算的納他霉素產(chǎn)率。
在一系列接種物增殖中，使各個步驟得以持續(xù)進行的時間長短取決于培養(yǎng)基的成分、所需鏈霉菌細胞的量及溫度等因素。一般說來，單個增殖步驟要進行大約6至24小時。
在接種物增殖步驟過程中要給接種物通氣。例如，可將裝有接種物的培養(yǎng)瓶或容器放在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以大約200rpm的速度攪拌。對于本發(fā)明，可用定位在裝接種物之容器內(nèi)的葉輪攪拌接種物，同時由容器的底部加壓充入無菌空氣。
現(xiàn)在參見附圖1，該圖以圖解方式說明可用于產(chǎn)生發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素之接種物的方法。圖1舉例說明了為得到一定量的液體接種物，實現(xiàn)以經(jīng)濟上有價值的方式生產(chǎn)納他霉素，以增殖方法達到的接種物的體積增加。例如，將25升接種物加到含有1225升接種物液體培養(yǎng)基的容器內(nèi)，可使接種物的體積從25升增加到1250升。
納他素生產(chǎn)在能夠容納發(fā)酵過程的發(fā)酵容器內(nèi)進行納他霉素生產(chǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入足夠量的堿性pH控制劑，使pH保持在大約5.0和6.5之間即可提高納他霉素的產(chǎn)生速率并改善產(chǎn)率。本發(fā)明的達到最大納他霉素產(chǎn)率的另一個重要方面是液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有適當量的可代謝碳和蛋白質(zhì)氮。另外可期望培養(yǎng)基包含復(fù)合生長因子(如維生素)、無機元素(如鉀、鈉、鈣等)及微量元素(如硼、鈷、鐵、銅、鋅等)。
可在水(如低礦物質(zhì)水、蒸餾水等)中制備適當?shù)陌l(fā)酵培養(yǎng)基，它包含a)大約80-250g/l的可代謝碳源，和b)至少大約15g/l，且正常大約20g/l至80g/l含有高水平蛋白質(zhì)和微量成分的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)氮源可包括非酵母蛋白質(zhì)氮成分和酵母蛋白質(zhì)氮成分。這兩種蛋白質(zhì)氮成分一般以基于蛋白質(zhì)含量的分別為大約5∶1至11∶1的比例范圍存在，且最好是約8∶1。
可由廣泛來源提供蛋白質(zhì)氮源。例如，大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品可含有非酵母蛋白質(zhì)氮源(如用含有80-95%蛋白質(zhì)的大豆蛋白質(zhì)源可獲得理想的納他維霉素產(chǎn)率)。蛋白質(zhì)氮也可含有牛肉提取物和/或蛋白質(zhì)水解物(如胨)。
如上所述，生產(chǎn)培養(yǎng)基還必須含有可被鏈霉菌代謝的碳源。碳源可以葡萄糖、多糖、玉米和馬鈴薯淀粉等的形式提供。
再者，就本發(fā)明的一個方面來說，作為納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基的初始成分，不必要在開始時就向培養(yǎng)基內(nèi)引入生產(chǎn)納他霉素所需要的全部量的碳源(如初始量的碳源不足以完成發(fā)酵)。在本發(fā)明的這個方面，可在納他霉素生產(chǎn)期間加入碳源以將碳源的量保持在大約5-30g/l，通常在20g/l。因此，發(fā)酵開始后和/或發(fā)酵開始時加入適當量的適當碳源。例如，碳源可以以大約40-100g/l的量存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。然后，在主發(fā)酵階段內(nèi)向發(fā)酵器內(nèi)連續(xù)加入碳源，進料速率至少等于發(fā)酵期間被鏈霉菌酶促消耗之碳源的速度(即使碳源濃度保持在最小水平或最小水平以上)。在接近發(fā)酵過程結(jié)束和主發(fā)酵階段之后，間斷地加入碳源，以便在發(fā)酵周期結(jié)束時只留下少量或沒有碳源(即碳源的量等于完成發(fā)酵過程所必需之發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的特定的碳源量)。
可用常規(guī)技術(shù)(如在大約120-140℃的溫度下分別或同時消毒碳和氮源)制備為鏈霉菌發(fā)酵和納他霉素生產(chǎn)提供營養(yǎng)素的納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基。滅菌后，希望生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH為7左右。
引入接種物直到所得生產(chǎn)培養(yǎng)基中接種物的濃度為大約0.1-10%，通常為大約2%(體積比)(例如接種物的量可足以接種多個發(fā)酵罐)。發(fā)酵罐內(nèi)的余留體積包括上述的發(fā)酵培養(yǎng)基?？墒褂萌魏我环N技術(shù)將接種物引入發(fā)酵罐內(nèi)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，借之轉(zhuǎn)移呈活性代謝狀態(tài)的接種物。
使發(fā)酵或生產(chǎn)培養(yǎng)基達到大約25-40℃，且正常約28-35℃的溫度。使發(fā)酵過程繼續(xù)進行的時間取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、溫度、接種物中鏈霉素的量，所需的納他霉素的量等因素。一般發(fā)酵過程要進行大約70到至少168小時。
發(fā)酵期間向納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基中供入氧氣。在大部分發(fā)酵期間內(nèi)，生產(chǎn)培養(yǎng)基中溶解氧的水平最好保持在大約20%-80%的空氣飽和度?？赏ㄟ^適當調(diào)整通氣和/或攪拌速率提高達到適當溶解氧水平的能力。例如，必須借助加壓空氣(如無菌空氣)通過發(fā)酵培養(yǎng)基向發(fā)酵或生產(chǎn)培養(yǎng)基內(nèi)通氣，通氣速率約為每體積發(fā)酵培養(yǎng)基0.3至至少1.0體積空氣。作為本發(fā)明的一個方面，可以在通氣的同時攪拌發(fā)酵培養(yǎng)基。另外，可使通氣速率足能攪動發(fā)酵培養(yǎng)基。
現(xiàn)參見圖2，該圖顯示在三個階段的各階段內(nèi)時間與納他霉素生產(chǎn)速率的相互關(guān)系。第一階段包括向發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入碳源，使鏈霉菌生長并多倍復(fù)制。第一階段還伴有納他霉素產(chǎn)生。發(fā)酵培養(yǎng)基中納他霉素的濃度隨著鏈霉菌細胞的不斷增殖而增加。在第一階段，納他霉素的濃度一般隨時間呈指數(shù)增加。最后，納他霉素的濃度將隨時間持繼增加，此表明納他霉素，生產(chǎn)的第二階段(即主發(fā)酵期)已完成。第三階段的特征是納他霉素的濃度出現(xiàn)平臺(如可能由于鏈霉素的代謝速率減慢)?？稍诓煌瑫r間分析發(fā)酵罐內(nèi)納他霉素的濃度，以估計發(fā)酵過程所處的階段。為了從總體上使納他霉素的產(chǎn)生量達到最大值，可以使用某種培養(yǎng)基和/或環(huán)境以迅速達到發(fā)酵的第二階段并維持之。
作為本發(fā)明的一個方面，當需要控制發(fā)泡時，可向發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入大約占發(fā)酵或納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基0.01-1%體積的消泡劑(如硅消泡劑)。
加入接種物后，納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH為7左右。如上所述，在相對短的第二發(fā)酵階段中，主要活性表現(xiàn)在培養(yǎng)物的迅速增殖。此后以納他霉素產(chǎn)生占優(yōu)勢，且pH下降?？刂苹蚓S持發(fā)酵期間的pH是本發(fā)明的一個關(guān)鍵，如不控制pH，發(fā)酵期間pH將降至大約pH4.0。
納他霉素生產(chǎn)的主階段或第二階段相當于pH已首先降到pH6.5以下至接近納他霉素生產(chǎn)結(jié)束的階段。在接近發(fā)酵終止時，可使pH降到大約pH5.0以下。根據(jù)本發(fā)明，當pH低于大約pH5.0時，主階段并不包括這一低pH期。
可向培養(yǎng)液內(nèi)加入pH控制劑以控制包括發(fā)酵培養(yǎng)基之發(fā)酵液的pH。用于本發(fā)明方法的pH控制劑包括可以控制pH，但又不會對納他霉素生產(chǎn)和回收造成不利影響的氫氧化物及堿式鹽。適用的pH控制劑至少包括氫氧化鈉、氫氧化鉀及氫氧化鈣、檸檬酸一、二和三鈉及一、二、三鉀等中的一種。
根據(jù)本發(fā)明，最初(即在培養(yǎng)物增殖期間)可允許發(fā)酵循環(huán)的pH降低到大約pH6。到這一時間，正在進行有效的納他霉素生產(chǎn)。pH降低到大約pH5.0至6.5之后，開始加入堿性pH控制劑，并以一定速率繼續(xù)加入使之足以使發(fā)酵培養(yǎng)液的pH保持在5.0至6.5。一般情況下，可用含pH控制劑的水溶液經(jīng)自動pH控制滴定法保持上述pH值。
可同時和/或依次使用各種pH控制劑組合物、摻合物、混合物等。例如，可向發(fā)酵液中引入檸檬酸鹽和氫氧化物(例如，同時加入氫氧化物可更容易地使pH保持在5.0-6.5)。但在某些情況下，可將酸式檸檬酸與堿性pH控制劑聯(lián)合加入。
本發(fā)明的一個關(guān)鍵方面包括使用含無機堿的pH控制劑以使pH保持在大約5.9-6.1。如上所述，本發(fā)明的pH控制可提高納他霉素生產(chǎn)的速率并改善納他霉素產(chǎn)率。例如，與在沒有控制pH情況下產(chǎn)生的相等納他霉素產(chǎn)率相比，本發(fā)明控制pH的方法可允許用更少時間發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素。一般生產(chǎn)時間可減少20-60%，普遍減少大約35%。
當恰當?shù)貙嵤┍景l(fā)明時(如有效地處理鏈霉菌接種物、選擇培養(yǎng)基等)，所得發(fā)酵液一般將含有至少約5g/l的納他霉素。
可從生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離納他霉素。在某些情況下，可從發(fā)酵液中提取納他霉素并結(jié)晶之。得到結(jié)晶體納他霉素的適用技術(shù)，如可參見英國專利846，933號。
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明的范圍。另特別指出者外，均使用商業(yè)上可得到的試劑級材料完成下列實施例。
實施例在下列試驗中，使用蒸餾水制備有下列組分的瓊脂斜面。
3g/l酵母浸膏(Difco“Bacto”酵母提取物)5g/l麥芽提取物(Difco麥芽提取物)5g/l胨(Difco“Bacto”胨)10g/l葡萄糖15g/l瓊脂。
瓊脂在大約121℃下滅菌處理約15分鐘。
在蒸餾水中制備有下列組分的接種物培養(yǎng)基，并用氫氧化鉀將pH調(diào)到7.0左右。
20g/l葡萄糖10g/l氯化鈉6g/l玉米漿液(PPM(商標)，CornSteepLiquid)6g/l胨(Difco“Baocto”胨)接種物培養(yǎng)基在121℃下滅菌15分鐘。
作為凍干的孢子懸液從ATCC得了登記號為No.13326的Streptomycesgilvosporeus并用作培養(yǎng)物來源。將培養(yǎng)物接種在25℃的瓊脂斜面上直到萌發(fā)孢子。
在大約10天之內(nèi)瓊脂斜面上長出大量孢子，于10-20天后使用之。將這些瓊脂斜面上的孢子刮入接種物培養(yǎng)基中，使孢子懸浮液的濃度達到大約108CFU/ml。向裝有大約200ml接種物培養(yǎng)基的500ml帶檔板的燒瓶內(nèi)加入約2ml孢子懸浮液。在大約29℃并在旋轉(zhuǎn)振蕩器以200rpm攪拌下，將燒瓶內(nèi)的接種物保溫約48小時。約48小時后，取大約4ml該培養(yǎng)物加入裝在1000ml帶檔板燒瓶內(nèi)的約200ml接種物培養(yǎng)基中，以增殖接種物。然后在29℃下將該接種物繼續(xù)保溫約24小時，同時在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以大約200rpm攪拌之。用如此得到的接種物接種81生產(chǎn)培養(yǎng)基。
本實施例中使用的納他霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基具有下列起始組成19.5g/l大豆蛋白分離物(ADM，“Profam”S970)4.5g/l酵母浸膏(Stauffer，TypeKAT)0.2ml消泡劑(Mazu，DF289)在14.01發(fā)酵罐內(nèi)蒸餾水中制備生產(chǎn)培養(yǎng)基，并用氫氧化鉀將pH調(diào)到約7.6。然后于121℃下消毒處理約15分鐘。作為在蒸餾水中的50%溶液，分別消毒處理葡萄糖。
接種前，將生產(chǎn)培養(yǎng)基加熱到大約29℃，并加入葡萄糖使其初始濃度達到約40g/l。發(fā)酵罐內(nèi)通氣速率約為0.3V/V-min。(每分鐘每體積培養(yǎng)基通空氣的體積比)，攪拌速率約300rpm。
將上述含Streptomycesgilvosporeus(ATCC登記號No.13326)的接種物加入發(fā)酵器內(nèi)使其中接種物含量達到約2%體積。發(fā)酵約40小時后向接種物內(nèi)加入葡萄糖，以使發(fā)酵器內(nèi)葡萄糖的濃度保持在大約20g/l。為此，以大約1g/小時的速率向發(fā)酵器內(nèi)供入葡萄糖。必要時可提高發(fā)酵器的攪拌速度，以使溶解氧水平保持在大約50%空氣飽和度。
試驗1該試驗顯示典型的高產(chǎn)率發(fā)酵工藝，而沒有使用本發(fā)明的pH控制方法。如前所述，本工藝以大約8.0l生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH約為7)的初始體積開始，并繼續(xù)發(fā)酵約117小時(pH約為4.5)，其中總葡萄糖加入量為大約110g/l，在大約8.7l發(fā)酵液中得到大約7.3g/l納他霉素產(chǎn)率(總共64g納他霉素)。
試驗2方法大致同試驗1，但當18小時后pH降至約6.0時加入約20%KOH以使pH保持在約6.0，并在約92小時發(fā)酵過程中加入約155g/l葡萄糖，結(jié)果在大約10.1l發(fā)酵液中得到約7.4g/l納他霉素(共75g納他霉素)?？梢?，與1相比，本發(fā)明的這一試驗在較短生產(chǎn)周期內(nèi)提供了相等的納他霉素產(chǎn)率。
借助基本相同的方法，但使用NaOH代替KOH，可達到相似的快速高產(chǎn)率納他霉素生產(chǎn)。
試驗3繼續(xù)試驗2的生產(chǎn)并在約282小時的總發(fā)酵時間內(nèi)加入約250g/l葡萄糖，結(jié)果在大約10.4l發(fā)酵液中得到約12.4g/l產(chǎn)率的納他霉素(共129g納他霉素)。因此，延長納他霉素生產(chǎn)發(fā)酵時間有可能提高納他霉素產(chǎn)率。
試驗4方法大致同試驗2，但當pH降至約pH6時，用自動滴定法加入約20%氫氧化鉀，以使pH保持在大約6.1-5.9。發(fā)酵約66小時后，在大約9.2l發(fā)酵液中產(chǎn)生約6.6g/l納他霉素(共61g納他霉素)。
試驗5方法大致同試驗2，但24小時后當發(fā)酵液pH為大約5.1時向發(fā)酵器加入約7g/l檸檬酸三鈉。pH保持在大約5.0到6.5的范圍內(nèi)。在大約8.7l發(fā)酵液中約產(chǎn)生6.6g/l產(chǎn)率的納他霉素(共57g納他霉素)。
借助基本上相同的方法，但使用等摩爾量的檸檬酸三鉀，結(jié)果達到相似的快速高產(chǎn)率納他霉素生產(chǎn)。
試驗6方法基本上同試驗6，但不完全使檸檬酸三鈉pH控制劑。當發(fā)酵開始后約24小時時加入檸檬酸三鈉，并檸檬酸將pH調(diào)到5.0左右(使其中含有大約5g/l檸檬酸根離子);約45小時后，加檸檬酸使pH保持在約5.0以下。發(fā)酵約117小時后只產(chǎn)生了大約25.6g納他霉素。
試驗7方法基本上同試驗1，但沒有加入任何pH控制劑，發(fā)酵約66小時后在8.3l發(fā)酵液中只得到4.3g/l的納他霉素(共36g納他霉素)。將試驗4與試驗7比較，表明進行pH控制將會提高納他霉素生產(chǎn)速率(即試驗4中66小時發(fā)酵過程產(chǎn)生61g納他霉素，而試驗7號產(chǎn)生36g納他霉素)。
下表總結(jié)了試驗1-7中在納他霉素生產(chǎn)之相對速度方面的結(jié)果?？v觀下表可以證明，本發(fā)明的pH控制可改善通過發(fā)酵工藝所得納他霉素的產(chǎn)率。
表實驗序號pH控制劑生產(chǎn)時間(hrs)生成的納他霉素量(總量/濃度)1無11764g/7.3/l2KOH9275g/7.4g/l3KOH282129g/12.4g/l4KOH6661g/6.6g/l5檸檬酸三鈉6957g/6.6g/l6檸檬酸三鈉/檸檬酸11725.6g/3.2g/l7無6636g/4.3g/l現(xiàn)參見圖3，該圖顯示按試驗4、5、6和7完成的約115小時發(fā)酵過程中納他霉素產(chǎn)生量(發(fā)酵液中的g/l數(shù))。圖3以圖解方式表明本發(fā)明的pH控制方法可提高納他霉素的產(chǎn)生速率。
雖然上文詳細描述了本發(fā)明的幾個實施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解到，基于本發(fā)明的許多組合和改動均包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵制備納他霉素的方法，該方法包括在預(yù)定的接種物培養(yǎng)基中增殖含有鏈霉菌菌種的孢子懸浮液以得到接種物；將接種物引入預(yù)定的發(fā)酵培養(yǎng)基中；使接種物發(fā)酵并產(chǎn)生納他霉素；將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在約5.0至6.5范圍內(nèi)，以及回收納他霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的納他霉素生產(chǎn)菌種包括Streptomyces gilvosporeus，ATCC 13326。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的孢子懸浮液含有至少為105-1010CFU/ml的孢子懸浮液。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所說的發(fā)酵培養(yǎng)基含有非酵母和酵母蛋白質(zhì)氮成分，所說的非酵母和酵母成分以分別占蛋白質(zhì)含量之大約5∶1到11∶1的比例存在。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中接種物培養(yǎng)基包含大約2-16g/l的蛋白質(zhì)氮源和大約5-30g/l的碳源。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基包含大約80至250g/l的碳源的氮源，其中氮源進一步包括非酵母成分和酵母成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說蛋白質(zhì)氮源之非酵母和酵母成分的比例為基于蛋白質(zhì)含量的大約5∶1到11∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說所說蛋白質(zhì)氮源的非酵母成分包括大豆蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的濃度在納他霉素生產(chǎn)的主階段內(nèi)保持在大約5-30g/l。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中每升發(fā)酵培養(yǎng)基至少產(chǎn)生7g納他霉素。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中增殖和發(fā)酵是在大約25-40℃的溫度下進行的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中發(fā)酵進行大約70至至少168小時的時間。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其進一步包括在增殖和發(fā)酵期間向接種物內(nèi)通氣。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其進一步包括在納他霉素生產(chǎn)期間向接種物內(nèi)通氣。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中接種物和發(fā)酵培養(yǎng)基包括至少含有選自葡萄糖、多糖和淀粉中之一種的碳源。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其中接種物和發(fā)酵培養(yǎng)基包括至少含有選自大豆蛋白質(zhì)、酵母及蛋白質(zhì)水解物中之一種的蛋白質(zhì)氮源。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)氮源包括至少含有選自分離物、粉和粗粉中之一種的大豆蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)氮源包括至少含有選自全酵母提取物和自溶產(chǎn)物中之一種的酵母。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項的方法，其進一步包括使用選自氫氧化物和檸檬酸鹽中之至少一種的pH控制劑。
全文摘要
發(fā)酵能產(chǎn)生納他霉素的鏈莓菌以生產(chǎn)納他霉素。在預(yù)定的培養(yǎng)基中增殖鏈霉菌的孢子懸浮液以得到一定量的鏈霉菌細胞。在控制pH的預(yù)定的生產(chǎn)培養(yǎng)基中發(fā)酵該鏈霉菌細胞以產(chǎn)生可回收量的納他霉素。
文檔編號C12P19/62GK1072959SQ9211063
公開日1993年6月9日 申請日期1992年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月5日
發(fā)明者M·A·艾森申克, P·T·奧爾森 申請人:生物技術(shù)資源公司