專利名稱：用南昌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)梅嶺霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用微生物發(fā)酵方式生產(chǎn)抗生素的方法。特別是涉及用南昌鏈霉菌(Streptomycesnanchangensis)發(fā)酵生產(chǎn)殺蟲素梅嶺霉素的方法。
本發(fā)明人于1984年報(bào)道了有關(guān)他們發(fā)現(xiàn)的南昌鏈霉菌的情況。(請?jiān)斠姟段⑸飳W(xué)報(bào)》24(3)195-199，1984)。該菌是從江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園油茶根際土壤中分離到的一株具有產(chǎn)生多種殺蟲抗生素的鏈霉菌新種，其中對雞的球蟲病具有顯著防治效果的一種抗生素，依產(chǎn)生菌名稱命名為南昌霉素。南昌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)南昌霉素的方法已由本發(fā)明人于1991年10月18日向中國專利局申請發(fā)明專利(申請?zhí)?1109736.8)，并已于1992年2月21日得到中國專利局初審合格通知。
本發(fā)明人現(xiàn)在申請用南昌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)另一種殺蟲抗生素-梅嶺霉素的發(fā)明專利。
本發(fā)明主要涉及有下述的十六元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的殺蟲素梅嶺霉素及其相近衍生物。
結(jié)構(gòu)式
梅嶺霉素(Meilingmycin)
本發(fā)明的目的在于提供一種以南昌鏈霉菌為發(fā)酵菌種生產(chǎn)殺蟲抗生素梅嶺霉素的工業(yè)方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有殺昆蟲、殺螨和殺線蟲抗生素功效-梅嶺霉素。
本發(fā)明主要涉及一種用南昌鏈霉菌生產(chǎn)殺蟲抗生素梅嶺霉素的方法。包括斜面種子培養(yǎng)，茄子瓶固體培養(yǎng)，種子罐深層培養(yǎng)，發(fā)酵罐深層培養(yǎng)，發(fā)酵液預(yù)處理和分離提取濃縮步驟。其中首先將在砂土管中保存的南昌鏈霉菌接種到高氏一號培養(yǎng)基或麩皮培養(yǎng)基斜面上在24-34℃下培養(yǎng)1-3周。將培養(yǎng)好的上述培養(yǎng)基斜面上的南昌鏈霉菌孢子接入內(nèi)裝本發(fā)明設(shè)計(jì)的種子培養(yǎng)基的種子罐發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵條件為，發(fā)酵溫度24-34℃，通氣量1∶0.45-1.6V/V，攪拌速度210-610轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時間24-60小時，將經(jīng)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)得到的合格培養(yǎng)物進(jìn)一步接種到內(nèi)裝本發(fā)明設(shè)計(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵條件為接種量6-18%(V/V)，發(fā)酵溫度24-34℃，通氣量1∶0.45-1.6V/V，攪拌速度210-610轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵周期72-192小時。
在發(fā)酵罐發(fā)酵過程中可以進(jìn)行多次中間補(bǔ)料。這時發(fā)酵時間可延長到100-240小時，所述的中間補(bǔ)料依碳、氮、磷代謝曲線，產(chǎn)素曲線，比生長量檢定數(shù)據(jù)適時補(bǔ)進(jìn)，可以是1-25%糖液(或淀粉)，或1-25%糖液(或淀粉)另加0.1-1%硫酸銨，或另加0.5-5%十六烷，或以原發(fā)酵培養(yǎng)基各組分濃度2-4倍培養(yǎng)液補(bǔ)充加入發(fā)酵罐。每次補(bǔ)料量為發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液容積0.5-10%。
在發(fā)酵過程中，通常采用植物油如豆油、菜油、花生油等或采用泡敵做消泡劑。
本發(fā)明也可以經(jīng)一步發(fā)酵法完成整個發(fā)酵過程。
本發(fā)明也可以用固體培養(yǎng)基經(jīng)一步發(fā)酵法或多級培養(yǎng)法完成整個發(fā)酵過程。
將經(jīng)上述發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液先經(jīng)加溫或加堿液預(yù)處理，然后用壓濾或離心技術(shù)使發(fā)酵液的液相部分和固相部分分離，前者稱為清液部分，后者稱為菌絲體部分。
得到的菌絲體部分用乙醇浸提，真空濃縮得到菌絲體濃縮液。
得到的清液部分可以棄去，或直接薄膜濃縮后再用工業(yè)酒精浸提并濃縮得到清液濃縮液。
得到的兩種濃縮液合并再濃縮(或稀釋)到含梅嶺霉素的含量符合產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，得到Ⅰ型產(chǎn)品;或者兩種濃縮液再用乙酸乙酯提取，再濃縮成油狀物，再用輔料如碳酸鈣吸附所述的油狀物后，烘干、磨粉、加填充料，分別制得液態(tài)或粉狀梅嶺霉素制品。
梅嶺霉素是十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，純品為無色片狀結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮，微溶于石油醚、己烷，不溶于水，所以它的分離方法可用溶媒提取。
梅嶺霉素對多種農(nóng)林害蟲如天蛾、鳳蝶、刺蛾、粘蟲、蚜蟲、紅蜘蛛等有很強(qiáng)的毒殺作用，對線蟲也有強(qiáng)的殺滅作用。
本發(fā)明中所用的有機(jī)溶劑可以采用本領(lǐng)域中熟知的方法加以回收。
本發(fā)明上述涉及的麩皮瓊脂培養(yǎng)基，其組分包括(%W/V)麩皮1.6-4.2磷酸氫二銨0.01-0.05硫酸鎂0.008-0.03磷酸二氫鉀0.01-0.05瓊脂1.8-2.2本發(fā)明在種子罐和發(fā)酵罐中采用的培養(yǎng)基主要含有0.8-8%的有機(jī)碳源，0.1-5%的氮源和0.002-0.04%的礦物質(zhì)(均為%W/V)，其pH為5.6-8.5，所述的碳源為各種糖類、淀粉，所述的氮源為各種有機(jī)氮如黃豆餅粉，魚粉，蛋白胨和無機(jī)氮如硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨，所述的礦物質(zhì)主要由P、K、S、Mg、Fe、Ca、Zn和Mn等。
本發(fā)明種子罐中采用的培養(yǎng)基的組分包括(%W/V)蔗糖0.1-4淀粉0.4-3玉米粉1-6黃豆餅粉0.1-3酵母粉0-1硫酸銨0.1-0.25磷酸銨0-0.25磷酸二氫鉀0.1-0.3氯化鈉0.02-0.05碳酸鈣0.3-1.8硫酸鎂0-0.5硫酸錳0-0.35氯化鋅0-0.2植物油0.1-1.2本發(fā)明發(fā)酵罐中采用的培養(yǎng)基的組分包括(%W/V)蔗糖0.1-4玉米粉1-6淀粉2.5-7.5黃豆餅粉0-2.5魚粉0-2.5蠶蛹粉0-2酵母粉0-1.6玉米漿0-2.5硫酸銨0.08-0.6磷酸銨0-0.25
磷酸二氫鉀0.1-0.5碳酸鈣0.4-1.6氯化鈉0-0.1硫酸鎂0-0.5硫酸錳0-0.35氯化鋅0-0.2植物油0.1-1.2α-淀粉酶淀粉量的1/210-1/400下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明附

圖1，為本發(fā)明的工藝流程圖。
現(xiàn)將本發(fā)明的方法過程分作兩大工段，其一為發(fā)酵培養(yǎng)工段，其二為分離提取工段。
實(shí)施例1利用南昌鏈霉菌培養(yǎng)生產(chǎn)含梅嶺霉素的發(fā)酵液。
取南昌鏈霉菌NMUB-1砂土管孢子接種在麩皮瓊脂斜面培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)2周，其所述培養(yǎng)基的配方(%W/V)為麩皮3.2磷酸氫二銨0.03硫酸鎂0.01磷酸二氫鉀0.02瓊脂2選擇產(chǎn)生暗綠色水溶性色素，孢子褐灰色，生長豐滿的斜面存貯于冰箱(4℃)中各用。
取上述南昌鏈霉菌NMUB-1斜面1支，用10毫升無菌水分兩次注入，洗下孢子，制成孢子懸液。用1毫升的無菌吸管吸取0.5毫升孢子懸浮，注入盛有麩皮瓊脂培養(yǎng)基的茄形瓶內(nèi)，并用滅菌玻璃刮鏟將懸液涂布均勻，置于32℃培養(yǎng)2周。選擇孢子生長豐滿呈褐灰色，培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為暗綠色的茄形孢子瓶，貯存于冰箱(4℃)內(nèi)備用。
用無菌操作法將100毫升無菌水注入上述已長滿孢子的茄形孢子瓶中，刮洗下表面孢子，制成孢子懸液。在瓶口上塞上已滅菌的接種專用針頭，用無菌操作法將該針頭刺入種子罐的接種孔上的橡皮使茄形孢子瓶與罐內(nèi)相連通，然后用負(fù)壓法將茄形瓶內(nèi)的孢子懸液吸入40升的不銹鋼種子罐內(nèi)。接種完畢后開動攪拌裝置開始種子培養(yǎng)，其接種量按每20升種子發(fā)酵培養(yǎng)基接入一瓶孢子懸液。
種子罐培養(yǎng)溫度31℃，攪拌速度460轉(zhuǎn)/分，通氣量1∶0.8，罐內(nèi)壓力0.4kg/cm2，種子罐培養(yǎng)時間為48小時，其使用培養(yǎng)基見表1采用滅菌移種管道，利用種子罐與發(fā)酵罐內(nèi)氣壓差將上述種子罐培養(yǎng)物移種入200升不銹鋼發(fā)酵罐，接種量為15%(V/V)，發(fā)酵罐使用的培養(yǎng)基見表1，培養(yǎng)溫度為31℃，通氣量1∶1.4，攪拌速度300轉(zhuǎn)/分。
自移種后開始取樣，每隔12小時取樣測定發(fā)酵液的總糖和還原糖、氨基氮、溶磷含量、菌體DNA含量，和產(chǎn)梅嶺霉素效價(jià)等(見表2)。
第一次補(bǔ)料時間發(fā)酵液總糖下降至1.49g/100ml時，在培養(yǎng)時間中間，約76小時左右，補(bǔ)料容積為10升。
第二次補(bǔ)料時間是發(fā)酵液總糖消耗至1.40g/100ml時，約在培養(yǎng)時間中間100小時左右，補(bǔ)料容積為10升。
中間補(bǔ)料的濃度和具體數(shù)量詳見表1和表2當(dāng)顯微鏡檢查到菌絲形成空泡、染色不均勻，并有菌絲自溶，生化測定總糖下降至1.2g/100ml以下，菌體DNA含量開始下降，培養(yǎng)基pH上升時，放罐。
在發(fā)酵罐培養(yǎng)時間為144小時，最后放罐體積為120升，放罐單位305μg/ml，放罐總億0.366億。
實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例1中所述的發(fā)酵步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中種子罐和發(fā)酵罐采用的培養(yǎng)基以及中間補(bǔ)料使用情況見表3，發(fā)酵罐內(nèi)南昌鏈霉菌的生長情況見表4。
最后放罐體積為115升，放罐單位為321μg/ml，放罐總億為0.369億。
下述的實(shí)例主要涉及梅嶺霉素的分離和提取工藝。
實(shí)施例3發(fā)酵在200升罐進(jìn)行，放罐體積115毫升，發(fā)酵單位321μg/ml，用5N氫氧化鈉調(diào)pH8.5-9.0后用小板框過濾，并用壓縮空氣適量吹干，得濾餅12kg(效價(jià)2700mg/g)，濾液95升(效價(jià)40μg/ml)，濾餅用60升工業(yè)酒精分三次浸提，得浸提液62升，在60℃真空濃縮至3升，效價(jià)8380μg/ml;濾液經(jīng)薄膜濃縮至5升，效價(jià)730μg/ml，用10升工業(yè)酒精浸提，浸提液經(jīng)薄膜濃縮至3升，效佳580μg/ml?；旌蟽煞N濃縮液，再用薄膜濃縮至2.68升，使效價(jià)達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)10000μg/ml，即得梅嶺霉素Ⅰ型產(chǎn)品，最后產(chǎn)品得率為72.6%，各提取步驟及參數(shù)詳見表5。
實(shí)施例4發(fā)酵在200升罐中進(jìn)行，放罐體積120升，發(fā)酵單位305μg/ml，發(fā)酵液用板框壓濾，得濾餅13kg，濾液效價(jià)含量較低放棄處理，濾餅效價(jià)2550μg/ml，用65升工業(yè)酒精分三次浸提菌絲體，得濾液67升，65℃真空濃縮至4升，用醋酸乙酯12升分三次萃取，得萃取液11.2升，萃取液加活性碳脫色過濾，濾液60℃濃縮至漿狀物163克，漿狀物溶于二氯甲烷溶媒中，分子篩Sephadex LH-20柱分離，石油醚-二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)洗脫，收集洗脫液4.5升，濃縮至油狀物73克，效價(jià)327mg/g，提取總收率占菌絲體含量的72%，占下罐總含量的65.3%，加輔料166g制成產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)100mg/g成品239克。即得梅嶺霉素Ⅱ型產(chǎn)品。(詳見表6)
實(shí)施例5固體發(fā)酵法實(shí)例1.培養(yǎng)基成份(高氏培養(yǎng)基)可溶性淀粉2%硝酸鉀0.1%硫酸鎂0.05%磷酸氫二鉀0.05%氯化鈉0.05%硫酸亞鐵0.001%瓊脂2%pH7.22.發(fā)酵選用高氏培養(yǎng)基制備成茄形瓶斜面，每瓶接種南昌鏈霉菌NMUB-1孢子懸液1ml，置28-32℃培養(yǎng)15-20天，當(dāng)斜面孢子呈褐灰色，產(chǎn)生暗綠色水溶性色素時，終止培養(yǎng)。
3.提取分離固體培養(yǎng)終止后，每個茄形瓶用50ml酒精分二次各浸提24小時后過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮去酒精后，用乙酸乙酯1∶1提取二次，提取液脫色，減壓濃縮后得濃縮物，濃縮物上硅膠柱層析，用三倍柱體積二氯甲烷-乙醚(8∶2)洗脫，洗脫液真空濃縮，得油狀物，可供直接加入填料或乳化后制成適用于家畜飼料填加劑和大田使用的農(nóng)藥。提取各參考數(shù)見表7。
權(quán)利要求
1.一種用南昌鏈霉菌生產(chǎn)梅嶺霉素的生產(chǎn)方法，包括斜面種子培養(yǎng)，茄子瓶固體培養(yǎng)，種子罐深層培養(yǎng)，發(fā)酵罐深層培養(yǎng)，發(fā)酵液預(yù)處理和提取濃縮等步驟。其特征在于(1)將砂土管保存的南昌鏈霉菌孢子接種到高氏一號或麩皮瓊脂培養(yǎng)基斜面上在24-34℃下培養(yǎng)1-3周。(2)將步驟1得到的南昌鏈霉菌斜面孢子接種到內(nèi)裝高氏一號培養(yǎng)基或麩皮瓊脂培養(yǎng)基的茄形瓶內(nèi)，在24-34℃下培養(yǎng)1-3周。(3)將步驟(2)得到的南昌鏈霉菌茄形瓶孢子接種到內(nèi)裝本發(fā)明設(shè)計(jì)的種子培養(yǎng)基并帶有通氣攪拌裝置的種子罐中發(fā)酵培養(yǎng)。其發(fā)酵培養(yǎng)條件溫度24-34℃通氣量1∶0.45～1∶1.6V/V攪拌速度 210-610轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)時間 24-60小時(4)將步驟(3)中得到的培養(yǎng)物一次移接到內(nèi)裝本發(fā)明設(shè)計(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基并帶通氣攪拌裝置的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)。其發(fā)酵培養(yǎng)條件接種量6-18V/V 溫度 24-34℃通氣量1∶0.45～1∶1.6V/V 攪拌速度210-610轉(zhuǎn)/分發(fā)酵周期 72-192小時可在發(fā)酵罐發(fā)酵時進(jìn)行中間補(bǔ)料，此時的發(fā)酵周期可延長到100-240小時。(5)將經(jīng)步驟(4)得到的發(fā)酵液，用壓濾或離心技術(shù)得到液相和固相兩部分，前者稱清液部分，后者稱菌絲體部分。(6)用溶媒提取法處理步驟(5)所得菌絲體部分，得到菌絲體浸提液，菌絲體浸提液再經(jīng)真空濃縮，得到菌絲體濃縮液；步驟(5)所得清液部分可以棄去，或用薄膜濃縮法處理，得到初步濃縮物，初步濃縮物再用工業(yè)酒精浸提后再濃縮，便得到清液濃縮液。(7)將步驟(6)得到的菌絲體濃縮液和清液濃縮液合并，再濃縮(或稀釋)到含梅嶺霉素的含量符合產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，得到本發(fā)明方法制備的Ⅰ型產(chǎn)品。(8)將步驟(6)得到的兩種濃縮液，再用溶媒提取，濃縮，得到油狀物。用本發(fā)明設(shè)計(jì)的吸附料吸收上述油狀物后，干燥，粉碎或再加入其它輔料，制得梅嶺霉素的Ⅱ型成品。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述的本發(fā)明設(shè)計(jì)的種子罐培養(yǎng)基的組分為碳源物質(zhì)0.8-8%，氮源物質(zhì)0.1-5%，礦物質(zhì)0.002-0.04%，其pH為5.6-8.5。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的礦物質(zhì)是P、K、S、Mg、Fe、Ca、Zn和Mn。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的麩皮瓊脂培養(yǎng)基的組分包括(% W/V)麩皮 1.6-4.2磷酸氫銨 0.01-0.05硫酸鎂 0.008-0.03磷酸二氫鉀 0.01-0.05瓊脂 1.8-2.2
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的溶媒是乙醇、丙酮、乙酸乙酯。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的本發(fā)明設(shè)計(jì)的種子罐中采用的培養(yǎng)基的組分包括(% W/V)蔗糖 0.1-4淀粉 0.4-3玉米粉 1-6黃豆餅粉 0.1-3酵母粉 0-1硫酸銨 0.1-0.25磷酸銨 0-0.25磷酸二氫鉀 0.1-0.3氯化鈉 0.02-0.05碳酸鈣 0.3-1.8硫酸鎂 0-0.5硫酸錳 0-0.35氯化鋅 0-0.2植物油 0.1-1.2
7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐中采用的培養(yǎng)基的組分包括(% W/V)蔗糖 0.1-4玉米粉 1-6淀粉 2.5-7.5黃豆餅粉 0-2.5魚粉 0-2.5蠶蛹粉 0-2酵母粉 0-1.6玉米漿 0-2.5硫酸銨 0.08-0.6磷酸銨 0-0.25磷酸二氫鉀 0.1-0.5碳酸鈣 0.4-1.6氯化鈉 0-0.1硫酸鎂 0-0.5硫酸錳 0-0.35氯化鋅 0-0.2植物油 0.1-1.2α-淀粉酶 淀粉量的1/210-1/400
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的中間補(bǔ)料，是在發(fā)酵罐培養(yǎng)期間，依碳、氮、磷代謝曲線及比生長量檢測數(shù)據(jù)適時補(bǔ)進(jìn)碳源和氮源物質(zhì)或另加促進(jìn)劑。
9.如權(quán)利要求1或8所述的方法，其補(bǔ)料可以是1-25%的糖液(或淀粉)，或1-25%糖液(或淀粉)另加0.1-1%硫酸銨，或另加0.5-5%十六烷，或以原發(fā)酵培養(yǎng)基各組分濃度2-4倍培養(yǎng)液補(bǔ)充加入發(fā)酵罐。
10.如權(quán)利要求1所述方法，其特征是步驟(8)所稱的溶媒是丙酮或乙醇，所稱的吸附料是碳酸鈣或滑石粉，所稱的其它輔料是豆粉或相應(yīng)粉料。
11.本發(fā)明也可以經(jīng)過一步發(fā)酵法完成整個發(fā)酵過程。
12.本發(fā)明也可以用固體培養(yǎng)基經(jīng)一步培養(yǎng)法或多級培養(yǎng)法完成整個發(fā)酵過程。
全文摘要
一種用南昌鏈霉菌生產(chǎn)梅嶺霉素的生產(chǎn)方法，包括斜面種子培養(yǎng)，茄子瓶固體培養(yǎng)，種子罐深層培養(yǎng)，發(fā)酵罐深層培養(yǎng)，發(fā)酵液預(yù)處理和提取濃縮等步驟。采用該方法生產(chǎn)的梅嶺霉素，具有殺昆蟲、殺螨和殺線蟲等功效。
文檔編號C12N1/20GK1070228SQ9211053
公開日1993年3月24日 申請日期1992年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月14日
發(fā)明者歐陽諒, 涂國全, 高勇生, 章平肇 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)