專利名稱：化學(xué)發(fā)光方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光方法，該方法借助一種酶的作用由一種受護(hù)增強(qiáng)劑生成第二種酶的增強(qiáng)劑，而第二種酶本身又催化一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本發(fā)明還涉及使用該方法來檢測第一種酶。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及使用該方法對結(jié)合在第一種酶上的各種生物分子進(jìn)行檢測和定量。例如，該方法可借助免疫測定技術(shù)用來單獨檢測第一種酶或用第一種酶標(biāo)記的半抗原、抗原和抗體;以Western印跡法檢測蛋白質(zhì);分別以Southern印跡法和Northern印跡法檢測DNA和RNA。該方法還可以在DNA順序測定中用于檢測DNA。
a.魯米諾及有關(guān)化合物的化學(xué)發(fā)光氧化作用氨基取代的環(huán)?；ｋ?，如魯米諾和異魯米諾，能夠在堿性條件下與H2O2和過氧化物酶催化劑(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)反應(yīng)而發(fā)光。該反應(yīng)曾用作檢測H2O2的分析方法及金屬離子分析方法的基礎(chǔ)。魯米諾和異魯米諾可以直接與所要檢測的物質(zhì)結(jié)合。用魯米諾作標(biāo)記物的第一個化學(xué)發(fā)光免疫試驗，是由Schroeder報導(dǎo)的一種生物素測定法(H.R.Schroeder，P.O.Vogelhut，R.J.Carrico，R.C.Boguslaski，R.T.Buckler，Anal.Chem.，481933，1976)。從此便有了許多有關(guān)用魯米諾衍生物作標(biāo)記物應(yīng)用的報導(dǎo)(H.R.Schroeder in Luminescent ImmunoassaysPerspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry，M.Serio and M.Pazzagli，Eds.，Raven Press，New York，pp129-146(1982);M.Pazzagli，G.Messeri，A.L.Caldini，G.Monetti，G.Martinazzo，M.Serio，J.Steroid Biochem.，19407，1983;Bioluminescence and Chemiluminescence New Perspectives，J.Scholmerich，et al，Eds.，J.Wiley & Sons，Chichester(1987))。還曾使用各種增強(qiáng)劑與魯米諾合用以提高發(fā)光強(qiáng)度。這些增強(qiáng)劑包括D-熒光素(T.P.Whitehead，G.H.Thorpe，T.J.Carter，C.Groucutt，L.J.Kricka，Nature 305158，1983)及對碘苯酚和對苯基苯酚(G.H.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Mosely，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，311335，1985)。
b.酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)1.穩(wěn)定化1，2-二氧雜環(huán)丁烷的酶促觸發(fā)。最近開發(fā)的熱穩(wěn)定性二氧雜環(huán)丁烷類，可以用化學(xué)方法或酶法觸發(fā)，產(chǎn)生所需求的化學(xué)發(fā)光(A.P.Schaap，美國專利4，857，652;A.P.Schaap，R.S.Handley，B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.DeSilva，B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987);A.P.Schaap，M.D.Sandison，R.S.Handley，Tetrahedron Lett.，1159(1987))。這些二氧雜環(huán)丁烷類具有幾個關(guān)鍵特征(1)利用了螺環(huán)稠合的金剛烷基的穩(wěn)定化影響，使二氧雜環(huán)丁烷類的“貯存壽命”在室溫下達(dá)數(shù)年之久;(2)有一個富電子芳香基團(tuán)，它使激發(fā)態(tài)得以有效產(chǎn)生，并在受到激發(fā)時發(fā)出熒光;(3)有一個保護(hù)基，該基團(tuán)能防止化學(xué)發(fā)光分解作用，直到該基團(tuán)由酶或其他化學(xué)反應(yīng)脫除為止。
反應(yīng)式1
例如，對衍生自3-羥基苯甲酸甲酯和金剛烷酮的磷酸酯基取代的二氧雜環(huán)丁烷(1)(Lumigen PPD)，觀察到了堿性磷酸酯酶的酶促觸發(fā)作用。將酶加到二氧雜環(huán)丁烷溶液中產(chǎn)生持續(xù)數(shù)分鐘的化學(xué)發(fā)光。發(fā)現(xiàn)總發(fā)光量與二氧雜環(huán)丁烷濃度呈線性關(guān)系。發(fā)光衰減速度是酶濃度的函數(shù)，而總發(fā)光量則與酶濃度無關(guān)。由于二氧雜環(huán)丁烷在緩沖液中緩慢水解而造成的本底發(fā)光很弱，所以在增強(qiáng)劑存在下能檢測到低于10-18摩爾(1)微微微摩爾)的堿性磷酸酯酶(A.P.Schaap，H.Akhavan，L.J.Romano，Clin.Chem.，351863，1989)。其他酶即β-半乳糖苷酶、酯酶和硫酸酯酶類似的受護(hù)二氧雜環(huán)丁烷底物，也已被開發(fā)出來。市場上銷售的許多用于檢測蛋白質(zhì)和核酸的產(chǎn)品，都是采用Lumigen PPD檢測堿性磷酸酯酶化學(xué)發(fā)光(D.Pollard-Knight，A.C.Simmonds，A.P.Schaap，H.Akhavan，M.A.W.Brady，Anal.Biochem.，185353-358，1990;J.M.Clyne，J.A.Running，R.Sanchez-Pescador，D.Besemer，M.Stempien，A.P.Schaap，R.S.Stephens，M.S.Urdea，J.Biolumin.Chemilumin.2193，1988)。
2.過氧化氫的酶促生成。已知有各種不同的酶促反應(yīng)都能生成過氧化氫。所生成的過氧化氫又能用來氧化一種發(fā)光化合物。例如，葡萄糖氧化酶與O2和葡萄糖反應(yīng)生成H2O2。同樣，氨基酸氧化酶與氨基酸和O2反應(yīng)也生成H2O2。能被過氧化氫氧化而發(fā)光的化合物的例子有魯米諾和異魯米諾、光澤精、N-甲基吖啶的酯類以及草酸的酯類和酰胺類。曾利用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和半乳糖-6-磷酸脫氫酶使氧經(jīng)電子傳遞體系被還原，從而間接生成H2O2是(K.Tanabe，T.Kawasaki，M.Maeda，A.Tsuji，M.Yabuuchi，Bunseki Kagaku，3682，1987;A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，Anal.Sci.，5497，1989)。
3.由魯米諾-NAG結(jié)合物酶促生成魯米諾。化合物鄰氨基鄰苯二甲酰肼-N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷(魯米諾-NAG)是N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶的底物，該化合物是魯米諾的掩蔽形式。一旦酶作用于該底物，即釋放出魯米諾，便可如上所述進(jìn)行檢測(K.Sasamoto，Y.Ohkura，Chem.Pharm.Bull.，38(5)1323，1990)。
4.熒光蟲或細(xì)菌熒光素酶的生物發(fā)光檢測。有一類酶稱為熒光素酶，這類酶催化許多活體中某些稱作螢光素的底物的自氧化。熒火蟲就是一個例子，它的生物發(fā)光過程以88%的效率使其熒光素發(fā)生氧化而發(fā)光。曾有人報導(dǎo)了一種DNA斑點雜交分析法，該方法采用堿性磷酸酯酶由磷酸鹽生成游離的熒光蟲熒光素。在最終步驟中加入熒光素酶使熒光素發(fā)生化學(xué)發(fā)光氧化(R.Huber，R.Geiger，Nuc.Ac.Res.，16(3)1213，1988)。該方法中僅涉及一個酶增強(qiáng)步驟，因為第一種酶只生成第二種酶的底物。
c.化學(xué)發(fā)光在酶免疫測定法和DNA雜交測定法中的應(yīng)用。涉及酶的生物測定法，如酶免疫測定法和DNA探針測定法，采用多種多樣的底物，這些底物在與酶反應(yīng)時或者生色(產(chǎn)色作用)，或者發(fā)熒光(產(chǎn)生熒光作用)，或者發(fā)光(化學(xué)發(fā)光)。在這三種選擇中，化學(xué)發(fā)光的靈敏度最高。在測定中，酶(報道酶)與所要檢測的分子結(jié)合，或者與能選擇性地與所要檢測的分子結(jié)合的某些其他物質(zhì)結(jié)合。一旦將結(jié)合的報道酶與未結(jié)合的酶分離，就加入一種底物，報道酶則與該底物產(chǎn)生一種信號。迄今所用過的化學(xué)發(fā)光底物包括可用酶觸發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷類，如堿性磷酸酯酶底物L(fēng)umigen PPD。該底物已廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫測定法和DNA探針中。在酶免疫測定法和DNA雜交測定法中業(yè)已廣泛應(yīng)用辣根過氧化物酶，并用魯米諾或異魯米諾作底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(T.P.Whitehead，G.H.Thorpe，T.J.Carter，C.Groucutt，L.J.Kricha，Nature 305，158(1983);G.H.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Mosely，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，31，1335(1985);G.H.Thorpe，S.B.Mosely，L.J.Kricha，R.A.Stott，T.P.Whitehead，Anal.Chim.Acta，170，107(1985);J.A.Matthews，A.Batki，C.Hynds，L.J.Kricka，Anal.Biochem.，151，205(1985))。市售的用于HRP與增強(qiáng)的魯米諾化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)合的試劑盒以商品名AmerliteTM出售。
d.靈敏檢測的酶級聯(lián)順序。曾有人報道了一種用于堿性磷酸酯酶比色檢測的偶聯(lián)酶級聯(lián)反應(yīng)(D.M.Obzansky，D.M.Severino，Abstracts of 23rd Oak Ridge Conference on Advanced Analytical Concepts for the Clinical Laboratory，1991年4月12日)。在這一方案中，堿性磷酸酯酶生成的一種物質(zhì)能與第二種酶的無活性形式反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為活性態(tài)。第二種酶與其自身的底物反應(yīng)生成H2O2。H2O2則通過后續(xù)的比色步驟來檢測。
有人曾報道了一種比色酶免疫測定法，該方法用在夾層免疫測定中結(jié)合上的HRP來催化H2O2與生物素一苯酚結(jié)合物的氧化沉積。氧化產(chǎn)物沉積在測定容器的固體表面上。利用結(jié)合的生物素捕獲另一些酶-抗生蛋白鏈菌素結(jié)合物。捕獲的酶可以是更多的HRP，也可以另一種酶，即堿性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶。未采用化學(xué)發(fā)光檢測(M.N.Bobrow，T.D.Harris，K.J.Shaughnessy，G.J.Litt，J.Immun.Meth.，125，279(1989))。
已知有一種以酶促釋放一種酶抑制劑為特征的方法(Anal.Biochem.，179，229(1989))。該方法的基礎(chǔ)是將一種抑制劑酶促釋放給第二種酶。其靈敏度與第一種酶的濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，并且局限于檢測第二種酶時所能達(dá)到的靈敏度。并沒有由于使用兩種酶而達(dá)到真正的增強(qiáng)作用。
曾利用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和半乳糖-6-磷酸脫氫酶使氧經(jīng)電子傳遞體系被還原，從而間接生成H2O2(K.Tanabe，T.Kawasaki，M.Maeda，A.Tsuji，M.Yabuuchi，Bunseki Kagaku，36，38(1987);A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，Anal.Sci.，5，497(1989))。在這些方法中，增強(qiáng)作用僅僅是由于酶的快速循環(huán)而產(chǎn)生的，而不是由于生成了另一種具有催化活性的物質(zhì)。
美國專利4，318，980公開了一種不均一結(jié)合測定法，該方法采用具有催化作用的循環(huán)劑(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)作為分析物的標(biāo)記。隨后由化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來檢測循環(huán)劑。結(jié)果只涉及一個酶增強(qiáng)步驟。
美國專利4，598，042公開了用于磷酸酯酶結(jié)合物的免疫測定法，其中的磷酸酯酶將NADP轉(zhuǎn)化為NAD。NAD在其氧化形式和還原形式之間循環(huán)，所形成的NAD起到了醇脫氫酶循環(huán)劑輔因子的作用，并催化有色化合物的形成。但沒有公開化學(xué)發(fā)光或過氧化物酶的使用。
美國專利4，498，042公開了使用一種酶作標(biāo)記物的免疫測定法，該酶將第二種酶的無活性形式轉(zhuǎn)化為其活性形式。第二種酶則通過與底物的反應(yīng)來檢測。也可以是第二種酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生第三種酶，隨后通過與底物反應(yīng)檢測第三種酶。
由過氧化物酶催化的過氧化物使氨基取代的環(huán)酰基酰肼的氧化，所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光檢測具有良好的靈敏度。加入增強(qiáng)劑使該反應(yīng)增強(qiáng)，就能用更低水平的過氧化物酶對化學(xué)發(fā)光進(jìn)行測量。然后將該酶與目標(biāo)生物分子偶聯(lián)，就能以很高的靈敏度檢測該生物分子。該技術(shù)的實用性僅限于使用過氧化物酶。需要對這種業(yè)已增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光加以利用，而這樣做則需要用其他酶來啟動氨基取代的環(huán)?；ｋ碌拇呋l(fā)光。如果使另一種酶成為該體系中的檢測標(biāo)記物，結(jié)果便是對已由酶增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號的進(jìn)一步增強(qiáng)。這種對增強(qiáng)作用的增強(qiáng)將會實現(xiàn)對逐漸減小的酶量的檢測，因而也將會實現(xiàn)對目標(biāo)生物分子的檢測。開發(fā)超靈敏的檢測體系的一個關(guān)鍵設(shè)想是，要使相對于所要測量信號的本底信號保持在可能的最低水平。在所提出的任何檢測方法中至關(guān)重要的是，通過增強(qiáng)作用得到盡可能大的信號，而本底信號不同步增強(qiáng)(即，只應(yīng)增強(qiáng)目標(biāo)信號)。
所以，本發(fā)明的一個目的是提供一種方法和可由酶觸發(fā)的受護(hù)增強(qiáng)劑，用于借助過氧化物酶的作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，以檢測生物物質(zhì)和化合物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種方法和可由酶觸發(fā)的受護(hù)增強(qiáng)劑，用于借助過氧化物酶的作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，以用于在溶液中進(jìn)行的免疫測定。本發(fā)明的再一個目的是提供一種方法和可由酶觸發(fā)的受護(hù)增強(qiáng)劑，用于借助過氧化物酶的作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，以用Western印跡法檢測蛋白質(zhì)，用Southern印跡法和其他DNA雜交測定法檢測DNA。


圖1是采用實施例1所述的反應(yīng)體系時化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度作為時間函數(shù)的曲線。用Turner Designs TD20-e型發(fā)光計在室溫下測量化學(xué)發(fā)光。用200倍中性濾光片使光衰減。通過加入堿性磷酸酯酶來啟動反應(yīng)。
圖2顯示了人轉(zhuǎn)鐵蛋白的化學(xué)發(fā)光Western印跡法的結(jié)果。正文中描述了Western印跡法的實驗條件。各甬道中人轉(zhuǎn)鐵蛋白的用樣量從左到右分別為5ng、1ng、200pg、50pg、20pg。將濾膜洗滌并封閉后在試劑中保溫5分鐘，對柯達(dá)X-OMAT AR膠片曝光5秒。
本發(fā)明涉及一種發(fā)光方法，該方法包括混合以下各成分一種水解酶;一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物、以及一種與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的?；ｋ拢渲惺茏o(hù)增強(qiáng)劑化合物的化學(xué)式為ArOX，其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar為環(huán)中可含有C、O、S或N的無干擾芳環(huán)基團(tuán)，水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)而脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比較，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng)。
本發(fā)明特別涉及一種借助于某個第一種酶的作用產(chǎn)生一種催化劑或循環(huán)劑的方法，第一種酶具有增強(qiáng)或放大第二種酶的作用，第二種酶本身又催化一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本發(fā)明還涉及使用該方法以高靈敏度檢測第一種酶。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及使用該方法對借助化學(xué)鍵或通過物理相互作用結(jié)合在上述酶上的各種生物分子進(jìn)行檢測和定量。所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，對帶標(biāo)記有機(jī)或生物分子的數(shù)量構(gòu)成了一種直接的量度。例如，該方法可借助免疫測定技術(shù)檢測半抗原、抗原和抗體，以Western印跡法檢測蛋白質(zhì)，分別用Southern和Northern印跡法檢測DNA和RNA。該方法還可以用于DNA順序測定操作中檢測DNA。
所述化合物優(yōu)選具有下式的苯酚類化合物
其中R是一個無干擾基團(tuán)，該基團(tuán)可以是雜環(huán)的，也可以與苯環(huán)的其他部位相連。
因此，R可以選自鹵素(Cl、Br、F或I)、含有1-30個碳原子的烷基(可以是環(huán)烷基)、含有1-30個碳原子的芳烷基，其中烷芳基或芳烷基可以被鹵素取代，也可以由O、N或S置換碳原子。
進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種用于以某種測定法檢測水解酶的試劑盒，該試劑盒包括一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物、一種過氧化物酶以及一種與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的?；ｋ?，其中增強(qiáng)劑化合物的化學(xué)式為ArOX，其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar為環(huán)中可含有O、S或N的無干擾芳環(huán)基團(tuán);其中水解酶與增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比較，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng)。
最后，本發(fā)明涉及一種用于與水解酶反應(yīng)的組合物，該組合物包含一種氨基取代的?；ｋ潞鸵环N化學(xué)式為ArOX的受護(hù)增強(qiáng)劑化合物，其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar為環(huán)中可含有O、S或N的無干擾芳基，其中水解酶與增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比較，氨基取代的?；ｋ略谶^氧化物和過氧化物酶存在下的發(fā)光水平得以增強(qiáng)。
反應(yīng)式2
受護(hù)增強(qiáng)劑化合物中的X基團(tuán)被水解酶脫除后，生成了一種增強(qiáng)劑化合物，如苯酚類化合物，這種化合物大大增強(qiáng)了第二種酶即辣根過氧化物酶催化劑魯米諾與過氧化氫氧化反應(yīng)發(fā)光的能力。掩蔽或受護(hù)增強(qiáng)劑化合物(ArOX)的一些實例中給出了具體的離去基團(tuán)X。各種特異酶類與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)時，都脫除X基團(tuán)，并釋放出芳羥基化合物或芳氧化物離子?？赡艿腦基團(tuán)包括在使用條件下適宜的任何化學(xué)離去基團(tuán)，該基團(tuán)在后續(xù)步驟中用適當(dāng)?shù)拿柑幚韼в蠿基團(tuán)的標(biāo)記分子時可被脫除。相應(yīng)的OX基團(tuán)包括(但不限于)烷基或芳基羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧-吡喃糖苷。
本發(fā)明的一個必不可少的要素是，可以把氨基取代的環(huán)?；ｋ?、過氧化物、過氧化物酶和抑制劑混合在同一個溶液中貯存?zhèn)溆?，而不會產(chǎn)生大的化學(xué)發(fā)光本底信號。鑒于氨基取代的環(huán)?；ｋ?、過氧化氫和過氧化物酶的混合物通常將構(gòu)成強(qiáng)度很高的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系，預(yù)計不會產(chǎn)生大的化學(xué)發(fā)光本底信號。另外，在這個混合物中加入受護(hù)催化劑也不會產(chǎn)生大的化學(xué)發(fā)光本底信號。
本發(fā)明涉及借助酶或酶結(jié)合物與一種混合物作用而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法，所述混合物為一種緩沖水溶液，其中含有氨基取代的環(huán)酰基酰肼、過氧化物、過氧化物酶、受護(hù)增強(qiáng)劑化合物(ArOX)和抑制劑。本發(fā)明還涉及使用該方法檢測溶液中的生物分子，如半抗原、抗原、抗體和核酸。本發(fā)明還涉及使用該方法在固體載體如硝化纖維素膜或尼龍膜上以Western印跡法檢測蛋白質(zhì)、以Southern印跡法和其他DNA雜交測定法檢測DNA，以Northern印跡法檢測RNA。
本方法涉及由化學(xué)式Ar-OX表示的受護(hù)增強(qiáng)劑化合物，該化合物選自表1中OH中的H被X置換的化合物，其中Ar為選自芳基、芳烷基或雜芳基的無干擾基團(tuán)，X為能被酶脫除從而生成芳羥基化合物或芳氧化物離子的化學(xué)上不穩(wěn)定的取代基，OX則選自烷基或芳基羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧-吡喃糖苷。
表1.芳族增強(qiáng)劑化合物(ArOH)熒光蟲熒光素 鄰苯基苯酚脫氫熒光素 對羥基肉桂酸6-羥基苯并噻唑 鄰羥基肉桂酸2-氰基-6-羥基苯 2-氯-4-苯基苯酚并噻唑?qū)Φ獗椒? 2-萘酚鄰碘苯酚 1-溴-2-萘酚對溴苯酚 1，6-二溴-2-萘酚對氯苯酚 對羥基苯基乙酸2，4-二氯苯酚對苯基苯酚 鄰羥基苯基乙酸本方法優(yōu)選涉及由下式表示的受護(hù)增強(qiáng)劑化合物
其中，R選自I、Ph或-HC＝CH-COOH，X為可被酶脫除從而生成苯酚或苯酚鹽離子的化學(xué)上不穩(wěn)定的取代基，OX則選自烷基或芳基羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧-吡喃糖苷。
本方法特別涉及由下式表示的受護(hù)增強(qiáng)劑化合物
其中，R選自H、CN或
X為可被酶脫除從而生成苯酚或苯酚鹽離子的化學(xué)上不穩(wěn)定的取代基，OX選自烷基或芳基羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧-吡喃糖苷。
本發(fā)明涉及到一種緩沖水溶液，該溶液中含有(1)受護(hù)增強(qiáng)劑化合物;(2)過氧化物，該過氧化物可以是過氧化氫、過硼酸鹽、過氧化脲或有機(jī)過酸;(3)過氧化物酶，該酶可以是辣根過氧化物酶、微過氧化物酶或乳過氧化物酶;(4)氨基取代的環(huán)?；ｋ?，該氨基取代的環(huán)酰基酰肼可以選自3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)、3-(N-烷基氨基)鄰苯二甲酰肼、3-(N，N-二烷基氨基)鄰苯二甲酰肼、6-烷基-3-氨基鄰苯二甲酰肼、4-氨基鄰苯二甲酰肼(異魯米諾)、4-(N-烷基氨基)鄰苯萘二甲酰肼、7-氨基萘二甲酰肼、7-(N-烷基氨基)萘二甲酰肼和7-(N，N-二烷基氨基)萘二甲酰肼;(5)抑制劑，該抑制劑可以選自脫脂乳、碘封阻液、牛血清清蛋白、明膠或各種表面活性劑(包括非離子型、陽離子型、陰離子型和兩性離子型表面活性劑)。
儀器除非另外指明，核磁共振(NMR)譜用通用電氣公司QE300TM型波譜儀以CDCl3溶液測得，用四甲基硅烷作內(nèi)標(biāo)。質(zhì)譜用Kratos MS-80型或AEI MS-90型質(zhì)譜儀測得。用Mettler AE 163型分析天平稱重?；瘜W(xué)發(fā)光的測量或者用Turner TD 20e型發(fā)光計進(jìn)行，或者用本實驗室自制的與Apple Macintosh型計算機(jī)接口的裝置進(jìn)行。
材料除另外指明外，從各種商業(yè)來源得到的溶劑和試劑為現(xiàn)有的最好等級，并且不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。溶劑用加氫化鈉或氫化鈣進(jìn)行蒸餾的方法進(jìn)行干燥。各種酶是從商業(yè)來源購得，并且不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。辣根過氧化物酶IgG結(jié)合物購自Cappel Products公司。由于游離酶顯示出磷酸酯酶活性，所以在這些研究中使用上述結(jié)合物而不使用游離的商品酶。
酶底物的合成
對碘苯基磷酸二鈉鹽。將吡啶(0.395克，5毫摩爾)溶于15ml CH2Cl2。將溶液冷卻至約5℃，在攪拌的同時緩慢加入POCl3(2.30克，15毫摩爾)。接著，用5分鐘的時間滴加對碘苯酚(1.10克，5毫摩爾)在10ml CH2Cl2中的溶液。撤去冷卻浴，繼續(xù)攪拌30分鐘。減壓除去溶劑，加入15ml CH3CN以溶解固體物。在攪拌下滴加NaOH(0.80克，20毫摩爾)在1ml水中的溶液，生成白色沉淀物。放置10分鐘后收集固體物，并用大量的CH3CN洗滌，然后用丙酮洗滌，空氣干燥。
對苯基苯酚磷酸酯二鈉鹽。將吡啶(0.395克，5毫摩爾)溶解在15ml CH2Cl2中。將溶液冷卻至約5℃，在攪拌的同時緩慢加入POCl3(2.30克，15毫摩爾)。接著，用5分鐘的時間滴加對苯基苯酚(0.85克，5毫摩爾)在10ml CH2Cl2中的溶液。撤去冷卻浴，繼續(xù)攪拌30分鐘。減壓除去溶劑，并加入15mlCH3CN以溶解固體物。在攪拌下滴加NaOH(0.80克，20毫摩爾)在1.2ml水中的溶液，生成白色沉淀物。放置10分鐘后收集固體物，并用大量CH3CN洗滌，然后用丙酮洗滌，空氣干燥。
對碘苯基-β-D-半乳吡喃糖苷。將對碘苯酚(1克，4.5毫摩爾)溶于3ml丙酮中，并用3ml 5M KOH水溶液處理。在攪拌下向溶液中分次加入乙酰溴半乳糖(5.6克，13.6毫摩爾)。先加入4.1克，同時加入1ml 5M KOH，然后每隔2-3小時加入0.5克乙酰溴半乳糖，同時加入0.5ml 5M KOH，直到加入總量為5.6克(3當(dāng)量)。繼續(xù)攪拌過夜。加入水，溶液用二氯甲烷萃取，然后用乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)層并蒸發(fā)，粗產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱層析純化，用30%乙酸乙酯的甲醇溶液洗脫除去未反應(yīng)的糖。從適當(dāng)?shù)南疵撘杭壏种谐ト軇┖?，得到所要化合物的四乙酸酯。?00毫克所要化合物溶解在2ml丙酮中，并與650μl 10M KOH一起攪拌過夜，從而實現(xiàn)水解。蒸去丙酮并加入30ml水。加入氯化銨使pH達(dá)中性，所得溶液用乙酸乙酯萃取。用1∶1乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行硅膠柱層析后，蒸除乙酸乙酯。
對苯基苯酚-β-D-半乳吡喃糖苷。將對苯基苯酚(0.25克，1.5毫摩爾)溶于1.5ml丙酮中，并用0.5ml 10M KOH水溶液處理。在攪拌下向溶液中分兩次加入乙酰溴半乳糖(1.8克，4.4毫摩爾)。先加入1.5克，同時加入0.5ml 10M KOH。兩小時后，加入0.3克乙酰溴半乳糖，同時加入0.5ml 10M KOH。繼續(xù)攪拌過夜。待薄層層析表明起始原料已消耗完時，再加入1ml 10M KOH，繼續(xù)攪拌1天。蒸去丙酮，殘留物用乙酸乙酯萃取5次。合并有機(jī)層，干燥和蒸發(fā)后，粗產(chǎn)物用30%甲醇的乙酸乙酯溶液進(jìn)行硅膠柱層析純化。
對苯基苯酚乙酸酯。將吡啶(2ml)溶于15ml CH2Cl2中，將溶液冷卻至約5℃，在攪拌的同時緩慢加入乙酰氯(1.8克，4.4毫摩爾)。接著，用15分鐘的時間滴加對苯基苯酚(0.85克，5毫摩爾)在20ml CH2Cl2中的懸浮液。撤去冷卻浴，繼續(xù)攪拌30分鐘。減壓除去溶劑，加入50ml乙酸乙酯以溶解固體物。溶液用水萃取，用Na2SO4干燥，減壓蒸發(fā)。
標(biāo)記酶的化學(xué)發(fā)光檢測實施例1用于增強(qiáng)堿性磷酸酯酶檢測的典型反應(yīng)液的組成為2-甲基-2-氨基-1-丙醇緩沖液 0.1M，pH9.4Mg(OAc)28.8×10-4MH2O20.3%(v/v)魯米諾 1×10-3M對苯基苯酚磷酸酯 1×10-3M辣根過氧化物酶-IgG 1×10-10-1×10-18摩爾按照典型方法，將200μl試劑移入置于Turner TD 20e型發(fā)光計或其他合適發(fā)光計中的聚丙烯管中。測量本底發(fā)光5分鐘，然后加入5μl堿性磷酸酯酶溶液試樣。圖1顯示了在25℃下進(jìn)行該反應(yīng)時得到的光強(qiáng)度與時間關(guān)系曲線。該方法能在205μl的體積中測量出低至6×10-18摩爾的堿性磷酸酯酶，信號/本底比為4。
實施例2使用實施例1的溶液并加入0.1%脫脂奶粉(NFM)，結(jié)果與實施例1類似，所不同的是本底明顯地降低了。
實施例3使用實施例1的溶液并加入5%碘封阻液，結(jié)果與實施例1類似，所不同的是本底明顯地降低了。
實施例4使用實施例1的溶液并用對碘苯基磷酸酯代替對苯基苯酚磷酸酯，結(jié)果與實施例1類似。
實施例5用于增強(qiáng)β-半乳糖苷酶檢測的典型試劑溶液的組成為磷酸鹽緩沖液 0.1M，pH7.6Mg(OAc)28.8×10-4MH2O20.3%(v/v)魯米諾 1×10-3M對苯基苯酚半乳糖苷 1×10-3M辣根過氧化物酶-IgG 10-10-10-18摩爾脫脂奶粉(NFM) 0.1%(w/v)按照典型方法，將200μl試劑移入置于Turner TD 20e型發(fā)光計或其他合適發(fā)光計中的聚丙烯管中。測量本底發(fā)光5分鐘，然后加入5μlβ-半乳糖苷酶溶液試樣。立即開始發(fā)出化學(xué)光，在不到5分鐘內(nèi)達(dá)到最強(qiáng)，發(fā)光強(qiáng)度與β-半乳糖苷酶的量成正比。發(fā)光強(qiáng)度緩慢衰減1小時以上。
實施例6使用實施例5的溶液并用對碘苯基半乳糖苷代替對苯基苯酚半乳糖苷，結(jié)果與實施例5類似。
實施例7用于增強(qiáng)酯酶檢測的典型試劑溶液的組成為磷酸鹽緩沖液 0.1M，pH7.6Mg(OAc)28.8×10-4M
H2O20.3%(v/v)魯米諾 1×10-3M對苯基苯酚乙酸酯 1×10-3M辣根過氧化物酶-IgG 10-10-10-18摩爾脫脂奶粉(NFM) 0.1%(w/v)按照典型方法，將200μl試劑移入置于Turner TD 20e型發(fā)光計或其他合適發(fā)光計中的聚丙烯管中。測量本底發(fā)光5分鐘，然后加入5μl酯酶溶液試樣。立即開始發(fā)出化學(xué)光，在不到5分鐘內(nèi)達(dá)到最強(qiáng)，發(fā)光強(qiáng)度與酯酶的量成正比。發(fā)光強(qiáng)度緩慢衰減1小時以上。
用Western印跡法進(jìn)行蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測羊非免疫血清、人全血清和兔抗羊IgG-堿性磷酸酯酶結(jié)合物得自CappeI Products公司(Durham，NC)。人轉(zhuǎn)鐵蛋白、經(jīng)過分級分離的羊抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白血清以及硝化纖維素膜，購自Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)。每個血清和IgG樣品都在10，000g下離心2分鐘，用上清液進(jìn)行免疫反應(yīng)。Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜和尼龍轉(zhuǎn)移膜分別得自Millipore公司(Bedford，MA)和MSI公司(Micron Separations，Inc.，Westboro，MA)。測定步驟中使用柯達(dá)X-OMAT AR X光膠片。
利用前人所述的緩沖體系進(jìn)行SDS-PAGE(U.K.Laeammli，Nature，227680，1970)。濃縮膠為4.38%丙烯酰胺∶0.12%雙丙烯酰胺。分離膠為6.81%丙烯酰胺∶0.19%雙丙烯酰胺。電泳后，凝膠用含有20mM Tris、153mM甘氨酸和20%(v/v)甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液平衡7-8分鐘。將凝膠夾在一片Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜和一片層析紙3MM(Whatmann)之間，放入轉(zhuǎn)移裝置(Bio-RadLaboratories，Richmond，CA)。在4℃下以100伏的恒壓將凝膠中的蛋白質(zhì)電洗脫60-80分鐘。然后于4℃下將膜在pH7.4的50mM Tris-HCl緩沖液中放置過夜。這段時間之后，用TBS洗膜15分鐘。
在室溫下，用含有1% NFM的0.05%吐溫-20在50mM Tris-HCl緩沖生理鹽水中的溶液(T-TBS)(pH為7.4)將膜處理1小時。于室溫下，用含有1% NFM的T-TBS將這個封閉膜與第一抗體(1∶500稀釋劑的羊抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白IgG部分)一起保溫75分鐘。
在室溫下，將膜與第二抗體(1∶5000稀釋的兔抗羊IgG-堿性磷酸酯酶結(jié)合物)在含有1%NFM的T-TBS中保溫1小時。保溫后，將該膜用T-TBS淋洗，并用T-TBS洗滌4次，每次10分鐘，然后在TBS中洗滌10分鐘。將該膜用蒸餾水淋洗三次。
將洗過的膜浸泡在試劑溶液中5分鐘，放出試劑溶液，將膜置于支持物(透明膜)中，對X光膠片曝光5秒至30分鐘，然后顯影。圖2顯示了條形化學(xué)發(fā)光Western印跡，其中使不同濃度的人轉(zhuǎn)鐵蛋白與抗體-堿性磷酸酯酶結(jié)合物在Immobilon-P尼龍膜上結(jié)合，并使其與實施例1所述的化學(xué)發(fā)光試劑溶液接觸。
這種化學(xué)發(fā)光方法能測量出500毫微微克(5×10-13克)/條的人轉(zhuǎn)鐵蛋白。另外，該方法能在X光膠片上得到永不褪色的實驗記錄，而且有可能以很短的曝光時間安全而方便地檢測少量蛋白質(zhì)。
以上敘述只打算說明本發(fā)明，本發(fā)明只由后附的權(quán)利要求書來限定。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)光方法，該方法包括混合以下各成分(a)一種水解酶；(b)一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物、一種與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的?；ｋ?，其中受護(hù)增強(qiáng)劑化合物的化學(xué)式為ArOX，其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar為環(huán)中可含有C、O、S或N的無干擾芳環(huán)基團(tuán)，水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)而脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中水解酶與一種生物分子相連。
3.權(quán)利要求1的方法，其中水解酶與一種抗體相連。
4.權(quán)利要求1的方法，其中水解酶與測定中構(gòu)成結(jié)合對一部分的分子相連。
5.權(quán)利要求1的方法，其中水解酶與核酸相連。
6.權(quán)利要求1的方法，其中混和和檢測操作在膜上進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1的方法，其中膜為ImmobilonTM-P。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在加入水解酶之前加入一種抑制劑，以阻滯發(fā)光。
9.權(quán)利要求1的方法，其中OX選自烷基羧基酯、羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧吡喃糖苷取代基。
10.權(quán)利要求1的方法，其中水解酶選自堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶和酯酶。
11.一種用于某種測定法檢測水解酶的試劑盒，該試劑盒包括一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物、一種過氧化物酶以及一種與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的?；ｋ?，其中增強(qiáng)劑化合物的化學(xué)式為ArOX，其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar為環(huán)中可含有C、O、S或N的無干擾芳環(huán)基團(tuán);水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng)。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，該試劑盒還包括一種在其上檢測水解酶的膜。
13.權(quán)利要求11的試劑盒，該試劑盒還包括與測定中某一結(jié)合對中的一個成分偶聯(lián)的水解酶。
14.權(quán)利要求11的試劑盒，該試劑盒還包括與水解酶偶聯(lián)的抗體。
15.權(quán)利要求11的試劑盒，該試劑盒還包括與水解酶偶聯(lián)的抗原。
16.權(quán)利要求11的試劑盒，該試劑盒還包括與水解酶偶聯(lián)的核酸。
17.權(quán)利要求11的試劑盒，其中還包括一種在不加水解酶時阻滯發(fā)光的抑制劑。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中抑制劑選自蛋白質(zhì)和表面活性劑。
19.權(quán)利要求11的試劑盒，其中OX選自烷基羧基酯、羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧吡喃糖苷取代基。
20.一種用于與水解酶反應(yīng)的組合物，該組合物包含(a)一種氨基取代的酰基酰肼;(b)一種化學(xué)式為ArOX的受護(hù)增強(qiáng)劑化合物，其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar為環(huán)中可含有C、O、S或N的無干擾芳基，其中水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的?；ｋ略谶^氧化物和過氧化物酶存在下的發(fā)光水平得以增強(qiáng)。
21.權(quán)利要求20的組合物，該組合物與過氧化物酶和過氧化物及一種抑制劑混合。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中抑制劑選自蛋白質(zhì)和表面活性劑。
23.權(quán)利要求20的組合物，其中OX選自烷基羧基酯、羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧吡喃糖苷取代基。
24.一種發(fā)光方法，該方法包括混合以下各成分(a)一種水解酶;(b)一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物、一種與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的?；ｋ拢渲性鰪?qiáng)劑化合物的化學(xué)式為
其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，R為無干擾基團(tuán)，其中水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng)。
25.權(quán)利要求24的方法，該方法還包括一種抑制劑，阻滯在不加水解酶時發(fā)光。
26.一種檢測水解酶存在的方法，該方法包括(a)混合下列各成分水解酶、一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物酶、一種過氧化物、一種在與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的酰基酰肼，其中受護(hù)增強(qiáng)劑化合物的化學(xué)式為
其中X為可被水解酶脫除的離去基團(tuán)，R為無干擾的有機(jī)基團(tuán)，其中水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng);(b)檢測該水解酶，其中酶量是氨基取代的?；ｋ掳l(fā)光強(qiáng)度的函數(shù)。
27.權(quán)利要求26的方法，該方法還包括一種抑制劑以阻滯在不存在水解酶時發(fā)光。
28.權(quán)利要求26的方法，其中水解酶與一種生物分子相連。
29.權(quán)利要求26的方法，其中水解酶與抗體相連。
30.權(quán)利要求26的方法，其中水解酶與測定中構(gòu)成結(jié)合對一部分的分子相連。
31.權(quán)利要求26的方法，其中水解酶與核酸相連。
32.權(quán)利要求26的方法，其中混合和檢測操作在一種膜上進(jìn)行。
33.權(quán)利要求32的方法，其中膜為ImmobilonTM_P。
34.權(quán)利要求24的方法，其中OX選自烷基羧基酯、羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧吡喃糖苷取代基。
35.權(quán)利要求24的方法，其中水解酶選自堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶和酯酶。
36.權(quán)利要求26的方法，其中水解酶選自堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶和酯酶。
37.一種用于某種測定法檢測水解酶的試劑盒，該試劑盒包括一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物、一種過氧化物、一種過氧化物酶、一種與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時發(fā)光的氨基取代的?；ｋ拢渲惺茏o(hù)增強(qiáng)劑化合物的化學(xué)式為
其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，R為無干擾基團(tuán)，其中水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的?；ｋ碌陌l(fā)光水平得以增強(qiáng)。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，該試劑盒還包括一種在其上檢測水解酶的膜。
39.權(quán)利要求37的試劑盒，該試劑盒還包括與測定中某一結(jié)合對中的一個成分偶聯(lián)的水解酶。
40.權(quán)利要求37的試劑盒，該試劑盒還包括與水解酶偶聯(lián)的抗體。
41.權(quán)利要求37的試劑盒，該試劑盒還包括與水解酶偶聯(lián)的抗原。
42.權(quán)利要求37的試劑盒，其中還包括一種在不加水解酶時阻滯發(fā)光的抑制劑。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中抑制劑為蛋白質(zhì)。
44.權(quán)利要求37的試劑盒，其中OX選自烷基羧基酯、羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧吡喃糖苷取代基。
45.一種用于與水解酶反應(yīng)的組合物，該組合物包含(a)一種氨基取代的?；ｋ?(b)一種具有如下化學(xué)式的受護(hù)增強(qiáng)劑化合物
其中X為易與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，R為無干擾基團(tuán)，其中水解酶與受護(hù)增強(qiáng)劑化合物反應(yīng)脫除X，從而與不加增強(qiáng)劑化合物時的發(fā)光水平相比，氨基取代的酰基酰肼在過氧化物和過氧化物酶存在下的發(fā)光水平得以增強(qiáng)。
46.權(quán)利要求45的組合物，該組合物與過氧化物酶和過氧化物及一種抑制劑混合。
47.權(quán)利要求45的組合物，其中抑制劑為蛋白質(zhì)。
48.權(quán)利要求45的組合物，其中OX選自烷基羧基酯、羧基酯、無機(jī)含氧酸鹽和氧吡喃糖苷取代基。
49.權(quán)利要求24的方法，其中，R選自鹵素、含1-30個碳原子的烷基、含1-30個碳原子的芳基、含1-30個碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被鹵素取代，其中的芳基可含有置換碳原子的O、N或S;OX位于R的對位。
50.權(quán)利要求26的方法，其中，R選自鹵素、含1-30個碳原子的烷基、含1-30個碳原子的芳基、含1-30個碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被鹵素取代;OX位于R的對位。
51.權(quán)利要求37的試劑盒，其中，R選自鹵素、含1-30個碳原子的烷基、含1-30個碳原子的芳基、含1-30個碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被鹵素取代;OX位于R的對位。
52.權(quán)利要求45的組合物，其中，R選自鹵素、含1-30個碳原子的烷基、含1-30個碳原子的芳基、含1-30個碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被鹵素取代;OX位于R的對位。
全文摘要
描述了一種化學(xué)發(fā)光方法，該方法使用了一種受護(hù)增強(qiáng)劑化合物，該化合物由水解酶觸發(fā)可增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。該反應(yīng)涉及到一種氨基取代的酰基酰肼，該化合物在活化增強(qiáng)劑化合物存在下被過氧化物和過氧化物酶活化而發(fā)光。結(jié)果使該反應(yīng)發(fā)出的光得到增強(qiáng)。水解酶單獨存在或者在免疫測定、DNA探針測定或其他測定中作為標(biāo)記物與報道分子相結(jié)合。
文檔編號C12Q1/68GK1067257SQ92103938
公開日1992年12月23日 申請日期1992年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1991年5月24日
發(fā)明者M·H·阿克萬-塔夫蒂 申請人:生光有限公司