專利名稱：防病增產(chǎn)基因工程菌熒光93及研制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于防病增產(chǎn)基因工程菌熒光93及其研制方法，特別是關(guān)于假單胞菌屬(Pseudomonas)，熒光假單胞菌種(P.fluorescens Migula)，菌株名熒光93及其研制方法。
近年來，我國廣大麥區(qū)，尤其是北方冬、春麥區(qū)土傳病害發(fā)生十分普遍，危害逐年加重，已成為威脅小麥生產(chǎn)的一個重要因素。自山東、寧夏、和甘肅采集引起小麥根病和白穗癥狀的病害標(biāo)樣5432份，分離得到全蝕病菌、紋枯病菌、根腐病菌和鐮刀菌等3676株，其中全蝕病菌占69.6%。小麥全蝕病是一種典型的毀滅性土傳病害，發(fā)生后一般可減產(chǎn)20-30%，嚴(yán)重為害減產(chǎn)50%以上以至絕收。據(jù)報道，這一病害現(xiàn)已蔓延到我國近20個省(區(qū))，尤以山東、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙等省(區(qū))為害嚴(yán)重。1987年寧夏引黃灌區(qū)42%的小麥發(fā)生全蝕病，損失小麥1億多斤。1988年山東81個縣(市)發(fā)病，面積近640萬畝，損失巨大。
由于土傳病害種類多、發(fā)病周期長、傳播途徑廣泛，現(xiàn)有化學(xué)防治等措施往往難以奏效，加上缺乏抗病品種，更為病害的控制帶來極大的困難。必須積極研究新的防治方法，探索新的防治途徑。
70年代以來，現(xiàn)代生物科學(xué)與生物技術(shù)的發(fā)展促進了生物防治基礎(chǔ)與應(yīng)用研究的不斷深入。利用有益微生物防治土傳病害已成為一個十分活躍，并開始顯示良好應(yīng)用前景的研究領(lǐng)域。在各類有益微生物中，熒光假單胞菌(主要是Pseudomonas fluorescens，P.putida等)因其同植物密切的關(guān)系、對根圍環(huán)境高度的適應(yīng)性、獨特的防病增產(chǎn)作用、以及便于用現(xiàn)代生物技術(shù)進行遺傳操作等引起了研究者極大的興趣。近年國外在病菌與益菌生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，致力于試用熒光假單胞菌防治小麥全蝕病、水稻紋枯病、棉苗立枯病等多種土傳病害，同時也十分重視此種益菌的生化和分子遺傳研究。
本發(fā)明的目的之一是創(chuàng)建基因工程菌株，為小麥全蝕病等作物土傳病害的防治和增產(chǎn)開辟一條新途徑。
本發(fā)明的目的之二是應(yīng)用轉(zhuǎn)座子誘變等現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)造一種微生物育種新方法。
本發(fā)明的目的之三是開發(fā)新的抗病增產(chǎn)基因資源，為用生物工程技術(shù)培育抗病作物品種和防病增產(chǎn)微生物育種提供目的基因。
本發(fā)明其它目的和任務(wù)將通過以下具體描述進一步說明。
本發(fā)明的特征在于創(chuàng)建了一株基因工程細(xì)菌，分類上屬于假單胞菌屬(Pse-udomonas)、熒光假單胞菌種(P.fluorescens)，菌株名熒光93。
本發(fā)明菌株的主要形態(tài)和生理生化特征是桿菌，直或稍彎曲，有多根極鞭，革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)生芽孢。在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素，在4-30℃均能生長，在37℃或41℃均不能生長。在pH4.5或以下均不能生長，適宜pH為5.5-8.5。氧化酶反應(yīng)陽性，明膠液化陽性，硝酸鹽還原陽性，脫氮作用陽性，奎尼酸鹽陽性，山梨醇陽性，肌醇陽性，果聚糖陽性，蔗糖陽性，甜菜堿陽性，頡氨酸陽性，β-丙氨酸陽性，L-乳酸鹽陽性，甘露醇陰性，D-酒石酸鹽陰性，L-酒石酸鹽陰性，苯甲酸鹽陰性，鄰氨基苯甲酸陰性，阿東糖醇陰性。
本發(fā)明的菌株研制方法如下首先從小麥全蝕病(Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx & Olivier var.tritici Walker，又稱白穗病，根腐病)發(fā)生嚴(yán)重的病田中取出生長正常的小麥植株，將小麥根部用流水洗凈，用常規(guī)的組織分離方法結(jié)合KB或NBY選擇性培養(yǎng)基通過稀釋分離培養(yǎng)得到熒光假單胞菌，培養(yǎng)溫度為26℃，pH為7.0-7.5。在此KB培養(yǎng)基見King，E.O.，Ward，M.K.，and Raney，D.E.1954.Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.J.Lab.Clin.Med.44301-307.NBY培養(yǎng)基見Vidaver，A.K.1967.Synthetic and complex media for the rapid detection of fluorescence of phytopathogenic pseudomonadsEffects of the carbon source.Appl.Microbiol.151523-1524.以上二篇文獻通過參考引入本文。將分離得到的熒光假單胞菌進行轉(zhuǎn)座子誘變，篩選獲得基因工程菌株熒光93。
本發(fā)明的熒光93具有在小麥根部和葉部的定殖和上下轉(zhuǎn)移能力，即用熒光93處理小麥種子后細(xì)菌能在小麥根部定殖并向上轉(zhuǎn)移到莖和葉部，在葉部施用后能在葉部定殖并向下轉(zhuǎn)移到根系，因此該菌株在生產(chǎn)中應(yīng)用時可以采用浸種、拌種等種子處理、土壤處理、地上部噴霧等方法。熒光93同作物關(guān)系密切，親和性好，具有刺激和促進作物生長發(fā)育、提高作物產(chǎn)量的能力，特別是對小麥全蝕病有顯著防治效果，對水稻紋枯病、小麥紋枯病、棉花立枯病、棉花黑根腐病等多種作物土傳病菌也有顯著拮抗作用。
本發(fā)明的菌種根據(jù)中國專利法的規(guī)定，在申請日之前已經(jīng)進行了保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC 0169。
在此，申請人聲明，本專業(yè)普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明所公開的內(nèi)容可以作出許多變化和改變，但均應(yīng)理解為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下通過實施例來進一步說明本發(fā)明。請注意，實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不能限制本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。
例1.防病增產(chǎn)自然菌株的分離和純化從寧夏回族自治區(qū)賀蘭縣春小麥全蝕病發(fā)生嚴(yán)重的病田中取生長正常的小麥植株，將其根部洗凈后晾干。在超凈工作臺內(nèi)將小麥根用0.1%升汞表面消毒或不經(jīng)過表面消毒，滅菌水沖洗5次，切取4毫米左右的根段，用滅菌的玻棒將根組織研碎，在研缽中加約1毫升滅菌水或NBY液體培養(yǎng)基，充分混勻后靜置15-30分鐘，使根組織中的細(xì)菌流入水中而成懸浮液。懸浮液經(jīng)系列稀釋后在稀釋倍數(shù)為10、102、103的試管中用微量取樣器吸取0.1毫升移入KB或NBY選擇性培養(yǎng)基中。在26-28℃培養(yǎng)2-3天后挑取單菌落。用移植環(huán)在KB平板上劃線培養(yǎng)再次獲得單菌落，即為純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物經(jīng)過形態(tài)特征鑒定、對小麥全蝕病菌的離體拮抗作用測定以及溫室防病增產(chǎn)效果試驗后篩選獲得對小麥全蝕病有良好防病增產(chǎn)效果的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens Migula)自然菌株，株號為CN12(見表1)。
例2 防病增產(chǎn)基因工程細(xì)菌的構(gòu)建和應(yīng)用通過細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移(Conjugation)，將轉(zhuǎn)座子Tn5轉(zhuǎn)移并插入到例1中熒光假單胞菌自然菌株CN12的基因組中，篩選獲得防病增產(chǎn)效果顯著提高的基因工程菌株熒光93(見表1-2)?；饕^程如下以含自殺性質(zhì)粒pSUP2021的大腸桿菌S17-1為轉(zhuǎn)座Tn5供體，熒光假單胞菌CN12為受體。當(dāng)供體和受體生長到對數(shù)晚期時取等量細(xì)胞(1∶1，V/V)在LB培養(yǎng)基上進行平板接合交配，22℃2小時。菌體經(jīng)系列稀釋后轉(zhuǎn)移到含Rif和Km的選擇性培養(yǎng)基上篩選接合子，同時分別取等量供體和受體細(xì)胞測量自發(fā)突變率，重復(fù)5次。接合子經(jīng)單胞分離純化后在NBY培養(yǎng)基上繁殖并進行抗生素耐性測驗，其中兼抗Km和Rif，但對Ap和Cm敏感的接合子視為Tn5突變體。在此請參見附

圖1。在Tn5誘變試驗中，共獲得突變體5100個，以受體細(xì)胞計算，Tn5的轉(zhuǎn)移頻率為1.2×10-7。對Tn5誘變株再次進行單孢分離純化后，在PDA(馬鈴薯250克，葡萄糖10克，瓊脂15克，蒸餾水1000毫升)平板上測驗對小麥全蝕病菌的拮抗作用，在溫室和田間自然條件測驗對小麥全蝕病的防病增產(chǎn)效果，獲得基因工程菌株，菌株名熒光93，株號D93。與親本菌自然菌株CN12相比，熒光93對小麥全蝕病菌的拮抗作用提高1-2倍，對小麥全蝕病的田間防治效果提高72.8%，防病增產(chǎn)率提高1.2倍(見表3)。在無病條件下，熒光93使小麥產(chǎn)量增產(chǎn)26.4%(見表4)。
表1是熒光假單胞菌CN12及其Tn5誘變株對小麥全蝕病的溫室防治效果。
表2是熒光93對小麥全蝕病的防治效果。
表3為基因工程菌熒光93與自然菌株CN12對小麥全蝕病的田間防病增產(chǎn)效果的比較。
表4是熒光93對小麥的防病和增產(chǎn)效果。
圖1為熒光假單胞菌轉(zhuǎn)座子Tn5誘變程序。
表1 熒光假單胞菌CN12及其Tn5誘變株對小麥全蝕病的溫室防治效果處理 株高(mm) 地下部干重(mg/株) 發(fā)病級別(0-5)Ggt對照 193 d D 87.3 e E 3.53 a AGgt+CN12 226 c C 110.9 d D 3.03 b BGgt+2942 260.2 b B 166.5 c C 2.5 c CGgt+727 261 b B 166.8 c BC 2.37 cd CGgt+1533 263 b B 168.5 b B 2.13 d C無Ggt，無 281 a A 206.8 a A 0 e D細(xì)菌表2 熒光93對小麥全蝕病的防治效果病菌接種 菌劑處理 死株和白穗率% 病指 產(chǎn)量(mg/盆Ggt - 100 91.67 638.5Ggt 浸種 0 31.67 2439.8- 浸種 0 0 2857.0Ggt 土壤 0 30.00 2733.3- - 0 0 2260.5病土 - 100 88.33 686.2病土 浸種 0 33.33 2576.2- - 0 0 2238.4Ggt為人工接種全蝕病菌，設(shè)4次重復(fù);病土為寧夏自然病土，設(shè)5次重復(fù)。
表3 基因工程菌熒光93與自然菌株CN12對小麥全蝕病防病增產(chǎn)效果的比較處理 白穗率% 防效% 實產(chǎn)(kg/區(qū)) 增產(chǎn)%CK 24.94 - 5.655 -CN12 15.32 38.6 6.350 12.3D93 8.31 66.7 7.195 27.2試驗設(shè)2塊田6次重復(fù)，小區(qū)面積10平方米。白穗數(shù)每小區(qū)逐行調(diào)查，產(chǎn)量按小區(qū)單收單打。
表4 熒光93對小麥的防病和增產(chǎn)效果人工接種 D93菌株 病指 產(chǎn)量 較發(fā)病對 較無病對Ggt 處理 (mg/盆) 照增產(chǎn)% 照增產(chǎn)%- 種子 0 2857.0±52.50 347.5 26.4+ 土壤 30.00 2733.3±76.40 328.1 20.9+ 種子 31.67 2439.8±53.55 282.1 7.9- - 0 2260.5±39.13 254.0+ - 91.67 638.50±99.71 - 71.8
權(quán)利要求
1.本發(fā)明的特征在于構(gòu)建了一株基因工程細(xì)菌，分類上屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，熒光假單胞菌種(P.fluorescens Migula)，菌株名熒光93。
2.如權(quán)利要求1所述的菌種，其特征在于所述菌種是從小麥上發(fā)現(xiàn)的。
3.如權(quán)利要求1所述的菌種，其特征在于所述菌種是從小麥根部分離的。
4.如權(quán)利要求1所述的菌種，其特征在于所述菌種是經(jīng)過轉(zhuǎn)座子誘變改造的。
5.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述菌種的方法，包括如下步驟a將小麥根部用流水洗凈;b用常規(guī)的組織分離法結(jié)合KB或NBY選擇性培養(yǎng)基分離獲得熒光假單胞菌;c、對菌株進行轉(zhuǎn)子Tn5誘變，篩選獲得菌株熒光93。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于該小麥為嚴(yán)重發(fā)病田中生長正常的小麥植株。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于該分離方法選用KB、NBY等選擇性培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于該育種方法是以自殺質(zhì)粒為供體、以熒光假單胞菌為受體進行轉(zhuǎn)座子誘變育種。
9.如權(quán)利要求1所述的菌種，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC 0169。
全文摘要
本發(fā)明利用轉(zhuǎn)座子Tn5誘變技術(shù)對熒光假單胞菌進行遺傳改良。得到一株純的基因工程細(xì)菌，分類上屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、熒光假單胞菌種(P.fluoresccns Migula)，菌株名熒光93。對小麥有明顯促進生長和增產(chǎn)作用，對小麥全蝕病(Gaeumannomyces graminis var.tritici)具有顯著防病增產(chǎn)效果，對水稻紋枯病、小麥紋枯病、棉花立枯病和棉花黑根腐病等土傳根病也有顯著拮抗作用。
文檔編號C12N1/21GK1058230SQ91105260
公開日1992年1月29日 申請日期1991年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月3日
發(fā)明者彭于發(fā), 張中鴿, 黃大昉, 陳彩層, 張 杰, 陳善銘 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所