本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，同時(shí)也涉及飼料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備與飼料。
背景技術(shù)：
：隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，對蛋白原料的需求日趨增大。而優(yōu)質(zhì)蛋白原料如魚粉等受原料來源，市場供應(yīng)等多種因素影響，供應(yīng)量日趨不足。尋找替代魚粉的新型蛋白源，特別是利用廉價(jià)的植物蛋白源部分或者全部替代魚粉。在眾多的植物蛋白源中，豆粕由于蛋白質(zhì)含量高、價(jià)格適宜、供應(yīng)量充足而成為最好的選擇，成為制備畜禽精飼料的基本原料。發(fā)酵豆粕利用生物發(fā)酵酶解技術(shù)克服了豆粕蛋白在營養(yǎng)學(xué)上的弱點(diǎn)，通過有益微生物作用提高了豆粕蛋白的溶解度，利于消化；減小了豆粕中蛋白的分子量，其中的一部分已達(dá)到小肽水平甚至氨基酸水平，可以直接被動(dòng)物吸收；發(fā)酵豆粕具有一定的芳香氣味和鮮味，有一定的誘食作用，適口性較好；并且豆粕中一些非淀粉性多糖在發(fā)酵過程中得到了分解，有利于動(dòng)物消化。發(fā)酵豆粕已廣泛地應(yīng)用于飼料行業(yè)，成為替代魚粉的最佳選擇。菌種開發(fā)和酶解技術(shù)，直接影響發(fā)酵豆粕的質(zhì)量。發(fā)酵豆粕常用的菌種為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌等。海洋紅酵母是指自然海域中存在的酵母菌，其菌體營養(yǎng)豐富而全面，富含蛋白質(zhì)、肝糖、不飽和脂肪酸、動(dòng)物幼體生長激素和以蝦青素為主的類胡蘿卜素，是優(yōu)良的蝦青素(astaxanthin)生產(chǎn)菌、天然色素源、極具潛力的動(dòng)物飼料蛋白和食品添加劑。蝦青素即3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，為萜烯類不飽和化合物，具有很強(qiáng)的清除氧自由基、促進(jìn)抗體產(chǎn)生、增加宿主免疫力以及艷麗紅色的作用。蝦青素最大的市場是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和家禽養(yǎng)殖業(yè)，主要用作魚類和蝦蟹等甲殼類動(dòng)物及家禽的飼料添加劑，能提高仔豬的養(yǎng)分消化率和免疫力，減少腹瀉的發(fā)生，進(jìn)而提高仔豬的生產(chǎn)性能，并能夠提高哺乳母豬的采食量、奶水質(zhì)量和哺乳仔豬的日增重。加強(qiáng)研究與開發(fā)蝦青素和蝦青素產(chǎn)品在養(yǎng)豬領(lǐng)域的應(yīng)用具有非常廣闊的前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕，其制備方法與飼料，該制備方法簡單、有效地提高豆粕營養(yǎng)成分含量，尤其是提高了發(fā)酵豆粕中蝦青素的含量。本發(fā)明的一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備方法技術(shù)方案如下：1)制備富含蝦青素的海洋紅酵母發(fā)酵液；2)制備協(xié)同發(fā)酵所用復(fù)合發(fā)酵菌液；3)配制發(fā)酵底物；4)將步驟2)所得到的復(fù)合發(fā)酵菌液接種至步驟3)中的發(fā)酵底物中，并調(diào)節(jié)含水量，混合均勻；5)將步驟4)接種菌液后的發(fā)酵底物在溫控的條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完成即得發(fā)酵豆粕。其中，將海洋紅酵母接種至海洋紅酵母液體培養(yǎng)基，溫度25-30℃，轉(zhuǎn)速為150-250rpm振蕩培養(yǎng)44-48小時(shí)作為海洋紅酵母發(fā)酵液；優(yōu)選的，所述海洋紅酵母為膠紅酵母cgmccno.13012。本發(fā)明中的膠紅酵母(rhodotorulamucilaginosa)新菌株，已于2016年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13012。進(jìn)一步的，所述的海洋紅酵母培養(yǎng)基中各成分的濃度為：糖蜜20-30g/l，蛋白胨1.5-2.5g/l，酵母膏1.5-2.5g/l，硫酸銨2.5-5.0g/l，磷酸二氫鉀1.0-1.5g/l，一水硫酸鎂0.05-0.15g/l，硫酸亞鐵0.1-0.15g/l，氯化鈉10-15g/l，ph調(diào)節(jié)至5.5-6.0。其中，將芽孢桿菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8-10h，制備活化液；海洋紅酵母發(fā)酵菌種和活化液以體積比為2:1混合均勻后，形成復(fù)合發(fā)酵菌液。其中，所述的活化液含有下述組分：蛋白胨1～5g/l，酵母膏4～9g/l，氯化鈉3.5～4.5g/l，紅糖9～12g/l，ph調(diào)節(jié)至6.5-7.0。其中，所述芽孢桿菌由枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)cgmccno.8148、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)cgmccno.2383復(fù)配而成，枯草芽孢桿菌的濃度為200億cfu/g，地衣芽孢桿菌濃度為100億cfu/g；所述乳酸菌由糞腸球菌(enterococcusfaecalis)cgmccno.2385、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)復(fù)配而成，糞腸球菌的濃度為200億cfu/g，植物乳桿菌為100億cfu/g。芽孢菌菌粉在活化液中的濃度為：5-10g/l，乳酸菌菌粉的濃度為：5-10g/l。按下述質(zhì)量百分比配置發(fā)酵底物：豆粕(46％)70-95％，糖蜜1-5％，玉米面3-7％，硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.2％、七水合硫酸鎂0.1％、碳酸鈣0.1％，酸性蛋白酶0.04～0.05％，纖維素酶0.01～0.03％、淀粉酶0.02～0.04％，混合制得發(fā)酵底物；進(jìn)一步的，上述的富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備方法，所述的酸性蛋白酶的酶活力為50,000iu/g；纖維素酶的活力為6000iu/克，淀粉酶的酶活力為7000iu/g。將步驟3)所得到的復(fù)合發(fā)酵菌液接種至步驟4)中的發(fā)酵底物中，接種量為3～6％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，并調(diào)節(jié)含水量至35～50％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))混合均勻，將步驟5)接種菌液后的發(fā)酵底物采用噸包或者發(fā)酵池的方式，在25℃至45℃的條件下，發(fā)酵48-96h后，形成發(fā)酵豆粕半成品；本發(fā)明還提供一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕，其通過上述制備方法得到；所述的發(fā)酵豆粕具有較濃郁的酸香味；水分含量35-50％，ph在4.0～5.5，粗蛋白含量25-40％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，較原豆粕粗蛋白含量提高5-15％。發(fā)酵后海洋紅酵母母菌數(shù)1.5×107cfu/g以上，蝦青素含量為125.43μg/kg以上，乳酸菌數(shù)6.5×108cfu/g以上，芽孢菌數(shù)1.0×108cfu/g以上；嘔吐毒素較原豆粕降低70～90％。所述的發(fā)酵豆粕具有較濃郁的酸香味；水分含量優(yōu)選35-42％，ph優(yōu)選為4.52～5.28，粗蛋白含量優(yōu)選為35.36～37.25％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，較原豆粕粗蛋白含量提高10.63-16.54％。發(fā)酵后海洋紅酵母母菌數(shù)優(yōu)選1.5×107～2.5×108cfu/g以上，蝦青素含量優(yōu)選為125.43～547.26μg/kg，乳酸菌數(shù)優(yōu)選為6.5×108～2.1×109cfu/g，芽孢菌數(shù)優(yōu)選為1.2×108-3.5×108cfu/g；嘔吐毒素較原豆粕降低75～90％。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供一種富含蝦青素的飼料，其由下述方法制備而成：將玉米，豆粕經(jīng)過初篩處理，用2.5mm的篩片將上述原料粉碎成粉狀，進(jìn)入待配料倉，將粉碎后的玉米，豆粕及麩皮，以及所述的富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備方法制備的發(fā)酵豆粕通過大料配料秤按比例加入混合機(jī)，然后分別將魚粉、磷酸氫鈣、石粉、食鹽、l-賴氨酸、蘇氨酸、復(fù)合預(yù)混合飼料、氯化膽堿從微量秤或手動(dòng)稱量加入混合機(jī)，混合10-15秒后再加入植物油混合均勻后進(jìn)入待制粒倉進(jìn)行制粒。其中，經(jīng)過120秒的混合時(shí)間混合均勻，在蒸汽壓0.2mpa，溫度75℃的條件下進(jìn)行制粒，粉碎粒度為2.0-3.0mm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：1采用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的海洋紅酵母菌種，結(jié)合了微生物發(fā)酵、酶制劑的使用，提高粗蛋白和酸溶蛋白的含量，減少霉菌毒素污染。2發(fā)酵過程中，海洋紅酵母和乳酸菌的使用，增加了發(fā)酵的酸香味，改善飼料的適口性，提高了動(dòng)物的采食量，并且，乳酸菌等有益菌對畜禽的腸道起到一定的調(diào)節(jié)作用。芽孢菌分泌的酶類和抗菌物質(zhì)，可以提高幼齡動(dòng)物和母豬的消化率，并能改善動(dòng)物腸道，對動(dòng)物生產(chǎn)性能具有促進(jìn)作用。3通過海洋紅酵母在發(fā)酵過程中的使用，增加了發(fā)酵豆粕中蝦青素的含量，減少仔豬腹瀉，并利用蝦青素的作用提高動(dòng)物的免疫力和抗氧化能力，提高仔豬生產(chǎn)性能。4通過噸包等易于操作的發(fā)酵方式，減少占地和人員消耗，對設(shè)備的要求不高，制備方法簡單易行，節(jié)能環(huán)保，降低發(fā)酵豆粕的使用成本。5采用低水分發(fā)酵工藝，與飼料原料進(jìn)行配料、混合、調(diào)制、制粒、冷卻，發(fā)酵豆粕半成品直接進(jìn)入飼料加工環(huán)節(jié)，減少干燥環(huán)節(jié)的能耗，以及運(yùn)輸成本，并保護(hù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的益生因子，便于發(fā)酵豆粕在規(guī)模養(yǎng)殖場和飼料廠的應(yīng)用與推廣。本發(fā)明的富含蝦青素的發(fā)酵豆粕在斷奶仔豬上應(yīng)用，能夠減少仔豬的腹瀉，增強(qiáng)免疫球蛋白的含量，提高動(dòng)物的免疫力，對動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有促進(jìn)作用。在母豬上應(yīng)用能夠提高母豬的繁殖性能，減少哺乳仔豬腹瀉的發(fā)生，增加斷奶重，并提高母乳中乳蛋白、乳脂肪和乳糖的含量，減少仔豬的應(yīng)激。附圖說明圖1所示為膠紅酵母y4-5(hyh4-5-21)菌株傳代類胡蘿卜素含量測定結(jié)果。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1分離篩選高產(chǎn)類胡蘿卜素海洋紅酵母菌株取來自于福建、江蘇魚塘和蝦塘的水樣、泥樣及動(dòng)物腸道樣品、公園泥樣及紅樹葉等，取1ml液體樣品或1g固體樣品于18ml試管的9mlypd液體培養(yǎng)基中，加入青霉素鈉(80萬單位每瓶滅菌蒸餾水稀釋成1ml，添加1ul/試管)，85℃水浴處理10min后。試管放入溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下振蕩培養(yǎng)16h后得到富集培養(yǎng)液。采用倍比稀釋法將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于ypd固體培養(yǎng)基上，放置于28℃培養(yǎng)箱中48h，挑取平板上所生長的粉紅色、紅色或橙色單菌落進(jìn)行劃線，并純化兩次，獲得活的單菌落，共47株菌，菌種甘油保藏。實(shí)施例2測定生物干重及類胡蘿卜素產(chǎn)量，篩選優(yōu)秀菌株在超凈臺中，將47株待測菌株單菌落接入篩選培養(yǎng)基中，重復(fù)數(shù)為3。培養(yǎng)方法為：250ml搖瓶裝液50ml，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)時(shí)間36h。其中，液體培養(yǎng)基p3配方為：酵母膏15g，七水硫酸鎂1g，蔗糖40g，海水1000ml(海鹽20g)。固體培養(yǎng)基瓊脂為20g/l。細(xì)胞干重測定方法：取發(fā)酵液10ml，8000r/min離心5min，倒去上清液，加入蒸餾水洗滌三次，再8000r/min離心5min，倒去上清液，在50度烘干至恒重即得干菌體(單位g/l)。類胡蘿卜素的提取方法：1)破壁方法--超聲波輔助酸熱法：取干菌體放入帶帽試管中，按照15ml/g干菌體的量加入3mol/l鹽酸(需要配制)，浸泡40min。浸泡過程中將試管至于超聲波條件下。破壁完成之后，向細(xì)胞碎片中加入丙酮。2)2倍于鹽酸破壁液體積作為浸提液，浸泡30min，4000r/min離心15min，所得上清液即為丙酮的類胡蘿卜素浸提液。將浸提液用484nm測定。類胡蘿卜素含量測定(μg/g)＝od×d×v/(0.16×w)(d為稀釋倍數(shù)；v為有機(jī)溶劑體積；w為提取用菌體干重；0.16為有機(jī)溶劑消光系數(shù)。)測定吸光度，單位：μg/g。9株優(yōu)選菌株測定結(jié)果如表1，由表1可見，菌株hyh4-5細(xì)胞干重和總類胡蘿卜素產(chǎn)量都為最高。表1生物干重及類胡蘿卜素產(chǎn)量前9的菌株實(shí)施例3海洋紅酵母菌株hyh4-5的itsrrna基因序列分析將獲得的菌株hyh4-5進(jìn)行itsrrna基因序列分析，序列如seqidno.1所示。將基因序列輸genbank，通過blast程序?qū)?shù)據(jù)庫中所有序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海洋紅酵母菌株hyh4-5的itsrrna基因序列與膠紅酵母屬模式菌株有較高的相似性。實(shí)施例4海洋紅酵母菌株hyh4-5的生理生化特性分析本發(fā)明中的海洋紅酵母新菌株hyh4-5，其生理生化特性如下：不發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、棉子糖和蜜二糖中的任何一種?？蓪ζ咸烟恰Ⅺ溠刻?、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纖維二糖、海藻糖、木糖、d-阿拉伯糖和l-阿拉伯糖進(jìn)行同化，對半乳糖、乳糖和可溶性淀粉不能進(jìn)行同化。綜上所述，確定海洋紅酵母菌株hyh4-5為膠紅酵母(rhodotorulamucilaginosa)。實(shí)施例5獲得膠紅酵母誘變菌株y4-5采用亞硝基胍對海洋紅酵母hyh4-5進(jìn)行誘變，操作方法如下：1)制備菌懸液。取搖瓶培養(yǎng)液10ml4000rpm離心10min收集酵母。培養(yǎng)方法：250ml搖瓶裝液50ml，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)時(shí)間24h。用0.1mol/lph5.5檸檬酸鈉緩沖液洗滌2次，用檸檬酸緩沖溶液將細(xì)胞懸浮，制成細(xì)胞濃度為108cfu/g的菌懸液。2)配制亞硝基胍原液。滴加2-3滴丙酮溶液至10mg亞硝基胍中，然后加入10ml0.1mol/lph5.5檸檬酸鈉緩沖液使之完全溶解。實(shí)驗(yàn)確定亞硝基胍溶液誘變濃度為42μg/ml時(shí)，細(xì)胞致死率為95％左右，此時(shí)突變率最高。3)進(jìn)行誘變。取上述菌懸液10ml，加入亞硝基胍溶液0.44ml，使其在菌懸液中的最終濃度達(dá)到42μg/ml，于28℃保溫30min，取出后立即離心棄去上清液，用0.1mol/lph7.0磷酸鉀緩沖液洗滌2次再用10mlp3液體培養(yǎng)基使菌體懸浮于24℃培養(yǎng)過夜。4)篩選突變株：將培養(yǎng)好的菌液適當(dāng)稀釋涂布于培養(yǎng)基p3固體平板上(滅菌后固體培養(yǎng)基p3，降溫至45℃左右時(shí)加入二苯胺溶液中，終濃度為25μg/ml：抑制酵母合成類胡蘿卜素的能力，該濃度可殺死90％的細(xì)胞)。24℃培養(yǎng)7d，待形成菌落后，挑選出紅色較深的菌落，劃線保存培養(yǎng)，測定突變株總類胡蘿卜素含量。由表2可知，菌株hyh4-5-14類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，菌株hyh4-5-21的類胡蘿卜素總量為最高，因此將hyh4-5-21選為產(chǎn)品候選菌株，重新編號為y4-5。表2膠紅酵母hyh4-5菌株突變菌株類胡蘿卜素含量測定結(jié)果突變株穩(wěn)定性測試和保藏。將y4-5菌株接種于p3固體斜面上保存菌株，連續(xù)傳代10次，每次傳代測定其類胡蘿卜素含量。結(jié)果見圖1。結(jié)果表明y4-5具有傳代穩(wěn)定性。本發(fā)明中的膠紅酵母(rhodotorulamucilaginosa)新菌株y4-5，已于2016年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13012。實(shí)施例6膠紅酵母y4-5耐受性測定(1)低溫耐受試驗(yàn):分別在12℃、15℃、18℃、21℃、24℃、28℃下，在p3固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)海洋紅發(fā)酵液點(diǎn)種生長實(shí)驗(yàn)(用移液槍吸取發(fā)酵稀釋液2ul，接種在培養(yǎng)基平板上)，培養(yǎng)時(shí)間均為36h，期間每4h進(jìn)行觀察生長狀況(菌落大小和顏色)，表征其低溫耐受性。觀察結(jié)果：在不同溫度下，發(fā)酵液菌株均可正常生長，但在溫度為12-18℃范圍內(nèi)比21-28℃生長速度較慢(體現(xiàn)為同一稀釋梯度發(fā)酵液，同一時(shí)間菌落較小)，但溫度越低越有利于色素的產(chǎn)生(菌落顏色越深)，說明該菌株在低溫時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)生的量不受影響。(2)高鹽耐受試驗(yàn)：在鹽度分別為0‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰的p3固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)培養(yǎng)液點(diǎn)種生長實(shí)驗(yàn)(用移液槍吸取培養(yǎng)稀釋液2ul，接種在培養(yǎng)基平板上)，培養(yǎng)時(shí)間36h，培養(yǎng)溫度28℃。期間每4h進(jìn)行觀察生長狀況(菌落大小和顏色)，表征其高鹽耐受性。觀察結(jié)果：在不同鹽度下，發(fā)酵液菌株均可正常生長，但在鹽度為20-30‰范圍內(nèi)生長效果最佳(體現(xiàn)為同一稀釋梯度發(fā)酵液，同一時(shí)間菌落大，菌落顏色深)。實(shí)施例7海洋紅酵母菌株y4-5的中試發(fā)酵培養(yǎng)(1)一級搖瓶種子液制備：在超凈臺中，將分離獲得的海洋紅酵母菌株單菌落接種至液體培養(yǎng)基p3中，250ml搖瓶裝液50ml，180rpm，28℃培養(yǎng)30h。(2)二級搖瓶種子液制備：將步驟(1)中制備的菌株種子液按照10％的接種量接入以二級搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，1000ml搖瓶裝液300ml，發(fā)酵溫度28℃，轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵時(shí)間24h；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟(2)中制備的菌株種子液按照5％的接種量接入100l發(fā)酵罐(裝液量為60l)中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度28℃，轉(zhuǎn)速300rpm，灌壓0.05mpa，通風(fēng)比是1:0.5，初始ph值為6.0左右，發(fā)酵時(shí)間24h。在此中試條件下，測得類胡蘿卜素的產(chǎn)量為10.45mg/l，蛋白含量為41％。實(shí)施例8一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備將海洋紅酵母cgmccno.13012接種至海洋紅酵母液體培養(yǎng)基，溫度28℃，轉(zhuǎn)速為180rpm振蕩培養(yǎng)45小時(shí)作為海洋紅酵母發(fā)酵液；所述的海洋紅酵母培養(yǎng)基中各成分的濃度為：糖蜜20g/l，蛋白胨2.5g/l，酵母膏1.5g/l，硫酸銨5.0g/l，磷酸二氫鉀1.0g/l，一水硫酸鎂0.15g/l，硫酸亞鐵0.1g/l，氯化鈉10g/l，ph調(diào)節(jié)至6.0。其中，將芽孢桿菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8-10h，制備活化液；所述的活化液含有下述組分：蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l，氯化鈉3.5g/l，紅糖10g/l，ph調(diào)節(jié)至6.5。所述芽孢桿菌由枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)cgmccno.8148、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)cgmccno.2383復(fù)配而成，枯草芽孢桿菌的濃度為200億cfu/g，地衣芽孢桿菌濃度為100億cfu/g；所述乳酸菌由糞腸球菌(enterococcusfaecalis)cgmccno.2385、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)復(fù)配而成，糞腸球菌的濃度為200億cfu/g，植物乳桿菌為100億cfu/g。芽孢菌菌粉在活化液中的濃度為：5g/l，乳酸菌菌粉的濃度為：10g/l。制備的海洋紅酵母發(fā)酵菌種、芽孢桿菌和乳酸菌活化液以體積比為2:1混合均勻后，形成復(fù)合發(fā)酵菌液。按下述質(zhì)量百分比配置發(fā)酵底物：豆粕(46％)93％，糖蜜1％，玉米面5％，硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.2％、七水合硫酸鎂0.1％、碳酸鈣0.1％，酸性蛋白酶0.04％，纖維素酶0.04％、淀粉酶0.02％，混合制得發(fā)酵底物。所述的酸性蛋白酶的酶活力為50,000iu/g；纖維素酶的活力為6000iu/克，淀粉酶的酶活力為7000iu/g。將復(fù)合發(fā)酵菌液接種至發(fā)酵底物中，接種量為3％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，并調(diào)節(jié)含水量至40％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))混合均勻，采用噸包或者發(fā)酵池的方式，在30℃的條件下，發(fā)酵72h后，形成發(fā)酵豆粕半成品。實(shí)施例9一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備將海洋紅酵母cgmccno.13012接種至海洋紅酵母液體培養(yǎng)基，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為150rpm振蕩培養(yǎng)44小時(shí)作為海洋紅酵母發(fā)酵液；所述的海洋紅酵母培養(yǎng)基中各成分的濃度為：糖蜜30g/l，蛋白胨1.5g/l，酵母膏2.5g/l，硫酸銨5.0g/l，磷酸二氫鉀1.0g/l，一水硫酸鎂0.10g/l，硫酸亞鐵0.1g/l，氯化鈉10g/l，ph調(diào)節(jié)至5.5。其中，將芽孢桿菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8h，制備活化液；所述的活化液含有下述組分：蛋白胨5g/l，酵母膏6g/l，氯化鈉4.5g/l，紅糖10g/l，ph調(diào)節(jié)至6.5。所述芽孢桿菌由枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)cgmccno.8148、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)cgmccno.2383復(fù)配而成，枯草芽孢桿菌的濃度為200億cfu/g，地衣芽孢桿菌濃度為100億cfu/g；所述乳酸菌由糞腸球菌(enterococcusfaecalis)cgmccno.2385、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)復(fù)配而成，糞腸球菌的濃度為200億cfu/g，植物乳桿菌為100億cfu/g。芽孢菌菌粉在活化液中的濃度為：10g/l，乳酸菌菌粉的濃度為：5g/l。按下述質(zhì)量百分比配置發(fā)酵底物：豆粕(46％)92％，糖蜜2％，玉米面5％，硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.2％、七水合硫酸鎂0.1％、碳酸鈣0.1％，酸性蛋白酶0.05％，纖維素酶0.03％、淀粉酶0.02％，混合制得發(fā)酵底物。所述的酸性蛋白酶的酶活力為50,000iu/g；纖維素酶的活力為6000iu/克，淀粉酶的酶活力為7000iu/g。將復(fù)合發(fā)酵菌液接種至發(fā)酵底物中，接種量為5％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，并調(diào)節(jié)含水量至35％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))混合均勻，采用噸包或者發(fā)酵池的方式，在25℃的條件下，發(fā)酵96h后，形成發(fā)酵豆粕半成品。實(shí)施例10一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備將海洋紅酵母cgmccno.13012接種至海洋紅酵母液體培養(yǎng)基，溫度25℃，轉(zhuǎn)速為250rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)作為海洋紅酵母發(fā)酵液；所述的海洋紅酵母培養(yǎng)基中各成分的濃度為：糖蜜30g/l，蛋白胨2.5g/l，酵母膏2.5g/l，硫酸銨2.5g/l，磷酸二氫鉀1.2g/l，一水硫酸鎂0.05g/l，硫酸亞鐵0.15g/l，氯化鈉15g/l，ph調(diào)節(jié)至6.0。其中，將芽孢桿菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化10h，制備活化液；所述的活化液含有下述組分：蛋白胨2.5g/l，酵母膏9g/l，氯化鈉4.0g/l，紅糖12g/l，ph調(diào)節(jié)至7.0。所述芽孢桿菌由枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)cgmccno.8148、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)cgmccno.2383復(fù)配而成，枯草芽孢桿菌的濃度為200億cfu/g，地衣芽孢桿菌濃度為100億cfu/g；所述乳酸菌由糞腸球菌(enterococcusfaecalis)cgmccno.2385、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)復(fù)配而成，糞腸球菌的濃度為200億cfu/g，植物乳桿菌為100億cfu/g。芽孢菌菌粉在活化液中的濃度為：10g/l，乳酸菌菌粉的濃度為10g/l。制備的海洋紅酵母發(fā)酵菌種、芽孢桿菌和乳酸菌活化液以體積比為2:1混合均勻后，形成復(fù)合發(fā)酵菌液。按下述質(zhì)量百分比配置發(fā)酵底物：豆粕(46％)87％，糖蜜5％，玉米面7％，硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.2％、七水合硫酸鎂0.1％、碳酸鈣0.1％，酸性蛋白酶0.05％，纖維素酶0.03％、淀粉酶0.02％，混合制得發(fā)酵底物。所述的酸性蛋白酶的酶活力為50,000iu/g；纖維素酶的活力為6000iu/克，淀粉酶的酶活力為7000iu/g。將復(fù)合發(fā)酵菌液接種至發(fā)酵底物中，接種量為5％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，并調(diào)節(jié)含水量至50％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))混合均勻，采用噸包或者發(fā)酵池的方式，在40℃的條件下，發(fā)酵48h后，形成發(fā)酵豆粕半成品。實(shí)施例11發(fā)酵豆粕指標(biāo)的測定得到的富含蝦青素的發(fā)酵豆粕半成品的指標(biāo)檢測結(jié)果見表2。其中，粗蛋白含量是通過gb/t6432-1994測定；ph通過ph計(jì)測得；海洋酵母菌數(shù)含量依據(jù)gb4789.15-2010方法測得，乳酸菌菌數(shù)含量依據(jù)gb4789.35-2010方法測得，芽孢菌菌數(shù)含量依據(jù)ny/t2131-2012、ny/t1461-2007方法測得。蝦青素含量依據(jù)db23/t1275-2008方法測得。嘔吐毒素的測定參照嘔吐毒素檢測試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行。表2豆粕發(fā)酵前后指標(biāo)的變化情況實(shí)施例12富含蝦青素的發(fā)酵豆粕在斷奶仔豬飼料中的應(yīng)用飼料配制：飼料配制參照nrc(2012)和豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)，試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平見表3。將玉米，豆粕經(jīng)過初篩處理，用2.5mm的篩片將上述原料粉碎成粉狀，進(jìn)入待配料倉，將粉碎后的玉米，豆粕，以及所述的富含蝦青素的發(fā)酵豆粕半成品，通過大料配料秤按比例加入混合機(jī)，然后分別將魚粉、乳清粉、磷酸氫鈣、石粉、食鹽、l-賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、0.5％復(fù)合預(yù)混合飼料、氯化膽堿、三氧化二鉻、氧化鋅從微量秤或手動(dòng)稱量加入混合機(jī)，混合10-15秒后再加入大豆油混合均勻后進(jìn)入待制粒倉進(jìn)行制粒。市售發(fā)酵豆粕由上海某公司提供。其中，混合時(shí)間為120秒，蒸汽壓0.2mpa，調(diào)制器溫度75℃的條件下進(jìn)行制粒，制粒冷卻后再次進(jìn)行超微粉碎，粉碎粒度為(400-500μm)。表3試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平注：0.5％復(fù)合預(yù)混合混料為每kg全價(jià)飼料提供cu≥40g，fe≥1040mg，mn≥14.4g，se≥120g，i≥160mg，鈷≥200mg，鐵≥36.8g，水分≤10％。維生素a(kiu)≥2000，維生素d3(kiu)≥375，維生素e(iu)≥5300，維生素k≥400mg，維生素b1≥450mg，維生素b2≥600mg，維生素b6≥530mg，維生素b12≥6.4mg，葉酸≥216mg，生物素≥8.8mg，煙酸≥7800mg，泛酸鈣≥6000mg。試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理：本試驗(yàn)選用144頭(公母各半)的健康(杜×長×大)21日齡斷奶仔豬，試驗(yàn)期10d。試驗(yàn)在河北省唐山市玉田縣某豬場進(jìn)行。采用全封閉式豬舍，舍內(nèi)溫度、濕度、通風(fēng)、二氧化碳和氨濃度自動(dòng)化控制，試驗(yàn)期間舍溫保持在24-26℃。試驗(yàn)仔豬分欄飼養(yǎng)，漏縫地板，不銹鋼可調(diào)式料槽，乳頭式飲水器。采用自由采食和飲水的飼喂方式。試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將144頭健康斷奶仔豬按體重和性別完全隨機(jī)分組為4個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬(公母各半)。日糧處理組分別為：(1)對照組：玉米-豆粕-市售發(fā)酵豆粕基礎(chǔ)日糧；(2)添加12％實(shí)施例8發(fā)酵豆粕組；(3)添加12％實(shí)施例9發(fā)酵豆粕組；(4)添加12％實(shí)施例10發(fā)酵豆粕組。保證各試驗(yàn)組的粗蛋白水平一致。檢測指標(biāo)與測定方法：平均日增重(adg)、平均日采食量(adfi)，料重比。試驗(yàn)期間，為了觀測斷奶仔豬腹瀉的嚴(yán)重程度，每天記錄糞便指數(shù)，如表4，當(dāng)指數(shù)為4、5則認(rèn)定為腹瀉。試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1頭豬，每頭豬前腔靜脈采血10ml，3000r/min離心10min制備血清樣品，分裝后冷凍存放于-80℃待測。免疫球蛋白a、免疫球蛋白g和免疫球蛋白m的測定根據(jù)定量測定試劑盒(r&d，中國)的說明，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。表4糞便指數(shù)糞便指數(shù)腹瀉程度糞便狀態(tài)1便秘羊糞狀(球狀)2正常條狀成型3輕度腹瀉糞便呈粘粥狀4中度腹瀉糞便呈稀泥漿狀5嚴(yán)重腹瀉糞便呈水狀統(tǒng)計(jì)方法：試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用sas9.0軟件包中的平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)anova過程進(jìn)行方差分析，采用duncan法進(jìn)行均值的多重比較。試驗(yàn)結(jié)果：血液指標(biāo)：如表5所示，對照組、實(shí)施例8發(fā)酵豆粕組、實(shí)施例9發(fā)酵豆粕組和實(shí)施例10發(fā)酵豆粕組仔豬血液中iga和igm均無明顯差異，igg指標(biāo)各試驗(yàn)組均高于對照組，表明本發(fā)明的發(fā)酵豆粕能夠提高斷奶仔豬的免疫球蛋白水平，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力。表5發(fā)酵豆粕替代日糧中豆粕對斷奶仔豬血液指標(biāo)的影晌生產(chǎn)性能：含蝦青素的發(fā)酵豆粕替代日糧中市售發(fā)酵豆粕對斷奶仔豬生長性能的影響結(jié)果見表6。各組仔豬初始體重沒有差異。結(jié)果表明，含蝦青素的發(fā)酵豆粕各試驗(yàn)組比對照組日增重和日采食量有顯著的提高(p<0.05)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著。各試驗(yàn)組與對照組相比料肉比均有下降趨勢，實(shí)施例8和實(shí)施例9發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組之間差異不顯著(p>0.05)，但與對照組差異顯著(p<0.05)。根據(jù)上表數(shù)據(jù)顯示，含蝦青素的發(fā)酵豆粕替代日糧中普通發(fā)酵豆粕能夠提高斷奶仔豬的生長性能，并降低斷奶后的仔豬腹瀉率。表6含蝦青素的發(fā)酵豆粕替代日糧中市售發(fā)酵豆粕對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響實(shí)施例13富含蝦青素的發(fā)酵豆粕在規(guī)模豬場母豬飼料中的應(yīng)用飼料配制：飼料配制參照nrc(2012)和中國瘦肉型哺乳母豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)，試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平見表7。飼料為規(guī)模豬場自配料，將玉米、豆粕、麩皮、魚粉用3mm的篩片粉碎后，加入配料倉，然后按比例加入富含蝦青素的發(fā)酵豆粕半成品、預(yù)混料和大豆油，混合均勻后即可飼喂。表7試驗(yàn)日糧及營養(yǎng)水平注：4％復(fù)合預(yù)混合混料為每kg全價(jià)飼料提供cu≥5g，fe≥130mg，zn≥5g，mn≥1.8g，se≥15g，i≥20mg，鈷≥25mg，鈣≥160-270g，鐵≥4.6g，磷≥38g，水分≤10％。維生素a(kiu)≥253，維生素d3(kiu)≥47，維生素e(iu)≥662，維生素k≥53mg，維生素b1≥58mg，維生素b2≥75mg，維生素b6≥67mg，維生素b12≥0.8mg，葉酸≥27mg，生物素≥1.1mg，煙酸≥975mg，泛酸鈣≥750mg，氯化膽堿≥5g。試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理：試驗(yàn)地點(diǎn)在北京市順義區(qū)某種豬養(yǎng)殖場進(jìn)行，選取品種相同、年齡、體況和預(yù)產(chǎn)期接近七天內(nèi)的妊娠期110天左右的母豬48頭，隨機(jī)分為4組，每組12頭母豬，每頭母豬為1個(gè)重復(fù)。分別為對照組(基礎(chǔ)日糧)、實(shí)施例8發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組、實(shí)施例9發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組、實(shí)施例10發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組。試驗(yàn)從母豬產(chǎn)前7天轉(zhuǎn)至徹底消毒的分娩舍開始直至仔豬斷奶，飼養(yǎng)于全漏縫式的限位欄中單圈飼養(yǎng)，舍內(nèi)清潔干燥、通風(fēng)性良好、溫度適宜25-28℃。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)管理和免疫程序均按規(guī)?；i場統(tǒng)一要求執(zhí)行。從轉(zhuǎn)分娩舍至分娩，母豬根據(jù)體況每天限飼在2.0-2.5kg。母豬分娩當(dāng)天不喂料，分娩后第1天和第2天每日喂料1-2kg，以后每天增加1.0kg，第6天自由采食(以吃飽后料槽中略有剩料為準(zhǔn))，每天觀察試驗(yàn)豬的精神、食欲狀況，記錄母豬有無便秘現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)病豬及時(shí)隔離治療。母豬在仔豬斷奶(21天)后轉(zhuǎn)至配種舍檢測指標(biāo)與測定方法：記錄分娩前及泌乳期母豬采食量，計(jì)算平均日采食量,記錄產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、木乃伊數(shù)、死胎數(shù)、分娩持續(xù)時(shí)間(產(chǎn)程)、初生窩重，計(jì)算初生仔豬成活率(初生活仔數(shù)/窩產(chǎn)仔數(shù))、初生個(gè)體均重。根據(jù)母豬產(chǎn)活仔數(shù)和產(chǎn)乳情況組內(nèi)調(diào)整母豬帶仔數(shù)在10頭左右，記錄每頭母豬的帶仔數(shù)、仔豬斷奶頭數(shù)、斷奶窩重，計(jì)算哺乳仔豬平均日增重、斷奶個(gè)體均重、斷奶成活率(窩試驗(yàn)期間，為了觀測斷奶仔豬腹瀉的嚴(yán)重程度，每天記錄糞便指數(shù)，指數(shù)4、5則認(rèn)定為腹瀉。腹瀉系數(shù)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)參照表4。母豬分娩后第20天(理論上泌乳高峰期)，每處理隨機(jī)選取四頭豬分別從前、中、后3個(gè)部位的乳頭采集乳樣，每頭豬采集20m1左右，-20℃保存。用快速乳成分分析儀(milkyway-cp2)測定指標(biāo)：乳蛋白、乳脂肪、乳糖。統(tǒng)計(jì)方法：試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用sas9.0軟件包中的平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)anova過程進(jìn)行方差分析，采用duncan法進(jìn)行均值的多重比較。試驗(yàn)結(jié)果：發(fā)酵豆粕替代哺乳日糧中豆粕對母豬和哺乳仔豬生長性能的影響見表8。各組母豬窩均產(chǎn)健仔數(shù)、初生個(gè)體均重均無顯著差異。使用發(fā)酵豆粕后母豬的日均采食量顯著升高(p<0.05)，但各實(shí)施例間無顯著差異。添加發(fā)酵豆粕后母豬的斷配間隔有縮短的趨勢，但與對照組無顯著差異。使用發(fā)酵豆粕后哺乳仔豬的平均日增重較對照組明顯提高(p<0.05)，腹瀉率顯著下降(p<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加富含蝦青素的發(fā)酵豆粕替代日糧中能夠提高母豬的采食量，并提高哺乳仔豬的平均日增重，減少哺乳仔豬腹瀉的發(fā)生。表8發(fā)酵豆粕替代日糧中豆粕對母豬和哺乳仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響富含蝦青素的發(fā)酵豆粕替代哺乳日糧中豆粕對哺乳母豬乳成分均有不同程度提高。其中乳蛋白和乳脂肪的含量較對照組顯著提高(p<0.05)。發(fā)酵豆粕組的乳糖水平較對照組均呈上升的趨勢。富含蝦青素的發(fā)酵豆粕能夠提高泌乳期母豬奶水中乳蛋白和乳脂肪的水平。表9泌乳期母豬母乳生化指標(biāo)的測定以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>北京偉農(nóng)生物科技有限公司<120>一種富含蝦青素的發(fā)酵豆粕的制備與飼料<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>620<212>dna<213>膠紅酵母（rhodotorulamucilaginosa）<400>1cttccgtagggtgaacctgcggaaggatcattagtgaatataggacgtccaacttaactt60ggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatttgtttgggatagtaactctcgcaag120agggcgaactcctattcacttataaacacaaagtctatgaatgtattaaattttataaca180aaataaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaat240gcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgc300gctccatggtattccgtggagcatgcctgtttgagtgtcatgaatacttcaaccctcctc360tttcttaatgattgaagaggtgtttggtttctgagcgctgctggcctttagggtctagct420cgttcgtaatgcattagcatccgcaatcgaacttcggattgacttggcgtaatagactat480tcgctgaggaattctagtcttcggactagagccgggttgggttaaaggaagcttctaatc540agaatgtctacattttaagattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaag600catatcaataagcggaggaa620當(dāng)前第1頁12