本發(fā)明屬于飼料添加劑技術領域，具體涉及一種半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑的制備方法。
背景技術：
微生態(tài)制劑，是指運用微生態(tài)學原理，利用對宿主有益無害的益生菌或益生菌的促生長物質(zhì)，經(jīng)特殊工藝制成的制劑，其活性物質(zhì)包括活菌體、死菌體及其代謝產(chǎn)物。微生態(tài)制劑經(jīng)口或者其他黏膜途徑投放，旨在改善黏膜表面微生物或酶的動態(tài)平衡，或用于刺激特異性或非特異性免疫機制。目前，微生物添加劑己被應用于飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等各領域中。
芽孢桿菌屬于好氧菌或兼性厭氧菌，在一定極端條件下會產(chǎn)生芽孢，從而具有耐高溫、耐酸堿等特性；同時，一般芽孢桿菌制劑能夠發(fā)揮生物奪氧作用，以維持胃腸道厭氧環(huán)境，并且通常能夠和乳酸菌等厭氧菌混合使用，改善胃腸道環(huán)境；且芽孢桿菌在作用過程中可產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多種酶類及氨基酸、維生素和促生長物質(zhì)，促進水產(chǎn)生物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；并能夠與致病菌發(fā)生拮抗作用，從而抑制致病菌的生長；能夠促進淋巴細胞增殖及免疫球蛋白分泌，改善動物機體的免疫功能。
半滑舌鰨是海水養(yǎng)殖物，對水體環(huán)境的要求很高，幼苗的存活率低，個體的生長緩慢，且容易感染有害致病菌，產(chǎn)生疾病。目前半滑舌鰨的養(yǎng)殖多采取喂藥養(yǎng)殖，即使用抗生素來抑制有害病菌的生長。但是長期使用抗生素不僅對半滑舌鰨的養(yǎng)殖造成危害，而且濫用抗生素產(chǎn)生的耐藥菌對人類健康具有巨大的威脅。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑的制備方法。所得半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑既能提高半滑舌鰨幼苗存活率，又能促進半滑舌鰨個體的成長，在半滑舌鰨養(yǎng)殖方面具有良好市場前景。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
一種半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑的制備方法，包括以下步驟：
1）乳酸桿菌的擴大培養(yǎng)：將從試管斜面培養(yǎng)基中取出的乳酸桿菌單菌落接入到液體培養(yǎng)基中，然后置于揺床中，20℃、150-250r/min條件下培養(yǎng)3天；然后于對數(shù)期將所得乳酸桿菌培養(yǎng)液按1-3vol%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時間為24-48h；在所得發(fā)酵液中加入檸檬酸鈉0.5-0.8vol%、nacl2-6vol%和黃原膠1-5vol%，并調(diào)節(jié)ph至5-6，得乳酸桿菌液體制劑；
2）芽孢桿菌的擴大培養(yǎng)：將從固體培養(yǎng)基中取出的芽孢桿菌單菌落接入到液體培養(yǎng)基中，然后置于揺床中，15℃、150-250r/min條件下培養(yǎng)3天；然后于對數(shù)期將所得芽孢桿菌培養(yǎng)液按3-5vol%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為15℃，發(fā)酵時間為24-48h，得芽孢桿菌液體制劑；
3）復配：將步驟1）、2）所得乳酸桿菌液體制劑、芽孢桿菌液體制劑按體積比1-3:2（優(yōu)選1:2）混合，制得所述半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑。
步驟1）中所述液體培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml蒸餾水中含：酪蛋白胨8-12g、牛肉提取物10-12g、酵母提取物5-8g、葡萄糖5-6g、乙酸鈉5-6g、檸檬酸二銨2-4g、吐溫801-2g、磷酸氫二鉀2-4g、七水硫酸鎂0.2-0.6g、一水硫酸錳0.03-0.05g、碳酸鈣20-22g；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml蒸餾水中含：蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g。
步驟2）中所述液體培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml無菌水中含：蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g、檸檬酸鐵0.1-0.3g、氯化鈉18-20g、氯化鎂5-6g、氯化鈣1.5-2.0g；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml蒸餾水中含：蛋白胨5-10g、酵母粉1-3g。
所述半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑的應用方法為，按飼料重量的1-3%稱取半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑，將其與飼料混合后潑灑進半滑舌鰨養(yǎng)殖池進行飼養(yǎng)。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所得半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑可直接投入養(yǎng)殖水體中，并可以降低水體中有害病菌的生長，幫助半滑舌鰨對營養(yǎng)物質(zhì)進行消化吸收，從而顯著提高半滑舌鰨的增重率以及幼苗的存活率，且該飼料添加劑穩(wěn)定性良好，可以長期儲存。
具體實施方式
為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
實施例1乳酸桿菌液體制劑的制備
用接種環(huán)在乳酸桿菌的固體培養(yǎng)基上進行劃線，然后置于搖床中，以20℃、150-250r/min的條件恒溫培養(yǎng)48h，獲得單菌落；挑取單菌落，接入裝有200ml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，然后置于搖床中，以20℃、150-250r/min的條件恒溫培養(yǎng)48h，獲取種子液；按照1vol%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，然后置于搖床中，以20℃、150-250r/min的條件恒溫培養(yǎng)48h，得乳酸桿菌發(fā)酵液，最后往發(fā)酵液內(nèi)加入檸檬酸鈉5vol%、nacl4vol%和黃原膠3vol%，并調(diào)節(jié)ph至5，獲得乳酸桿菌液體制劑。
所用液體培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml蒸餾水中含：酪蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸二銨2.0g、吐溫801.0g、磷酸氫二鉀2.0g、七水硫酸鎂0.2g、一水硫酸錳0.05g、碳酸鈣20.0g。
所用發(fā)酵培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml蒸餾水中含：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g。
實施例2芽孢桿菌最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
將從固體培養(yǎng)基中取出的芽孢桿菌單菌落接入到裝有200ml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，15℃、150-250r/min條件下培養(yǎng)3天；然后將所得芽孢桿菌菌種液從液體培養(yǎng)基中取出，按5vol%的接種量接入18個內(nèi)裝有200ml不同碳氮比的培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，置于揺床中，15℃、150-250r/min條件下培養(yǎng)72±3小時。將其稀釋之后用酶標儀測定發(fā)酵液的od值，繪制生長曲線，對比以確定最佳培養(yǎng)基配方。
實驗確定最佳的液體培養(yǎng)基配方為：每1000ml無菌水中含：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、檸檬酸鐵0.1g、氯化鈉19.45g、氯化鎂5.98g、氯化鈣1.8g。
所用發(fā)酵培養(yǎng)基的原料配方為：每1000ml蒸餾水中含：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g。
實施例3半滑舌鰨養(yǎng)殖用飼料添加劑的制備
將實施例1、2所得芽孢桿菌液體制劑、乳酸桿菌液體制劑按照4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4混合，然后撒入魚池之中，測定不同比例飼料添加劑對半滑舌鰨幼苗存活率的影響。
表1不同比例飼料添加劑對半滑舌鰨幼苗存活率的影響
實施例4溫度變化對飼料添加劑品質(zhì)的影響
將芽孢桿菌液體制、乳酸桿菌液體制劑劑按體積比2:1混合制得的飼料添加劑分別放置在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃恒溫水浴環(huán)境下，經(jīng)過3h處理，分別檢測飼料添加劑中芽孢桿菌含量及乳酸桿菌含量，確定菌種變化量，其結果見表2。
表2溫度對飼料添加劑品質(zhì)的影響
由表2可見，飼料添加劑中的芽孢桿菌和乳酸桿菌具有良好的穩(wěn)定性，溫度變化對其影響較小。
實施例5飼料添加劑穩(wěn)定性試驗
將芽孢桿菌液體制劑、乳酸桿菌液體制劑按體積比2:1混合制得的飼料添加劑在4℃冰箱中避光保存0個月、1個月、2個月、3個月后，分別檢測其中芽孢桿菌含量及低溫乳酸菌含量，其結果見表3。
表3穩(wěn)定性試驗
由表3可見，經(jīng)3個月的存放，飼料添加劑中的芽孢桿菌和乳酸桿菌含量仍較高。
實施例6飼料添加劑用于半滑舌鰨的養(yǎng)殖實驗
將芽孢桿菌液體制劑、乳酸桿菌液體制劑按體積比2:1混合制得的飼料添加劑與半滑舌鰨飼料混合，加水潤濕后進行投料。選擇無外傷，體質(zhì)健壯，規(guī)格均一，攝食、游動能力強的個體進行喂養(yǎng)。
具體喂養(yǎng)方式為：分別在上午08:30-09:30和下午14:00-15:00，分兩次進行喂食，每天喂食時間共2小時；估算半滑舌鰨幼魚的采食量；溫度控制在19±3℃，鹽度千分之28-30、ph7.4-7.9，溶解氧保持在5mg/l以上；及時將病魚、死魚撈出；為期60天。記錄魚體存活率、初重、終重、初始體長、最終體長，并以單純飼料喂養(yǎng)為對照，以探究該飼料添加劑對半滑舌鰨幼魚增重、增長和成活率的影響。
表4半滑舌鰨水箱養(yǎng)殖試驗
由表4可見，將本發(fā)明所制備的半滑舌鰨飼料添加劑應用于半滑舌鰨的養(yǎng)殖，可以明顯增加魚體的重量和體長，其平均增重198g，比正常飼料喂養(yǎng)的對照組多26g，平均增長12cm，比正常飼料喂養(yǎng)的對照組多2cm；同時，其可以提高養(yǎng)殖存活率，使存活率提高22%。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。