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一種影響嘌呤代謝的酵母果糖組合物的制作方法

文檔序號:11077962閱讀:752來源:國知局
一種影響嘌呤代謝的酵母果糖組合物的制造方法與工藝

本發(fā)明屬于藥物配制技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種能夠影響嘌呤代謝的酵母果糖組合物;其有效成份包括酵母膏和D-果糖,將有效成份按質(zhì)量配比混合后采用常規(guī)工藝配制成顆粒或溶液。



背景技術(shù):

血清尿酸是人類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,其異常升高可引起高尿酸血癥的發(fā)生。高尿酸血癥是痛風(fēng)的致病基礎(chǔ),據(jù)報道,18.8%的高尿酸血癥患者在5年的隨訪期間內(nèi)患上了痛風(fēng)。近年來,有流行病學(xué)研究表明高尿酸血癥與痛風(fēng)的患病率有越來越高的趨勢,兩種疾病都成為了亟待解決的公共衛(wèi)生問題。由于經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,中國人的生活方式發(fā)生了很大的變化,以碳水化合物和蔬菜為基本的傳統(tǒng)飲食方式也為之改變,肉類、乳類等其它富含嘌呤的食物的攝入量逐年升高,這與高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生是密切相關(guān)的。一些研究還表明,高尿酸血癥與多種疾病有關(guān),包括糖尿病、高血壓、中風(fēng)、血脂異常、慢性腎臟病、心血管疾病和心力衰竭等,痛風(fēng)也是目前非常嚴(yán)重的健康問題之一,是心臟衰竭和代謝綜合征的一個獨(dú)立危險因素。

有流行病學(xué)調(diào)查顯示,人類的果糖的攝入量正逐年增長,果糖消費(fèi)量的增長與人群血尿酸平均水平的升高存在一定的關(guān)聯(lián)性。另外,高果糖飲食與高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、腹型肥胖等代謝性疾病的發(fā)生均存在一定關(guān)系。果糖經(jīng)人體攝入后在果糖激酶的催化下快速磷酸化進(jìn)入細(xì)胞,而此過程無負(fù)反饋機(jī)制,因此可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)耗竭產(chǎn)生大量腺嘌呤核苷酸(AMP),AMP進(jìn)一步脫磷酸分解為次黃嘌呤核苷酸(IMP)或腺苷,經(jīng)核苷酶催化下產(chǎn)生次黃嘌呤,可在黃嘌呤氧化酶(XOD)的催化下最后分解為尿酸。此外,果糖大量磷酸化導(dǎo)致磷酸匱乏,加速了AMP去磷酸分解的一系列步驟。有研究表明10%果糖水可使大鼠血尿酸水平升高,但是形成的高尿酸水平極不穩(wěn)定??紤]到采用單一藥物干預(yù)嘌呤代謝的方法因其作用機(jī)制單一,往往不能取得很好的效果,故本申請擬采用含嘌呤較高的酵母飼料與果糖飲水結(jié)合的方式影響機(jī)體嘌呤代謝,可采用此組合物建立高尿酸形成穩(wěn)定的動物模型,為開展尿酸代謝、干預(yù)效果及其機(jī)制研究提供良好的技術(shù)支持。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn),尋求制備一種影響嘌呤代謝的酵母果糖組合物,繼而用其建立高尿酸形成穩(wěn)定的動物模型,用于開展尿酸代謝、干預(yù)效果的機(jī)制探討。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明涉及的組合物包含質(zhì)量百分比為20%的高酵母飼料和質(zhì)量百分比濃度為10%的果糖水溶液;其中,高酵母飼料為大鼠用市售顆粒飼料粉碎后,再在其中均勻加入質(zhì)量百分比為20%的酵母膏,最后再重新制作成原來形狀和尺寸的顆粒;涉及的果糖水溶液為將D-果糖溶于純凈水中,配置成質(zhì)量百分比濃度為10%的果糖水溶液;其中,所涉及的大鼠用市售顆粒飼料中包含:粗蛋白為20.50%,粗脂肪為4.62%,粗纖維為4.35%,粗灰分為6.2%,鈣為1.23%,磷為0.91%,均為質(zhì)量百分比,能量為345kcal/kg;所涉及的果糖、酵母膏均采用市售產(chǎn)品;將高酵母飼料與果糖水溶液作為套餐式組合物用于組合喂養(yǎng)動物。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,采用喂養(yǎng)與飲水結(jié)合的方法干預(yù)動物,操作易于掌握,避免長期灌胃或注射造成動物損傷;其組合物配方科學(xué),配制工藝簡單,有效成份均勻,成份搭配合理,使用效果好,喂養(yǎng)方便。

附圖說明:

圖1為本發(fā)明涉及的空白對照組C、酵母對照組Y、酵母氧嗪酸鉀組YO和酵母果糖組YF的血清中XOD活性和ADA活性以及10%肝勻漿中XOD活性和ADA活性。

圖2為本發(fā)明涉及的空白對照組a、酵母對照組b、酵母氧嗪酸鉀組c和酵母果糖組d光鏡下腎臟結(jié)構(gòu)。

圖3為本發(fā)明涉及的空白對照組C、酵母對照組Y、酵母氧嗪酸鉀組YO和酵母果糖組YF的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平。

具體實(shí)施方式:

下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1:

本實(shí)施例涉及的組合物為質(zhì)量百分比為20%的高酵母飼料配合質(zhì)量百分比濃度為10%果糖水溶液,搭配成套餐式組合物,用于動物模型的培養(yǎng)。

本實(shí)施例涉及的質(zhì)量百分比為20%的高酵母飼料,其制作方法為:將購買的大鼠用市售的普通顆粒飼料粉碎成粒徑為0.1~1mm的粉末,然后在其中均勻加入重量百分比為20%的酵母膏,再將飼料重新制作成直徑為2~6mm的球狀顆粒;涉及的質(zhì)量百分比濃度為10%的果糖水溶液,為將D-果糖溶解于自來水中,配置成的果糖水溶液。

本實(shí)施例涉及的大鼠用普通顆粒飼料其配方為:粗蛋白為20.50%,粗脂肪為4.62%,粗纖維為4.35%,粗灰分為6.2%,鈣為1.23%,磷為0.91%,能量為345kcal/kg;其中的果糖和酵母膏均采用市售產(chǎn)品。

本實(shí)施例涉及的酵母膏中含有蛋白質(zhì)、核苷酸和B族維生素;在體內(nèi)充分水解為含氮的有機(jī)堿,包括嘌呤堿、嘧啶堿類和磷酸,增加尿酸生成的前體物質(zhì),使尿酸生成增加,從而升高機(jī)體血尿酸水平。

實(shí)施例2:本實(shí)施例為具體構(gòu)建高尿酸血癥動物模型的步驟包括:

(1)動物試樣選?。哼x取8周齡雄性清潔級Wistar大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,飼于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級動物飼養(yǎng)室,實(shí)驗(yàn)開始前用普通大鼠顆粒飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠體表特征,行為活動是否有異常變化,對異常大鼠進(jìn)行隔離,最終選出經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)后體表特征和行為活動均無異常的Wistar大鼠40只;適應(yīng)性喂養(yǎng)的環(huán)境為:溫度:20~24℃,相對濕度:50%~70%,光照節(jié)律:12D:12L,工作照度:150~300lx,氣流、風(fēng)速0.1~0.2m/s,噪聲≤60dB;所述適應(yīng)性喂養(yǎng)的飼料為普通大鼠顆粒飼料,其配方中粗蛋白含量為20.50%,粗脂肪含量為4.62%,粗纖維含量為4.35%,粗灰分含量為6.2%,鈣含量為1.23%,磷含量為0.91%,能量為345kcal/kg。

(2)高尿酸血癥模型構(gòu)建:采用隨機(jī)數(shù)字表法將選出的40只雄性Wistar大鼠按體質(zhì)量分組,分別是空白對照、酵母對照、酵母氧嗪酸鉀和酵母果糖4組,每組10只,空白對照組給予普通大鼠顆粒飼料喂養(yǎng),其他三組給予實(shí)施例1的酵母飼料喂養(yǎng);酵母果糖組大鼠給予質(zhì)量濃度10%果糖飲水,其他三組給予自來水飲水;高酵母氧嗪酸鉀組予以0.5g/(kg·d)氧嗪酸鉀灌胃,其他三組予以蒸餾水灌胃,灌胃體積均為10ml/(kg·d);所有大鼠均自由飲水和進(jìn)食。

(3)材料與設(shè)備:

氧嗪酸鉀(CAS:2207-75-2)購于上海麥克林生化科技有限公司;酵母膏的嘌呤含量為1.2%,貨號:01-014,購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;D-果糖(CAS:57-48-7),購于北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司;尿酸、肌酐、尿素氮測定試劑盒,購于中生北控生物科技有限公司;黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶測定試劑盒,購于南京建成試劑公司;一抗(兔抗):RST、GLUT9、OATl、GAPDH、二抗抗體(羊抗兔),購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;CX4全自動生化分析儀購于貝克曼庫爾特公司;這些大鼠試樣和材料設(shè)備為模型建立所需。

實(shí)施例3:

本實(shí)施例采用實(shí)施例2的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn):在實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行2、4、6和8W后的早晨8點(diǎn),大鼠禁食12h后剪尾取血1.0~1.5ml,室溫靜置凝血,3000r/min離心5min,取300μl血清,用全自動生化分析儀測定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr);結(jié)果如表1顯示,在實(shí)驗(yàn)2w后,酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組血SUA水平分別達(dá)到262.66、267.44和345.91μmol/L;與空白對照組相比均顯著性上升(P<0.05),分別升高26.49%、28.79%和66.58%;而且酵母果糖組SUA水平比酵母對照組和酵母氧嗪酸鉀組大鼠血尿酸水平分別增加83.25和78.47μmol/L(P值均<0.05);在實(shí)驗(yàn)4w后,酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組與空白對照組相比SUA水平顯著升高(p<0.05),分別升高88.38、164.02和101.88μmol/L;在實(shí)驗(yàn)6w后,酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組,與空白對照組相比,SUA水平顯著升高(P<0.05);酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組三組之間SUA水平無顯著差異;在實(shí)驗(yàn)8w后,酵母對照組SUA水平下降至322.21μmol/L,與空白對照組(265.77μmol/L)相比已無顯著性差異(P>0.05),酵母氧嗪酸鉀組(465.25μmol/L)和酵母果糖組(451.41μmol/L)與空白對照組相比,SUA水平仍然顯著升高(P<0.05);其中表2結(jié)果顯示,在實(shí)驗(yàn)分別滿2、4、6和8W時,酵母果糖組BUN水平降至6.01、4.62、4.71、3.65mmol/L,與空白對照組相比BUN水平均顯著降低(p<0.05),分別下降27.32%、37.48%、35.12%、50.14%,因此在實(shí)驗(yàn)第2w末到第8w末,酵母果糖組的BUN表現(xiàn)為下降趨勢,大鼠體內(nèi)BUN濃度逐漸降低;在實(shí)驗(yàn)第4w末,酵母氧嗪酸鉀組BUN水平與酵母對照組相比顯著降低(p<0.05);表3結(jié)果顯示所示,除第6w末酵母對照組與空白對照組相比,SCr水平顯著降低(p<0.05),其他各時間段各組SCr水平無顯著差異;BUN是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物,BUN水平的高低可反映腎臟功能,當(dāng)BUN水平升高時可提示腎功能損壞、腎小球?yàn)V過率較低,但腎臟具有較強(qiáng)代償能力,當(dāng)腎臟損傷較輕時,BUN水平可不表現(xiàn)為升高;當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降至50%以下時,BUN水平才能升高,同時可伴隨SCr水平升高,本實(shí)施例中各組大鼠均未出現(xiàn)BUN與SCr水平升高現(xiàn)象,說明并未出現(xiàn)腎臟功能的嚴(yán)重?fù)p害;

綜合結(jié)論:酵母聯(lián)合果糖干預(yù)能使大鼠SUA水平長期穩(wěn)定維持在一個較高的水平上,在第2、4、6、8周末分別達(dá)到345.91、403.71、447.21、451.41μmol/L,與空白對照組相比分別升高了66.5%、33.8%、37.5%和69.8%;

表1:各組大鼠血清尿酸水平(x±S,μmol/L)

注:a:與空白對照組相比,p<0.05,b:與酵母對照組相比,p<0.05,c:與酵母氧嗪酸鉀組相比,p<0.05;

表2:各組大鼠血清尿素氮水平(x±S,mmol/L)

注:a:與空白對照組相比,p<0.05,b:與酵母對照組相比,p<0.05,c:與酵母氧嗪酸鉀組相比,p<0.05;

表3:各組大鼠血清肌酐水平(x±S,mmol/L)

注:a:與空白對照組相比,p<0.05。

實(shí)施例4:

本實(shí)施例采用實(shí)施例2的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn):在動物實(shí)驗(yàn)第8w末,大鼠禁食12h后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,室溫靜置凝血,3000r/min離心10min,取100μl血清測定黃嘌呤氧化酶(XOD)活性,取50μL血清,測定腺苷脫氨酶(ADA)活性;然后摘取各組大鼠肝臟,取1g肝臟組織與9ml生理鹽水用組織搗碎機(jī)10000~15000r/min上下研磨制成10%肝勻漿,取100μl 10%肝勻漿測定XOD活性,取50μl 10%肝均漿測定ADA活性;結(jié)果如附圖1所示,酵母果糖組與空白對照組相比,血清中XOD活性和ADA活性(圖1(a))均顯著上升(P<0.05),達(dá)到了46.30和26.83U/L,分別升高21.33%和37.30%;10%肝勻漿中XOD活性和ADA活性(圖1(b))均顯著上升(P<0.05),達(dá)到了10.44和15.31U/L,分別升高36.11%和38.05%;酵母氧嗪酸鉀組與空白對照組相比,血清中XOD活性升高21.75%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);10%肝勻漿中ADA活性和XOD活性均顯著升高(P<0.05);綜合結(jié)論:酵母聯(lián)合果糖干預(yù)能使大鼠SUA水平升高,其機(jī)制可能與大鼠體內(nèi)XOD與ADA被激活有關(guān)。

實(shí)施例5:

本實(shí)施例采用實(shí)施例2的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn):在動物實(shí)驗(yàn)第8w末,大鼠禁食12h后,處死大鼠,摘取各組大鼠右側(cè)腎臟,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋后制成3μl厚切片,HE染色,光鏡(×400)下觀察腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu);結(jié)果如附圖2所示,空白對照組與酵母對照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常,腎皮質(zhì)中腎小球分布均勻,大小正常,腎小管無腫脹變性;酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟偶見間質(zhì)片灶狀單核淋巴細(xì)胞浸潤1,無明顯纖維化;酵母果糖組大鼠腎小管管腔間質(zhì)偶見結(jié)晶物沉積2,無明顯纖維化;綜合結(jié)論:酵母果糖組大鼠腎小管偶見結(jié)晶物沉積,病理損傷較輕,符合高尿酸血癥大鼠腎臟病理損傷機(jī)制。

實(shí)施例6:

本實(shí)施例采用實(shí)施例2的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn):在實(shí)驗(yàn)第54日時,用代謝籠法收集各組大鼠24h尿液,并測量尿液體積,于離心機(jī)中3000r/min離心10min,取上清液測定尿液尿酸(UUA)、尿液肌酐(UCr),計算尿酸清除率(CUA)和肌酐清除率(CCR),CUA計算公式為:UUA/SUA×每分鐘尿量(ml/min),CCR計算公式為:UCr/SCr×每分鐘尿量(ml/min);在動物實(shí)驗(yàn)第8w末,大鼠禁食12h后,處死大鼠,摘取各組大鼠左側(cè)腎臟,提取大鼠腎組織中腎臟皮質(zhì)刷狀緣膜(BBMV)蛋白及腎臟皮層蛋白,采用考馬斯亮藍(lán)法測定BBMV和腎皮質(zhì)上清中的蛋白含量,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品;將蛋白統(tǒng)一稀釋后,沸水浴煮5min,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,濕轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜,配置5%脫脂奶于室溫封閉1h,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1~2h,化學(xué)發(fā)光劑X光片上曝光,底片經(jīng)掃描儀透掃后轉(zhuǎn)化為圖片,用Quantity one軟件定量分析,確定雜交條帶的相對吸光度值;結(jié)果顯示(表4),酵母果糖組大鼠24h尿量與空白對照組相比明顯升高(P<0.05),酵母果糖組與酵母氧嗪酸鉀組大鼠CUA與空白對照組相比明顯降低(P均<0.05),各組大鼠CCR值無顯著性變化;Western Blotting的結(jié)果表明(圖3):與空白對照組相比,酵母果糖組與酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟皮質(zhì)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子1(OAT1)蛋白表達(dá)顯著降低(P均<0.05);酵母果糖組大鼠腎臟BBMV中腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(RST)蛋白表達(dá)與空白對照組相比顯著升高(P<0.05),同時,酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟RST蛋白表達(dá)與空白對照組相比有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義;與空白對照組相比,酵母果糖組與酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟BBWV中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(GLUT9)蛋白有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義;綜合結(jié)論:本實(shí)施例中酵母果糖組大鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)紊亂,這是酵母果糖組大鼠血尿酸升高的重要原因;

表4:各組大鼠尿酸清除率與肌酐清除率情況(x±S)

注:a:與空白對照組相比,p<0.05,b:與酵母對照組相比,p<0.05。

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