本發(fā)明屬于抗菌劑及食品添加劑領域，具體涉及一種SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的制備及應用。

背景技術：

青蒿，別名黃花蒿(Artemisia annua L.)，為菊科春黃菊族蒿屬植物；青蒿素是中國科研人員于1972年從植物黃花蒿莖葉中提取的有過氧基團的倍半萜內酯藥物，是一種能夠治療瘧疾的有效成分；青蒿素具有抗瘧疾、免疫調節(jié)、抗腫瘤和抗菌等多種藥理作用；但是由于青蒿素具有水不溶性，會使它的抗菌活性在實際應用中大打折扣，本研究著重解決青蒿素的水溶解性問題，提高其水分散性，進而提高其抗菌活性，增加其生物利用度。

目前，國內已經有許多關于青蒿素的專利申請。中國專利CN101293889A公開了一種水溶性青蒿素衍生物及其制備方法，具有良好的水溶性，易于制劑，且對正常細胞無毒副作用，具有成藥前景；中國專利CN102727440A提出了一種青蒿素超細粉體及其制備方法該青蒿素超細粉體顆粒為類球形、水分散性良好且粒度分布窄，生物利用度高；中國專利CN102755316A公開了一種青蒿素及其衍生物在制備治療丙型肝炎病毒藥物中的應用，屬于醫(yī)藥領域；中國專利CN103948585A公開了一種青蒿素及其衍生物在制備防治神經性疾病藥物中的應用，為神經性疾病的治療和預防帶來了新的研究方向；中國專利CN104906084A公開了一種青蒿素及其衍生物在制備防治眼科血管性疾病藥物中的應用及藥物組合物，屬于醫(yī)藥方面的應用。

納米SiO₂為白色粉末狀，比表面積大，具有較好吸附性，廣泛用作食品、抗菌材料及醫(yī)藥等領域。在抗菌材料領域，利用納米SiO₂龐大的比表面積、表面多介孔結構、生理惰性和超強的吸附能力，結合抗菌活性成分，開發(fā)出高效、持久、廣譜抗菌的納米抗菌劑，可廣泛用于食品行業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生等領域中。在食品行業(yè)中，添加納米SiO₂的食品包裝袋，對水果蔬菜可起到保鮮作用；納米SiO₂應用于酒類生產中可起到凈化和延長保鮮期的作用；食品級納米SiO₂添加于顆粒、粉末狀食品中，能夠保持食品粉粒處于松散或最佳自由流動狀態(tài)，起到抗結塊作用。在醫(yī)藥方面，采用納米SiO₂為載體能起到很好的藥物緩釋效果。

目前，國內已有許多關于納米SiO2方面的專利申請。中國專利CN105169398A公開了一種基于介孔氧化硅納米粒子的控釋系統(tǒng)及其制備方法；中國專利CN104785214A提出了一種制備殼聚糖包覆磁性介孔二氧化硅核-殼結構納米粒子的方法，發(fā)明的產物對亞甲基藍具有優(yōu)異的吸附效果；中國專利CN104262852A公開了使用二氧化硅納米粒子改性聚氯乙烯塑料粒子，大大擴展聚氯乙烯管材方面的應用領域；中國專利CN102424961A公開了一種二氧化硅納米粒子分散于溶膠體系的溶膠凝膠涂層及其制備方法；中國專利CN102652735A發(fā)明了一種載有難溶性藥物的多孔二氧化硅納米粒子及其制備方法和應用，屬于生物醫(yī)藥領域。

等離子體是指高度電離的氣體，氣體在受到外界高能量(高溫、強電磁場、輻射等)作用時電離產生的由大量帶電粒子(離子、電子)和中性粒子(原子、分子)所組成的表現(xiàn)為電荷中性的體系。等離子體反應溫度低，速度快且環(huán)保。低溫等離子體中絕大部分粒子的能量均略高于聚合物中的化學鍵能，通過電場加速后低溫等離子體完全有足夠的能量引起聚合物表面的各種化學鍵發(fā)生斷裂或重新組合，因而會對分子材料表面進行改性。例如利用等離子體技術處理一些可食用膜，可以改變膜的表面粗糙度，提高膜的表面親水性；再如等離子體處理低密度聚乙烯(LDPE)，會提高乳鏈菌肽(Nisin)的吸附量，對食品達到抗菌保鮮效果。

基于納米SiO₂的生理惰性和高度吸附性，可以解決由于青蒿素的水不溶性而導致的在實際應用中存在的抗菌效果差以及功效期短的問題；通過納米SiO₂吸附青蒿素，制成抗菌納米粒子，并且具有一定的緩釋效果；再結合等離子體協(xié)助處理，可以提高其表面親水性，進一步提高青蒿素在水中的溶解性，從而提高青蒿素的利用率，達到高效利用與長效抗菌的目的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一米SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的制備及應用；使用納米SiO₂吸附青蒿素，制成抗菌納米粒子，再結合等離子體協(xié)助處理，可以提高青蒿素在水中的溶解性，且具備一定的緩釋效果，從而提高青蒿素的生物利用度，達到高效利用與長效抗菌的目的。

本發(fā)明以正硅酸乙酯(TEOS)、青蒿素晶體為原料，以無水乙醇和去離子水為共溶劑，氨水(25％，wt％)作為催化劑，制備納米SiO₂/青蒿素抗菌納米離子，再結合等離子體協(xié)助處理，可以使青蒿素溶解性大大提高。

本發(fā)明的具體制備方法是：將無水乙醇、去離子水和氨水混合，加熱攪拌后，再逐滴加入TEOS，滴完后立即加入青蒿素晶體，維持溫度繼續(xù)加熱攪拌；完成后真空干燥使溶劑蒸發(fā)；將得到的粉末收集、研磨、洗滌、干燥、研磨；最后采用等離子體協(xié)助處理，即可制成SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子。

所述無水乙醇、去離子水和氨水的體積比為：20：5：1。

所述加熱攪拌是指采用加熱式磁力攪拌器，300rmp的攪拌速率下，60℃攪拌20min。

所述TEOS與氨水的體積比為1：1。

所述正硅酸乙酯(TEOS)的加入采取逐滴滴加法，并且滴加速度為2.0mL/2min。

所述青蒿素晶體與去離子水的質量比為5:1。

所述維持溫度繼續(xù)加熱攪拌指采用加熱式磁力攪拌器，300rmp的攪拌速率下，60℃攪拌60min。

所述真空干燥使溶劑蒸發(fā)指：放于60℃的烘箱中，真空干燥48h，使溶劑蒸發(fā)。

所述粉末的洗滌要使用無水乙醇洗滌1次，去離子水洗滌2次，再用無水乙醇洗滌1次；第一步無水乙醇洗滌是為了去除殘存的TEOS，第二步無水乙醇洗滌是為了去除沉淀中的水分，使溶液表面張力降低，減輕粉末在干燥過程中的聚集。

所述等離子體協(xié)助處理條件為：功率800W，時間2min。

本發(fā)明想法新穎，產品結構特殊，充分發(fā)揮了各組分的優(yōu)越性，將各組分的優(yōu)點的疊加，制備出了一種高穩(wěn)定性、高抗菌性的SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子。

附圖說明

圖1納米SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子對大腸桿菌的抗菌效果。

圖2納米SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子對金黃色葡萄球菌的抗菌效果。

圖3納米SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子在牛肉中的實際應用(大腸桿菌)。

圖4納米SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子在牛肉中的實際應用(金黃色葡萄球菌)。

具體實施方式

通過下面實例說明本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護內容，不僅局限于此。

實施例1 SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的溶解度

1實驗材料

2實驗方法

①將40.0mL無水乙醇、10.0mL去離子水和2.0mL氨水加入反應瓶中，放于加熱式磁力攪拌器上加熱攪拌20min(60℃，300rmp)，再逐滴加入2.0mL TEOS(保證在2min之內全部滴加完)，滴完后立即加入50mg青蒿素晶體，維持溫度在60℃，300rmp繼續(xù)攪拌60min。

②將反應瓶放于60℃的烘箱中48h，真空干燥，使溶劑蒸發(fā)；將制備好的粉末收集研磨、洗滌，進一步干燥、研磨、收集。

③最后采用等離子體協(xié)助處理，處理條件為：功率800W，時間2min，即可制成SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子。

④特別說明：制作過程中未添加青蒿素晶體的標記為空白SiO₂納米粒子。

3 SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子溶解度的測定

稱量一次制備(添加50mg青蒿素晶體的)干燥至恒重的SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子，記為W，于50mL燒杯中，再加入40.0mL蒸餾水，振蕩使樣品溶解，并移入50mL離心管中，加蓋離心(5000r/min，10min)，傾去上清液。再加入40mL蒸餾水，使樣品充分溶解，再移入離心管中，加蓋離心(5000r/min，10min)傾去上清液，用少量蒸餾水將沉淀洗入已知質量的蒸發(fā)皿中，置于100℃烘箱中干燥至恒重。對照組為：50mg青蒿素晶體加(W-50)mg空白SiO₂納米粒子，具體操作方式同上。溶解度計算公式如下：

其中，W為樣品的質量；W₁為蒸發(fā)皿的質量；W₂為干燥至恒重的蒸發(fā)皿與不溶物的總質量。

4 SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的溶解度

經過計算分析可知，SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子中青蒿素的溶解度大大提高，相比單純青蒿素大約提高了30％；而經過等離子體處理過的SiO₂/青蒿素納米粒子中青蒿素的溶解度更是提高到35％左右，因此，納米SiO₂的引入以及等離子體的協(xié)助處理，大大提高了青蒿素的水溶性以及生物利用度。

實施例2 SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的抗菌性能測定

1實驗材料

SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子-等離子體、SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子、青蒿素晶體菌種：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

2實驗方法

采用平板菌落計數(shù)法，以大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為模式菌種，測定SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的抗菌性能。

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種到液體培養(yǎng)基中，分別置于空氣搖床中在37℃、150rpm的條件下震蕩培養(yǎng)24～48h，獲得對數(shù)生長期的菌懸液。取適量處于生長對數(shù)期飽和的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別加入含有一定量無菌磷酸鹽緩沖液的試管中稀釋，使得細菌濃度約為10⁵～10⁶CFU/mL。

然后再向試管中加入4％的SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子(SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子-等離子體)，添加4％的青蒿素晶體的一組作空白對照，將各試管均置于空氣搖床中在37℃、150rpm的條件下震蕩反應24～48h。分別在24h和48h兩個時間點取適量培養(yǎng)液進行十倍梯度稀釋到合適的濃度，然后移取100μL稀釋液滴到無菌固體平板培養(yǎng)基上，涂布均勻之后放入37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。24～48h后進行平板菌落計數(shù)，從而對SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的抗菌活性進行評價。實驗重復三次，結果取平均值。

3 SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的抗菌性能評價

由于青蒿素晶體具有水不溶性，因此單純青蒿素晶體的抗菌性能不能充分發(fā)揮出來。由圖1、圖2清晰可知，納米SiO₂和等離子體的引入可以大大提高了青蒿素的水分散性，從而對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性。而且從時間上可以看出，納米SiO₂對青蒿素具有明顯的緩釋作用，從而保證青蒿素能夠發(fā)揮長效的抗菌活性以及更好的殺菌效果。

實施例3 SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子在牛肉中的實際應用

1實驗材料

SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子-等離子、SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子、青蒿素晶體菌種：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)牛肉(切成25×20×5mm大小)

2實驗方法

采用平板菌落計數(shù)法，以大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為模式菌種，測定SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的抗菌性能。

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種到液體培養(yǎng)基中，分別置于空氣搖床中在37℃、150rpm的條件下震蕩培養(yǎng)24～48h，獲得對數(shù)生長期的菌懸液。取適量處于生長對數(shù)期飽和的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別加入含有一定量無菌磷酸鹽緩沖液的試管中進行稀釋，使得細菌濃度約為10⁵～10⁶CFU/mL。

以大腸桿菌為例，將牛肉切成25×20×5mm大小，并進行紫外殺菌(或輻照殺菌)，正反兩面各處理1h。將處理過的牛肉試樣浸于事先稀釋成10⁵～10⁶CFU/mL的大腸桿菌菌懸液中30s。

隨后將牛肉試樣從菌液中取出，于無菌環(huán)境下晾干，放入含有4％的SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子的PBS液體的容器中，含有4％的青蒿素晶體的一組作空白對照。在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中各培養(yǎng)24～72h。分別在24h、48h和72h三個時間點取出牛肉試樣后于無菌環(huán)境下晾干，再轉移到無菌均質袋中，并向裝有牛肉試樣的無菌均質袋中加入9倍的無菌磷酸緩沖液(PBS)，均質。吸取上清液測定牛肉試樣中的細菌總數(shù)。測定方法按照GB4789.2—2010食品衛(wèi)生微生物學檢測菌落總數(shù)進行。從而可對SiO₂/青蒿素抗菌納米粒子在牛肉中的對大腸桿菌的抗菌活性進行評價。實驗重復三次，結果取平均值。

3 SiO2/青蒿素抗菌納米粒子在牛肉中的實際應用評價

由圖3、圖4分析可得，SiO2/青蒿素抗菌納米粒子對牛肉中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較好的抗菌活性。而且從時間上可以看出，納米SiO₂對青蒿素具有明顯的緩釋作用，從而保證青蒿素發(fā)揮長效的抗菌活性以及更好的殺菌效果。