可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)及其應(yīng)用。本發(fā)明利用Strep-tag多肽可與負(fù)載有Strep-Tactin蛋白的基質(zhì)相結(jié)合的特性，可在不同基質(zhì)表面連接多肽。將生物靶向分子進(jìn)行化學(xué)衍生形成生物分子-Strep-tag偶聯(lián)物，通過Strep-tag與Strep-Tactin的特異性識(shí)別作用將生物分子-Strep-tag偶聯(lián)物固定于基質(zhì)表面。加入生物素后，生物素與Strep-Tactin的競爭結(jié)合會(huì)破壞生物分子與基質(zhì)的連接，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的可逆捕獲和釋放。本發(fā)明制備及使用過程簡單、快速，并且重復(fù)性好，可廣泛用于腫瘤標(biāo)志物檢測、細(xì)胞捕獲和釋放等領(lǐng)域。
【專利說明】可逆組裝和分解的strep-tag多化標(biāo)記的生物分子衍生化 基質(zhì)及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物、化學(xué)及材料科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種可逆組裝和分解的Strep-tag 多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] Str巧-tag純化系統(tǒng)是基于Str巧-tag多膚和特殊設(shè)計(jì)的Str巧-Tactin (streptavidin的變體）之間高選擇性和極易控制的相互作用而建立起來的蛋白純化系 統(tǒng)，其技術(shù)開發(fā)的原理是生物素（biotin)和鏈霉親和素（str巧tavidin)之間的結(jié)合反 應(yīng)。Str巧-tag多膚包含Strep-tag I和Strep-tag II，它們對(duì)Strep-Tactin的結(jié)合親 和力比對(duì)streptavidin高。在親和純化過程中，附了 tag的蛋白質(zhì)結(jié)合在被固定了的 Strep-Tactin上。短暫的洗涂步驟之后，在同一緩沖液中加入特異性競爭劑生物素即可將 純化的重組蛋白溫和地洗脫下來。該系統(tǒng)具有簡單、易使用、可在生理?xiàng)l件下進(jìn)行競爭性洗 脫等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)混合物的分離純化及鑒定領(lǐng)域。但目前該一系統(tǒng)并未運(yùn) 用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲及釋放，限制了其應(yīng)用范圍。
[0004] 循環(huán)腫瘤細(xì)胞是進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，其檢測可有效地應(yīng)用于體外早期診斷及 個(gè)性化治療等。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的無損分離、捕獲和再培養(yǎng)可W為循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基因和蛋 白質(zhì)分析提供研究基礎(chǔ)。但由于腫瘤細(xì)胞具有數(shù)量稀少及異質(zhì)性等特點(diǎn)，因此需要發(fā)展能 高效分離腫瘤細(xì)胞的方法。
[0005] 目前，針對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲及釋放的方法有較多報(bào)道，但往往存在缺乏特異 性、探針制備過程繁瑣、操作過程復(fù)雜、捕獲及釋放過程對(duì)細(xì)胞有較大損傷等問題，關(guān)于循 環(huán)腫瘤細(xì)胞的無損分離及體外培養(yǎng)仍較少被報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種可逆組裝和分解的 Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)及其在細(xì)胞的捕獲及釋放中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種可逆組裝和分解的Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)為將Strep-tag多 膚標(biāo)記的生物分子固定在負(fù)載有Strep-化ctin蛋白的基質(zhì)上得到。
[0008] 所述的str巧-tag多膚包括strep-tag I (含九個(gè)氨基酸，其序列為Ala -hp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly)、Str巧-tag II (含八個(gè)氨基酸，其序列為 T;rp-Se;r-His-P;r〇-Gln-Phe-Glu-Lys)及其相關(guān)的衍生物和類似物。
[0009] 所述的生物分子包括抗體、鏈霉親和素、凝集素、生長因子、核酸適配體等可W對(duì) 細(xì)胞、蛋白、核酸、生物小分子進(jìn)行特異性識(shí)別和捕獲的蛋白或核酸。
[0010] 所述的str邱-tag多膚標(biāo)記的生物分子為偶聯(lián)strep-tag多膚的生物分子（生物 分子-Str巧-tag偶聯(lián)物）。
[0011] 當(dāng)生物分子為抗體時(shí)，Str巧-tag多膚標(biāo)記的抗體優(yōu)選通過包含如下步驟的方法 制備得到；通過高楓酸軸或高楓酸鐘將抗體化端的糖殘基氧化成酵基后與Strep-tag多膚 上的氨基反應(yīng)得到Strep-tag多膚標(biāo)記的抗體。
[0012] 當(dāng)生物分子為除抗體外的鏈霉親和素、凝集素、生長因子或核酸適配體等生物分 子時(shí)，所述的Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備得到；通 過1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（l-eth5d-3-(3-dimeth}daminop;ropyl )carbodiimide hy化ochloride,邸C ?肥1)、N-輕基玻巧醜亞胺（N-Hy化oxysuccinimide, N服）活化鏈霉親和素、凝集素、生長因子或核酸適配體等生物分子的駿基，再與Strep-tag 多膚的氨基連接得到Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子。
[0013] 所述的負(fù)載有Strep-化ctin蛋白的基質(zhì)為商品化負(fù)載有Strep-化ctin的磁珠或 商品化含Strep-化ctin的樹脂球、孔板等，也可將Strep-化ctin蛋白修飾于任一種基質(zhì) 上。
[0014] 當(dāng)可逆組裝和分解的Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)中的生物分子 為鏈酶親和素時(shí)，還可W將另外一種生物分子生物素化后通過與鏈酶親和素的作用固定在 負(fù)載有Strep-化ctin蛋白的基質(zhì)上。
[0015] 本發(fā)明通過將Strep-tag多膚連接生物分子制得Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分 子；再利用Str巧-tag多膚可與負(fù)載有Strep-化ctin蛋白的基質(zhì)相結(jié)合的特性，將多膚 標(biāo)記的生物分子固定于基質(zhì)表面，制得具有優(yōu)異生物祀向性的Strep-tag多膚標(biāo)記的生物 分子衍生化基質(zhì)。將生物素與Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)賠育，生物素與 Strep-Tactin的競爭結(jié)合會(huì)破壞生物分子與基質(zhì)的連接，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的可逆捕獲和 釋放。
[0016] 上述Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)可用于細(xì)胞的捕獲及釋放。當(dāng)生 物分子為抗體，在制備多膚標(biāo)記的抗體衍生化基質(zhì)用于細(xì)胞的捕獲和釋放時(shí)，可W通過W 下兩種方式：先將二抗通過高楓酸軸或高楓酸鐘氧化，然后與Strep-tag多膚連接獲得多 膚標(biāo)記的二抗，再通過二抗與一抗的作用固定可W用于細(xì)胞識(shí)別的一抗；也可W直接將一 抗通過高楓酸軸或高楓酸鐘氧化，然后與Strep-tag多膚連接獲得多膚標(biāo)記的一抗，用于 細(xì)胞的捕獲。
[0017] 一種Str巧-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)用于細(xì)胞的捕獲及釋放的方法， 包括如下步驟： (1)將Strep-tag多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)與細(xì)胞混合并賠育后分離，提取特 異性捕獲細(xì)胞的基質(zhì)。
[0018] (2)將特異性捕獲細(xì)胞的基質(zhì)與生物素或其衍生物巧日脫硫生物素代替）混合后賠 育，提取釋放后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。
[0019] 優(yōu)選的，一種strep-tag多膚標(biāo)記的抗體衍生化基質(zhì)用于細(xì)胞捕獲及釋放的方法 包括如下步驟： (1)將5?1000 y g/mL的抗體與20mM高楓酸軸或高楓酸鐘按照體積比1:1混合，賠 育0. 5?2小時(shí)后，通過高楓酸軸或高楓酸鐘將抗體化端的糖殘基氧化成酵基，將所得物 超濾洗涂，提取氧化的抗體。
[0020] (2)將0. 1?lOOmg/mL的Str巧-tag多膚與步驟（1)得到的氧化的抗體按照摩爾 比1?50:1 (多膚：抗體）混合，賠育0. 5?8小時(shí)后，Str巧-tag多膚上的氨基與抗體的 酵基形成醜胺鍵，將所得物超濾洗涂，提取Strep-tag多膚標(biāo)記的抗體。
[002。 （3)將0. 1?lOOmg/mL步驟（2)得到的Strep-tag多膚標(biāo)記的抗體與濃度為0. 1? 200mg/mL的商品化負(fù)載有Strep-化ctin的磁珠按照體積比1:0. 1?50混合并賠育0. 5? 8小時(shí)后，將所得物充分洗涂分離，提取Strep-tag多膚標(biāo)記的抗體衍生化磁珠。
[0022] (4)將Strep-tag多膚標(biāo)記的抗體衍生化磁珠與細(xì)胞混合，賠育5?45min后分 離，提取特異性捕獲細(xì)胞的磁珠。
[0023] (5)將特異性捕獲細(xì)胞的磁珠與生物素或其衍生物巧日脫硫生物素代替）混合后， 賠育5?45min，提取釋放后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。
[0024] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果： 本發(fā)明制備的多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)具有優(yōu)異的生物祀向性。將生物素與多 膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)賠育，可切斷生物祀向分子與基質(zhì)的連接，從而生物祀向分 子與基質(zhì)剝離，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的可逆捕獲和釋放。本發(fā)明操作制備及使用過程簡單、快速， 并且重復(fù)性好，在一般化學(xué)及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室均能完成。本發(fā)明捕獲及釋放后對(duì)細(xì)胞損傷 較小，可W用于祀細(xì)胞的可逆捕獲、釋放和再培養(yǎng)，為臨床診斷和個(gè)性化治療提供有利的工 具，可廣泛用于腫瘤標(biāo)志物檢測、細(xì)胞捕獲和釋放等領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[00巧]圖1是實(shí)施例1制備的多膚標(biāo)記二抗衍生化的樹脂球的英光顯微圖。其中，a圖為 多膚標(biāo)記二抗衍生化的樹脂球與FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG反應(yīng)后，樹脂球顯示的FITC英 光；b圖為多膚標(biāo)記抗體衍生化的樹脂球與FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG反應(yīng)后，再經(jīng)脫硫生 物素處理，樹脂球上的英光強(qiáng)度大大減弱，表明多膚標(biāo)記的二抗從樹脂球上脫離。
[0026] 圖2是實(shí)施例2制備的多膚標(biāo)記二抗衍生化的磁珠的英光顯微圖。其中，a圖為 多膚標(biāo)記二抗衍生化的磁珠與FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG反應(yīng)后顯示的FITC英光；b圖為 多膚標(biāo)記二抗衍生化的磁珠與FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG反應(yīng)后，再經(jīng)脫硫生物素處理，磁 珠上的英光強(qiáng)度明顯減弱，表明多膚標(biāo)記的二抗可W從磁珠上脫離。
[0027] 圖3是實(shí)施例3制備的多膚標(biāo)記一抗衍生化的磁珠捕獲和釋放腫瘤細(xì)胞A431的 結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0029] 實(shí)施例1 (1)取Img羊抗小鼠IgG (二抗）分散于1血0. 1M P冊(cè).4的PBS中，與20mM高楓酸軸 溶液按照1:1 (v/v)混合，室溫條件下避光賠育比，用ImL 0. 1M P冊(cè).4的PBS超濾洗涂除 去多余的高楓酸軸并分散于ImL 0. 1M P冊(cè).4的PBS中獲得氧化的二抗。
[0030] (2)將濃度為0. 3mg/mL的Strep-tag II多膚與氧化的二抗（200 y L，Img/血）按 照摩爾比20:1 (多膚：抗體）混合，室溫條件下賠育30min后，超濾洗涂3次除去多余的多 膚并分散于200 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中獲得多膚標(biāo)記的二抗。
[00引](3)取濃度為5mg/血的商品化負(fù)載有5化69-化(3*111的樹脂球100 y L與100 y L Str巧-tag多膚標(biāo)記的二抗（Img/mL)混合，室溫賠育30min后，洗涂3次并分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中獲得多膚標(biāo)記的二抗衍生化的樹脂球。將獲得的多膚標(biāo)記的二抗衍生 化的樹脂球與3 y L FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG混合并在室溫條件下避光賠育30min，洗涂3 次后分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中，英光顯微鏡下成像，其結(jié)果如圖la所示；多膚標(biāo) 記的二抗衍生化樹脂球可W被FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG識(shí)別并顯示FITC的英光，說明二 抗成功固定于樹脂球表面。
[003引 （4)將多膚標(biāo)記的二抗衍生化的樹脂球（100 y L，5mg/血）與FITC標(biāo)記的兔抗山羊 IgG反應(yīng)，洗涂除去多余的FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG后分散于1血lOmM的脫硫生物素中， 室溫條件下賠育30min，破壞抗體與樹脂球的連接，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的釋放。其英光顯微鏡照片 如圖化所示，經(jīng)脫硫生物素處理后樹脂球的英光強(qiáng)度大大減弱，表明多膚標(biāo)記的二抗衍生 化的樹脂球可W進(jìn)行可逆組裝和分解。
[003引 實(shí)施例2 (1)取Img羊抗小鼠IgG (二抗）分散于1血0. 1M P冊(cè).4的PBS中，與20mM高楓酸軸 溶液按照1:1 (v/v)混合，室溫條件下避光賠育比，用ImL 0. 1M P冊(cè).4的PBS超濾洗涂除 去多余的高楓酸軸并分散于ImL 0. 1M P冊(cè).4的PBS中獲得氧化的二抗。
[0034] (2)將濃度為 0. 3mg/mL 的 Strep-tag II 多膚與氧化的二抗（200 y L，Img/mL)按照 摩爾比3:1混合，室溫賠育30min后，超濾洗涂3次除去多余的多膚并分散于200 uL 0. 1M pH7. 2的PBS中獲得多膚標(biāo)記的二抗。
[00對(duì) （3)取濃度為50mg/血的商品化負(fù)載有的磁珠10 y L經(jīng)100 y L buffer W (lOOmM Tris/肥 1 pH 8. 0，150mM 化Cl，lmM 邸TA)洗涂 2 后分散于 200yL 多膚 標(biāo)記的二抗中，室溫賠育30min后，洗涂3次并分散于lOOuL 0. 1M pH7. 2的PBS中獲得多 膚標(biāo)記的二抗衍生化的磁珠。將獲得的多膚標(biāo)記的二抗衍生化的磁珠與3y L FITC標(biāo)記的 兔抗山羊IgG混合并在室溫條件下賠育30min，洗涂3次后分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的 PBS中，英光顯微鏡下成像，其結(jié)果如圖2a所示；多膚標(biāo)記的二抗衍生化的磁珠可W被FITC 標(biāo)記的兔抗山羊IgG識(shí)別并顯示FITC的英光，說明抗體成功固定于磁珠表面。
[0036] (4)將多膚標(biāo)記的二抗衍生化的磁珠與FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG反應(yīng)，洗涂除去 多余的FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG后分散于2mM的生物素中，賠育30min，破壞抗體與磁珠的 連接，釋放抗體。其英光顯微鏡照片如圖化所示，經(jīng)生物素處理后英光強(qiáng)度明顯減弱，表明 多膚標(biāo)記的二抗衍生化的磁珠可W進(jìn)行可逆組裝和分解。
[0037] 實(shí)施例3 (1)取Img羊抗小鼠IgG (二抗）分散于1血0. 1M P冊(cè).4的PBS中，與20mM高楓酸軸 溶液按照1:1 (v/v)混合，室溫條件下避光賠育比，用ImL 0. 1M P冊(cè).4的PBS超濾洗涂除 去多余的高楓酸軸并分散于ImL 0. 1M P冊(cè).4的PBS中獲得氧化的二抗。
[0038] (2)將濃度為 0. 3mg/mL 的 Strep-tag II 多膚與氧化的二抗（200 y L，Img/mL)按照 摩爾比3:1混合，室溫賠育30min后，超濾洗涂3次除去多余的多膚并分散于200 uL 0. 1M pH7. 2的PBS中獲得多膚標(biāo)記的抗體。
[0039] (3)取濃度為 50mg/mL 負(fù)載有 Str巧-Tactin 的磁珠 10 y L 經(jīng) 100 y L buffer W (lOOmM Tris/肥1 pH 8. 0，150mM NaCl，lmM EDTA)洗涂2后分散于200yL多膚標(biāo)記的抗體 中，賠育30min后，洗涂3次并分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中獲得多膚標(biāo)記的二抗衍 生化的磁珠。
[0040] (4)將多膚標(biāo)記的二抗衍生化的磁珠與10 y g鼠抗人化CAM抗體(一抗）混合，賠 育30min后，洗涂3次并分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中，得到連接有多膚標(biāo)記的一抗 衍生化的磁珠。
[00川 （5)取lX105個(gè)人皮膚癌A431細(xì)胞(表達(dá)化CAM抗原)分散于400ilLlXPBS中， 之后加入100 y L Img/mL上述（4)中多膚標(biāo)記的一抗衍生化的磁珠。室溫下賠育30min后， 經(jīng)磁力架吸引Imin，除去未捕獲的細(xì)胞，將捕獲的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)捕獲效率。
[0042] (5)將特異性捕獲細(xì)胞的磁珠分散于400 y L 2mM的生物素，室溫下賠育30min，經(jīng) 磁力架吸引除去磁珠，得到被釋放的細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)獲得釋放效率。結(jié)果如圖3所示，多膚 標(biāo)記的一抗衍生化的磁珠用于A431細(xì)胞的捕獲可獲得86%的捕獲效率，加入生物素后70% 的細(xì)胞被釋放。W上結(jié)果說明本發(fā)明的多膚標(biāo)記的一抗衍生化的磁珠可進(jìn)行可逆組裝和分 解，因而能用于細(xì)胞的捕獲和釋放。
[0043] 上述實(shí)施例表明本發(fā)明方法制備得到的多膚標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)具有較 好的祀向識(shí)別功能，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
[0044] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)，其特征在于：通過將Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子固定于負(fù)載有Strep-Tactin蛋白的基質(zhì)上得到。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基 質(zhì)，其特征在于： 所述的Strep-tag多肽包括Strep-tag I、Strep_tag II及其相關(guān)的衍生物和類似物； 所述的生物分子為對(duì)細(xì)胞、蛋白、核酸、生物小分子進(jìn)行特異性識(shí)別和捕獲的蛋白或核 酸，包括抗體、鏈霉親和素、凝集素、生長因子、核酸適配體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化 基質(zhì)，其特征在于：所述的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子為偶聯(lián)Strep-tag多肽的生物分 子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基 質(zhì)，其特征在于： 當(dāng)生物分子為抗體時(shí)，Strep-tag多肽標(biāo)記的抗體通過包含如下步驟的方法制備得到： 通過高碘酸鈉或高碘酸鉀將抗體Fc端的糖殘基氧化成醛基后與Strep-tag多肽上的氨基 反應(yīng)得到Strep-tag多肽標(biāo)記的抗體； 當(dāng)生物分子為除抗體外的生物分子時(shí)，所述的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子通過包 含如下步驟的方法制備得到：通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥 基琥珀酰亞胺活化鏈霉親和素、凝集素、生長因子或核酸適配體的羧基，再與Strep-tag多 肽的氨基反應(yīng)得到Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化 基質(zhì)，其特征在于：所述的負(fù)載有Strep-Tactin蛋白的基質(zhì)為商品化負(fù)載有Strep-Tactin 的磁珠或商品化含Strep-Tactin的樹脂球、孔板，或?qū)trep-Tactin蛋白修飾于其他基質(zhì) 上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基 質(zhì)，其特征在于：所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)中 的生物分子為鏈酶親和素時(shí)，將另外一種生物分子生物素化后通過與鏈酶親和素的作用固 定在負(fù)載有Strep-Tactin蛋白的基質(zhì)上。
7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生 化基質(zhì)在細(xì)胞的捕獲及釋放中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：當(dāng)生物分子為抗體，在制備多肽標(biāo)記的 抗體衍生化基質(zhì)用于細(xì)胞的捕獲和釋放時(shí)，通過以下兩種方式：1)先將二抗通過高碘酸 鈉或高碘酸鉀氧化，然后與Strep-tag多肽連接獲得多肽標(biāo)記的二抗，再通過二抗與一抗 的作用固定用于細(xì)胞識(shí)別的一抗；2)直接將一抗通過高碘酸鈉或高碘酸鉀氧化，然后與 Strep-tag多肽連接獲得多肽標(biāo)記的一抗，用于細(xì)胞的捕獲。
9. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的可逆組裝和分解的Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生 化基質(zhì)用于細(xì)胞的捕獲及釋放的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將Strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子衍生化基質(zhì)與細(xì)胞混合，孵育后分離，提取特異 性捕獲細(xì)胞的基質(zhì)； (2) 將特異性捕獲細(xì)胞的基質(zhì)與生物素或其衍生物混合，孵育后分離，提取釋放后的細(xì) 胞進(jìn)行后續(xù)分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述的strep-tag多肽標(biāo)記的生物分子 為Strep-tag多肽標(biāo)記的抗體時(shí)，包括如下步驟： (1) 將5?1000 ii g/mL的抗體與20mM高碘酸鈉或高碘酸鉀按照體積比1:1混合，孵育 0. 5?2小時(shí)后，將所得物超濾洗滌，提取氧化的抗體； (2) 將0? 1?100mg/mL的Strep-tag多肽與步驟（1)得到的氧化的抗體按照摩爾比 1?50:1混合，孵育0. 5?8小時(shí)后，將所得物超濾洗滌，提取Str印-tag多肽標(biāo)記的抗體； (3) 將0? 1?100mg/mL步驟（2)得到的Strep-tag多肽標(biāo)記的抗體與濃度為0? 1? 200mg/mL的商品化負(fù)載有Strep-Tactin的磁珠按照體積比1:0. 1?50混合并孵育0. 5? 8小時(shí)后，將所得物洗滌分離，提取Strep-tag多肽標(biāo)記的抗體衍生化磁珠； (4) 將Str印-tag多肽標(biāo)記的抗體衍生化磁珠與細(xì)胞混合，孵育5?45min后分離，提 取特異性捕獲細(xì)胞的磁珠； (5) 將特異性捕獲細(xì)胞的磁珠與生物素或其衍生物混合后，孵育5?45min，提取釋放 后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104437411SQ201410776505
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】黃衛(wèi)華, 陸寧寧, 謝敏, 程世博 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)