一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法
【專利摘要】一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，步驟是：(A)將細(xì)胞、微納顆粒充分混勻于聚陰離子等滲溶液中形成混合液；(B)用靜電微注射儀將混合液滴入盛有二價陽離子等滲溶液的收集池，得到包裹細(xì)胞和微納顆粒的凝膠微球；(C)將B步的凝膠微球投入聚陽離子等滲溶液中，形成一層聚陽離子包覆膜；隨后投入聚陰離子等滲溶液中振蕩再形成一層聚陰離子包覆膜；重復(fù)操作0-3次，得到具有2-8層包覆膜的凝膠微球；(D)將(C)步的凝膠微球投入二價陽離子的等滲置換液，即獲得用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。該微反應(yīng)器使細(xì)胞-微納顆粒充分接觸，細(xì)胞、微納顆粒的計量準(zhǔn)確，能更準(zhǔn)確、可靠地反映微納顆粒對細(xì)胞的影響作用關(guān)系。
【專利說明】一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，環(huán)境問題愈來愈嚴(yán)重?？諝庵写嬖诒姸嗟奈⒓{(微米、納米尺度)顆粒，科學(xué)技術(shù)的發(fā)展已揭示環(huán)境中存在的PM2.5 (粒徑小于等于2.5微米的顆粒)嚴(yán)重地威脅人類的健康。PM2.5這種微納顆粒如何引起細(xì)胞毒性及人體的病變成為人們普遍關(guān)注的問題。此外，利用微納顆粒載藥治療各種疾病也成為研發(fā)熱點。而微納顆粒由于有較大的比表面積和較小的體積，其對細(xì)胞的影響和作用關(guān)系評價困難。
[0003]通過將微納顆粒置于培養(yǎng)板底部，隨后加入細(xì)胞懸液，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，同時在實驗過程中，對細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化和細(xì)胞因子等相關(guān)特性進(jìn)行檢測，從而完成微納顆粒對細(xì)胞影響的實驗，以反映、評價微納顆粒對細(xì)胞的影響和作用關(guān)系。但其普遍存在取樣及檢測困難的問題:1、取樣過程中易引起細(xì)胞和微納顆粒的損失，不能準(zhǔn)確反映微納顆粒對細(xì)胞作用的量效關(guān)系；2、細(xì)胞與密度較小的微納顆粒共培養(yǎng)時，由于微納顆粒密度小于液體培養(yǎng)基的密度，在共培養(yǎng)時微納顆粒漂浮于培養(yǎng)基上方，無法與貼于培養(yǎng)板底部生長的細(xì)胞直接接觸，從而影響細(xì)胞實驗檢測的結(jié)果。對此，有人提出將微納顆粒與I型膠原溶液在培養(yǎng)板中混合，待I型膠原溶液在室溫下固化后，微納顆粒粘于固化的I型膠原上方，再與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，雖解決了微納顆粒與細(xì)胞無法接觸的問題；但是，微納顆粒被固定于固化的I型膠原上表面后可能導(dǎo)致細(xì)胞的新陳代謝、活性、細(xì)胞間及微納顆粒與細(xì)胞間信號傳遞受阻等問題，且部分微納顆粒會存于固化的I型膠原內(nèi)部，而無法與細(xì)胞接觸，仍會導(dǎo)致實驗的準(zhǔn)確性不足。也有人提出倒置培養(yǎng)模型，即待細(xì)胞貼于培養(yǎng)板底部后，再加入微納顆粒，并將培養(yǎng)板加滿培養(yǎng)基，用封口膜將培養(yǎng)板覆蓋，最后將培養(yǎng)板倒置。培養(yǎng)過程中細(xì)胞貼附于上方(倒置后的培養(yǎng)板底部)，而微納顆粒會漂浮于培養(yǎng)基上方，即聚集于倒置后的培養(yǎng)板底部，該方法雖解決了微納顆粒與細(xì)胞接觸的問題，但操作難度大，換液困難，不能進(jìn)行長期培養(yǎng)；且在需要分離培養(yǎng)基檢測細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化和細(xì)胞因子的等相關(guān)特性時，微納顆粒易被同時帶出，也將影響微納顆粒對細(xì)胞影響作用關(guān)系的檢測結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，將該方法制備的微反應(yīng)器置于培養(yǎng)基中，即可進(jìn)行微納顆粒對細(xì)胞影響的實驗，實驗時細(xì)胞-微納顆粒充分接觸，細(xì)胞和微納顆粒的計量準(zhǔn)確，能更準(zhǔn)確、可靠地反映微納顆粒對細(xì)胞的影響作用關(guān)系。
[0005]本發(fā)明實現(xiàn)其發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是，一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，包括以下步驟:
[0006](A)預(yù)處理:將16-1O9個實驗用細(xì)胞和0.1-2.0g微納顆粒充分混勻于5_50mL的1.0-5.0wt.%的聚陰離子等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0007](B)凝膠體系構(gòu)建:采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液滴入盛有20_200mL的0.5-10.0wt.%二價陽離子等滲溶液的收集池；靜置5-20min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和微納顆粒的凝膠微球；
[0008](C)絡(luò)和成膜:將凝膠微球投入0.1-1.5wt.%的聚陽離子等滲溶液中，振蕩5-15min ;聚陽離子在凝膠微球表面形成一層聚陽離子包覆膜；靜置后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.1-0.5wt.%的聚陰離子等滲溶液中振蕩5-15min，再在凝膠微球表面形成一層聚陰離子包覆膜；靜置后，棄去上清液并用生理鹽水洗滌；
[0009]重復(fù)以上操作0-3次，得到具有2-8層包覆膜的凝膠微球；
[0010](D)液化反應(yīng):將C步得到的具有2-8層包覆膜的凝膠微球投入二價陽離子的等滲置換液中振蕩0.5-5min，等滲置換液的濃度為0.5-10.0wt.%，使凝膠微球中的二價陽離子被置換，聚陰離子與二價陽離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和微納顆粒的、用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0011]本發(fā)明制得的微反應(yīng)器的使用方法是:
[0012]將微反應(yīng)器置于培養(yǎng)基中即可進(jìn)行微納顆粒對細(xì)胞影響的實驗:即將培養(yǎng)基及其微反應(yīng)器在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化和細(xì)胞因子相關(guān)特性檢測，即可得出微納顆粒對細(xì)胞的影響作用關(guān)系。實驗環(huán)境為通常的細(xì)胞實驗環(huán)境即十萬級超凈實驗室或萬級超凈臺。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0014]一、本發(fā)明通過將實驗用細(xì)胞和微納顆粒混勻于聚陰離子等滲溶液中形成粘稠混合液，采用靜電微注射儀滴入二價陽離子等滲溶液中，由于靜電場的作用，粘稠混合液在滴入二價陽離子等滲溶液前被分散成微米級的液粒，隨后與等滲溶液中的二價陽離子交聯(lián)形成包裹細(xì)胞和微納顆粒的凝膠微球。即細(xì)胞和微納顆粒全部被包裹在微米尺度的凝膠微球中，保證了細(xì)胞和微納顆粒的計量準(zhǔn)確。
[0015]二、包裹細(xì)胞和微納顆粒的凝膠微球含聚陰離子，可與聚陽離子等滲溶液中的聚陽離子通過聚電解質(zhì)的靜電吸附作用形成聚陽離子包覆膜；再置于聚陰離子等滲溶液中通過聚電解質(zhì)的靜電吸附作用形成聚陰離子包覆膜，多次重復(fù)得到包覆多層陰、陽離子膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球；最后凝膠微球球芯內(nèi)的二價陽離子被置換，聚陰離子與二價陽離子的微球交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，得到多層膜結(jié)構(gòu)包裹的細(xì)胞和微納顆粒共存的微米級球形腔的微反應(yīng)器。
[0016]微反應(yīng)器的微米級球形腔將細(xì)胞和微納顆粒共同局限在微反應(yīng)器內(nèi)狹小的三維空間內(nèi)，既可以保護(hù)其中的細(xì)胞免于物理損傷，也能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞和微納顆粒的互相充分接觸。同時允許營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、廢物的雙向擴(kuò)散，能夠保證培養(yǎng)基自由進(jìn)出；還可以滿足細(xì)胞足夠的生長空間，利于細(xì)胞生長代謝和穩(wěn)定化，使細(xì)胞之間信號傳遞暢通，并有利于維持細(xì)胞活性；從而更真實地模擬人體或動物體內(nèi)細(xì)胞與微納顆粒的共存和接觸環(huán)境，更可靠地反映微納顆粒對細(xì)胞的影響作用關(guān)系。
[0017]三、使用本發(fā)明的微反應(yīng)器進(jìn)行微納顆粒對細(xì)胞影響的實驗，選取的細(xì)胞和微納顆粒能全部被包裹在微米級的凝膠微球中；共培養(yǎng)過程中，細(xì)胞和微納顆粒均局限在微反應(yīng)器內(nèi)狹小的微米級球形三維空間內(nèi)，培養(yǎng)(包括換液)過程中不會溢出和丟失；保證了細(xì)胞和微納顆粒的計量準(zhǔn)確，能準(zhǔn)確地反映微納顆粒對細(xì)胞影響的量效關(guān)系，其實驗結(jié)果更精確、可靠。
[0018]上述(A)步的聚陰離子是海藻酸鈉、海藻酸鉀、纖維素硫酸鈉、聚丙烯酸鈉或聚丙烯酸鉀。
[0019]以上聚陰離子資源豐富、毒性小、生物相容性好，使其得到廣泛應(yīng)用。
[0020]上述(C)步的聚陽離子是殼聚糖、聚賴氨酸、聚烯丙基胺、聚二甲基二烯丙基氯化銨、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨或聚乙烯亞胺。
[0021]以上聚陰離子生物相容性好、價格便宜，具有很大應(yīng)用價值。
[0022]上述(B)步的二價陽離子為鈣離子、錳離子或鋅離子。
[0023]以上二價陽離子對細(xì)胞無毒無害，不會影響細(xì)胞生長。
[0024]上述(D)步的二價陽離子的等滲置換液是檸檬酸鈉等滲溶液、檸檬酸鉀等滲溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)等滲溶液或乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)等滲溶液。
[0025]以上二價陽離子置換液對細(xì)胞無毒無害、價格便宜，與鈣離子、錳離子或鋅離子結(jié)合力強(qiáng)。
[0026]上述(A)步的微納顆粒為超高分子量聚乙烯微納顆粒、納米金顆粒、羥基磷灰石微納顆粒、載藥磷酸鈣微納顆粒、PM2.5、二氧化鈦微納顆?；蚨趸栉⒓{顆粒。
[0027]上述⑶步的靜電微注射儀的外加電壓為5-20kV。
[0028]選擇以上電壓范圍可保證微反應(yīng)器尺寸為微米級別。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為實例I制備的微反應(yīng)器在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Id后的倒置顯微鏡圖。

【具體實施方式】
[0030]以下實施例中所有制備及操作過程均嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。
[0031]實施例1
[0032]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，包括以下步驟:
[0033](A)將I X 17個實驗用細(xì)胞和0.1g超高分子量聚乙烯微納顆粒充分混勻于1mL的1.5wt.%的海藻酸鈉等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0034](B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液滴入盛有20mL的1.0wt.%氯化鈣溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為1kV ;靜置15min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和超高分子量聚乙烯微納顆粒的凝膠微球；
[0035](C)將凝膠微球投入1.0wt.%的殼聚糖等滲溶液中，振蕩15min，殼聚糖在凝膠微球表面形成一層殼聚糖包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.15wt.%的海藻酸鈉等滲溶液中振蕩15min，再在凝膠微球表面形成一層海藻酸鈉包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌完成二次覆膜過程；
[0036](D)將C步得到包覆有2層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至1.5wt.%檸檬酸鈉等滲溶液中振蕩0.5min，使凝膠微球中的鈣離子被置換，海藻酸鈉與鈣離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和超高分子量聚乙烯微納顆粒的、用于超高分子量聚乙烯微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0037]圖1為本例制備的微反應(yīng)器在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Id后的倒置顯微鏡圖。圖1示出，本例制備的微反應(yīng)器形狀規(guī)則尺寸均勻，培養(yǎng)Id后，微反應(yīng)器內(nèi)部巨噬細(xì)胞邊界清晰，長勢良好，細(xì)胞和超高分子量聚乙烯微納顆粒分布均勻且接觸生長。
[0038]實施例2
[0039]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其步驟是:
[0040](A)將2.5 X 16個實驗用細(xì)胞和0.5g納米金顆粒充分混勻于5mL的1.0wt.%的海藻酸鉀等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0041 ] (B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液滴入盛有30mL的5.0wt.%硝酸鈣溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為8kV ;靜置1min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和納米金顆粒的凝膠微球；
[0042](C)將凝膠微球投入0.5wt.%的聚賴氨酸等滲溶液中，振蕩lOmin，聚賴氨酸在凝膠微球表面形成一層聚賴氨酸包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入
0.1wt.%的海藻酸鉀等滲溶液中振蕩lOmin，再在凝膠微球表面形成一層海藻酸鈉包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌；
[0043]重復(fù)以上操作I次驟，得到具有4層包覆膜的凝膠微球；
[0044](D)將C步包覆有4層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至0.5wt.%的檸檬酸鉀等滲溶液中振蕩5min，使凝膠微球中的鈣離子被置換，海藻酸鉀與鈣離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和納米金顆粒的、用于納米金顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0045]實施例3
[0046]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其步驟是:
[0047](A)將2X 16個實驗用細(xì)胞和1.0g羥基磷灰石微納顆粒充分混勻于20mL的
2.5wt.%的聚丙烯酸鈉等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0048](B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液滴入盛有40mL的10.0wt.%氯化錳溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為15kV ;靜置5min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和羥基磷灰石微納顆粒的凝膠微球；
[0049](C)將凝膠微球投入1.5wt.%的聚乙烯亞胺等滲溶液中，振蕩5min，聚乙烯亞胺在凝膠微球表面形成一層聚乙烯亞胺包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.25wt.%的聚丙稀酸鈉溶液中振蕩5min，再在凝膠微球表面形成一層聚丙稀酸鈉包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌；
[0050]重復(fù)以上操作2次驟，得到具有6層包覆膜的凝膠微球；
[0051](D)將C步包覆有6層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至10.0wt.%的EDTA等滲溶液中振蕩5min，使凝膠微球中的錳離子被置換，聚丙烯酸鈉與錳離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和羥基磷灰石微納顆粒的、用于羥基磷灰石微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0052]實施例4
[0053]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，包括以下步驟:
[0054](A)將3X 18個實驗用細(xì)胞和1.0g載藥磷酸鈣微納顆粒充分混勻于30mL的5.0wt.%的纖維素硫酸鈉等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0055](B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液以8mL/h的速度滴入盛有50mL的7.5wt.%氯化鋅溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為20kV ;靜置12min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和載藥磷酸鈣微納顆粒的凝膠微球；
[0056](C)將凝膠微球投入0.1wt.%的聚賴氨酸等滲溶液中，振蕩12min，聚賴氨酸在凝膠微球表面形成一層聚賴氨酸包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.5wt.%的纖維素硫酸鈉等滲溶液中振蕩12min，再在凝膠微球表面形成一層纖維素硫酸鈉包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌；
[0057]重復(fù)以上操作3次驟，得到具有8層包覆膜的凝膠微球；
[0058](D)將C步包覆有8層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至2.5wt.%等滲的EGTA等滲溶液中振蕩3min，使凝膠微球中的鋅離子被置換，纖維素硫酸鈉與鋅離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和載藥磷酸鈣微納顆粒的、用于載藥磷酸鈣微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0059]實施例5
[0060]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其步驟是:
[0061](A)將2X 18個實驗用細(xì)胞和2.0g PM2.5顆粒充分混勻于40mL的3.0wt.%的聚丙烯酸鉀等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0062](B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液以6mL/h的速度滴入盛有10mL的
0.5wt.%氯化鈣溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為12kV ;靜置20min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和PM2.5顆粒的凝膠微球；
[0063](C)將凝膠微球投入0.8wt.%的聚烯丙基胺等滲溶液中，振蕩8min，聚烯丙基胺在凝膠微球表面形成一層聚烯丙基胺包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.3wt.%的聚丙烯酸鉀等滲溶液中振蕩8min，再在凝膠微球表面形成一層聚丙烯酸鉀包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌；
[0064]重復(fù)以上操作3次驟，得到具有8層包覆膜的凝膠微球；
[0065](D)將C步包覆有8層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至3.0wt.%的EDTA等滲溶液中振蕩2.5min，使凝膠微球中的鈣離子被置換，聚丙烯酸鉀與鈣離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和PM2.5顆粒的、用于PM2.5顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0066]實施例6
[0067]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其步驟是:
[0068](A)將IXlO9個實驗用細(xì)胞和0.3g 二氧化鈦微納顆粒充分混勻于50mL的4.0wt.%的聚丙烯酸鈉等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0069](B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液以10mL/h的速度滴入盛有200mL的
1.0wt.%氯化鋅溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為18kV ;靜置7min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和二氧化鈦微納顆粒的凝膠微球；
[0070](C)將凝膠微球投入1.3wt.%的聚二甲基二烯丙基氯化銨等滲溶液中，振蕩7min，聚二甲基二烯丙基氯化銨在凝膠微球表面形成一層聚二甲基二烯丙基氯化銨包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.4wt.%的聚丙烯酸鈉溶液中，振蕩7min，再在凝膠微球表面形成一層聚丙烯酸鈉包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌；[0071 ] (D)將C步包覆有2層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至1.5wt.%的EGTA等滲溶液中振蕩1.5min，使凝膠微球中的鋅離子被置換，聚丙烯酸鈉與鋅離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和二氧化鈦微納顆粒的、用于二氧化鈦微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0072]實施例7
[0073]一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其步驟是:
[0074](A)將IXlO6個實驗用細(xì)胞和0.8g 二氧化硅微納顆粒充分混勻于1mL的
3.0wt.%的纖維素硫酸鈉等滲溶液中形成粘稠混合液；
[0075](B)采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液以20mL/h的速度滴入盛有150mL的
2.5wt.%硝酸鈣溶液的收集池中，靜電微注射儀的外加電壓為5kV ;靜置8min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和二氧化硅微納顆粒的凝膠微球；
[0076](C)將B步的包含細(xì)胞和二氧化硅微納顆粒的凝膠微球投入0.6wt.%的聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨等滲溶液中，振蕩8min，聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨在凝膠微球表面形成一層聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨包覆膜，靜置后，除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.3wt.%的纖維素硫酸鈉等滲溶液中振蕩8min，再在凝膠微球表面形成一層纖維素硫酸鈉包覆膜，靜置后棄去上清液并用生理鹽水洗滌完成二次覆膜過程;
[0077](D)將C步包覆有2層膜結(jié)構(gòu)的凝膠微球轉(zhuǎn)移至1.0wt.%等滲的檸檬酸鉀等滲溶液中振蕩2min，使凝膠微球中的鈣離子被置換，纖維素硫酸鈉與鈣離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和二氧化硅微納顆粒的、用于二氧化硅微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
[0078]本發(fā)明使用的靜電微注射儀由微量注射器的針頭與外接高壓電源的正極相連，收集池下方的銅板與高壓電源的負(fù)極相連構(gòu)成。
【權(quán)利要求】
1.一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，包括以下步驟: ㈧預(yù)處理:將16-1O9個實驗用細(xì)胞和0.1-2.0g微納顆粒充分混勻于5-50mL的1.0-5.0wt.%的聚陰離子等滲溶液中形成粘稠混合液； (B)凝膠體系構(gòu)建:采用靜電微注射儀將A步的粘稠混合液滴入盛有20-200mL的0.5-10.0wt.%二價陽離子等滲溶液的收集池；靜置5-20min后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌得到包裹細(xì)胞和微納顆粒的凝膠微球； (C)絡(luò)和成膜:將凝膠微球投入0.1-1.5wt.%的聚陽離子等滲溶液中，振蕩5-15min ；聚陽離子在凝膠微球表面形成一層聚陽離子包覆膜；靜置后，過濾除去上清液并用生理鹽水洗滌；隨后投入0.1-0.5wt.%的聚陰離子等滲溶液中振蕩5-15min，再在凝膠微球表面形成一層聚陰離子包覆膜；靜置后，棄去上清液并用生理鹽水洗滌； 重復(fù)以上操作0-3次，得到具有2-8層包覆膜的凝膠微球； (D)液化反應(yīng):將C步得到的具有2-8層包覆膜的凝膠微球投入二價陽離子的等滲置換液中振蕩0.5-5min，等滲置換液的濃度為0.5-10.0wt.%，使凝膠微球中的二價陽離子被置換，聚陰離子與二價陽離子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌，即獲得包裹細(xì)胞和微納顆粒的、用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述(A)步的聚陰離子是海藻酸鈉、海藻酸鉀、纖維素硫酸鈉、聚丙烯酸鈉或聚丙烯酸鉀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述(C)步的聚陽離子是殼聚糖、聚賴氨酸、聚烯丙基胺、聚二甲基二烯丙基氯化銨、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨或聚乙烯亞胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述(B)步的二價陽離子為鈣離子、錳離子或鋅離子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述(D)步的二價陽離子的等滲置換液為檸檬酸鈉等滲溶液、檸檬酸鉀等滲溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)等滲溶液或乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)等滲溶液中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述(A)步的微納顆粒為超高分子量聚乙烯微納顆粒、納米金顆粒、羥基磷灰石微納顆粒、載藥磷酸鈣微納顆粒、PM2.5、二氧化鈦微納顆粒或二氧化硅微納顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微納顆粒對細(xì)胞影響實驗的微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述(B)步的靜電微注射儀的外加電壓為5-20kV。
【文檔編號】C12N11/10GK104498471SQ201410767863
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】屈樹新, 劉玉梅, 匙峰, 高雪玲, 劉陽, 翁杰 申請人:西南交通大學(xué)