短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：分別將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)制成濃縮液，然后將二者混合。其優(yōu)點表現(xiàn)在：本發(fā)明的制備方法工藝簡單、高效，制得的液體制劑可以廣譜、有效地清除弧菌引起的疾病。
CCTCC NO: M2013240
20130602
【專利說明】短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及飼料添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制 劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 弧菌屬于弧菌科弧菌屬，是一類革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運(yùn)動、無芽孢的短桿 狀細(xì)菌，其中有的弧菌有一定的彎曲，欠柔軟，有的彎曲不明顯?；【呛Ｑ蠹?xì)菌的優(yōu)勢類 群之一，廣泛分布于世界各地各類河口、內(nèi)灣、沿岸、水體養(yǎng)殖區(qū)和外海的水體及沉積物中， 各種海洋生物體表或體內(nèi)也常生存著高密度海洋弧菌，在海洋環(huán)境中占據(jù)著重要的生態(tài)地 位，具有多種多樣的生理、生態(tài)功能，在海洋微食物環(huán)中扮演重要角色，對海洋的營養(yǎng)物的 循環(huán)起著非常重要的作用。但同時，弧菌又是水生動物中的一類重要的病原菌。
[0003] 隨著高密度海水養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展,對養(yǎng)殖環(huán)境的污染日益加劇。水產(chǎn)品的病害已 成為海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問題?；【∈怯苫【鷮偌?xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病，該病在 全球范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，其爆發(fā)性流行不僅給海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等經(jīng)濟(jì)動物的養(yǎng) 殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還導(dǎo)致野生的海水魚類、貝類及甲殼類的大量死亡?；【∈亲?嚴(yán)重的疾病之一，其死亡率甚至高達(dá)100%。
[0004] 為了控制病害，通常過度使用抗生素類藥物，這不僅造成養(yǎng)殖產(chǎn)品的藥物殘留，而 且還提高了病原細(xì)菌的耐藥性，引起抗性基因的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)。2005年，歐盟已禁止 在動物養(yǎng)殖中使用一切非治療性抗生素。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式 已經(jīng)迫在眉睫。
[0005] 中國專利文獻(xiàn)CN101275119公開了一種蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中 致病菌的應(yīng)用，特別適用于消除淡水產(chǎn)品食用或加工前、運(yùn)輸過程及其養(yǎng)殖水體中攜帶的 致病菌。在污染了致病菌的淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中、食用前、加工前或運(yùn)輸過程中加入蛭弧 菌濃縮液，使其濃度至少達(dá)到l〇 3pfu/ml。淡水產(chǎn)品食用或加工前、運(yùn)輸過程中或養(yǎng)殖水體 中應(yīng)用該法時，蛭弧菌游泳體濃度范圍分別為IO 5?l〇13pfu/ml ;104?1012pfu/ml ;103? 107pfu/ml。中國專利文獻(xiàn)CN101948784A公開了一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用。發(fā) 酵方法包括以下步驟：（1)宿主菌懸液的制備；（2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備；（3)蛭弧 菌制劑的制備。中國專利文獻(xiàn)CN103719535A公開了一種噬菌蛭弧菌微膠囊，所述微膠囊 的壁為明膠，顆粒呈球形，表面有凹陷，但沒有孔和裂紋，所述顆粒粒徑大小為3?12 μ m， 分布基本均勻，且其中，噬菌蛭弧菌的含量為3. 69 X 107pfu/g?3. 70 X 107pfu/g，大腸桿菌 DH5 α的含量為8. 6X 109pfu/g?2. IOX 101Qpfu/g。該微膠囊的制備方法，其包括步驟：1) 大腸桿菌DH5a菌懸液的制備；2)噬菌蛭弧菌培養(yǎng)液的制備；和3)將步驟1)的大腸桿菌 DH5 a菌懸液和步驟2)的噬菌蛭弧菌培養(yǎng)液與無菌明膠溶液均勻混合后，進(jìn)行噴霧干燥， 最終制備成微膠囊。中國專利文獻(xiàn)CN104099268A公開了一種水產(chǎn)養(yǎng)殖復(fù)合微生物菌劑，其 包括如下菌劑及其重量份：枯草芽孢桿菌5-10份，地衣芽孢桿菌0. 5-4份，巨大芽孢桿菌 1-6份，膠質(zhì)紅假單胞菌0. 2-1份，莢膜紅假單胞菌0. 5-3份，噬菌蛭弧菌2-8份。中國專利 文獻(xiàn)CN101356927公開了一種蛭弧菌在消除海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病性弧菌的應(yīng)用，在 污染了致病性弧菌的海產(chǎn)品和/或養(yǎng)殖水體中加入蛭弧菌濃縮液,使蛭弧菌的濃度至少達(dá) 到102pfu/ml。海產(chǎn)品食用前、運(yùn)輸過程以及養(yǎng)殖水體中應(yīng)用該法時，蛭弧菌濃度范圍分別 為 IO4 ?1012pfu/ml、103 ?10npfu/ml、102 ?106pfu/ml。
[0006] 中國專利文獻(xiàn)CN103525723A公開了一種具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢 桿菌，其保藏編號為CCTCC M 2013240。該發(fā)明還提供這種短小芽孢桿菌的應(yīng)用以及以這種 短小芽孢桿菌或其發(fā)酵液為活性成分的微生物制劑。該發(fā)明以紫色桿菌為篩選模型，利用 "T"型劃線法和濾紙片法篩選出一株能夠抑制紫色桿菌紫色色素產(chǎn)生的菌株F3-1，試驗結(jié) 果表明菌株F3-1能夠抑制紫色桿菌的QS信號分子，具有抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的作用，可用于 制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的微生物制劑。
[0007] 但是關(guān)于本發(fā)明的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑的制備方法目前還未見報 道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體 制劑的制備方法。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的制備 方法，所述的制備方法包括以下步驟：分別將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌 和蛭弧菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)制成濃縮液，然后將二者混合。
[0010] 所述的具有群體感應(yīng)抑制作用的短小芽孢桿菌為保藏編號為CCTCC M 2013240的 短小芽孢桿菌。
[0011] 所述的蛭弧菌為噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔爾蛭弧菌中的一種或多種。
[0012] 所述的制備方法包括以下步驟：將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵 的順序培養(yǎng)，斜面和種子培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基，制得短小芽孢桿菌濃縮 液活菌數(shù)> l〇9cfu/ml ;蛭弧菌與副溶血弧菌濃縮液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角 錐瓶中，恒溫?fù)u床250rpm，28°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)物經(jīng)過5000rpm、4°C離心20min，取上清液，再 16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物， 制成濃度> l〇ncfu/ml的蛭弧菌濃縮液；將短小芽孢桿菌的濃縮液和蛭弧菌的濃縮液按照 體積比為10:1的比例進(jìn)行混合。
[0013] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0014] 1、本發(fā)明的制備方法工藝簡單、高效。
[0015] 2、本發(fā)明的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑，可 以廣譜、有效地清除弧菌引起的疾病，添加到對蝦飼料中不僅可以抑制對蝦腸道病原弧菌 的生長、減少對蝦弧菌病的發(fā)生，還能促進(jìn)對蝦生長、降低養(yǎng)殖成本，值得在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣 泛應(yīng)用。

【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0017] 具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌，其釋放出來的蛋白酶可以淬滅群體 感應(yīng)信號分子，進(jìn)而使致病菌調(diào)控毒力因子表達(dá)的機(jī)能喪失或者減弱，那么致病菌就是一 頭沒有獠牙的狼，而宿主有足夠的時間把它圍困進(jìn)而依靠自身免疫消除抗原。
[0018] 將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌組合在一起使用，將二者 的作用共同發(fā)揮出來，可以更好地清除弧菌引起的疾病。
[0019] 本發(fā)明實施例優(yōu)選的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌為保藏編號為 CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌。保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌的分類 命名：短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物中心，地址：中國湖 北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期：2013年06月02日，保藏編號為CCTCC N0:M2013240。
[0020] 本發(fā)明實施例優(yōu)選的蛭弧菌為噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus)。
[0021] 實施例1液體制劑
[0022] 本發(fā)明的液體制劑可以通過將短小芽孢桿菌和蛭弧菌分別進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，然 后將二者的濃縮液混合，即得到本發(fā)明的液體制劑。本實施例制備的液體制劑用于實施例 3、實施例4、實施例5的試驗。本實施例具體的制備方法如下：
[0023] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面和種子培養(yǎng)基 為常規(guī)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W/V):豆餅粉3%，淀粉1. 5%， 玉米漿 1%，葡萄糖 0.5%，（NH4) 2S040. 1 %，NH4ClO. 1 %，KH2PO4O. 05 %，NaH2PO4O. 5 %， MgSO4O. 05%，MnSO4O. 05 %，發(fā)酵培養(yǎng)條件為28-37 °C，通風(fēng)培養(yǎng)36-48h，活菌數(shù)彡IO9Cfu/ ml 〇
[0024] 蛭弧菌與副溶血弧菌濃縮液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角錐瓶中，恒溫?fù)u 床250rpm，28°C培養(yǎng)24h。培養(yǎng)物經(jīng)過5000rpm、4°C離心20min，取上清液，再16000rpm、4°C 條件下離心20min,棄上清液,加入適量DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物,制成濃度 彡10ncfu/ml的蛭弧菌濃縮液。
[0025] 將短小芽孢桿菌的濃縮液和蛭弧菌的濃縮液按照體積比為10:1的比例進(jìn)行混 合，即得到本發(fā)明的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑。
[0026] 實施例2粉狀制劑
[0027] 本發(fā)明的粉狀制劑可以通過將短小芽孢桿菌和蛭弧菌分別進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，然 后將二者的粉狀固體混合；也可以通過將短小芽孢桿菌和蛭弧菌分別進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)， 然后將二者混合，再進(jìn)行干燥制得粉狀制劑。本實施例制備的粉狀制劑用于實施例4、實施 例5的試驗。本實施例具體的制備方法如下：
[0028] 短小芽抱桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12h，調(diào)整菌濃度至5 X IO11Cfu/ ml,按重量比菌液：載體為1 :1的配比加入載體玉米芯粉,60 °C烘干24h制成活菌數(shù) 彡5 X 108cfu/g短小芽孢桿菌菌粉。
[0029] 將蛭弧菌菌種接種于IOOml于1/10NB培養(yǎng)基中，加入100L濃度為I. OX IO6Cfu/ ml大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下lOOr/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，檢測菌落總數(shù)，調(diào)蛭 弧菌菌液濃度為1.0 X l〇ncfu/ml備用。花生油、質(zhì)量濃度為5%的瓊脂和蛭弧菌含量為 I. OX 10ncfu/ml的菌液按照體積比為3:50:100的比例放入攪拌容器中，然后加入質(zhì)量濃 度為2 %的羧甲基纖維素納，25°C恒溫攪拌30min，使之混合均勻，將混合液滴入到質(zhì)量分 數(shù)為10 %的CaCl2溶液中固化12h，再將蛭弧菌固化顆粒于-20°C條件下冷凍干燥24h，制 得顆粒劑。蛭弧菌顆粒的含量彡l.〇Xl〇 ncfu/g。
[0030] 將短小芽孢桿菌菌粉與蛭弧菌顆粒按照質(zhì)量比為20:1的比例混合，即得到本發(fā) 明的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑。
[0031] 實施例3抑制弧菌譜分析
[0032] 采用平板濾紙片擴(kuò)散法對實施例1制得的液體制劑進(jìn)行抑制弧菌譜分析。根據(jù)抑 菌圈的大小判定抑菌能力的強(qiáng)弱，抑菌譜分析結(jié)果見表1 :
[0033] 表1組合物的抑制弧菌活性分析
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑的制備方法，其特征在于，所述的制備方法 包括以下步驟：分別將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng) 制成濃縮液，然后將二者混合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的具有群體感應(yīng)抑制作用的短 小芽孢桿菌為保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體制劑的制備方法，其特征在于，所述的蛭弧菌為噬菌蛭 弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔爾蛭弧菌中的一種或多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括以下步驟：將短 小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面和種子培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基，制得短小芽孢桿菌濃縮液活菌數(shù)> l〇9cfu/ml ;蛭弧菌與副溶血弧菌濃 縮液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角錐瓶中，恒溫?fù)u床250rpm，28°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)物 經(jīng)過5000rpm、4°C離心20min，取上清液，再16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，力口 入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，制成濃度> 10ncfu/ml的蛭弧菌濃縮液；將短小 芽孢桿菌的濃縮液和蛭弧菌的濃縮液按照體積比為10:1的比例進(jìn)行混合。
【文檔編號】C12R1/01GK104431522SQ201410751338
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】宋增福, 許維素 申請人:蘇州埃瑞特生物技術(shù)有限公司