一種冬瓜食療食品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種冬瓜食療食品的制備方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進一步采用底物誘導適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵冬瓜，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵冬瓜。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵冬瓜中，吡咯喹啉醌含量達到89-151ng/mL，納豆激酶活力達到476-888U/mL。
【專利說明】一種冬瓜食療食品的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種冬瓜食療食品的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對心血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (Nattokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個氨基酸殘基組成，分子量27KD左右， 無毒、無副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預防動脈硬化、心臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對消化系統(tǒng)的作用：大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人體吸收。Ig納豆中含有10億個以上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可以抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的痢疾桿菌等腐敗菌，促進乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細菌平 衡，預防痢疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纖維素酶和脲酶等酶群，這些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進消化吸收。納豆芽 孢桿菌在通過分解利用大豆蛋白進行繁殖的過程中，可以產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護作用，飲酒時可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對免疫系統(tǒng)的作用：通過接種納豆菌的動物實驗發(fā)現(xiàn)，納豆可以提高機體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可以誘發(fā)機體干擾素生成，增強機體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草甙、維生素 B2、維生素 E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進肌膚光滑；
[0006] ④促進骨骼發(fā)育：維生素 K2可促進鈣與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進骨骼形成，在骨骼形 成過程中起著重要作用，而納豆中維生素1(2含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標志性生理活性 物質(zhì)--卩比略喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷 酸之后在細菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，化學名稱為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等能夠合成 PQQ，但在各種植物、動物以及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學家測定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當中PQQ含量最高，達到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時會引起哺乳動物諸多代謝障礙，被認為是一種新型維生 素。PQQ對哺乳動物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能：PQQ作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細胞生長， 尤其是激活人體B細胞、T細胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷：PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對人體的傷害：PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如心臟病、癌 癥以及各類炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。篜QQ在體內(nèi)能促進神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾??；
[0013] ⑤促進氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進氨基酸吸收；
[0014] ⑥促進生長因子合成：生長因子是人類生長的激素，PQQ能刺激人體細胞生長，增 加細胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥：PQQ具有修復神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑧促進谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進機體谷胱甘肽合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強的抗癌功能：PQQ激活自然殺傷細胞（NK)細胞為ANK細胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細胞等免疫細胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細胞；封閉腫瘤細胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細胞溶解死亡；阻止腫 瘤細胞DNA復制，促其凋亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 孢桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽孢桿菌是公認安全的食品級微生物（GRAS微生 物），對納豆芽孢桿菌進行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對于 人們在日常飲食中補充NK和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。
[0019] 冬瓜包括果肉、瓢和籽，含有豐富的的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素以及礦質(zhì)元素 等很高的營養(yǎng)成分。不同產(chǎn)地的冬瓜營養(yǎng)成分略有差異，以中國廣東產(chǎn)冬瓜為例，每IOOg 鮮冬瓜中含有蛋白質(zhì)0. 3g，碳水化合物I. 8g克膳食纖維0. 9g，鉀65mg，鈉0. 2mg，磷14mg， 鎂5mg，鐵0. lmg，抗壞血酸27mg，維生素 E0. 02mg，核黃素0. Olmg，硫胺素0. Olmg，尼克酸 0. 2mg〇
[0020] 研宄表明，冬瓜維生素中以抗壞血酸、硫胺素、核黃素及尼克酸含量較高，具防治 癌癥效果的維生素 B1，在冬瓜子中含量相當豐富；礦質(zhì)元素有鉀、鈉、鈣、鐵、鋅、銅、磷、硒 等8種，其中含鉀量顯著高于含鈉量，屬典型的高鉀低鈉型蔬菜，對需進食低鈉鹽食物的腎 臟病、高血壓、浮腫病患者大有益處，其中元素硒還具有抗癌等多種功能；含有除色氨酸外 的8種人體必需氨基酸，谷氨酸和天門冬氨酸含量較高，還含有鳥氨酸和γ -氨基丁酸以及 兒童特需的組氨酸；冬瓜不含脂肪，膳食纖維高達0. 8%，營養(yǎng)豐富而且結(jié)構(gòu)合理，營養(yǎng)質(zhì) 量指數(shù)計算表明，冬瓜為有益健康的優(yōu)質(zhì)食物。
[0021] 冬瓜中的不少化學成分具有顯著的生理活性。冬瓜果肉含有腺嘌呤、β -谷甾醇、 羽扇豆醇、十三烷醇、甘露醇、鼠李糖、萌蘆素 β等多種功能性成分。冬瓜瓢含萌蘆巴堿、 組氨酸、腺嘌呤、維生素 Bi、C、E等。冬瓜皮含蠟類及樹脂類物質(zhì)等。冬瓜籽含皂苷0.6%， 尿素、尿素分解酶、脂肪油、瓜氨酸、組氨酸、蛇麻脂醇，甘露醇，谷留醇等，尤其以維生素 Bl含量相當豐富。
[0022] 冬瓜適合制作發(fā)酵蔬果。本發(fā)明通過選育納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌及其共發(fā) 酵，開發(fā)出富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。但如果干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌在同一體系中生 長不平衡會導致一種菌在競爭中排斥另一種，共發(fā)酵無法順利進行。關(guān)于生理特性，即使在 野生狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解蛋白質(zhì)獲得必 需氨基酸的能力不足，而納豆芽孢桿菌具有較強蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和 肽可滿足乳酸菌對氨基酸的需求。納豆芽孢桿菌兼性厭氧，通過消耗氧氣也促進乳酸菌生 長和產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴格偏利共生關(guān) 系外，更通過選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met-)而與納豆芽孢桿菌 形成嚴格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌的共發(fā)酵順利進行。
[0023] 納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無法通過理性優(yōu) 化手段提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核苷酸四大有 機物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性（Rigidity)又 顯示出柔性（Plasticity)，處于嚴格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對整個代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點但又相關(guān)的途徑進行協(xié)同突變后，會表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優(yōu)化手段（Unrational optimization technique)，對所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實現(xiàn)多位點協(xié)同突變，并通過高通量篩選使多位點協(xié) 同突變的表型從突變庫中凸顯，即可實現(xiàn)提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標。
[0024] 隨機突變是最常見的非理性優(yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點數(shù)量足夠大的突 變庫，但在突變庫中，各突變位點往往是分散獨立于單個細胞中，相互之間無法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒于突變庫中而不能得到篩選。
[0025] 基因組重排（Genome Shuffling)是在隨機突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過隨機突變產(chǎn)生突變位點數(shù)量足夠大的突變庫的基礎(chǔ)上，進一步通過 細胞融合使各突變位點優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)這種柔性進行多點協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐。Zhang等（2002)首先以傳統(tǒng)誘變方法獲得一個突變庫，篩選出若干個正向突變株作為 出發(fā)株，然后通過多輪遞推原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機重組，實現(xiàn)基因組重排，最 終從突變庫中篩選出性狀被提升的目的菌株；St印hanopoulos (2002)通過基因組重排改 造了細菌表型；Patnaik等（2002)利用基因組產(chǎn)品技術(shù)實現(xiàn)了乳酸桿菌的一株工業(yè)菌株 的改良，令其在PH 4.0下乳酸產(chǎn)量為出發(fā)野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobutylicum CICC 8012 產(chǎn) Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通過基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10， 其對五碳糖和六碳糖的轉(zhuǎn)化率達到69. 48 %和100%，而出發(fā)菌株為14. 83 %和100%， 乙醇產(chǎn)率達到47.08g/L，而出發(fā)菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產(chǎn)普魯藍多糖大幅度提高，并且遺傳穩(wěn)定；Zheng等（2010)通 過基因組重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產(chǎn)率和耐 酸性；John等（2008)通過原生質(zhì)體融合式的基因組重排，獲得了以木薯-甘蔗渣為基質(zhì) 的乳酸高產(chǎn)菌株；Yu等（2008)通過基因組重排獲得了糖耐度提高從而乳酸產(chǎn)率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產(chǎn) 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0026] 基因組重排也為進行微生物代謝組學分析提供了支撐。經(jīng)過基因組重排而代謝 優(yōu)化的目的菌其遺傳背景來源于出發(fā)菌，故通過比對目的菌與出發(fā)菌的蛋白表達譜差異， 輔以代謝流和代謝控制分析技術(shù)，即可解析導致代謝優(yōu)化的關(guān)鍵酶及有關(guān)途徑的調(diào)控機 制。Luo 等（2012)通過基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)產(chǎn)率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達譜發(fā)生 明顯改變，34種蛋白表達上升而20種蛋白表達下降，提示與游霉素合成有關(guān)的牽涉廣泛的 代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化；Zhang等（2010)通過基因組重排，使Propionibacteriumshermanii產(chǎn) Vb12大幅度提高，重排后菌株38種蛋白表達發(fā)生改變，其中22種蛋白表達上升而16種蛋白 表達下降，在表達上升的22種蛋白中，有6種是V b12合成途徑中的酶，提示與Vb12合成有關(guān) 的牽涉廣泛的代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化。
[0027] 但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間 無關(guān)聯(lián)，使得選育到的菌株在發(fā)酵時目標產(chǎn)物產(chǎn)率遠低于預期。針對此問題，本發(fā)明在進行 基因組重排選育時，選育平板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高 產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導適應(yīng)性策略。因此， 在對納豆芽孢桿菌高產(chǎn)NK兼PQQ表型進行基因組重排選育時，在選育平板中添加一定比例 冬瓜汁，而在發(fā)酵冬瓜時則添加一定比例豆芽汁。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0028] 本發(fā)明提供了一種冬瓜食療食品的制備方法。本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進 一步采用底物誘導適應(yīng)性策略，對納豆芽孢桿菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁 支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實現(xiàn)多位點協(xié)同突變，進而通過高通量篩選使多位點協(xié)同突變的表型從 突變庫中凸顯，獲得能夠在冬瓜發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410。 同時，通過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Me〇干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota-Met、LcS-MeO。LcS-Mef在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-410,但前者對后者 營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的 發(fā)酵冬瓜。
[0029] 一種冬瓜食療食品的制備方法，包括以下步驟：
[0030] 1)、將產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進行亞硝基 胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養(yǎng)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進一步 采用底物誘導適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽 孢桿菌 BN-NKPQQ-RWX-410 ;
[0031] 細胞融合傳代培養(yǎng)實現(xiàn)基因組改組，使納豆芽孢桿菌10261和10623所有誘變后 代的優(yōu)勢突變得到優(yōu)化整合。如有必要，可對融合后代進行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生長旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ納豆 芽孢桿菌。
[0032] 2)、將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Meif (Lactobacillus casei Shirota-Met-)；
[0033] 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410和干酪乳桿菌LcS-Mef共發(fā)酵冬瓜，得到 富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜，得到的富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜即為冬瓜食療食品。
[0034] 本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進一步采用底物誘導適應(yīng)性策略，對納豆芽孢桿 菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實現(xiàn)多位點協(xié)同突變，進而 通過高通量篩選使多位點協(xié)同突變的表型從突變庫中凸顯，獲得能夠在冬瓜發(fā)酵中高產(chǎn)NK 兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410。同時，通過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷 (Met )干酷乳桿菌LcS-Met。
[0035] 欲使干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌順利共發(fā)酵，兩者之間應(yīng)形成共生關(guān)系。本發(fā) 明的策略是使通常情況下競爭占優(yōu)的干酪乳桿菌成為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（LcS-MeO，從 而在代謝上對納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410形成依賴，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽孢桿菌供給，即形成嚴格的偏利共生關(guān)系。雖然LcS-Mef在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-410,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩菌之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。
[0036] 所用納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物，共發(fā)酵得到的富含 NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜中，PQQ含量達到89-151ng/mL，高于天然食品中含量最高的納豆 (55-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達到476-888U/mL。所獲得的發(fā)酵冬瓜富含 納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有發(fā)酵冬瓜固有的滋味和發(fā)酵后特有的風味。
[0037] 步驟1)中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆芽孢 桿菌10261來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙橋中 路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽孢桿菌10263來自中 國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院6號樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota) 來自養(yǎng)樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0038] 所述的底物誘導適應(yīng)性基因組重排后的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆 芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（冬瓜汁占平板總量的10% -15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導適應(yīng)性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿 菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€平板后，再用纖維素膜影印 至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠?周圍形成肉眼可見沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大小；④平板B中，高 產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低； ⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的 納豆芽孢桿菌。
[0039] 所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410保藏于斜面豆芽汁冬 瓜汁固體培養(yǎng)基中。
[0040] 所述的平板豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基以IL計， 由以下量的組分組成：
[0041] 冬瓜汁 100?150mL; 鹿糖 4.0?6.Og; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0042] 進一步優(yōu)選，所述的平板豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng) 基以IL計，由以下量的組分組成：
[0043] 冬瓜汁 100~150mL； 鹿糖 5.Og; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0044] 所述的豆芽汁的制備：剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL后過 濾，得到豆芽汁。
[0045] 該平板豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通量 篩選。該斜面豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌保藏。
[0046] 本發(fā)明中，采用基因組重排技術(shù)選育納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410時，選育平 板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分（冬瓜汁），而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，促使選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的 菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導適應(yīng)性策略。
[0047] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：① 制備2個平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D)，為平板D ;②將誘變后的干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei Shirota)涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落 而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營 養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Met^保藏于斜面MRS固體培養(yǎng)基中。
[0048] 所述的平板MRS固體培養(yǎng)基和斜面MRS固體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組 成：
[0049] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0050] 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
[0051] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0052] 本發(fā)明中，采用隨機誘變技術(shù)獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿 菌（Lactobacillus casei Shirota-Meif，LcS-Meif)。LcS-Meif在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-410,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，通過構(gòu)建共生關(guān) 系的策略實現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵，獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。
[0053] 步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-410和LcS-Met_*別進行活化培 養(yǎng)，BN-NKPQQ-RWX-410在豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36 °C (優(yōu)選35 °C ) ,LcS-Met-在MRS液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38 °C (優(yōu) 選 37。。）。
[0054] 所述的豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成：
[0055] 冬瓜汁 100 ?150mL ;
[0056] 鹿糖 4. 0 ?6. Og ;
[0057] 豆芽汁 余量。
[0058] 所述的豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基以IL計，優(yōu)選的，由以下量的組分組成：
[0059] 冬瓜汁 100 ?150mL ;
[0060] 鹿糖 5. Og ;
[0061] 豆芽汁 余量。
[0062] 該豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL后過濾，得到豆芽汁。
[0063] 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成：
[0064] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0065] 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
[0066] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0067] 將BN-NKPQQ-RWX-410和LcS_Met_共發(fā)酵含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體包括：將活化 后的BN-NKPQQ-RWX-410和LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含冬瓜的發(fā)酵 培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。
[0068] 所述的含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成：
[0069] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; Λ7.芽汁 IOOmL; 冬瓜 余量。
[0070] 在容器中加入蔗糖、酪氨酸、谷氨酸、麥芽糖和豆芽汁之后，用切成塊狀的冬瓜填 滿至IL即可。
[0071] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-410和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0072] 所述的混合菌液接種至含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1%?5%。
[0073] 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h?36h。、
[0074] 冬瓜汁的制備是直接將冬瓜榨汁后得到。
[0075] 共發(fā)酵時，在含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加酪氨酸和谷氨酸對BN-NKPQQ-RWX-410 進行代謝調(diào)控，促進PQQ合成，添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-410進行代謝調(diào)控，促進NK生 成，添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-410在冬瓜發(fā)酵過程中的增殖。本發(fā)明中，納豆芽孢桿 菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備的發(fā)酵冬瓜富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有發(fā)酵冬 瓜固有的滋味和發(fā)酵后特有的風味。
[0076] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0077] -、本發(fā)明使用的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物。
[0078] 二、首次采用基因組重排技術(shù)優(yōu)化NK和PQQ合成途徑，對納豆芽孢桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實現(xiàn)多位點協(xié)同突變，進而通過高通量 篩選使多位點協(xié)同突變的表型從突變庫中凸顯。同時，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進一步采 用底物誘導適應(yīng)性策略，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn) 表型，獲得能夠在冬瓜發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410。
[0079] 三、首次采用構(gòu)建共生關(guān)系的策略實現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵。通 過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met_)干酪乳桿菌LcS_Met_。LcS_Met_在生長速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-410,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā) 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。
[0080] 四、從結(jié)構(gòu)上看，PQQ通過酪氨酸和谷氨酸之間形成肽鍵連接環(huán)化而成。本發(fā)明通 過在含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸和谷氨酸對BN-NKPQQ-RWX-410進行代謝調(diào)控，促 進PQQ合成。通過在含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-410進行代謝調(diào) 控，促進NK生成。通過在含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-410在冬瓜 發(fā)酵過程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜，PQQ含量達到89-151ng/mL，高于 天然食品中含量最高的納豆（55-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達到476-888U/ mL。所獲得的發(fā)酵冬瓜富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有發(fā)酵冬瓜固有的滋味和氣味。

【具體實施方式】
[0081] 在實施例中，有關(guān)培養(yǎng)基配制如下，
[0082] (a)所述的豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計，由以 下量的組分組成：
[0083] 冬瓜汁 130mL ;
[0084] 鹿糖 5. Og ;
[0085] 豆芽汁 余量；
[0086] 該豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL后過濾，得到豆芽汁。
[0087] (b)所述的豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL 計，由以下量的組分組成：
[0088] 冬瓜汁 130mL; 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0089] 該豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（平板）的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0090] (C)所述的豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL 計，由以下量的組分組成：
[0091] 冬瓜汁 130mL; 鹿糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量； 倒試管斜面
[0092] 該豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（斜面）的配方有利于納豆芽孢桿菌的保藏。
[0093] ⑷所述的MRS液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計，由以下量的組 分組成：
[0094] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二銨 2Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6,4
[0095] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0096] (e)所述的MRS固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計，由以 下量的組分組成：
[0097] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 10.〇g; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2 Og;
[0098] 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0099] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[0100] (f)所述的MRS固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計，由以 下量的組分組成：
[0101] 蛋白胨 ia〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸猛 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4 倒試管斜面
[0102] 該MRS固體培養(yǎng)基（斜面）有利于干酪乳桿菌保藏。
[0103] (g)所述的含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成：
[0104] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽汁 IOOmL; 冬瓜 余量；
[0105] 在容器中加入蔗糖、酪氨酸、谷氨酸、麥芽糖和豆芽汁之后，用切成塊狀的冬瓜填 滿至IL即可。
[0106] (h)冬瓜汁的制備是直接將冬瓜榨汁后得到。
[0107] 本發(fā)明實施例中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆 芽孢桿菌10261來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙 橋中路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽孢桿菌10263 來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院 6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263 ;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)來自養(yǎng)樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0108] 實施例1
[0109] 本發(fā)明通過納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的發(fā) 酵冬瓜，包括以下步驟：
[0110] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410的選育
[0111] 采用底物誘導適應(yīng)性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410,具體方法為：首先構(gòu)建納豆芽孢桿菌突變庫，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘 變后代，進行細胞融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實現(xiàn)基因組改組，使納豆芽孢 桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生 長旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0112] 突變庫高通量篩選：①制備2個豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基平板（冬瓜汁占平板總 量的10-15 %，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導適應(yīng) 性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 孢桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-410,保藏于豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0113] (2)甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0114] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型（LcS-MeO。
[0115] LcS-Mett帝選：①制備2個MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個為單純MRS平板（平板D);②將干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei Shirota)的誘變后代涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至 另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為LcS-Met^保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0116] (3)BN-NKPQQ-RWX-410 的活化培養(yǎng)
[0117] 將保存于豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-410取一環(huán)，接種 至豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0118] (4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0119] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS_Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0120] (5)富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜的發(fā)酵制備
[0121] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-410與LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:2 (I X IO8CFMAiL: 2 X 108CFM/mL)，混合菌液以1 %接種量接種含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基，42°C 六層紗布封口培養(yǎng)24h，得到富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含豆芽 汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-410合成NK和PQQ進行代謝調(diào)控，豆芽汁有 利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過肽鍵連接環(huán) 化而成。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵冬瓜中NK活力476U/mL，PQQ含量89ng/mL。所獲得的發(fā)酵冬瓜 富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有發(fā)酵冬瓜固有的滋味和發(fā)酵后特有的風味。
[0122] 實施例2
[0123] 本發(fā)明通過納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的發(fā) 酵冬瓜，包括以下步驟：
[0124] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410的選育
[0125] 采用底物誘導適應(yīng)性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410,具體方法為：首先構(gòu)建納豆芽孢桿菌突變庫，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘 變后代，進行細胞質(zhì)融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實現(xiàn)基因組改組，使納豆芽 孢桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且 生長旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0126] 突變庫高通量篩選：①制備2個豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基平板（冬瓜汁占平板總 量的10-15 %，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導適應(yīng) 性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大?。虎芷桨錌中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅Γ鶕?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 孢桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-410,保藏于豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0127] (2)甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0128] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型（LcS-MeO。
[0129] LcS-Mett帝選：①制備2個MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)的誘變后代涂布其中一個平板后，再用纖維素 膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為LcS-Met^保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0130] (3)BN-NKPQQ-RWX-410 的活化培養(yǎng)
[0131] 將保存于豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-410取一環(huán)，接種 至豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0132] (4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0133] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS_Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0134] (5)富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜的發(fā)酵制備
[0135] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-410與LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:5 (I X 108CFM/mL: 5 X 108CFM/mL)，混合菌液以5 %接種量接種含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C 六層紗布封口培養(yǎng)36h，得到富含NK和PQQ的發(fā)酵冬瓜。含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含豆芽 汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-410合成NK和PQQ進行代謝調(diào)控，豆芽汁有 利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過肽鍵連接環(huán) 化而成。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵冬瓜中NK活力888U/mL，PQQ含量151ng/mL。所獲得的發(fā)酵冬 瓜富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有發(fā)酵冬瓜固有的滋味和發(fā)酵后特有的風味。
[0136] 本發(fā)明中采用色譜法測定PQQ，具體步驟參照"Noji N，Nakamura T, Kitahata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone(PQQ) analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Chem, 2007, 55 (18): 7258-7263·"。
[0137] 本發(fā)明中采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定NK活力。測定步驟：將發(fā)酵物與等 量水混合碾磨均勻后過濾，濾液點種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶 作為標準品，通過測量透明圈直徑計算納豆激酶相當于尿激酶的活力單位（U/mL)。
【權(quán)利要求】
1. 一種冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410 ; 2) 、將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_; 3) 將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵冬瓜，得到富含 納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵冬瓜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述的高 通量篩選具體包括：①制備2個平板豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基，其中一個將小鼠抗PQQIgG 單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B;②將納豆芽 孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€平板后，再用纖維素膜 影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的誘變 融合后代菌落周圍形成肉眼可見沉淀圈，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉醌量 大?。虎芷桨錌中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅Γ鶕?jù)透明圈直徑大 小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn)納豆 激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述的平 板豆芽汁冬瓜汁固體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 冬瓜汁 100?150mL; 庶糖 4.0?6.Og; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的從 中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備2個平板MRS固體培養(yǎng)基， 其中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板，為平板D;②將誘 變后的干酪乳桿菌涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板C和平 板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌 落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的平 板MRS固體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟3)中，在共發(fā) 酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410和干酪乳桿菌LcS-Met_分別進行活化培養(yǎng)， 納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410在豆芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 為34?36°C，干酪乳桿菌LcS-Met_iMRS液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36? 38。。。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的豆 芽汁冬瓜汁液體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 冬瓜汁 100?150mL; 鹿糖 4. 0?6.Og; 豆芽汁余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 LOmLi 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟3)中，將納豆芽 孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵冬瓜，具體包括：將活化后的納豆 芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410和干酪乳桿菌LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種 至含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵冬瓜。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的含 冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 m〇g; Λ7.芽?|· lOOmL； 冬瓜 余亙。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的冬瓜食療食品的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述 混合菌液中的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-410和干酪乳桿菌LcS-MetI^菌數(shù)密度比為 1:2 ?1:5 ; 所述的混合菌液接種至含冬瓜的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1%?5% ; 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h?36h。
【文檔編號】A23L1/212GK104431854SQ201410751321
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】李青青, 張哲滔, 吳淵, 鄧惟 申請人:杭州元佩特生物科技有限公司