一種包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦及其制備方法
【專利摘要】一種包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦及其制備方法，屬于固定化酶【技術(shù)領(lǐng)域】。該包埋有胺脫氫酶的聚乙烯亞胺(PEI)-氧化鈦固定化顆粒，粒徑為100～600nm，其中PEI在固定化過(guò)程中具有催化和模板雙重作用，即PEI通過(guò)分子中的氨基基團(tuán)與鈦前驅(qū)體分子之間的靜電和氫鍵作用促進(jìn)氧化鈦的形成，又能通過(guò)PEI的結(jié)構(gòu)為模板誘導(dǎo)并調(diào)控氧化鈦粒子的生成。其制備方法過(guò)程包括：配置PEI(直鏈和支鏈)及含有胺脫氫酶混合液；配置鈦的前驅(qū)體二-(2-羥基丙酸)二氫氧化二銨合鈦(Ti-BALDH)溶液；將鈦的前驅(qū)體溶液逐滴加入到PEI及胺脫氫酶的混合液，攪拌生成包埋胺脫氫酶的PEI-氧化鈦固定化顆粒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：制備條件溫和，工藝簡(jiǎn)單易行，所得包埋固定化顆粒具有固定化能力強(qiáng)，重復(fù)使用穩(wěn)定性好且能夠明顯提高胺脫氫酶的溫度穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】一種包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 手性胺是很多重要生物活性分子的結(jié)構(gòu)單元，是合成天然產(chǎn)物和手性藥物的重要 中間體。大概40%的光學(xué)活性藥物是手性胺。同時(shí)，手性胺可以為用作為拆分劑、手性助劑 和手性合成物，在精細(xì)化工、制藥和農(nóng)用化學(xué)品中得到廣泛的應(yīng)用。
[0003] 當(dāng)前，在化工和制藥產(chǎn)業(yè)中生物催化法制備手性化合物應(yīng)用廣泛，而且具有廣闊 前景。酮和游離氨不對(duì)稱還原胺化制備手性胺是目前應(yīng)對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)最夢(mèng)寐以求的反應(yīng)， 所以，尋找提高胺脫氫酶活性和穩(wěn)定性的方法至關(guān)重要。胺脫氫酶其高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境十分 敏感，極端的溫度和PH均有可能使酶喪失活力，即使在酶的適宜反應(yīng)條件下，隨著反應(yīng)時(shí) 間的延長(zhǎng)，酶也會(huì)逐漸喪失活性；另一方面，酶難以從反應(yīng)體系中回收，酶的存在會(huì)給產(chǎn)物 的分離帶來(lái)一定的困難。而固定化酶技術(shù)是目前提高酶使用效率和實(shí)現(xiàn)操作連續(xù)的最有效 的手段之一。
[0004] 利用生物硅化研究的基礎(chǔ)，將仿生思想應(yīng)用到其他氧化物的合成上逐漸成為研究 熱點(diǎn)。仿生礦化的過(guò)程可在常溫水溶液中進(jìn)行，溫和的制備條件使得酶分子的天然構(gòu)象和 生物活性得到很好的保持，為固定化酶提供了適宜的微環(huán)境。2002年，Livgae課題組報(bào)道 了利用仿生雜化微囊固定化酶，將海藻酸鈣微球侵入聚賴氨酸溶液，再浸入硅酸鈉溶液中 進(jìn)行硅化，微球表面形成氧化硅外殼，利用檸檬酸鹽的置換作用，進(jìn)一步得到具有海藻酸液 核和氧化硅外殼的雜化微囊，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。將相對(duì)分子量為135KDa的牛乳糖酶包 埋于上述雜化微囊中，硅化后固定化酶比活力稍有下降，但重復(fù)使用過(guò)程中未發(fā)生酶泄漏 現(xiàn)象，表現(xiàn)出較高的重復(fù)使用穩(wěn)定性。
[0005] 但胺脫氫酶由于敏感，目前高效固定化還較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺（PEI)-氧化鈦及其制備 方法。
[0007] 所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺（PEI)-氧化鈦固定化顆粒的制備方法，包括 以下步驟：
[0008] 1)全基因合成胺脫氫酶序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因序列，并將其連接至pET28a載 體，之后將該質(zhì)粒導(dǎo)入至大腸桿菌E. coliBL21(DE3);
[0009] 粗酶液制備：將步驟1)大腸桿菌菌種接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培 養(yǎng)一段時(shí)間后加入誘導(dǎo)劑IPTG ;培養(yǎng)所得發(fā)酵液，在冷凍離心機(jī)中離心獲得細(xì)胞，用緩沖 液重懸、洗滌，配制成細(xì)胞液；超聲破碎，將破碎液離心，收集上清液即為粗酶液；
[0010] 2)胺脫氫酶純酶的制備：采用鎳柱對(duì)胺脫氫酶進(jìn)行純化并除鹽；
[0011] 3)配備以及5?100mg/ml聚乙烯亞胺（PEI)溶液，向該P(yáng)EI溶液中加入3)所得 的胺脫氫酶配置成混合溶液，制備含0. 25?2mg/ml胺脫氫酶的混合溶液；
[0012] 4)配置的鈦的前驅(qū)體二-(2 -羥基丙酸）二氫氧化二銨合鈦溶液，溶劑為水，并用 鹽酸調(diào)節(jié)pH 5. 0 - 10. 0 ;
[0013] 5)將步驟5)的溶液逐滴加入到4)配置的胺脫氫酶-PEI混合液中，同時(shí)不斷攪拌 孵化生成的顆粒，過(guò)濾后，用去離子水洗滌，即可獲得包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦 固定化顆粒。
[0014] 其中，在步驟1)中所述的胺脫氫酶，其基因序列如SEQ ID NO 1所示。
[0015] 其中，在步驟1)中，正向引物為F:GAA TTC CCA TAT GAG CTT AGT AGA ;劃線部分 為NdeI酶切識(shí)別位點(diǎn)；
[0016] 反向引物為R:GCC CTC GAG TTA GTT GCG AAT劃線部分為XhoI酶切識(shí)別位點(diǎn)；
[0017] PCR產(chǎn)物與載體pET28a的連接：使用NdeI與XhoI將PCR產(chǎn)物及載體pET28a雙 酶切，經(jīng)純化后在T4DNA Iigase作用下4 °C過(guò)夜反應(yīng)。
[0018] 其中，步驟2)中的優(yōu)選操作為：所述的接種量為1%?3%，所述的LB培養(yǎng)基的 組成為：胰蛋白胨5. 0?15. Og/L，酵母浸膏1.0?10. Og/L，NaC15. 0?15. Og/L，調(diào)節(jié) pH7. 0?7. 5,接種前添加卡那霉素使其終濃度為50?150ug/mL ;所述培養(yǎng)條件為37°C， 150?250rpm培養(yǎng)1. 5?3h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為5?15mg/ml，繼續(xù)在25? 30°C，150 ?250rpm 下培養(yǎng) 4 ?6h。
[0019] 在步驟2)中所述的細(xì)胞懸液制備方法為培養(yǎng)結(jié)束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心 機(jī)中離心（優(yōu)選為4°C，8000rpm，15min)獲得細(xì)胞，棄上清液，沉淀用Tris-鹽酸緩沖液 (pH6. 5-8. 0)重懸,充分洗漆后離心,重復(fù)操作3次。所述的配置細(xì)胞液濃度為50?150g/ L〇
[0020] 在步驟2)中的超聲破碎時(shí)的優(yōu)選操作為：將制備的細(xì)胞懸液置于冰浴中，細(xì)胞破 碎儀探頭置于液面下lcm，功率200W，超聲2sec，間隔4sec，超聲20?60次。然后4°C、 12, OOOrpm離心15min去除不溶性細(xì)胞碎片，上清即為胺脫氫酶粗酶液。
[0021] 在步驟2)中所述的純化過(guò)程優(yōu)選采用的純化柱為能夠特異性純化帶有 His-tagged標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的HisTrap HP柱,其步驟包括平衡、上樣、平衡、洗脫、柱子再生； 收集洗脫的部分并利用超濾離心管進(jìn)行除鹽；除鹽后獲得的液體即為胺脫氫酶純酶液體。
[0022] 在步驟3)中所述的聚乙烯亞胺（PEI)包括分子量20_500KDa的直鏈PEI (優(yōu)選 為分子量為22KDa，87KDa，217KDa)與分子量20-500KDa的支鏈PEI (優(yōu)選分子量為25KDa， 187KDa)兩種，其濃度范圍為5?100mg/ml。
[0023] 在步驟3)中制備含有胺脫氫酶的PEI混合液，將胺脫氫酶與PEI母液按照一定的 體積比混合，其中胺脫氫酶的濃度范圍為0. 25?2mg/ml。
[0024] 在步驟4)中所述的鈦的前驅(qū)體二-(2-羥基丙酸）二氫氧化二銨合鈦（Ti-BALDH) 溶液，其濃度為〇. 1?〇. 5mol/L，采用的溶劑為去離子水。
[0025] 酶活力的檢測(cè)方法：將底物和還原性輔酶I二鈉加到2mL 200mM的氯化銨-氨水 緩沖液中，配置使得底物濃度為20mM，還原性輔酶I二鈉濃度為0. 2mM，加入制備的胺脫氫 酶液，在25°C，攪拌條件下進(jìn)行還原胺化反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定還原型輔酶I二鈉的 轉(zhuǎn)化量，得到固定化胺脫氫酶的酶活力。所述的底物為苯氧基-2丙酮、4-甲基-2-戊酮 (MIBK)、苯乙酮、5-甲基-2-己酮、環(huán)己酮中的一種，其中優(yōu)選苯氧基-2-丙酮。
[0026] 分離與檢測(cè)：反應(yīng)液加入等體積的正己烷，混合震蕩均勻，離心吸取上清液備用。 用高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算產(chǎn)物苯丙氨酸的收率及e. e.值。
[0027] 底物苯氧基-2-丙酮和產(chǎn)物苯氧基-2-丙酮用高效液相色譜檢測(cè)，色譜柱為 DaicelOD-H，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm(附圖5)。其檢測(cè)條件為：流動(dòng)性為體積比為90/10/0. 1的正 己烷/乙醇/二乙胺；流速為lml/min ;柱溫為35°C。
[0028] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0029] 本發(fā)明選用PEI作為誘導(dǎo)劑，二-(2-羥基丙酸）二氫氧化二銨合鈦（Ti-BALDH) 作為鈦前驅(qū)體，采用共沉淀的方法在PEI誘導(dǎo)生成氧化鈦的同時(shí)將胺脫氫酶固定。本發(fā)明 所獲得的包埋胺脫氫酶的PEI-氧化鈦固定化顆粒方法簡(jiǎn)單，包埋胺脫氫酶泄漏率低，具有 較好的溫度穩(wěn)定性及重復(fù)使用穩(wěn)定性。制備條件溫和，制備工藝簡(jiǎn)單易行，所得包埋胺脫氫 酶的PEI-氧化鈦顆粒粒徑為100?600nm，具有固定化能力強(qiáng)，泄漏率低，重復(fù)使用穩(wěn)定性 好。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例一所制備的包埋胺脫氫酶PEI-氧化鈦固定化顆粒表面掃描 電鏡（SEM)圖。
[0031] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例一所制備的包埋胺脫氫酶PEI-氧化鈦固定化顆粒重復(fù)使用 穩(wěn)定性變化圖。
[0032] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例一所制備的包埋胺脫氫酶PEI-氧化鈦固定化顆粒粒徑大小 (DLS)圖譜
[0033] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例一所制備的包埋胺脫氫酶PEI-氧化鈦固定化顆粒溫度穩(wěn)定 性實(shí)驗(yàn)變化圖。
[0034] 圖5為苯氧基-2-丙酮、L-苯氧基-2-丙胺、D-苯氧基-2-丙胺的高效液相色譜 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明
[0036] 實(shí)施例1
[0037] (1)根據(jù)SEQ ID NO 1，由商業(yè)化公司（上海生物工程有限公司）合成胺脫氫酶的 基因序列，與載體pET28a連接，構(gòu)建質(zhì)粒。
[0038] 其中，設(shè)計(jì)引物序列如下：
[0039] 正向引物 F: (5' )GAA TTC CCA TAT GAG CTT AGT AGA(3')劃線部分為 NdeI 酶 切識(shí)別位點(diǎn)；
[0040] 反向引物 R: (5' )GCC CTC GAG TTA GTT GCG AAT(3,)劃線部分為 XhoI 酶切識(shí) 別位點(diǎn)；
[0041] PCR擴(kuò)增條件如下：采用Taq酶
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦固定化顆粒，其特征在于該包埋胺脫氫酶 的PEI-氧化鈦固定化顆粒，粒徑為100?600nm。
2. 如權(quán)利要求1所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦固定化顆粒的制備方法， 包括以下步驟： 1) 全基因合成胺脫氫酶序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因序列，并將其連接至pET28a載體，之 后將該質(zhì)粒導(dǎo)入至大腸桿菌E. coliBL21DE3 ; 2) 粗酶液制備：將步驟1)大腸桿菌菌種接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培 養(yǎng)一段時(shí)間后加入誘導(dǎo)劑IPTG ;培養(yǎng)所得發(fā)酵液，在冷凍離心機(jī)中離心獲得細(xì)胞，用緩沖 液重懸、洗滌，配制成細(xì)胞液；超聲破碎，將破碎液離心，收集上清液即為粗酶液； 3) 胺脫氫酶純酶的制備：采用鎳柱對(duì)胺脫氫酶進(jìn)行純化并除鹽； 4) 配備以及5?100mg/ml聚乙烯亞胺溶液，向該P(yáng)EI溶液中加入3)所得的胺脫氫酶 配置成混合溶液，制備含0. 25?2mg/ml胺脫氫酶的混合溶液； 5) 配置的鈦的前驅(qū)體二-(2 -羥基丙酸）二氫氧化二銨合鈦溶液，溶劑為水，并用鹽酸 調(diào)節(jié) pH 5. 0 - 10. 0 ; 6) 將步驟5)的溶液逐滴加入到4)配置的胺脫氫酶-PEI混合液中，同時(shí)不斷攪拌孵化 生成的顆粒，過(guò)濾后，用去離子水洗滌，即可獲得包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦固定 化顆粒。
3. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于： 步驟1)中，設(shè)計(jì)引物序列如下： 正向引物F:GAA TTC CCA TAT GAG CTT AGT AGA ;劃線部分為Ndel酶切識(shí)別位點(diǎn)； 反向引物R:GCC CTC GAG TTA GTT GCG AAT劃線部分為Xhol酶切識(shí)別位點(diǎn)； PCR產(chǎn)物與載體pET28a的連接：使用Ndel與Xhol將PCR產(chǎn)物及載體pET28a雙酶切， 經(jīng)純化后在T4DNA ligase作用下4°C過(guò)夜反應(yīng)。
4. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于 步驟2)中所述的接種量為1 %?3%，所述的LB培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨5. 0?15. 0g/ L，酵母浸膏1. 0?10. 〇g/L，NaC15. 0?15. Og/L，調(diào)節(jié)pH7. 0?7. 5,接種前添加卡那霉素 使其終濃度為50?150ug/mL ;所述培養(yǎng)條件為37°C，150?250rpm培養(yǎng)1. 5?3h后加入 誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為5?15mg/ml，繼續(xù)在25?30°C，150?250rpm下培養(yǎng)4?6h。
5. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于 步驟2)中，培養(yǎng)結(jié)束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機(jī)中離心，獲得細(xì)胞，棄上清液，沉淀用pH 6. 5 -8. 0的Tris -鹽酸緩沖液重懸，充分洗滌后離心，重復(fù)操作3次；所述的配置細(xì)胞液濃 度為50?150g/L。
6. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于 步驟2)中所述的超聲破碎時(shí)是將制備的細(xì)胞懸液置于冰浴中，細(xì)胞破碎儀探頭置于液面 下lcm，功率200W，超聲2sec，間隔4sec，超聲20?60次；然后4°C、12, OOOrpm離心15min 去除不溶性細(xì)胞碎片，上清即為胺脫氫酶粗酶液。
7. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于 步驟3)中所述的純化過(guò)程采用的純化柱為能夠特異性純化帶有His - tagged標(biāo)簽的蛋白 質(zhì)的HisTrap HP柱，其步驟包括平衡、上樣、平衡、洗脫、柱子再生；收集洗脫的部分并利用 超濾離心管進(jìn)行除鹽；除鹽后獲得的液體即為胺脫氫酶純酶液體。
8. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于 步驟3)中所述的聚乙烯亞胺，包括分子量范圍為20 - 500KDa的直鏈PEI和/或分子量范 圍為20 - 500KDa的支鏈PEI，其濃度為5?100mg/ml。
9. 如權(quán)利要求2所述的包埋胺脫氫酶的聚乙烯亞胺-氧化鈦的制備方法，其特征在于 步驟5)中所述的鈦的前驅(qū)體二-(2 -羥基丙酸）二氫氧化二銨合鈦溶液，其濃度為0. 1? 0. 5mol/L，pH范圍在5. 0?12. 0,采用的溶劑為去離子水。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK104404026SQ201410748389
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】王世珍, 任紅, 方柏山 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)