多重?zé)晒鈖cr檢測mrsa用的試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒及檢測方法,該試劑盒，其特征在于包括：mecA正向引物；mecA反向引物；femA正向引物；femA反向引物；femB正向引物；femB反向引物；mecA探針；femA探針；femB探針。檢測方法包括以下步驟：提取樣品DNA；對步驟A中的樣品DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析后判定結(jié)果。本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準(zhǔn)確，適用于多重?zé)晒釶CR檢測MRSA的試劑盒；本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測MRSA的方法，該方法操作簡便、快速，成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說明】多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)計一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒，本發(fā)明還涉及一種采用上述 試劑盒檢測MRSA的方法。本發(fā)明基于Taqman技術(shù)，建立了一種多重突光PCR技術(shù)，可同時 檢測金黃色葡萄球菌耐甲氧西林methicillin resistant staphylococcus aureus,簡稱 MRSA的三種相關(guān)基因，即mecA、FemA、FemB。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于抗生素的使用，細(xì)菌也為了自身發(fā)展而不斷變異，就形成了細(xì)菌對抗菌藥物 的耐藥性，使本來有效的抗菌藥物在遇到耐藥菌引起的感染時療效下降甚至完全無效。金 黃色葡萄球菌至今仍然是國內(nèi)外醫(yī)院獲得性感染最常見的細(xì)菌之一。隨著內(nèi)酞胺類抗 生素在臨床的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)在臨床分離的葡萄球菌中比 例不斷增加，MRSA幾乎對所有內(nèi)酞胺類抗生素都耐藥。1996年，又出現(xiàn)了首例對萬古 霉素敏感性下降的MRSA。
[0003] 傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性方法雖然能夠滿足臨床的部分需要，但這些方法仍然存在一些缺 點，例如檢測時間較長和檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確等。因此，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢驗領(lǐng)域 的應(yīng)用近年來發(fā)展了一系列快速細(xì)菌鑒定或）耐藥檢測技術(shù)，例如基于PCR技術(shù)和DNA探 針雜交以及生物芯片技術(shù)等，這類方法的特點是快速而準(zhǔn)確，一般在幾個小時之內(nèi)就可以 得到檢測結(jié)果，大大縮短了檢測時間。
[0004]MRSA產(chǎn)生了mecA基因，該基因負(fù)責(zé)編碼青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)，它降低 3 -內(nèi)酰胺抗生素親和力，而PBP2a與固有的PBP2共同作用，使得細(xì)菌盡管在0 -內(nèi)酰胺抗 生素的環(huán)境中也能合成細(xì)胞壁，使細(xì)菌對青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素耐藥。mecA 基因位于葡萄球菌染色體mec盒staphylococcalcassettechromosomemec簡稱SCCmec 側(cè)面DNA的特有片段上。SCCmec是一個攜帶mec基因復(fù)合體的可移動基因島genomic islands，GI，甲氧西林耐藥和其他抗生素耐藥基因在此不斷積累，形成耐藥島resistance island，RI，導(dǎo)致MRSA對抗生素多重耐藥。
[0005] Berger克隆了 femA基因，在其中插人一個轉(zhuǎn)座子，使甲氧西林抗性金黃色葡萄 球菌轉(zhuǎn)變成敏感性金黃色葡萄球菌，證明femA與金黃色葡萄球菌的內(nèi)酞胺類抗生素 抗性緊密相關(guān)。N. K0BAYASHJF的研究則表明，部分表皮葡萄球菌中也發(fā)現(xiàn)有mecA的存在， 而femA和femB基因并不存在于表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌S. haemolyticus和頭葡萄球 菌S. capitis。因此僅僅檢測mecA并不能很好的預(yù)測MRSA的存在，N. K0BAYASHJF認(rèn)為同 時檢測三種基因是預(yù)測MRSA最可靠方法。
[0006] 針對金黃色葡萄球菌這三種MRSA相關(guān)基因，研究人員已開展了多重常規(guī)PCR方法 研究，基于Taqman技術(shù)建立MRSA檢測單一基因，如mecA基因方法也已經(jīng)研究成功，但是這 種方法存在很多局限，而且存在部分金黃色葡萄球菌，mecA熒光PCR檢測陽性，卻沒有表現(xiàn) 出耐甲氧西林的耐藥性，所以存在很多MRSA被漏檢的情況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種組分和配比合理，使 用方便，檢測快捷，準(zhǔn)確，適用于多重?zé)晒釶CR檢測MRSA的試劑盒；
[0008] 本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測MRSA的方法，該方法操作簡 便、快速，成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
[0010] 一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒，其特征在于包括：

【權(quán)利要求】
1. 一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒，其特征在于包括： mecA正向引物：5' -GGTCCCATTAACTCTGAA-3' ； mecA反向引物：5' -TGTGCGATTGTATTGCTA-3' ； femA正向引物：5' -AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3' ； femA反向引物：5' -CCACCAGCATAATAAACAA-3' ； femB正向引物：5' -CCACCAGCATAATAAACAA-3' ； femB反向引物：5' -CCGAATTTGACAACTTTG-3' ； mecA探針：5, -(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3,； femA探針：5' _(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3' ； femB探針：5' _(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒，其特征在于還包括 有PCR反應(yīng)液、dNTPs混合液、Taq聚合酶、DNA模版和水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒，其特征在于制備 20μL反應(yīng)體系由以下組分組成： 含Mg2+PCR反應(yīng)液 2.OuL 各 2. 5raMdNTPs混合液 2. 0μL Taq聚合酶 0· 5 μL mecA正向引物 0. 5 μL mecA反向引物 0μL femA正向引物 0. 5L femA反向引物 0. 5μL femB正向引物 0. 5μL femB反向引物 0. 5μΙ, mecA探針 0· 5μL femA探針 0. 5μL femB探針 0. 5μL DNA模版 1.0PL 水 10. 0μL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒，其特征在于所述各 2. 5mM的dNTPs混合液由 2. 5mMdATP、2. 5mMdCTP、2. 5mMdTTP、2. 5mMdGTP組成。
5. -種采用如權(quán)利要求3所述的多重?zé)晒釶CR檢測MRSA用的試劑盒檢測MRSA的方 法，其特征在于包括以下步驟： A、 提取樣品DNA; B、 對步驟A中的樣品DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，其中反應(yīng)體系由以下組分組成： 含Mg24 PCR反應(yīng)液 2. O PL 各 2. 5mMdNTPs混合液 2OμL Taq聚合酶 0· 5 μL mecA正向引物 0· 5 μL mecA反向引物 OημL feraA正向引物 OouL feraA反向引物 0.5UL femB正向引物 0 5UL femB反向引物 0. 5μL mecA探針 0 5μI feraA探針 0. 5μL femB探針 0.5 UL DNA模版 1.0UL 水 10.0 μL; c、對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析后判定結(jié)果。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟B中所述的熒光PCR擴(kuò)增按以下 步驟進(jìn)行： (1) 92°C?96°C預(yù)變性 30s; (2) 92°C?96°C變性5s?10s，55°C?63°C退火20s?40s，共進(jìn)行35?45個循環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟C中對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分 析，按以下步驟進(jìn)行： (1) 92°C?96°C變性Imin; (2) 40°C復(fù)性Imin; (3) 然后初始熔解溫度60°C?65°C，開始程序升溫熔解至92°C?96°C，并在熔解過程 中實時檢測熒光信號，15?25次/秒。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品DNA按以下步 驟進(jìn)行： 取I. 5mL培養(yǎng)物IOOOOrpm離心2min;沉淀物加入500μL的TE緩沖液，反復(fù)吹打使 之重新懸浮，加入30μL10%SDS和15μL的蛋白酶K，混勻，于37°C溫育Ih;加入IOOyL 5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后再65°C溫育IOmin;加入等 體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min，將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0. 8倍體積的異 丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來；沉淀用ImL的70%乙醇洗滌后，加入TE溶液溶解沉淀。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450908SQ201410740651
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月6日
【發(fā)明者】蔡先全, 劉恭源, 李云松, 張鵬杰, 蕭綺倩, 趙美轉(zhuǎn), 張磊 申請人:蔡先全