一組核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鑒定中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種核苷酸序列組合，由SEQ ID NO:1-6組成。所述組合中的核苷酸序列分別作為環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)中的外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物用于伊氏李斯特菌的鑒定方法。與普通PCR和Real-time PCR檢測方法相比，本發(fā)明的方法具有優(yōu)異的靈敏性、特異性、快速性和簡便性，適合檢測條件較差的應急檢測和基層檢測。
【專利說明】-組核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鑒定中的應用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)在細菌檢測中的應用，特別是在伊氏李斯特菌鑒 別診斷中的應用，屬于分子生物學和微生物學領域。

【背景技術(shù)】
[0002] 伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii，Liv)，又稱為綿羊李斯特菌，是廣泛存在于環(huán) 境中的革蘭氏陽性、有運動能力、兼性胞內(nèi)寄生短桿菌，是重要的人獸共患病病原菌。該病 原體主要引起反芻動物致病，導致李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)，約占動物李斯特菌病的15%。 由伊氏李斯特菌所致的動物李斯特菌病，其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、胃腸炎、新生兒敗血癥以及流 產(chǎn)，但不能穿過血腦屏障，侵入神經(jīng)中樞系統(tǒng)。伊氏李斯特菌也能引起人類李斯特菌病。該 李斯特菌病的易感人群主要為免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生兒 和孕婦；后者為腫瘤患者、艾滋病患者和器官移植受體等。人類伊氏李斯特菌病主要臨床 癥狀為敗血癥、孕婦流產(chǎn)、死產(chǎn)以及發(fā)熱性胃腸炎等。此外，與其他李斯特菌種比較，該病原 體在環(huán)境、食品中的分布更為廣泛。許多研究表明，伊氏李斯特菌所引起的李斯特菌病被低 估。為了給予臨床病人或感染動物準確快速的治療、以及伊氏李斯特菌的流行病學調(diào)查，研 發(fā)一個省時、省力和特異性較高的伊氏李斯特菌檢測方法成為必要。
[0003] 目前對于伊氏李斯特菌分離鑒定主要依賴于傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)和生化鑒定，該方 法耗時大約5到7天，包括二次增菌，選擇培養(yǎng)及后續(xù)的生化鑒定，耗時耗力，而且生化結(jié)果 的判讀依賴于人的主觀判斷，導致結(jié)果重復性差，易錯判。隨著核酸診斷技術(shù)的快速發(fā)展， 一些以PCR為基礎的診斷技術(shù)（如普通PCR技術(shù)，熒光PCR技術(shù)）被用于伊氏李斯特菌的 快速診斷，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續(xù)的電泳操作，昂貴的探針合成， 以及熟練的操作人員。對于一些條件有限的實驗室無法進行，限制了這些技術(shù)的運用。目前 運用這些檢測技術(shù)診斷伊氏李斯特菌的PCR方法和Real-time PCR方法，所選擇的目的基 因（如iap，Liv22-228)特異性差，極易出現(xiàn)假陽性擴增。此外這些檢測技術(shù)的靈敏度差， 檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。
[0004] 環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由 Notomi等發(fā)明的一種新型核酸特異性擴增技術(shù)。該技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、產(chǎn)物易檢 測等優(yōu)點，已被廣泛用于分子生物研究和診斷領域。LAMP針對靶核苷酸序列的6個區(qū)域設 計4條核心引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下（60?65°C )實現(xiàn) 擴增。
[0005] LAMP的4條核心引物，包括2條內(nèi)引物，即FIP (Forward inner primer，F(xiàn)IP)和 BIP (Backward inner primer，BIP)，2 條外引物（F3 和 B3)。FIP 包含 Flc (Fl 區(qū)域的互補序 列）和？2，即5/41(：42出1?包含81(3(81區(qū)域的互補序列）和82，即5 /-81(3-82。此 夕卜，兩條環(huán)引物（Loop primes, LF和LB)被增加到反應體系，能夠加速LAMP擴增反應。
[0006] LAMP擴增反應包括兩個過程，即啞鈴狀模板合成階段和循環(huán)擴增階段。在既定的 反應溫度下，雙鏈DNA在處于半解離和半結(jié)合的動態(tài)平衡狀態(tài)中，任何一個引物向雙鏈DNA 的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。在Bst DNA聚合酶的作用 下，以FIP引物F2區(qū)段的3'末端為起點，與對應的DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合 成。F3引物與F2c前端F3c序列互補，以3'末端為起點，通過鏈置換活性DNA聚合酶的作 用，首先置換出FIP引物合成的DNA鏈，同時合成自身DNA。最終F3引物合成而得的DNA鏈 與模板DNA形成雙鏈。然后由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產(chǎn)生一單鏈， 該單鏈通過5'末端的Flc區(qū)段和Fl區(qū)段互補，發(fā)生自我堿基配對，形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同 時，BIP引物同該單鏈雜交結(jié)合，以BIP引物的3'端為起點，合成互補鏈，在此過程中莖環(huán) 結(jié)構(gòu)被打開。接著，B3引物BIP引物外側(cè)的互補區(qū)域B3c配對結(jié)合，以：V端為起點，在聚 合酶的作用下，合成新的互補鏈。通過上述2個過程，形成雙鏈DNA。被置換的單鏈DNA依 據(jù)兩端存在的互補區(qū)域，發(fā)生自我堿基配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條被置換出來的DNA在 兩端呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為LAMP反應擴增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。LAMP反應擴增循環(huán)階 段：首先在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，以3'末端的Fl區(qū)段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。 與此同時，F(xiàn)IP引物F2與環(huán)上單鏈F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應，解離由Fl區(qū)段合成 的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)上存在單鏈形 式B2c，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增，經(jīng)過相同的過程，又形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通 過此過程，結(jié)果在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。LAMP反應可以特異、 高效、快速的擴增目的DNA，在1小時之內(nèi)使產(chǎn)物的量達到IO 9個拷貝。
[0007] LAMP擴增之后，其產(chǎn)物可以通過瓊脂糖電泳后檢測擴增子，陽性擴增產(chǎn)物的電泳 圖呈特異性階梯狀。其次，實時濁度檢測也被用于檢測LAMP擴增?，F(xiàn)在更為簡單的方法是 在反應混合物中加入可視染料（如FD試劑，朗普熒光可視試劑），陽性反應管的顏色從淺 灰色變?yōu)榫G色，陰性反應管則保持原來的淺灰色。
[0008] 本發(fā)明針對伊氏李斯特菌的種特異基因 smcL(NC_015713. 1，Listeriaivanovii, Liv)設計一套環(huán)介導恒溫擴增引物，旨在建立一種針對該病原的快速、敏感和特異的核酸 檢測體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一組能夠應用細菌檢測，特別是環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)的核 苷酸序列，更進一步提供環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)檢測伊氏李斯特菌的方法，以及應用于該方 法的試劑盒。
[0010] 基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一種核苷酸序列組合，所述組合由SEQ ID NO: 1-6組成。所述序列是根據(jù)伊氏李斯特菌種特異性基因 Smcl設計的LAMP反應引物，其 中，SEQ ID N0:1和2為外引物，SEQ ID N0:3和4為內(nèi)引物，SEQ ID N0:5和6為環(huán)引物。 [0011] 其次，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸組合在伊氏李斯特菌鑒定中的應用。
[0012] 再次，本發(fā)明又提供了一種用于檢測伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步 驟：
[0013] (1)將待檢測樣本、序列如SEQ ID N0:l-2所示的一對外引物、序列如SEQ ID NO: 3-4所示的一對內(nèi)引物、序列如SEQ ID NO: 5-6所示的一對環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合 酶、MgS04、甜菜堿以及環(huán)介導等溫擴增緩沖液加入到反應容器中；
[0014] ⑵將步驟⑴所得的混合液放置于63°C恒溫環(huán)境中進行DNA擴增反應；
[0015] (3)檢測步驟⑶獲得的產(chǎn)物。
[0016] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述MgSOJ^濃度為4mM，所述甜菜堿的濃度為0. 8mM。
[0017] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（1)中所述待檢測樣本為DNA提取物。
[0018] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（2)中所述的DNA擴增反應時間為60分鐘。
[0019] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（3)所述的檢測方法可以是目測判讀、瓊脂糖凝 膠電泳判讀、或者實時濁度儀判讀。
[0020] 優(yōu)選地，在檢測前在反應體系加入熒光試劑，步驟（3)所述的檢測方法為目測判 讀。
[0021] 最后，本發(fā)明提供了一種檢測伊氏李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包括：序列如 SEQ ID NO: 1-2所示的一對外引物、序列如SEQ ID N0:3-4所示的一對內(nèi)引物、序列如SEQ ID NO: 5-6所示的一對環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜堿、環(huán)介導等溫擴增緩沖 液。
[0022] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述MgSOJ^濃度為4mM，所述甜菜堿的濃度為0. 8mM。
[0023] 本發(fā)明提供的組合序列在使用環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)檢測伊氏李斯特菌的方法中 顯示了優(yōu)異的靈敏性、特異性、快速性和簡便性。
[0024] 運用連續(xù)稀釋好的伊氏李斯特基因組DNA進行環(huán)介導恒溫擴增反應，結(jié)果顯示： LAMP擴增反應的靈敏度比普通PCR方法高100倍，比Real-time PCR方法高10倍。
[0025] LAMP在模擬糞便中的檢測下限為8 X 103CFU/g，而Real-time PCR擴增檢測在模 擬糞便中的檢測下限為8X 104CFU/g。結(jié)果表明，在實際應用中，LAMP檢測方法10倍敏感 于 Real-time PCR 檢測。
[0026] 該體系在檢測26種其他常見致病菌和機會致病菌共94株時未出現(xiàn)非特異性擴 增，說明該檢測體系的特異性良好。
[0027] 使用LAMP技術(shù)在模擬糞便中僅需一次增菌培養(yǎng)6小時就能檢測出陽性結(jié)果。
[0028] 本發(fā)明的LAMP檢測方法的結(jié)果判讀不僅可以使用瓊脂糖凝膠電泳判讀、或者實 時濁度儀判讀，還可以在事先加入熒光試劑的情況下直接使用肉眼進行目測判讀，具有極 高的簡便性，適合檢測條件較差的應急檢測和基層檢測。
[0029] 綜上所述，基于本發(fā)明表現(xiàn)出的優(yōu)異的靈敏性、特異性、快速性和簡便性，本發(fā)明 提供的組合序列及使用環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)檢測伊氏李斯特菌的方法具有極為廣闊的應 用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖I. LAMP引物設計的位置和方向示意圖；
[0031] 圖2A. LAMP反應的目測濁度結(jié)果圖；
[0032] 圖2B. LAMP反應的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；
[0033] 圖3.使用瓊脂糖凝膠電泳評價LAMP靈敏性的結(jié)果圖；
[0034] 圖4.使用瓊脂糖凝膠電泳評價普通PCR靈敏性的結(jié)果圖；
[0035] 圖5.使用熒光實時檢測方法評價Real-time PCR靈敏性的結(jié)果圖；
[0036] 圖6.使用實時濁度儀評價LAMP靈敏性的結(jié)果圖；
[0037] 圖7.使用實時濁度儀評價LAMP快速性的結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制。
[0039] 引物設計
[0040] 根據(jù)伊氏李斯特菌種特異性基因 smcL(NC_015713. 1，Listeria ivanovii，Liv)設 計LAMP反應引物，該基因存在于伊氏李斯特菌所有亞種中，其特異性好，可以將伊氏李斯 特菌與其他密切相近的菌種（如單增李斯特菌，希爾李斯特菌，威爾李斯特菌，伊洛克李斯 特菌，格氏李斯特菌）和菌屬（如芽孢桿菌屬）區(qū)分開。利用環(huán)介導恒溫擴增引物設計軟 件 Primerexplorer V4 (http: //primerexplorer. ip/e/)和弓|物設計軟件 Primer Premier 5. 0設計LAMP引物,并將獲得的特異性引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(http: //blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. CRi)中進行序列比對分析，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹 配，最終獲得優(yōu)化后的一套環(huán)介導恒溫擴增引物。引物設計的位置和方向見圖1，序列見表 1〇
[0041] 表1.本發(fā)明檢測所有引物和探針序列一覽表
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種核苷酸序列組合，由SEQ ID NO: 1-6組成。
2. 權(quán)利要求1所述的核苷酸組合在伊氏李斯特菌鑒定中的應用。
3. -種用于檢測伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步驟： (1) 將待檢測樣本、序列如3￡〇10勵:1-2所示的一對外引物、序列如3￡〇10從):3-4所 示的一對內(nèi)引物、序列如SEQ ID N0:5-6所示的一對環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgS04、 甜菜堿以及環(huán)介導等溫擴增緩沖液加入到反應容器中； (2) 將步驟（1)所得的混合液放置于63°C恒溫環(huán)境中進行DNA擴增反應； (3) 檢測步驟（3)獲得的產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述MgSO 4的濃度為4mM，所述甜菜堿的 濃度為〇. 8mM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述待檢測樣本為DNA提 取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟（2)中所述的DNA擴增反應時間 為60分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述的檢測方法可以是目測 判讀、瓊脂糖凝膠電泳判讀、或者實時濁度儀判讀。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在檢測前在反應體系加入熒光試劑，步驟 (3)所述的檢測方法為目測判讀。
9. 一種檢測伊氏李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包括：序列如SEQ ID NO: 1-2所示的 一對外引物、序列如SEQ ID N0:3-4所示的一對內(nèi)引物、序列如SEQ ID N0:5-6所示的一對 環(huán)引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgS04、甜菜堿、環(huán)介導等溫擴增緩沖液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述MgSO 4的濃度為4mM，所述甜菜堿 的濃度為〇. 8mM。
【文檔編號】C12R1/01GK104498487SQ201410725837
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】王毅, 葉長蕓, 王艷 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所